CZ2004255A3 - Deriváty částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů jako inhibitory heparanázy mající antiangiogenní účinky a zabraňující antikoagulačnímu působení - Google Patents

Description

Deriváty částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů jako inhibitory heparanázy mající antiangiogenní účinky a zabraňující antikoagulačnímu působení

Oblast techniky

Zde popisovaný vynález se týká derivátů částečně desulfatovaných glykosaminoglykanů zvláště heparinů.

Dosavadní stav

Studie provedené v Biologické výzkumné jednotce pro nádory nemocnice university Hadassah-Hebrew v Izraeli (Isr. Med. Assoc. J., 2, 37 - 45, 2000; J. Med. Chem., 43, 2591 - 2600, 2000; Invasion Metastasis, 14, 290-302, 1994-1995; Exp. Cell Res., 201, 208 - 215, 1992) se zaměřují na zapojení růstových faktorů vázajících heparin, heparan sulfát a enzymy degradující heparansulfát (heparanáza) při angiogenezi nádorů a metastázách. Tyto studie byly použity na prověřování a na identifikaci heparinových derivátů a mimetik heparin/heparan sulfátu s potenciálními účinky na inhibici heparanázy (Nátuře Med., 5, 735 736, 1999; Science, 285, 33-34, 1999).

Nádorové buňky uvolňují enzym heparanázu, endo-p-Dglukuronidázu, která degraduje polysacharidový řetězec • ·

- 2 proteoglykanu heparan sulfátu na povrchu buňky a v extracelulární matrici.

Zapojení heparanázy do angiogeneze nádoru bylo porovnáváno se schopností uvolnit bFGF (FGF-2) a další růstové faktory z jejich nahromadění v ECM (extracelulární matrice).Tyto růstové faktory se starají o mechanismus navození neovaskularizace při normálních i patologických situacích.

Heparanáza tak může napomáhat nejen invazi nádorové buňky a metastáz, ale také angiogenezi nádoru, tedy obou kritických stupňů v progresi nádoru.

Specifické inhibitory enzymu heparanázy zabraňují uvolňování a aktivaci růstových faktorů nahromaděných heparan sulfátem, rovněž tak jako rozpadu ECM a pohlíží se na ně jako na velmi slibné látky pro výrobu protirakovinových léčiv.

Jedním z možných terapeutických přínosů pro antiangiogenní léčiva je tak vývoj silného a selektivního inhibitoru heparanázy.

Co se týká diskuse o angiogenezi, lze odkázat na WO 01/55221, náležející současnému přihlašovateli.

Další důležitou komplikací heparanázy je jak zánět, tak autoimunita. Účinky heparanázy mají také vztah k její schopnosti aktivovat buňky imunitního systému, aby opustily oběh a vyvolaly jak zánět, tak autoimunní odezvu. Interakce krevních destiček, granulocytů, T a B lymfocytů, makrofágů a žírných buněk se subendotheliální EMC je

- 3 působením heparanázy spojena s degradací heparan sulfátu. Enzym se uvolňuje z nitrobuněčných tělísek (tj. lysosomů, specifických granulí) jakožto odezva na různé aktivační signály dávajíc tak podnět k jeho řídící účasti a přítomnosti v zánětlivých místech a autoimunních lézích. Léčba pokusných zvířat heparanázovými inhibitory (tj. neantikoagulačními druhy nízkomolekulárního heparinu - LMWH) značně omezila u pokusných zvířat výskyt pokusně vyvolané autoimunní encefalomyelitidy (EAE), adjuvantní arthritidy a odmítání transplantátů, což ukazovalo na to, že lze heparanázové inhibitory použít k inhibici autoimunních a zánětlivých onemocnění.

Heparin

Heparin je heterogenní směs přirozeně se vyskytujících se polysacharidů různé délky řetězce a různého stupně sulfatace, mající antikoagulační účinky, a je vylučován žírnými buňkami pojivové tkáně přítomnými v játrech (odkud byl poprvé izolován), svalech, plicích, brzlíku a slezině.

V heparinu byla vedle normální sekvence identifikována navíc sekvence odpovídající aktivní poloze pro antithrombinové působení.

Protinádorový a antimetastatický účinek heparinu a jeho derivátů pochází od jeho schopnosti inhibovat heparanázu, schopnosti blokovat růstové faktory a regulovat angiogenezi.

• · · ·

- 4 Heparan sulfáty (HS)

Heparan sulfáty (HS) jsou všudypřítomné proteinové ligandy. Proteiny se vázají na řetězce HS při mnoha akcích od jednoduché imobilizace nebo ochrany proti účinkům proteolytické degradace až po specifickou modulaci biologických činností, jakou je angiogeneze.

Uhlohydrátový skelet jak heparinu, tak heparan sulfátů (HS) sestává ze střídajícího se D-glukosaminu (GlcN) a kyselin hexuronových (GIcA nebo IdoA).

V heparinu jsou GlcN zbytky ponejvíce N-sulfatované, zatímco v HS jsou jak N-sulfatované, tak N-acetylované, s malým počtem nesubstituovaných NH₂ skupin.

HS je v průměru také méně O-sulfatovaný než heparin.

Používání heparinu při léčbě angiogenních poruch, jako jsou nádory, a zvláště metastázy, je podstatně omezováno jeho antikoagulačními účinky.

Byly prováděny takové úpravy heparinu, aby se omezila jeho antikoagulační mohutnost, a současně byly zachovány jeho ochranné protinádorové vlastnosti.

Otevření jednotky kyseliny glukuronové v antithrombinové poloze snižuje affinitu heparinu k antithrombinu: takto může být heparin • · · ·

- 5 ) ·· · · • · • · · · použit jako látka se sníženými antikoagulačními účinky, ale stále ještě zachovávající si antiangiogenní vlastnosti.

Heparanázy

Heparanázy jsou enzymy náležející do skupiny endoglykosidáz (endo^-D-glukuronidáza), které hydrolyzují vnitřní glykosidovou vazbu řetězců heparan sulfátů (HS) a heparinu.

Tyto endoglykosidázy se angažují při proliferaci nádorových buněk, při metastázách a při neovaskularizaci nádorů. Tyto enzymy jsou biologickými cíly pro antiangiogenní působení. Ve vědecké literatuře existuje velký počet studií zabývajících se vztahem struktury a jejích účinků (viz například Lapierre, F., et al., Glycobiology, 6, (3), 355 366, 1996). I když ještě mnoho stránek věci musí být vyjasněno, byly uváděny studie týkající se inhibice heparanáz heparinem a jeho deriváty, za použití specifických zkoušek, které vedly k naléhavým úvahám o strukturních typech, které mohou sloužit jako vodítka k získání nových, selektivnějších derivátů.

Ve výše uvedené práci Lapierra, et al., jsou popisovány deriváty heparinu získané 2-0 desulfatací nebo „rozštěpením glykolu“ (oxidace perjodátem a následnou redukcí borohydridem sodným). Těmto derivátům zde uváděným jako „2-0-desulfatovaný heparin“ a „RO-heparin“ zůstává částečně zachován antiangiogenní účinek heparinu, což bylo prokázáno zkouškou CAM v přítomnosti kortikosteroidů (tamtéž, strana 360).

···· ·· · • · · ·

Byly popsány deriváty N-acylheparinu, které jsou bližšími mimetiky heparan sulfátu než heparin, které inhibují heparanázu jen o něco méně než N-sulfatované deriváty. (Irimira, T., Biochemistry, 25, 5322 - 5328, 1986; Ishai-Michaeli, R., et al., Biochemistry, 31, 2080 -2088, 1992).

Hepariny a FGF

FGF regulují četné fysiologické pochody, jako například růst buněk a jejich diferenciaci, ale také funkce týkající se patologických pochodů, jako je například nádorová angiogeneze.

FGF jsou růstové faktory (skupina více než 10 polypeptidů), jejichž kyselé (FGF-1) a bazické FGF (FGF-2) jsou jediné, které byly ponejvíce studovány, které vyžadují polysacharidový kofaktor, heparin nebo HS, aby se mohly navázat na FGF receptor (FGFR) a aktivovaly jej.

I když přesný mechanismus, kterým heparin a HS aktivoval FGF není znám, je přesto známo, že heparin, FGF a FGFR vytváří „třímolekulový“ nebo „ternární“ komplex.

Jedním z předpokládaných mechanismů je ten, kde heparin a HS vyvolává tak zvanou sendvičovou dimerizaci FGF a potom, takto dimenzovaný vytváří s FGFR stabilní komplex.

Antimetastatické účinky heparinových derivátů

Schopnost primárního nádoru generovat metastázované buňky je patrně hlavním problémem, kterému proti rakovi nová terapie čelí.

···· • · • ···

- 7 Zdá se, že heparinové deriváty s velkou schopností blokovat heparanázu, jsou schopné rovněž inhibovat angiogenezi jak primárních nádorů, tak metastáz.

Inhibice heparanázy navíc snižuje schopnost nádorových buněk migrovat z primárního nádoru k dalším orgánům.

Na zvířecích modelech bylo zjištěno, že antimetastatický účinek koreluje s heparanázovou inhibiční schopností heparinu a jeho derivátů (Bitan, M., et al., Isr. J. Med. Sci., 31, 106 - 108, 1995), rovněž tak jako dalších sulfatovaných polysacharidů (Miao, H. Q., et al., Int. J. Cancer, 83, 424 - 431, 1999 a zde uvedené odkazy). Provedené studie závislosti antimetastatických účinků na molekulové hmotnosti ukazují, že i velmi nízkomolekulární hepariny (Sciumbata, T., et al., Invasion Metastasis, 16, 132 - 143, 1996) a polysulfáty oligosacharidů (Parish, C. R., et al., Cancer Res., 59, 3433 - 3441, 1999) si udržují významné antimetastatické působení. I když globální odstranění N-sulfátových skupin (N-desulfatace) sníží antimetastatickou mohutnost heparinů, ta se částečně obnoví N-acylací (N-acetylace, N-hexanoylace) (Bitan, M., 1995) a Nsukcinylací (Sciumbata, T., 1996) výsledných volných skupin NH₂. Bylo zjištěno, že antimetastatické účinky heparinů jsou nepřímo úměrné stupni jejich O-sulfatace (Bitan, M., 1995). Selektivní 2-0desulfatace zbytku kyseliny iduronové nemá za následek výrazné snížení antimetastatických účinků heparinu (Lapierre, F., Glycobiology, 6, 355-366, 1996).

····

- 8 Obecně, jak heparanázová inhibice, tak antimetastatické účinky heparinů a dalších sulfatovaných polysacharidů se zmenšují se zmenšující se molekulovou hmotností a stupněm sulfatace (Bitan, M., 1995; Parish, C. R., 1999). Tyto účinky však také závisejí na karbohydrátovém skeletu polysacharidů (typ zbytků a poloha glykosidických vazeb) (Parish, C. R., 1999). Jelikož dosud není známa trojrozměrná struktura aktivních poloh heparanázy, je obtížné předpovídat, který polysacharidový skelet a které sulfatační polohy inhibují enzym nejúčinněji.

Na základě současných znalostí lze strukturální požadavky látek podobných heparinů, které by měly příznivé účinky na inhibici angiogeneze, rozdělit do dvou kategorií na základě cíle, který mají blokovat:

a) inhibici heparanázy: i když tento enzym rozpozná a rozštěpí heparinové a HS sekvence nejméně na osm monosacharidových jednotek skládajících se z kyseliny N-acyl-glukosamin-glukuronové (nebo N-sulfatovaných zbytků glukosaminu, viz například SandbackPikas, D, et al, J. Biol. Chem, 273, 18777 - 18780, 1998 a citované odkazy), může být jeho inhibice účinně dosaženo heparinovými fragmenty delšími než jsou tetradekasacharidové (Bitan, M, 1995), nebo vysoce sulfatovanými kratšími oligosacharidy, jako je sulfát maltohexosy (MHS) a sulfát fosfomannopentosy (PI-88) (Parish, C. R, 1999). Přes to jsou jak dlouhé heparinové fragmenty, tak vysoce sulfatované oligosacharidy antikoagulanty, tedy látky s vlastností, které se má u potenciálních antimetastatických léčiv předcházet;

- 9 b) inhibici angiogenních růstových faktorů (fibroblastového typu: FGF-1 a FGF-2; vaskulárního endotheliálního typu: VEGF; typu vaskulární permeability: VPF): až potud měly sloučeniny podobné heparinu sekvence dlouhé nejlépe alespoň pět monosacharidových jednotek, obsahující 2-sulfatovanou kyselinu iduronovou a N-6sulfatovaný glukosamin (viz například Maccarana, M., et al., J. Biol. Chem., 268, 23989 - 23905, 1993).

Literatura uvádí malé peptidy (5 až 13 aminokyselin) s antiangiogenními účinky (US patent 5,399,667 z University of Washington), které působí vazbou na thrombospondinový receptor, nebo delší peptidy (přibližně 50 aminokyselin).

Jsou známy i modifikované faktory krevních destiček - (EP 0 589 719, Lilly), schopné inhibovat endotheliální proliferaci s IC₅₀ = 7 nM.

Oligosacharidové fragmenty s antiangiogenními účinky byly též popsány bohatě: bylo zjištěno, že změnami sekvence cukrů lze zvýšit interakční selektivitu.

Heparin může být navíc použit jako vehikulum pro látky, které samy o sobě jsou antiangiogenní, jakými jsou například některé steroidy, využívající affinitu heparinu k vaskulárním endotheliálním buňkám; viz například WO 93/18793 z University of Texas a Imperiál Cancer Research Technology, kde jsou hepariny nárokovány s látkami vazebně labilními na působení takových kyselin, jako je hydrazid ···· ·· ··«·

- 10 kyseliny adipové vázaný na kortisol. Antiangiogenní účinek konjugovaných molekul je větší než účinek nekonjugovaných molekul, a to i pokud jsou podávány souběžně.

V Biochim. Biophys. Acta, 1310, 86 - 96, 1996 je popsána vazba heparinů vázaných na steroidy (např. kortisol) s hydrazonovou skupinou na C-20, která vykazuje větší angiogenní účinky než obě konjugované sloučeniny.

EP 0 246 654 od Daiichi Sc. popisuje sulfatované polysacharidy s angiogenními účinky se studiemi fáze II. EP 0 394 971 od Pharmacia & Upjohn - Harvard Coll. popisuje hexasacharidy s fragmenty heparinů o malé sulfataci, které jsou schopné inhibovat růst endotheliálních buněk a angiogenezi stimulovanou FGF-1. EP 0 618 234 od Alfa Wasserman popisuje metodu přípravy semisyntetických glykosaminoglykanů s heparinovou nebo heparanovou strukturou nesoucí nukleofilní skupinu. WO 95/05182 od Glycomed popisuje různé sulfatované oligosacharidy s antikoagulačními, antiangiogenními a protizánětlivými účinky. US 5,808,021 od Glycomed popisuje metodu přípravy v podstatě nedepolymerizovaného 2-O, 3-0 desulfatovaného heparinů s procentem desulfatace kyseliny iduronové v poloze 2 (I, 2-0) a poloze 3 glukosaminové jednotky (A, 3-0) přibližně od 99 do přibližně 75 % původní hodnoty. Tento způsob předpokládá desulfataci vedenou v přítomnosti kationtu dvojmocného kovu, jehož příkladem je vápník nebo měď, po níž následuje lyofilisace získaného produktu. Desulfátované hepariny mají antiangiogenní ··· · ·♦ · • · • ··· • ·

- 11 účinky. EP O 251 134 od Yeda Res & Dev Co Ltd, et al., popisuje použití tak velké dávky heparinu nebo jeho derivátů, které jsou ještě pod hranicí koagulace, k prevenci odmítání aloimplantátu a k léčbě autoimunních onemocnění. Účinek heparinu je dán inhibicí heparanázy. WO 88/05301 z Univ. Australian Nat., popisuje antimetastatické a/nebo protizánětlivé přípravky obsahující sulfatovaný polysacharid, který je inhibitorem heparanázy. Je použit heparin, fucoidan, pentosan sulfát a dextran sulfát. WO 92/01003 z Univ. Texas System popisuje použití derivátu heparinu, který zabraňuje antikoagulačnímu působení, jako inhibitoru heparanázy. Tyto deriváty mají sulfamino nebo O-sulfátové skupiny, m. hm. 1000 až 15000 a každá terminální monomerní jednotka je monomerní, opakováním jednotky s terminálním atomem O vázaným na blokovací skupinu. WO 94/14851 a WO 96/06867 od Glycomed používá 2-0, 3-0 desulfátovaný mukózní heparin nebo jeho fragmenty, které jsou alespoň z 96,7 % desulfátované v poloze 2-0 a alespoň ze 75 % desulfátované v poloze 3-0, které jsou vhodné jako neantikoagulační heparanázové inhibitory. WO 95/09637 a WO 96/09828 od Glycomed popisují vysoce sulfatované maltooligosacharidové sloučeniny s vlastnostmi podobnými heparinu. WO 95/30424 od Glycomed používá 6-0-desulfátovaný heparin nebo jeho fragmenty majícími heparanázové inhibiční účinky. WO 96/33726 z Univ. Australian Nat., popisuje sulfátované oligosacharidy jako heparanová mimetika, mající heparanázové inhibiční účinky. WO 01/35967, od Knoll AG, uvádí metodu léčby srdeční nedostatečnosti a odpovídajících stavů podáváním % ·*·· •0 ····

- 12 heparanázových inhibitorů, mezi nimiž jsou zmiňovány heparin, který má částečně redukované skupiny COOH, nebo je alespoň částečně N-desulfátovaný a N-acylovaný, nebo je alespoň částečně Ν,Ο-desulfátovaný a N-resulfátovaný, neboje O-acetylovaný. Požadavkem zde popisovaného vynálezu je nalezení optimální glykosaminoglykanové struktury vytvářející antiangiogenní působení založené na mechanismu inhibice heparanázy a/nebo inhibice růstového faktoru FGF. Dalším požadavkem zde popisovaného vynálezu je připravení léčiva s antiangiogenními účinky, které jsou nezbytné ke zbavení se typických vedlejších účinků heparinových derivátů, jakými jsou například anikoagulační účinky.

WO 01/55221 podaný jménem přihlašovatele popisuje glykosaminoglykany, a to zvláště desulfátovaný heparin, s desulfatačním stupněm ne vyšším než 60 % z celkového počtu uranových jednotek. Tyto deriváty jsou vybaveny antiangiogenními účinky a jsou zbaveny antikoagulačních účinků. Jmenované sloučeniny vykazují antiangiogenní účinky, které jsou založeny na inhibici FGF. Žádné účinky inhibice heparanázy nebyly předvídány.

Zcela obecně: WO 01/55221 uvádí také upravený heparin obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a případné následné celkové nebo částečné acetylaci.

Obecně uvedené jmenované odkazy nepopisují jednoznačně Ndesulfataci a případné následné kroky celkové nebo částečné acetylace.

- 13 Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že vystavení takového glykosaminoglykanu, jakým je například glykosaminoglykan podobný heparinu, heparin nebo modifikovaný heparin, obsahujícího glukosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a případně následně celkově nebo částečně N-acylované (nejlépe N-acetylované), řízené 2-0desulfataci iduronových jednotek, a to až do stupně desulfatace ne většího než 60 % z celkového počtu iduronových jednotek, udrží se angiogenní vlastnosti zprostředkované růstovým faktorem.

2-0-desulfátované hepariny uvedené výše ve WO 01/55221 jsou překvapivě také inhibitory heparanů. Bylo zjištěno, že tato vlastnost je u glykolového štěpení nesulfátovaných zbytků uronových kyselin dalším zlepšením. Bylo také zjištěno, že glykolové štěpení, tedy chemická úprava vedoucí k dramatické ztrátě antikoagulačního účinku (Času, B., et al., Arzneim. Forsch. (Drug Res.), 36, 637 642, 1986), dramaticky zlepší heparanázové inhibiční vlastnosti částečně N-acetylovaných heparinů získaných 50 % N-desulfatací, po které následuje N-acetylace výsledných volných aminoskupin a 2-O-desulfátovaných sloučenin.

Desulfatace prováděná za podmínek popisovaných v předloženém vynálezu vytváří také iduronové jednotky s oxyranovým kruhem v poloze 2 a 3. Otevřením oxyranového kruhu za podmínek

- 14 popisovaných v předloženém vynálezu vzniknou L-iduronové nebo L-galakturonové jednotky.

Předmětem zde popisovaného vynálezu je použití jmenovaných glykosaminoglykanových derivátů k přípravě léčiva působícího inhibici heparanázy a/nebo růstového faktoru FGF.

Podle předloženého vynálezu je glykosaminoglykanovým derivátem přednostně glykosaminoglykan podobný heparinů. Podle předloženého vynálezu je glykosaminoglykanovým derivátem modifikovaný heparin obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a případně následně celkově nebo částečně acetylovaný.

U jednoho z řešení zde popisovaný vynález uvádí sloučeninu obecného vzorce (I)

u

- 15 kde kruh U může mít následující významy:

X a X', které mohou být stejné nebo různé, jsou aldehydové skupiny, nebo skupina -CH₂-D, kde D je hydroxyl nebo aminokyselina, peptid, nebo zbytek cukru nebo oligosacharidu;

Ra Ř, které mohou být stejné nebo různé, jsou SO₃, C_rC₈ acylový zbytek, případně nesoucí alespoň další karboxylovou skupinu; nejlépe to jsou acylové zbytky acetyl, hexanoyl, sukcinyl a pivaloyl;

n a m, které mohou být stejné nebo různé, se může měnit od 1 do 40; součet n + m se pohybuje v rozmezí od 6 do 40; poměr m : n se pohybuje od 10 : 2 do 1 : 1;

Symbol M označuje, že jednotky označené man jsou statisticky rozdělené podél polysacharidového řetězce a nejsou nezbytně na sebe vázány v tom pořadí.

Příklady C_rC₈ acylových zbytků, případně nesoucích alespoň další karboxylovou skupinu, jsou acetyl, propionyl, butyryl, pentanoyl,

• ··*

- 16 hexanoyl, heptanoyl a všechny jejich možné isomery, oxalyl, malonyl, sukcinyl, pivaloyl, glutaroyl; přednost se dává acetylovému, hexanoylovému a pivaloylovému zbytku.

Pokud R a jsou N-acylovými skupinami, dává se přednost tomu, aby bylo jejich množství nejlépe od 40 do 60 % ze součtu R + Ri. Přednost se dává tomu, aby bylo m větší než n, nebo rovné n. Dává se přednost tomu, aby n bylo od 40 do 60 % z celkového součtu m + n.

Sloučeniny obecného vzorce (I) uváděné výše, kde R a R-ι je nebo C₃-C₈ acylový zbytek jsou nové.

Sloučeniny, které jsou předmětem vynálezu zde popisovaného, jsou charakterizovány vysokou mohutností inhibice heparanázy se zajímavými antiangiogenními vlastnostmi, a jsou proto vhodné jako účinné složky při přípravě léčiv k léčbě patologických stavů prospěšných pro inhibici heparanázy, patologických stavů na základě abnormální angiogeneze a zvláště k léčbě metastáz. Sloučeniny podle předloženého vynálezu inhibují také FGF.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu vykazují výhodně snížené, pokud ne zcela chybějící antikoagulační vlastnosti, a tak se předchází vedlejším účinkům typickým pro hepariny. Další výhodou těchto sloučenin podle předloženého vynálezu mimo tu skutečnost, že mohou být charakterizovány instrumentálními analytickými

- 17 technikami, jakými jsou například NMR spektroskopie, což umožňuje kontrolu postupu, která je z průmyslového hlediska zcela nutná.

I v případě modifikovaných heparinů má molekulová hmotnost (m.hm.) velmi důležitou funkci při výrobě inhibitorů angiogeneze. Je dobře známo, že zmenšení molekulové hmotnosti (m. hm.) až k hodnotám odpovídajícím pentasacharidovým jednotkám nevede ke ztrátě antiangioogenního účinku. Na druhé straně však bylo stanoveno, že nad určitou délku heparinového řetězce, jsou lepšími inhibitory při srovnání s inhibicí aktivace FGF, než kratší řetězce. Optimální délka řetězce pro inhibici heparanázy závisí na struktuře inhibitoru (charakter skeletu cukru, vazby v určité poloze, charakter sulfatace) a tu lze upravit pro každý nový typ potenciálního inhibitoru.

Podrobný popis vynálezu

Sloučeniny podle předloženého vynálezu obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a případně následně celkově nebo částečně acetylované jsou zde popsány a nárokovány jako nové sloučeniny.

Desulfatačním stupněm je zde míněno procentuální množství nesulfátovaných iduronových kyselin v porovnání s celkovým množstvím iduronových kyselin původně přítomných ve výchozím heparinů. Jedním výchozím rozsahem desulfatačního stupně, kterému se dává přednost, je hodnota přibližně od 40 do přibližně

%.

• · • · · • ···

Mezi sloučeninami obecného vzorce (I) je první sloučeninou, které se dává přednost částečně 2-O-desulfátovaný heparin o molekulové hmotnosti (m. hm.) 11200, polydisperzním indexu D rovným 1,3, desulfatačním stupni 1,99 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO), množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 50 %. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 1514) je i součástí obecného vzorce (I), kde je vedle dalších odpovídajících definicí poměr m : n = 1 : 1, a jednotky označené jako man jsou rozprostřeny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním.

Druhou sloučeninou, které se dává přednost je částečně 2-Odesulfátovaný nízkomolekulární heparin o molekulové hmotnosti (m. hm.) 3050, polydisperzním indexu 2,2, desulfatačním stupni 1,99 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO), množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 50 %. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná jako ST 2010) je součástí obecného vzorce (I), kde je vedle dalších odpovídajících definicí poměr m : n = 1 : 1 a jednotky označené jako man jsou rozprostřeny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním. Tato sloučenina se získá depolymerací sloučeniny ST 1514 kyselinou dusitou, po níž následuje redukce aldehydových skupin tak, že většina jejích zbytků redukujících konců jsou zbytky anhydromannosy;

CH-OH ch₂or

• · · ·

• · • · · • ···

Třetí sloučeninou, které se dává přednost je částečně 2-0desulfátovaný nízkomolekulární heparin o molekulové hmotnosti Mn = 5800, Mw = 7520, polydisperzním indexu 1,294, množstvím modifikovaných uronových kyselin v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 50 %. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná jako ST 2184) je i součástí obecného vzorce (I), kde je vedle dalších odpovídajících definicí poměr m : n = 1 : 1 a jednotky označené jako man jsou rozprostřeny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním. Tato sloučenina se získá depolymerací sloučeniny ST 1514 kyselinou dusitou, po níž následuje redukce aldehydových skupin tak, že většina jejích zbytků redukujících konců jsou zbytky anhydromannosy.

Čtvrtou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný heparin o molekulové hmotnosti (m. hm.) 11200, polydisperzním indexu rovným 1,3, desulfatačním stupni 1,6 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃ : COO), množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 1518) je i součástí obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 50 % součtu R a Ř náleží Nacetylu.

Pátou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný nízkomolekulární heparin o molekulové hmotnosti Mn = 4780, Mw = 10000, polydisperzním indexu rovným 2,092, množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %.

• · ·

- 20 Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 2168) je i součástí obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 50 % součtu R a Ri náleží N-acetylu.

Šestou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný heparin o molekulové hmotnosti Mn = 10890, Mw = 22370, polydisperzním indexu rovným 2,054. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 2037) je i součástí v obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 27 % součtu R a R! náleží N-acetylu.

Sedmou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný heparin o molekulové hmotnosti Mn = 10210, Mw = 21270, polydisperzním indexu rovným 2,083. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 2038) je i součástí obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 39 % součtu R a Rt náleží N-acetylu.

Osmou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný heparin o molekulové hmotnosti Mn = 11070, Mw = 22000, polydisperzním indexu rovným 1,987. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 2041) je i součástí obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 64 % součtu R a Ri náleží N-acetylu.

Devátou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný heparin, u kterého je množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %. Jmenovaná sloučenina je i • · · · •« ·· · · · ·

9 9 9 · • 9 9 9 9· 9

9 9 9 9 9 • 9 ··

9 99 9 ·· • · · • ···

- 21 součásté obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 27 % součtu R a R-ι náleží N-acetylu (ST 2185).

Desátou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný heparin, u kterého je množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 30 %. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 2186) je i součástí obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 39 % součtu R a Ri náleží Nacetylu.

Jedenáctou sloučeninou, které se dává přednost je částečně Ndesulfátovaný a N-reacetylovaný heparin, u kterého je množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 30 %. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 2187) je i součástí obecného vzorce (I), kde vedle dalších odpovídajících definicí 64 % součtu R a R-i náleží Nacetylu.

Dvanáctou sloučeninou, které se dává přednost je částečně 2-0desulfátovaný heparin o molekulové hmotnosti (m. hm.) 12900 D, polydisperzním indexu rovným 1,5, desulfatačním stupni 1,9 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO), množstvím modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových: 5 % epoxidových skupin, 29 % oxidovaných a redukovaných uranových zbytků. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 1513) je i součástí obecného vzorce (I), kde je vedle dalších odpovídajících definicí poměr m : n = 1 : 1 a ···*

9* 9 ·· 9

9 9 9 9

9999 9 999

999 9999

9 9 9 9

999 99 9

- 22 jednotky označené jako man jsou rozprostřeny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním.

Třináctou sloučeninou, které se dává přednost je částečně 2-0desulfátovaný heparin o molekulové hmotnosti (m. hm.) 9200 D, polydisperzním indexu D rovným 1,5, množstvím modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových: 11 % epoxidových skupin, 27,5 % oxidovaných a redukovaných uranových zbytků. Jmenovaná sloučenina (zde označovaná též jako ST 1515) je i součástí obecného vzorce (I), kde je vedle dalších odpovídajících definicí poměr m : n = 1 : 1 a jednotky označené jako man jsou rozprostřeny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním.

Čtrnáctou sloučeninou, které se dává přednost je částečně 2-0desulfátovaný heparin o molekulové hmotnosti (m. hm.) 11000 D, polydisperzním indexu D rovným 1,5, desulfatačním stupni 1,93 (vyjádřeno jako poměr SO₃' : COO'), množstvím modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových: 5 % epoxidových skupin, 29 % oxidovaných a redukovaných uranových zbytků.

Příprava sloučenin ST 1514, ST 1513, ST 1516 a ST 1515 je podrobně uvedena ve WO 01/55221.

Částečně 2-O-desulfátované deriváty podle zde opisovaného vynálezu se připravují tak, jak je uvedeno ve výše zmíněném WO 01/55221.

Co se týká N-desulfátovaných a případně N-acetylovaných glykosaminoglykanů podle předloženého vynálezu, ty mohou být

- 23 0000 • 0 · » « · 0 0 0 000 • 0 0 0000 0 000 0 0 000 0000 000 • 0 «0 0000

0 0 0 00000 00 * připravovány postupem umožňujícím též přípravu částečně 2-0desulfátovaných heparinů, který sestává z:

a) N-desulfatace sulfaminových zbytků ve směsi DMSO a H₂0 v poměru 95 : 5 (obj./obj.) solvolytickou hydrolýzou za teploty okolního prostředí po dobu sahající od 0,5 do 8 hodin, a lépe po dobu přibližně 2 hodin, aby se celkově nebo částečně eliminovaly sulfátové skupiny glukosaminových zbytků v poloze 2;

b) N-acylace jmenovaných zcela nebo částečně desulfátovaných skupin glukosaminových zbytků v poloze 2 působením acylačních činidel, jako jsou například acyl andydridy, ve vodném alkalickém roztoku (pH 8-9), k získání glukosaminových zbytků s celkově nebo částečně acylovanými skupinami v poloze 2; potom se získané sloučeniny podrobí postupu uvedenému dále v reakčních stupních

c) , d) nebo e) a f) až g), nebo alternativně přímo dále uvedenému stupni f);

c) působení báze při teplotě sahající od okolní teploty přibližně až do 100 °C, lépe však od 50 do 70 °C, a vůbec nejlépe přibližně při 65 °C, což vede ke kontrolovanému odstranění požadovaného množství sulfátových skupin iduronové kyseliny v poloze 2 a k tvorbě epoxidových skupin; a pokud je to požadováno,

d) otevření jmenovaného epoxidového kruhu přibližně při pH 7 za teplot sahajících přibližně od 50 °C přibližně do 100 °C, lépe však přibližně při 70 °C, k získání zbytků kyseliny galakturonové; nebo případně

- 24 Φ »«·· ·Φ ··*· φφ « ΦΦΦ • φ · · ···

Φ ΦΦΦ · • Φ ΦΦΦ

ΦΦΦ Φ φφ ΦΦΦ

ΦΦ ► • 4 Φ

Φ ΦΦΦ Φ 4 444

4 4

ΦΦ Φ

e) otevření jmenovaného epoxidového kruhu při teplotě sahající přibližně od 0 °C do 30 °C, lépe však přibližně při 25 °C k získání zbytků kyseliny iduronové; a pokud je požadováno

f) oxidace diolů perjodátem sodným, které vede k otevření glykosidového kruhu a vytvoření dvou aldehydových skupin na každý modifikovaný zbytek; a pokud je požadováno,

g) redukce jmenovaných aldehydových skupin na primární alkohol, a pokud je požadováno, tedy z transformace D skupiny na jinou skupinu než je hydroxyl tak, jak to pojímá různý význam uvedený v obecném vzorci (I);

h) případné kyselé hydrolýzy sloučenin získaných ve stupni g) k získání oligosacharidů odpovídajících pravidelným sekvencím, nejlépe deaminací kyselinou dusitou. Tyto reakce, které se obvykle používají k získání nízkomolekulárního heparinu, a to štěpením vazby mezi zbytky glukosamin N-sulfátu a následující kyselinou uronovou, vedou k nízkomolekulární sloučenině mající na neredukujícím konci zbytek sestávající z kyseliny uronové a na redukujícím konci zbytek anhydromannosy tak, aby tato mohla být později dále modifikována redukcí borohydridem na anhydromannitol. Získané nízkomolekulární sloučeniny obsahují alespoň jeden zbytek kyseliny iduronové rozštěpeného na glykolu; nebo alternativně

i) vystavení produktů získaných v reakčním stupni g) částečné enzymatické hydrolýze enzymem vybíraným ze skupiny sestávající z lyázy, heparinázy, heparitinázy, nebo rovnocenné, k získání ologosacharidů, přednostně tetra- nebo oktosacharidů,

s nered ukuj ící m terminálním zbytkem sestávajícím z nenasyené kyseliny iduronové, redukujícího zbytku sestávajícího z Nsulfoglukosaminu a obsahujícího alespoň jeden zbytek otevřené kyseliny iduronové;

i) případně se sloučenina získaná v reakčnim stupni c) nebo produkt získaný v reakčnim stupni d) podrobí částečné enzymové hydrolýze; a pokud se to požaduje,

j) podrobení produktů získaných v jednom z reakčních stupňů b), c) a f) částečné 6-O-desulfataci; nebo alternativně

k) podrobení výchozího částečné nebo úplně 6-desulfatovaného heparinu na reakčnim stupni b), c) a f).

2-O-desulfátované deriváty podle předloženého vynálezu se získávají postupem popsaným výše za vynechání reakčního stupně

a) a b).

Postup podle předloženého vynálezu je též znázorněn na schématech uvedených dále:

Slarttag Heparin

De-M-SuM.

1. Py

2. DMSQ/MeOH S%

Hydradsls partiai Epotdda H. (ST1509<ST1S25)

NaJO^ljO partlal 2-O-Desu«.H. ÍST1527-ST152B)

N-acel^H.

ACjO

NaHCOj, HjO

LMW-N-AeyFRO-Heparin (ST216B) (Ok)

HNO,

LMAř-RO-Hoparin (ST2Q10) • · • · · ·

- 26 RedOx

Starting Heparin [Spliíting on non-sulphated iduronic acids originally present in the Starting Heparin]

RO-Heparin

1) Py

2) DMSO/MeOH . NaOH _ Hydrolysis „ _ . ... RedOx '-»- Epox ~2-O-desulphate-«........ pncrease of 2-O-desulphation degree]........

N-Desulfated-Heparin partially 2-O-des-RO-H.

Hydrolysis witb enzymes -orwith HNOj LMW-2-O-des-RO-Heparin

1) Ac₂O

2) Na₂CO₃/H₂O

2Ě2ÍU Epox 2-O-desulphate

........ pncrease of 2-O-desulphation degree]........

RedOx

N-acyl-Heparin

N-Acyl-RO-Heparin

RedOx

ISpliiting on non-sulphated uronic acids originally present in the Starting Heparin]

Hydrolysis with enzymes or with HNOj

LMW-N-Acyl-RO-Heparin

Podle zde popisovaného vynálezu jsou sloučeniny, kterým se dává přednost tyto:

částečně 2-O-desulfátovaný heparin, který má molekulovou hmotnost (m. hm.) 11200, polydisperzní index D rovný 1,3, stupeň desulfatace 1,99 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO'), procentuální množství modifikované kyseliny uronové vztažené na celkové množství kyseliny uronové přibližně 50 % (zde nazývaný ST 1514), který lze získat postupem uvedeným výše, kde se reakční stupeň a) a b) vynechá a reakční stupeň c) se provádí po dobu 45 minut při 60 °C, a reakční stupeň d) při 70 °C při pH 7;

částečně 2-O-desulfátovaný nízkomolekulární heparin, mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 3050, polydisperzní index D 2,2, stupeň desulfatace 1,99 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃ :

• 0

0 0 0 · · • ···· 0 · · · • 0 0 9 0 00000

0 0 0 0 0 •000« 00 ·

- 27 COO'), množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 50 % (zde také nazývaný ST 2010), který lze získat podle postupu uvedeného výše, přičemž reakční stupně a) a b) se vynechají, stupeň c) se provádí po dobu 45 minut při 60 °C a stupeň d) při 70 °C při pH 7, a je následovaný stupněm f), g) a h) prováděným deaminací;

částečně 2-O-desulfátovaný nízkomolekulární heparin mající molekulovou hmotnost Mn = 5800, Mw = 7520, polydisperzní index D 1,294, množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 50 % (zde také nazývaný ST 2184), který lze získat podle postupu uvedeného výše, přičemž reakční stupně a) a b) se vynechají, stupeň c) se provádí po dobu 45 minut při 60 °C a stupeň d) při 70 °C při pH 7, a je následovaný stupněm f), g) a h) prováděným deaminací;

N-acetyl heparin (50 %) mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 11200, polydisperzní index D 1,3, stupeň desulfatace 1,6 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' COO'), množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 30 % (zde také nazývaný ST 1518), který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d) a e) se vynechají, stupeň f) se provádí při 4 °C přes noc, stupeň g) po dobu 3 hodin při laboratorní teplotě;

• · • · · • · · ·

- 28 nízkomolekulární N-acetyl heparin (50 %) mající molekulovou hmotnost Mw = 4780, Mn = 10000, polydisperzní index D 2,092, množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 % (zde také nazývaný ST 2168který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d) a e) se vynechají, stupeň f) se provádí při 4 °C přes noc, stupeň g) po dobu 3 hodin při laboratorní teplotě, stupeň h) se provádí deaminací kyselinou dusitou při 4 °C po dobu 17 minut, potom následuje redukce aldehydových skupin borohydridem při laboratorní teplotě po dobu 3 hodin;

N-acetyl heparin (27 %) mající molekulovou hmotnost Mn = 10890, Mw = 22370, polydisperzní index D 2,054, (zde také nazývaný ST 2037), který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (39 %) mající molekulovou hmotnost Mn = 10210, Mw = 21270, polydisperzní index D 2,083, (zde také nazývaný ST 2038), který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (64 %) mající molekulovou hmotnost Mn = 11070, Mw = 22000, polydisperzní index D 1,987, (zde také

- 29 nazývaný ST 2041);který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (27 %) mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 30 % (zde také nazývaný ST 2185), který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (39 %) mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 % (zde také nazývaný ST 2186), který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (64 %) mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 % (zde také nazývaný ST 2187), který lze získat postupem popsaným výše, přičemž se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají,.

Příprava sloučenin ST 1514, ST 1513, ST 1516 a ST 1515 je podrobně popsána ve WO 01/55221.

• · · · • » • ···

- 30 Molekulová hmotnost je stanovena HPLC-GPC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie - gelová chromatografie). Stupeň desulfatace je stanoven konduktometricky, a množství modifikovaných kyselin uronových ¹³C-NMR.

M. hm. je molekulová hmotnost a D je polydisperzní index vyjádřený jako m. hm./Mn.

Podle zde popisovaného vynálezu jsou výchozími produkty glykosaminoglykany různého původu, nejlépe hepariny přirozeného původu. Také je možné používat chemicky modifikované hepariny s množstvím N,6 disulfátu sahajícím od 0 do 100 %. Při zahájení s produkty o různém obsahu 6-0 sulfonovaného glukosaminu, je možno upravovat délku pravidelných sekvencí mezi otevřenou kyselinou iduronovou a dalšími. Glykosaminoglykany podle vynálezu, které umožňují otevření glykosidového kruhu, se obvykle odborníky z oboru nazývají RO deriváty, což znamená, že glykosidový kruh se otevírá oxidativním působením, po němž následuje redukce (redukce - oxidace - RO). Toto otevření glykosidového kruhu se také běžně nazývá „glykolové štěpení“, protože tvorba dvou primárních hydroxylů obnáší otevření kruhu. Sloučeniny zde popisované budou též nazývány deriváty „RO“ nebo deriváty „glykolového štěpení“.

U dalšího řešení zde popisovaného vynálezu se též s aldehydy a hydroxidy odvozenými od výše popisované reakce otevření kruhu („glykolové štěpení“) vedou k následné funkcionalizaci. Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou tedy nést stejné nebo různé skupiny tak,

- 31 jak jsou výše definovány pro X a X', na primárních hydroxyderivátech pocházejících z glykolového štěpení, například oligosacharidové nebo peptidové skupiny, velikosti od jednoduchého cukru nebo aminokyseliny kviče než jedné jednotkové délce, nejlépe ke 2 nebo 3 jednotkám.

Sloučeniny obecného vzorce (I), kde X a X' jsou -CH₂OH, mohou být též použity jako vehikuly pro další typy léčiv pomocí vhodné vazby s heparinovou částí, která je za normálních podmínek výroby a skladování složeného léčiva schopná zajistit stabilitu, a která umožňuje transport léčiva v těle, a to zvláště do okolí cílového orgánu. Příklady léčiv, která takto mohou být transportována, jsou steroidní a nesteroidní protizánětlivá léčiva, kortikosteroidy, a další léčiva s antimetastatickými účinky, která mohou výhodně zlepšovat antimetastatický účinek jakožto důsledek součtu jednotlivých zásadních účinků sloučenin podle vynálezu a účinků antimetastatických činidel na ně vázaných s odpovídajícími výhodami větší cílové selektivity a nižší systémové toxicity. Příklady takovýchto léčiv jsou metaloproteinázové inhibitory. Další léčiva, která mohou být vhodně transportována jsou taková léčiva, která působí na endotheliální úrovni. Jako vehikuly pro léčiva lze také používat sloučeniny obecného vzorce (I), kde X a X'jsou jiné než hydroxyl nebo aldehyd v případě, ve kterých skupiny X a X' působí jako „vložky“ mezi transportovanými molekulami, což je například glykosaminglykan podle předloženého vynálezu a molekula působící

- 32 • ··· · ·· ···· ·· · • · · · · · ··· • · · · · · · · · · · • « · · · · · · · · · · • · · · ···· ·«« ( ····· · · · jako vehikulum v těch případech, kdy to lze doporučit z důvodů farmakokinetických a farmakodynamických.

Sloučeniny podle vynálezu odvozené od heparinu, se připravují z výchozího heparinu například N-desulfatací, po které následuje Nacylace za využití technik známých odborníkům z oboru. Tak například N-desulfatace se provádí solvolýzou v roztoku DMSO a H₂O v poměru 95 : 5 (obj./obj.) za laboratorní teploty po dobu sahající od 0,5 do 8 hodin, po ní následuje N-acylace v alkalickém prostředí, například acylanhydridy (tj. acetyl-, hexanoyl-, sukcinyl-, pivaloylanhydrid).

Následující 2-O-desulfatace se provádí v přítomnosti alkalie, jakou je například hydroxid sodný, a to za teplot sahajících od teploty okolí do teploty 100 °C, přednostně však od 50 do 70 °C, například při 60 °C, a to po dostatečně dlouhou dobu, k získání požadovaného 2-Odesulfátového produktu. 2-O-desulfatace se reguluje působením na parametry postupu, jakými jsou například koncentrace reakčních látek, teplota a reakční doba. Jedním z příkladů, kterému se dává přednost spočívá v udržování stálé koncentrace substrátu (glykosaminglykanu) na 80 mg.ml'¹ a koncentrace NaOH na 1M, stálé teploty 60 °C a řízení desulfatace reakční dobou od 15 do 60 minut. Odborníci znalí oboru mohou měnit podmínky, například zvýšením reakční teploty a zkrácením reakční doby na základě v praxi běžně pokusně používaného systému pokus-omyl a na základě svých obecných znalostí věci.

• ·· ·· ·· ···» · · · • · · · · · · · · • · · · · · · 9 · · · φ 9 · · · · · · ···· • · ·· · · · 9 ·«« · ··«·· · · ·

- 33 Působením alkalických činidel vznikají meziprodukty charakterizované přítomností epoxidového kruhu na desulfátované jednotce. Je zcela překvapující, že se prokázalo, že tyto meziprodukty mají schopnost inhibovat heparanázu podobnou té, jakou mají sloučeniny obecného vzorce (I).

Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu jsou proto deriváty částečně 2-O-desulfátovaného heparinu, a tedy heparinu se zmenšeným nábojem, zvláště heparinu, který nebyl 2-0desulfátovaný více než ze 60 %, a charakterizovaný epoxidovým kruhem v desulfátované poloze. Jmenované sloučeniny charakterizované epoxidovým kruhem náležejí kcelé řadě látek, které pokrývají předložený vynález.

Po vytvoření epoxidového kruhu se tento otevře, a to opět uchýlením se ke známým technikám. Množství vytvořeného epoxidu se vypočítá z poměru mezi plochami signálů ¹³C-NMR přibližně při 55 ppm, charakterizujících 2. a 3. uhlík kruhu uronové kyseliny obsahující epoxid a celkovým počtem anomerních signálů (zbytky Ci glukosaminu a kyseliny uronové). Pokud se otevření provádí za tepla, získá se zbytek kyseliny galakturonové, zatímco pokud se otevření epoxidového kruhu provádí za studená, získá se zbytek kyseliny iduronové. Příklady sloučenin obsahujících epoxidový kruh, kterým se dává přednost, jsou sloučeniny, které lze získat postupy popisovanými výše a mající obsah epoxidované kyseliny uronové 14 % (dále ST 1509), 24 % (dále ST 1525) a 30 % (dále ST 1526).

- 34 ·· ·

9 9 ·· ···· · » · • « · · 999 9 9 9 9

9 999 9 9 9 · 999

9 9 9 9 9 9 9 • ·· · · · · 9 · · · ·

Částečně desulfátovaný heparin je potom podroben „glykolovému štěpení“ (zkráceně RO) postupem popsaným výše a Smithově degradaci (zkráceně SD).

Sloučeniny obecného vzorce (I) lze také získat bez přechodu přes epoxidový meziprodukt, což jest tak řečeno, přímým glykolovým štěpením a následnou Smithovou degradací.

Takto popsaný postup vede ke sloučeninám obecného vzorce (I), u kterých jsou skupiny X a X'obě -CH₂OH.

Pro jiné X a X' než -CH₂OH jsou odborníkům z oboru dostupné metody transformace hydroxylové skupiny jinými skupinami představované výše uváděnými definicemi (viz například schéma na stránce 26, sloučeniny ST 1828, ST 1829, ST 1917 a ST1919). Tak například konjugace s aminokyselinami nebo peptidy může být provedena reduktivní aminací (Hoffmann, J., et al., Carbohydrate Research, 117, 328 - 331, 1983) aldehydového meziproduktu získaného z reakce glykolového štěpení, které může být provedeno ve vodném rozpouštědle a je kompatibilní s udržením heparinové struktury.

Pokud je to požadováno, a to je také dalším předmětem zde popisovaného vynálezu, mohou být sloučeniny obecného vzorce (I) dále degradovány kyselými činidly za vhodných podmínek pH, např.

- 35 při pH 4, což vede ke směsi oligosacharidů, které si udržují antiangiogenní vlastnosti.

Předmětem předloženého vynálezu jsou stejně tak sloučeniny získané některým z reakčních stupňů g), h), i) a j) podle postupu popsaného výše.

Předmětem zde popisovaného vynálezu jsou farmaceutické přípravky obsahující jako účinnou složku alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce (I), a to samotnou nebo v kombinaci s jednou nebo více sloučeninami obecného vzorce (I), nebo jmenovanou sloučeninou nebo sloučeninami v kombinaci s N-acyldesulfátovanými hepáriny popsanými výše, např. epoxidovanými meziprodukty; posledně jmenované lze také použít samotné jako účinné složky farmaceutických přípravků. Účinná složka podle předloženého vynálezu musí mít ve směsi s vhodným vehikuly a/nebo excipienty obvykle ve farmaceutické technologii používanými, jako na příklad s takovými, které jsou popsány v posledním vydání „Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook“. Přípravky podle předloženého vynálezu musejí obsahovat terapeuticky účinné množství účinné složky. Dávky musejí být stanoveny odborníkem z oboru, např. klinickým nebo praktickým lékařem podle typu onemocnění, které se má léčit a podle pacientova stavu, nebo podle současně podávaných dalších účinných složek. Jako příklad mohou sloužit dávky sahající od 0,1 do 100 mg.kg'¹.

- 36 • ···· ·· 4444 »· · • 4 4 444 444 • · 44 444 4 444

4 444 4 4 4 4 4··

4 4 4*44 • 44 · 44444 44 ·

Příklady farmaceutických přípravků jsou takové přípravky, které mohou být podávány orálně nebo parenterálně, intravenozně, intramuskulárně, subkutánně, transdermálně nebo ve formě nosních nebo ústních sprejů. Farmaceutickými přípravky vhodnými pro tento účel jsou tablety, tvrdé nebo měkké tobolky, prášky, roztoky, suspenze, sirupy a tuhé formy k přípravě kapalných léčiv. Přípravky pro parenterální podávání jsou například všechny intramuskulární, intravenozní a subkutánní injekční formy, rovněž tak jako roztoky, suspenze a emulze. Musejí být též zmíněny liposomální přípravky. Mezi tablety patří také formy s kontrolovaným uvolňováním účinné složky, a to ať už formy pro orální podávání, tablety potahované vhodnou vrstvou, mikrokapslované prášky, komplexy s cyklodextriny, depotní formy, například subkutánní formy jakými jsou například depotní injekce nebo implantáty.

Sloučeniny podle zde předloženého vynálezu mají antiheparanázové a antiangiogenní účinky. To je činí vhodnými k přípravě léčiv vhodných k léčbě jedinců, obecně savců a částečně lidí, postižených změnou angiogeneze nebo jedinců, kteří potřebují léčbu inhibující heparanoidní účinky.

Příklady onemocnění léčených léčivy, které jsou předmětem předloženého vynálezu jsou primární nádory, metastázy, diabetická retinopatie, psoriaza, retrolentikulární fibroplasie, restenózy po angioplastice a po koronárních bypasech, zánět, arthritida,

- 37 • 444· ·· 4444 ·· · · · · • 4 4 · · 4 · • 4 4 · · 4 • · 4 · · ··· · ·· 444 ·· 4

4 4 • 4 4 4 • *444 · 4

4 autoimunní onemocnění, odmítání implantátů, kardiovaskulární onemocnění, fibroproliferativní onemocnění, onemocnění vyvolaná abnormální agregací krevních destiček, onemocnění vyvolaná proliferací hladkého svalstva, Goodpasturův syndrom, akutní glomerulonefritida, neonatální pulmonární hypertenze, asthma, kondestivní srdeční selhání, pulmonární hypertenze u dospělých, renální vaskulární hypertenze, proliferativní retinopatie, pokusně vyvolaná autoimunní encefalomyelitida, roztroušená skleróza, diabetes závislá na inzulínu, zánětlivé onemocnění střev, ulcerativní kolitis, Crohnova nemoc.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu vydatně zabraňují vedlejším účinkům, typickým pro heparin. Sloučeniny podle předloženého vynálezu vydatně zabraňují antikoagulačnímu účinku. Vydatným zabráněním takovým účinkům musejí z pohledu klinického využití chápat odborníci z oboru buď žádný, nebo jen zanedbatelný účinek.

Účinek inhibující heparanázu byl stanoven metodou stanovenou skupinou Vlodavského (Bitan, M., et al., 1995). Metoda je založena na hodnocení nadbytečné fragmentace proteoglykanů heparan sulfátu řetězce heparan sulfátu (HSPG) způsobeného heparanázou. Jako zdroj HSPG se obvykle používá sulfátem značená extracelulární matrice (ECM). Sulfátem značená ECM se inkubuje s rekombinantní heparanázou při pH 6,2 v nepřítomnosti a v přítomnosti zvyšujících se koncentrací zkoušené sloučeniny.

- 38 9·9 • · • · · • ···

Κ hodnocení nastalé degradace proteoglykanu se inkubační medium odebírá a pro gelovou filtraci nanáší na kolonu se Sepharosou 6B (0,9 x 30 cm). Frakce (0,2 ml) se eluují PBS při průtoku 5 ml.h'¹ a měří se radioaktivita. Vyloučený objem (V_o) se obarví dextranovou modří a celkový nanesený objem (V_t) fenolčervení. Degradované fragmenty postranních řetězců HS se eluují ze Sepharosy 6B při 0,5 < K_av < 0,8 (peak II). Za uváděných pokusných podmínek dobré heparanázové inhibitory inhibují fragmentaci HS při koncentracích 10 pg.ml'¹ nebo nižších.

Výsledky jsou v níže uvedené tabulce 1.

Tabulka 1

Inhibice heparanázy v dávkách sahajících od 25 pg.ml'¹ do 5 pg.ml'¹

		inhbice
	dávka	25 pg.ml'1	10 pg.ml'1	5 pg.ml·1
	heparin	100%	nestanoveno	>100%
ST 1516	heparin 40 % RO	100%	nestanoveno	>85 %
ST1514	heparin ~50 % RO	100%	100%	>85 %
ST1515	heparin 27,5 % RO	100%	100%	100%
ST1518	50 % NAc heparin 30 % RO	100%	100%	>85 %

9999 ·· ···9

9

9 9 9 9 9 9 9

9 99999 9999

9 999 9999 999

9 9 9 9 9 9 9

99 9 99 99 9 99 ·

- 39 Stojí za zmínku, že ST 1518 má velký inhibiční účinek i při koncentraci 1 pg.ml'¹.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu a zvláště pak nové sloučeniny, byly zkoušeny na své účinky vzhledem k růstovým faktorům FGF podle stejného pokusného modelu, který byl popsán ve WO 01/55221, a vykazovaly účinky srovnatelné s účinky uvedenými v citovaném odkazu.

Následující příklady ještě dále vynález objasní.

Příklady provedení

Příklad 1

ST 1518

K vodnému roztoku 1 g heparinu předem eluovanému z kolony sAmberlitem IR 120, byl přidán nadbytek pyridinu. Roztok byl za sníženého tlaku odpařen; výsledná pyridinová sůl heparinu byla rozpuštěna v 50 ml směsi DMSO/voda v poměru 95 : 5 a mícháno při 20 °C po dobu 2 hodin k získání desulfatačního stupně okolo 50 %.

Potom byl roztok zředěn stejně velkým objemem nasyceného roztoku NaHCO₃. Tento roztok byl na membráně dialyzován proti destilované vodě (odebráno 1000 až 2000 D). Výsledný produkt byl izolován odpařením za sníženého tlaku.

- 40 N-acetylovaný heparin byl připraven N-acetylací 50 % Ndesulfátovaného heparinu. 1 g heparinu bylo rozpuštěno v 10 ml destilované vody; roztok byl ochlazen na 4 °C a nasycen hydrogenuhličitanem sodným; k tomuto roztoku bylo přidáno 625 pl anhydridu kyseliny octové a směs míchána po dobu 2 hodin při 4 °c. Během reakce bylo pH sledováno a udržováno na hodnotě okolo 8 přidáváním hydrogenuhličitanu sodného. Potom byl získaný roztok dialyzován přes membránu proti destilované vodě (odebráno 2000 1000 D).

g 50 % N-acetylovaného heparinu bylo rozpuštěno ve 25 ml destilované vody a ochlazeno na 4 °C. Po přídavku 25 ml 0,2 M roztoku NalO₄ byl roztok ponechán míchat v temnu 20 hodin a reakce byla zastavena přídavkem ethylenglykolu a sole byly odstraněny tangenciální ultrafiltrací. K odsolenému roztoku přidáváno 400 mg NaBH₄ rozděleného na několik dávek. Roztok byl ponechán míchat po dobu 3 hodin při okolní teplotě, potom zneutralizován zředěnou HCI a odsolen tangenciální ultrafiltrací. ¹³C-NMR spektrum sloučeniny je znázorněno na obrázku 1.

Příklad 2

ST 2010 a ST 2184 g heparinu bylo rozpuštěno v 63 ml roztoku 1N NaOH. Roztok byl ponechán míchat po dobu 45 minut při 60 °C, ochlazen a zneutralizován zředěnou HCI. Potom byl roztok míchán ještě 48 ·· · ·

9949

- 41 hodin při 70 °C, ochlazen a dialyzován přes membránu proti vodě (odebráno 2000 - 1000 D).

g 2-O-desulfátovaného heparinu bylo rozpuštěno v 50 ml destilované vody a ochlazeno na 4 °C. Po přídavku 50 ml 0,2 M roztoku NalO₄ byl roztok ponechán míchat v temnu 20 hodin a reakce byla zastavena přídavkem ethylenglykolu a sole byly odstraněny tangenciální ultrafiltrací. Potom bylo k odsolenému roztoku přidáváno 800 mg NaBH₄ rozděleného na několik dávek. Roztok byl ponechán míchat po dobu 3 hodin při okolní teplotě, potom zneutralizován zředěnou HCI a odsolen tangenciální ultrafiltrací.

400 mg oxidovaného a redukovaného heparinu bylo rozpuštěno ve 25 ml destilované vody. Po přídavku 7 mg NaNO₂ bylo pH nastaveno zředěnou HCI na hodnotu 2 a roztok ponechán míchat 17 minut při 4 °C. Reakce byla zastavena zneutralizováním. Potom bylo k odsolenému roztoku přidáváno 60 mg NaBH₄ rozděleného na několik dávek. Roztok byl ponechán míchat po dobu 3 hodin při okolní teplotě, potom zneutralizován zředěnou HCI a frakcionován gelovou filtrací. Byly izolovány dvě frakce o rozdílné molekulové hmotnosti: ST 2010 mající Mw = 3050 a ST 2184 mající Mn = 5800 a Mw = 7520.

¹³C-NMR spektrum sloučeniny ST 2010 je znázorněno na obrázku 2.

- 42 ··«· ·· ·· · · ·· · • · · · · · · φ · · · · · · 9 9 9 • · · 9 9 · 9999

9 9 9 9 9

999 99 9

Příklad 3

ST 2041

K vodnému roztoku 2 g heparinů předem eluovanému z kolony s Amberlitem IR 120, byl přidán nadbytek pyridinu. Roztok byl za sníženého tlaku odpařen; výsledná pyridinová sůl heparinů byla rozpuštěna ve 100 ml směsi DMSO/H₂O v poměru 95 : 5 a mícháno při 20 °C po dobu 4 hodin k získání desulfatačního stupně okolo 64 %.

Potom byl roztok zředěn stejně velkým objemem nasyceného roztoku NaHCO₃. Tento roztok byl na membráně dialyzován proti destilované vodě (odebráno 1000 až 2000 D). Výsledný produkt byl izolován odpařením za sníženého tlaku.

¹³C-NMR spektrum sloučeniny ST 2041 je znázorněno na obrázku 3.

Claims (24)

1. Použití derivátu glykosaminoglykanů, zvláště pak desulfátovaného heparinů o desulfatačním stupni ne větším než 60 % z celkového množství uronových jednotek, k přípravě léčiva majícího inhibiční účinky na heparanázu a/nebo inhibiční účinky na růstový faktor FGF.

2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že jmenovaným derivátem je glykosaminoglykan podobný heparinů.

3. Použití podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jmenovaným derivátem je modifikovaný heparin obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a případně následně zcela nebo jen částečně N-acylovaného.

4. Použití podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že jmenovaným derivátem je sloučenina následujícího obecného vzorce (I):

kde kruh U může mít tyto významy:

···· • ·

X a X', které mohou být stejné nebo různé, jsou aldehydové skupiny, nebo skupina -CH₂-D, kde D je hydroxyl nebo aminokyselina, peptid, nebo zbytek cukru nebo oligosacharidu;

R a R₁₍ které mohou být stejné nebo různé, jsou SO₃, C_rC₈ acylové zbytky, případně nesoucí alespoň další karboxylovou skupinu;

n a m, které mohou být stejné nebo různé, se může měnit od 1 do 40; součet n + m se pohybuje v rozmezí od 6 do 40; poměr m : n se pohybuje od 10.; 2 do 1 ; 1; symbol M označuje, že jednotky označené man jsou statisticky rozdělené podél polysacharidového řetězce a nejsou nezbytně na sebe vázány v uvedeném pořadí.

5. Použití derivátu podle nároku 4, vyznačující se tím, že R a Ri jsou N-acylované skupiny v množství 40 až 60 % ze součtu R + Rv

6. Použití podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že R a Ř, které mohou být stejné, nebo různé jsou acetyl.

• · • · · ·

- 45

7. Použití derivátu podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že m je větší nebo rovno n.

8. Použití derivátu podle nároku 5 nebo 6, kde se n pohybuje od 40 do 60 % ze součtu m + n.

9. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že jmenovaný derivát se vybírá se skupiny obsahující:

částečně 2-O-desulfátovaný heparin, který má molekulovou hmotnost (m. hm.) 11200, polydisperzní index D rovný 1,3, stupeň desulfatace 1,99 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO), procentuální množství modifikované kyseliny uronové vztažené na celkové množství kyseliny uronové přibližně 50 %, m : n = 1 : 1 a jednotky označené man jsou rozděleny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním;

částečně 2-O-desulfátovaný nízkomolekulární heparin, mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 3050, polydisperzní index 2,2, stupeň desulfatace 1,99 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃ : COO), množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 50 %, m : n = 1

1 a jednotky označené man jsou rozděleny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním;

částečně 2-O-desulfátovaný nízkomolekulární heparin, mající molekulovou hmotnost Mn = 5800, Mw = 7520, polydisperzní index D 1,294, množství modifikovaných kyselin uranových • · · ·

- 46 v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 50 %, m : n = 1 : 1 a jednotky označené man jsou rozděleny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním;

částečně 2-O-desulfátovaný heparin, mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 12900 D, polydisperzní index D 1,5, desulfatační index 1,9 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO), množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových 5 % epoxidových skupin, 29 % oxidovaných a redukovaných uranových zbytků, m : n = 1 : 1 a jednotky označené man jsou rozděleny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním;

částečně 2-O-desulfátovaný heparin, mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 9200 D, polydisperzní index D 1,5, množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových: 11 % epoxidových skupin, 27,5 % oxidovaných a redukovaných uranových zbytků, m : n = 1 : 1 a jednotky označené man jsou rozděleny podél polysacharidového řetězce s pravidelným střídáním;

částečně 2-O-desulfátovaný heparin, mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 11000 D, polydisperzní index D 1,5, desulfatační index 1,93 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO ), množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových: 5 % epoxidových skupin, 29 % oxidovaných a redukovaných uranových zbytků;

• φφφφ · · φφφφ · · φ ·· φ · φ · · · · • · · φ · · · φ φφφ φ φ φφ · φφφ φ φφφ φφ φφ φφφφ φφφφ φφφφφ φφ ·

- 47

10. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že se jmenovaný derivát vybírá se skupiny obsahující:

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 11250, polydisperzní index D 1,66, stupeň desulfatace 1,7 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO'), množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %, a 50 % součtu Ra Ř tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný nízkomolekulární heparin, mající molekulovou hmotnost Mw = 4780, Mn = 10000, polydisperzní index D 2,092, množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %, a 50 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající molekulovou hmotnost Mn = 10890, Mw = 22370, polydisperzní index D 2,054, a 27 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající molekulovou hmotnost Mn = 10210, Mw = 21270, polydisperzní index D2,083, a 39 % součtu Ra R₁ tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající molekulovou hmotnost Mn = 11070, Mw = 22000, polydisperzní index D 1,987, a 64 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání

- 48 s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 30 %, a 27 % součtu R a R-ι tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 30 %, a 39 % součtu R a R! tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající množství modifikovaných kyselin uranových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uranových přibližně 30 %, a 64 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl.

11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačují se tím, že jmenované léčivo má antiangiogenní účinky.

12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačují se tím, že jmenované léčivo je vhodné k léčbě zánětů.

13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačují se tím, že jmenované léčivo je vhodné k léčbě autoimuních onemocnění.

14. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačují se tím, že onemocnění, která se mají léčit, sestávají ze skupiny obsahující primární nádory, metastázy, diabetickou retinopatii, psoriazu, retrolentikulární fibroplasii, restenózy po angioplastice a koronárních bypasech, záněty, arthritidu, autoimunní onemocnění, odmítání implantátů, kardiovaskulární onemocnění, • · · fibroproliferativní onemocnění, onemocnění vyvolaná abnormální agregací krevních destiček, onemocnění vyvolaná proliferaci hladkého svalstva, Goodpasturův syndrom, akutní glomerulonefritidu, neonatální pulmonární hypertenzi, asthma, kongestivní srdeční selhání, pulmonární hypertenzi u dospělých, renální vaskulární hypertenzi, proliferativní retinopatii, roztroušenou sklerózu, pokusně vyvolanou autoimunní encefalomyelitidu, diabetes závislou na inzulínu, zánětlivé onemocnění střev, ulcerativní kolitis, Crohnova nemoc.

15. Sloučenina obecného vzorce (I)

CH,OSO,OSO.

- 50 • 44 · * · · · · ·· · • · · 4 · · 4 • · · · · 4 · · · ·

4 · · * · · · 4 44 4

4 4 4 4 4 4 4

4 ·· ··· 44 · kde kruh U může mít tyto významy:

X a X', které mohou být stejné nebo různé, jsou aldehydové skupiny, nebo skupina -CH₂-D, kde D je hydroxyl nebo aminokyselina, peptid, nebo zbytek cukru nebo oligosacharidu;

Ra Ř, které mohou být stejné nebo různé, jsou SO₃, C_1f nebo C₃-C₈ acylový zbytek;

n a m, které mohou být stejné nebo různé, se může měnit od 1 do 40; součet n + m se pohybuje v rozmezí od 6 do 40; poměr m : n se pohybuje od 10 : 2 do 1 : 1; symbol l/l označuje, že jednotky označené man jsou statisticky rozdělené podél polysacharidového řetězce a nejsou nezbytně na sebe vázány v tom pořadí.

16. Sloučeniny podle nároku 15 vybírané ze skupiny látek obsahující:

• · · · • · ·· · · ·· · • · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · ··· • · 9 9 9 9

- 51 částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin, mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 11250, polydisperzní index 1,66, stupeň desulfatace 1,7 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃' : COO), množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %, a 50 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný nízkomolekulární heparin, mající molekulovou hmotnost Mw = 4780, Mn = 10000, polydisperzní index D 2,092, množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %, a 50 % součtu R a R-ι tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající molekulovou hmotnost Mn = 10890, Mw = 22370, polydisperzní index 2,054, a 27 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající molekulovou hmotnost Mn = 10210, Mw = 21270, polydisperzní index 2,083, a 39 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající molekulovou hmotnost Mn = 11070, Mw = 22000, polydisperzní index D 1,987, a 64 % součtu R a Ri tvoří N-acetyl;

částečně N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparin mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %, a 27 % součtu R a R-ι tvoří N-acetyl;

• · · · • A A A A 4 • ·

- 52 A A A A A • AAA

17. Postup přípravy sloučeniny podle nároku 15 nebo 16 založený na těchto reakčních stupních:

a) N-desulfatace sulfaminových zbytků ve směsi DMSO a H₂O v poměru 95 : 5 (obj./obj.) solvolytickou hydrolýzou za teploty okolního prostředí po dobu sahající od 0,5 do 8 hodin, aby se celkově nebo částečně odstranily sulfátové skupiny glukosaminových zbytků v poloze 2;

b) N-acylace jmenovaných zcela nebo částečně desulfátovaných skupin glukosaminových zbytků v poloze 2 působením acylačních činidel, ve vodném alkalickém roztoku (pH 8-9), k získání glukosaminových zbytků s celkově nebo částečně acylovanými skupinami v poloze 2; potom se získané sloučeniny podrobí postupu uvedenému dále v reakčních stupních c), d) nebo e) a f) až g)), nebo alternativně přímo dále uvedenému stupni f);

c) působení báze při teplotě sahající od okolní teploty přibližně až do 100 °C, což vede kříženému odstranění požadovaného množství sulfátových skupin iduronové kyseliny v poloze 2 a k tvorbě epoxidových skupin; a pokud je to požadováno,

d) otevření jmenovaného epoxidového kruhu přibližně při pH 7 za teploty sahající přibližně od 50 °C přibližně do 100 °C, k získání zbytků kyseliny galakturonové; nebo případně

e) otevření jmenovaného epoxidového kruhu při teplotě sahající přibližně od 0 °C do 30 °C, k získání zbytků kyseliny iduronové; a pokud je požadováno • · · • · · · • · 9 999

- 53 f) oxidace diolů perjodátem sodným, které vede k otevření glykosidového kruhu a vytvoření dvou aldehydových skupin u každého modifikovaného zbytku;

g) redukce jmenovaných aldehydových skupin na primární alkohol, a pokud je požadováno, tedy z transformace D skupiny na jinou skupinu než je hydroxyl tak, jak to pojímá různý význam uvedený v obecném vzorci (I);

h) případné kyselé hydrolýzy sloučenin získaných ve stupni g) k získání oligosacharidů odpovídajících pravidelným sekvencím; nebo alternativně

i) vystavení produktů získaných v reakčním stupni g) částečné enzymatické hydrolýze enzymem vybíraným ze skupiny sestávající z lyázy, heparinázy, heparitinázy, nebo rovnocenného, k získání ologosacharidů, přednostně tetra- nebo oktosacharidů, s neredukujícím terminálním zbytkem sestávajícím z nenasyené kyseliny iduronové, redukujícího zbytku sestávajícího z Nsulfoglukosaminu a obsahujícího alespoň jeden zbytek otevřené kyseliny iduronové;

j) případně se sloučenina získaná v reakčním stupni c) nebo produkt získaný v reakčním stupni d) podrobí částečné enzymové hydrolýze; a pokud se to požaduje,

k) podrobení produktů získaných v jednom z reakčních stupňů b), c) a f) částečné 6-O-desulfataci; nebo alternativně

l) podrobení výchozího částečné nebo úplně 6-desulfatovaného heparinu stupňům b), c) a f).

• · • φ ·

ΦΦΦ • φ·· φ φ •

- 54

18. Sloučeniny, které lze získat postupem podle nároku 17.

19. Sloučeniny, které lze získat postupem podle nároku 17, které se vybírají ze skupiny obsahující:

N-acetyl heparin (50 %), mající molekulovou hmotnost (m. hm.) 11200, polydisperzní index D 1,3, stupeň desulfatace 1,6 (vyjádřeno jako molární poměr SO₃ COO), množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 50 %, u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň

b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d) a e) se vynechají, stupeň f) se provádí při 4 °C přes noc, stupeň g) po dobu 3 hodin při laboratorní teplotě;

nízkomolekulární N-acetyl heparin (50 %) mající molekulovou hmotnost Mw = 4780, Mn = 10000, polydisperzní index D 2,092, množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %, u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d) a e) se vynechají, stupeň f) se provádí při 4 °C přes noc, stupeň g) po dobu 3 hodin při laboratorní teplotě, stupeň h) se provádí deaminací kyselinou dusičnou při 4 °C po dobu 17 minut, potom následuje redukce aldehydových skupin borohydridem při laboratorní teplotě po dobu 3 hodin;

• · ·

- 55 N-acetyl heparin (27 %) mající molekulovou hmotnost Mn = 10890, Mw = 22370, polydisperzní index D 2,054, u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (39 %) mající molekulovou hmotnost Mn = 10210, Mw = 21270, polydisperzní index D 2,083, u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (64 %) mající molekulovou hmotnost Mn = 11070, Mw = 22000, polydisperzní index D 1,987, u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (27 %) mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %, u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

N-acetyl heparin (39 %) mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají;

• · · • · · φ · · · • 9 999 • 99

- 56 N-acetyl heparin (64 %) mající množství modifikovaných kyselin uronových v porovnání s celkovým obsahem kyselin uronových přibližně 30 %u kterého se reakční stupeň a) provádí po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě a stupeň b) po dobu 2 hodin při 4 °C, stupně c), d), e), f), g) a h) se vynechají.

20. Farmaceutické přípravky obsahující alespoň jednu sloučeninu podle nároků 15 nebo 16 a/nebo 19 jako účinnou složku v příměsi s farmaceuticky přijatelnými vehikuly a excipienty.

21. Použití sloučenin podle nároků 15 až 16 a 19 jako léčiv.

22. Použití sloučenin podle nároků 15 až 16 a 19 jako vehikulů pro léčiva.

23. Použití podle nároku 22, vyznačující se tím, že jmenované léčivo se vybírá ze skupiny obsahující: steroidní a nesteroidní protizánětlivá léčiva, kortikosteroidy, léčiva s antimetastatickým účinkem, léčiva, která působí na endotheliální úrovni.

24. Použití podle nároku 23, vyznačující se tím, že jmenovaným antimetastatickým léčivem je inhibitor metaloproteinázy.