SK288335B6

SK288335B6 - Čiastočne alebo úplne N-desulfatovaný, N-reacetylovaný heparín, spôsob jeho prípravy, jeho použitie na prípravu liečiva s inhibičným účinkom na heparanázu, s antiangiogénnym a protizápalovým účinkom a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom

Info

Publication number: SK288335B6
Application number: SK160-2004A
Authority: SK
Inventors: Benito Casu; Giangiacomo Torri; Annamaria Naggi; Giuseppe Giannini; Claudio Pisano; Sergio Penco
Original assignee: Sigma-Tau Research Switzerland S.A.
Priority date: 2001-09-12
Filing date: 2001-09-12
Publication date: 2016-02-02
Also published as: CN1547477B; ATE511846T1; SI1427427T1; CY1112551T1; HUP0401693A2; PT1427427E; JP2005506326A; HUP0401693A3; SK1602004A3; BR0117124A; US20050137167A1; CN1547477A; ES2431362T3; CZ2004255A3; CY1114544T1; EP1427427B1; EP1427427A1; AU2001292231B2; EP2343077B1; CA2457719C

Abstract

Je opísaný čiastočne alebo úplne N-desulfátovaný, N-reacetylvoaný heparín vzorca (I). Uvedená zlúčenina má inhibičný účinok na heparanázu, antiangiogénny a protizápalový účinok. Je tiež opísaný spôsob jej prípravy a farmaceutický prostriedok s obsahom opísanej zlúčeniny.

Description

(54) Názov: Čiastočne alebo úplne N-desulfátovaný, N-reacetylovaný heparín, spôsob jeho prípravy, jeho použitie na prípravu liečiva s inhibičným účinkom na heparanázu, s antiagiogénnym a protizápalovým účinkom a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom (57) Anotácia:

Oblasť techniky

Vynález sa týka čiastočne desulfátovaných derivátov glykozaminoglykánov, predovšetkým heprínov, spôsobov ich prípravy, ich použitia ako aktívnych zložiek na prípravu liekov užitočných v patologických stavoch, ako sú nádory vrátane metastatických foriem a na akúkoľvek terapeutickú indikáciu, na získanie benefitu z inhibície heparanázy a farmaceutických kompozícií, ktoré ich obsahujú.

Doterajší stav techniky

Štúdie uskutočnené v Tumor Biological Research Unit na Hadassah-Hebrew University Hospital v Izraeli (Isr. Med. Assoc. J. 2000, 2, 37-45; J. Med. Chem. 2000, 43, 2591-600; Invasion Metastasis 1994-95, 14, 290-302; Exp. Celí Res. 1992, 201, 208-15;) boli zamerané na zapojenie rastových faktorov viažucich heparín, enzýmov degradujúcich síran heparanu (heparanáza) pri nádorovej angiogenéze a metastázach. Tieto štúdie boli použité pri depistáži a na identifikáciu derivátov heparínu a látok napodobňujúcich heparín/heparan síranov s účinnou inhibičnou aktivitou proti heparanáze (Náture Med. 1999, 5, 735-6; Science, 1999, 285, 334).

Nádorové bunky uvoľňujú enzým heparanázu, endo-p-D-glukurónidázu, ktorá degraduje polysacharidový reťazec heparanových síranových proteoglykánov na povrchu buniek a vo vnútrobunkovom matrixe.

Zapojenie heparanázy do nádorovej angiogenézy bolo korelované so schopnosťou uvoľňovať bFGF (FGF-2) a iných rastových faktorov zo zásob v ECM (extracelulárna matrix). Tieto rastové faktory predstavujú mechanizmus na indukciu neovaskularizácie v normálnych a patologických situáciách.

Heparanáza môže tak uľahčiť nielen inváziu nádorových buniek a metastázu, ale tiež nádorovú angiogenézu, ktoré sú kritickými krokmi v progresii nádoru.

Špecifické inhibítory enzýmu heparanázy zabraňujú uvoľneniu a aktivácii rastových faktorov uskladnených vo forme síranu heparanu rovnako ako rozrušenie ECM a predstavujú veľmi nádejný prístup pre protinádorové lieky.

Jedným z terapeutických prístupov pre antiangiogénne lieky je vývoj účinného a selektívneho inhibítora heparanázy.

Čo sa týka angiogenézy, treba sa odvolať na WO 01/55221, autora predkladanej žiadosti.

Inou dôležitou skutočnosťou je účasť heparanázy pri zápaloch a autoimunite. Aktivita heparanázy koreluje tiež so schopnosťou aktivovaných buniek imunitného systému opustiť cirkuláciu a vykázať zápalové a autoimúnne odpovede. Interakcia trombocytov, T a B lymfocytov, makrofágov a mast buniek so subendoteliálnou ECM je spojená s degradáciou síranu heparanu heparanázou. Enzým je uvoľňovaný z vnútrobunkových kompartmentov (to znamená špecifických granúl) ako odpoveď na rôzne aktivačné stimuly, čo predpokladá jeho zapojenie a prítomnosť pri zápalových miestach a autoimúnnych léziách. Podávanie inhibítorov heparanázy pokusným zvieratám (neantikolaguklačným druhom heparínu s nízkou molekulovou hmotnosťou LMWH) výrazne znížili incidenciu experimentálnej autoimúnnej encefalomyelitídy (EEAE), adjuvantnej artritídy a odmietnutie transplantátu u pokusných zvierat, čo znamená, že inhibítory heparanázy môžu byť zapojené do autoimúnnych a zápalových chorôb.

Heparín

Heparín je heterogénna zmes prirodzene sa vyskytujúcich polysacharidov rôznej dĺžky a s rôznym stupňom sulfatácie, ktorý má antikoagulačnú aktivitu a je vylučovaný spojivovým tkanivom a mast bunkami pečene (z ktorej boli primárne izolované), vo svaloch, pľúcach, týmuse a slezine.

Okrem toho, v heparíne bola identifikovaná pravidelná sekvencia, sekvencia zodpovedajúca aktívnemu miestu antitrobínovej aktivity.

Protinádorová a protimetastatická aktivita heparínu a jeho derivátov je dôsledkom jeho schopnosti inhibovať heparanázu, čím blokuje rastové faktory a reguluje angiogenézu.

Sírany heparanu (HS)

Sírany heparanu (HS) sú všadeprítomné ligandy proteínov. Proteíny sa viažu na reťazce HS s rôznym účinkom, ako je jednoduchá imobilizácia alebo ochrana proti proteolytickej degradácii špecifických modulátorov biologických účinkov, ako je angiogenéza.

Uhľohydrátová kostra tak heparínu, ako aj heparanovej štruktúry (HS), je tvorená zmenami D-glukozamínu (GlcN) a hexurónových kyselín (GlcA alebo IdoA).

V heparíne sú GlcN zvyšky, hlavne N-sírany, kým v HS sú ako N-sírany a v N-acetylovanej forme, s malým podielom nesubstituovaných NH₂ skupín.

Priemerne je HS menej O-sulfatovaná ako heparín.

Používanie heparínu pri liečení angiogenetických porúch, ako sú nádory, predovšetkým metastázy, je podstatne obmedzené antikoagulačnou aktivitou heparínu.

Uskutočnili sa chemické modifikácie heparínu v zmysle zníženia antikoagulačnej kapacity a súčasného zachovania jeho protinádorových vlastností.

Otvorenie jednotky glukurónovej kyseliny v mieste antitrombínovej aktivity, znižuje afinitu heparínu pre antitrombín: týmto spôsobom môžu byť použité heparíny so zníženými antikoagulačnými účinkami, ale pri zachovaní antiangiogénnych vlastností.

Heparanázy

Heparanázy sú enzýmy, ktoré patria do rodiny endoglykozidáz (endo-p-D-glukuronidáza), ktoré hydrolyzujú vnútorné glykozidové väzby síranov heparanu (HS) a heparínu.

Tieto endoglykozidázy sa zúčastňujú proliferácie nádorových buniek, pri metastázach a neovaskularizácii nádorov, a sú biologickými cieľmi pre antiangiogenetickú aktivitu. Vo vedeckej literatúre existuje veľký počet štúdií o vzťahoch medzi štruktúrou a aktivitou (pozri, napríklad, Lapierre F. a spol., Glycobiology, 7N. 6, (3), 355-366, 1996). Hoci stále nie je známych veľa vzťahov, boli uverejnené štúdie týkajúce sa inhibície heparanáz heparínom a jeho derivátmi. Použitie špecifických testov viedlo k potrebe takých štruktúr, ktoré môžu byť vodidlom na získanie nových, selektívnejších derivátov.

V uvedenej práci Lapierra a spol. sú opísané deriváty heparínu získané 2-0 desulfátáciou alebo odštiepením glykolu (oxidácia jodistanom a následná redukcia hydroboridom sodným). Takéto deriváty, definované ako 2-O-desulfátovaný heparín a RO-heparín, majú čiastočne zachovanú angiogenetickú aktivitu heparínu stanovenú CAM testom v prítomnosti kortikosteroidov (to isté, strana 360).

Bolo opísané, že N-acyl deriváty heparínu, ktoré viac napodobňujú síran heparanu ako heparínu, inhibujú heparanázu o niečo menej ako deriváty N-síranu (Irimira T. Biochemistry 1986, 25, 5322-5328; IshaiMichaeli R. a spol., Biochemistry 1992, 31, 2080-2088).

Heparíny a FGF

FGF regulujú mnohé fyziologické pochody, ako je bunkový rast a diferenciácia, ale sú tiež zapojené do patologických procesov, ako je angiogenéza nádorov.

FGF sú rastové faktory (rodina viac ako 10 polypeptidov, z ktorých sú najviac preštudované kyslé (FGF1) a zásadité FGF (FGF-2), potrebujú na svoju účinnosť poly sacharide vý ko faktor, heparín alebo HS, pre väzbu na FGF receptor (FGFr) a jeho aktiváciu.

Hoci nie je známy presný mechanizmus, ktorým heparín a HS aktivujú FGF, je známe, že heparín/FGF/FGFr tvoria tri molekulárny alebo trojitý komplex.

Jedným z predpokladaných mechanizmov je, že heparín a HS indukujú takzvanú sendvičovú dimerizáciu FGF a po dimerizácii vytvorenie stabilného komplexu s FGFr.

Antimetastatická aktivita derivátov heparínu

Pravdepodobne hlavný problém, ktorému čelí protirakovinová terapia, je schopnosť primárnych nádorov produkovať metastatické bunky.

Zdá sa, že deriváty heparínu s významnou schopnosťou blokovať heparanázu sú rovnako schopné inhibovať angiogenézu pri primárnych nádoroch a aj pri metastázach.

Okrem toho, inhibícia heparanázy redukuje migračnú schopnosť nádorových buniek z primárneho nádoru k iným orgánom.

Vo zvieracích modeloch sa zistilo, že antimetastatická aktivita koreluje s inhibičnou heparanázovou schopnosťou heparínu a derivátov heparínu (Bitan M. a spol., Isr. J. Med. Sci. 1995, 31, 106-108) rovnako ako sulfatované polysacharidy (Miao, H.Q. a spol., Int. J. Cancer 1999, 83, 424-431). Štúdie zamerané na závislosť antimetastatickej aktivity a molekulovej hmotnosti naznačujú, že významnú antimetastatická aktivitu majú tiež heparíny veľmi nízkej molekulovej hmotnosti (Sciumbata T. a spol., Invasion Metastasis 1996, 16, 132-143) a oligosacharidové polysulfáty (Parish C.R. a spol. Cancer Res. 1999, 59, 3433-3441). Všeobecne, odstránenie N-síranových skupín (N-desulfátácia) znižuje antimetastatická vlastnosť heparínov, táto aktivta je čiastočne prinavrátená N-acyláciou (N-acetylácia, N-hexanoylácia (Bitan M., 1995)), a N-sukcinylácia (Sciumbata T., 1996) voľných NH₂ skupín. Zistilo sa, že antimetastatická aktivita heparínov je negatívne korelovaná so stupňom O-sulfatácie (Bitan M., 1995). Avšak selektívna 2-O-desulfátácia zvyškov idurónovej kyseliny nezahrňuje výrazná redukciu antimetastatickej aktivity heparínu (Lapierre, F., Glycobiology 1996, 6, 355-366).

Všeobecne, inhibičná aktivita heparanázy a antimetastatická aktivita heparínov a iných sulfatovaných polysacharidov klesá so znižovaním molekulovej hmotnosti a stupňom sulfatácie (Bitan M., 1995; Parish C.R., 1999). Tieto aktivity však tiež závisia od uhľohydrátovej kostry polysacharidu (typ zvyšku a poloha glykozidických väzieb) (Parish C.R., 1999). Keďže nie je známa trojrozmerná štruktára heparanázy, je ťažko predpokladať, ktorá polysacharidevá kostra a sulfatácia najáčinnejšie inhibujá enzým.

Na základe súčasných vedomostí, štruktáry molekúl podobných heparínu, ktoré podporujá angiogenetic kú inhibičnú aktivitu, možno na základe blokovaných cieľov rozdeliť do dvoch kategórií:

a) inhibícia heparanázy: aj keď tento enzým rozoznáva a štiepi sekvencie heparín a HS s najmenej ôsmimi monosacharidmi obsahujúcimi N-acyl-glukozamín-glukurónovú kyselinu (alebo N-sulfátované glukozamínové zvyšky, pozri napríklad D. Sandback-Picas a spol., J. Biol.Chem., 273, 18777-18780 (1998) a citovaná literatúra). Jej inhibícia môže byť účinne dosiahnutá fragmentmi heparínu dlhšími ako tetradekasacharid (Bitan M., 1995) alebo extenzívnou sulfatáciou, kratšími oligosacharidmi, ako sú maltohexaóza síran (MHS) a fosfomanopentaóza síran (PI-88) (Parish C.R., 1999). Dlhé fragmenty heparínu a intenzívne sulfatované oligosacharidy majú antikoagulačné vlastnosti, ktoré by mali byť vylúčené pri potencionálnych antimetastatických liekoch;

b) inhibícia angiogenetických rastových faktorov (fibroblastový typ: FGF-1 a FGF-2; vaskulárny endoteliálny typ: VEGF; vaskulárny permeabilitný typ: VPF): zlúčeniny podobné heparínu majú výhodne sekvenciu najmenej piatich monosacharidov obsahujúcich 2-sulfatovanú idurónovú kyselinu a N, 6-sulfátovaný glukózamín (pozri, napríklad, M. Maccarana a spol., J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993)).

Literatúra opisuje malé peptidy (5-13 aminokyselín) s antiangiogenetickou aktivitou (US patent 5,399,667 pre University of Washington), ktoré pôsobia cez väzbu na trombospondínový receptor, alebo dlhšie peptidy (približne 50 aminokyselín).

Známe sú modifikované doštičkové faktory (EP 0 589 719, Lilly), ktoré sú schopné inhibovať proliferáciu endotelu s hodnotou IC₅₀ = 7 nM.

Tiež boli opísané fragmenty oligosacharidov s antiangiogenetickou aktivitou. Zistilo sa, že obmenou sekvencie uhľohydrátov môže byť zvýšená selektivita interakcií.

Okrem toho, heparín môže byť použitý ako nosič pre látky, ktoré samy majú antiangiogenetický účinok, napríklad steroidy, čím sa využije afinita heparínu k vaskulárnym endoteliálnym bunkám; (pozri napríklad WO 93/18793, University of Texas, an Imperiál Cancer Research Technology, kde sú nárokované heparíny vo väzbe citlivej na kyseliny, ako je hydrazín kyseliny adipovej, naviazané na kortizol. Antiangiogenetický účinok konjugovaných molekúl je väčší ako nekonjugovaných molekúl, dokonca aj keď sú podávané súčasne.

V Biochim. Biophys. Acta (1996) 1310, 86-96, sú opísané heparíny naviazané na steroidy (napríklad, kortizol) s hydrazónovou skupinou na C20. Takýto derivát má väčšiu antiangiogenetickú aktivitu ako dve nekonjugované molekuly.

EP 0 246 654 (Daiichi Sc) opisuje sulfátované polysacharidy s antiangiogenetickou aktivitou, ktoré sú v II. fáze štúdia. EP 0 394 971 (Pharmacia & Upjohn - Harvard Coll.) opisuje hexa-sacharidové-heparínové fragmenty s nízkou sulfatáciou, ktoré sú schopné inhibovať rast endotelových buniek a angiogenézu stimulovanú FGF-1. EP 0 618 234 (Alfa Wasserman) opisuje spôsob prípravy semisyntetických glykozaminoglykanov s heparínovou alebo heparanovou štruktúrou, ktorá obsahuje nukleofilnú skupinu. WO 95/05182 (Glycomed) opisuje rôzne sulfátované oligosacharidy s antikoagulačnou, antiangiogenetickou a protizápalovou aktivitou. US 5,808,021 (Glykomed) opisuje spôsob prípravy v podstate nedepolymerizovaného 2-O, 3-0 desulfátovaného heparínu, % desulfátácie v polohe 2-kyseliny idurónovej (I, 2-O) a polohe 3 glukozamínovej jednotky (A, 3-O) je v rozsahu 99 až 75 % z pôvodného počtu. Tento spôsob zviditeľňuje desulfátáciu v prostredí katiónu alebo dvojmocného kovu, ako je vápnik alebo meď, po ktorej nasleduje lyofilyzácia získaného produktu. Desulfátované heparíny majú antiangiogenetickú aktivitu. EP 0251 134 (Yeda Res & Dev Co Ltd a spol.) opisuje použitie subkoagulačných dávok heparínu alebo jeho derivátov na prevenciu odmietnutia štepu a na liečenie autoimúnnych ochorení. Aktivita heparínu je vyjadrená inhibíciou heparanázy. WO 88/05301 (Univ. Australian Nat.) opisuje antimetastatické a/alebo protizápalové kompozície s obsahom sulfatovaného polysacharidu, ktorý inhibuje heparanázu. Uvedené sú heparín, fukoidan, pentosan síran, dextran síran. WO 92/01003 (Univ. Texas System) opisuje použitie derivátu heparínu, bez antikoagulačnej aktivity, ako inhibítora heparanázy. Tieto deriváty majú sulfamino alebo O-sulfátové skupiny, molekulová hmotnosť je v rozsahu 1 000 až 15 000 a každá koncová monomérna jednotka je monomérna opakujúca sa jednotka s koncovým atómom kyslíka naviazaného na blokovaciu skupinu. WO 94/14851 a WO 96/06867 (Glycomed) uvádzajú 2O, 3-O-desulfátovaný mukózny heparín alebo jeho fragmenty, ktoré sú najmenej 96,7 % desulfátované v polohe 2-0 a najmenej 75 % desulfátované v polohe 3-O. Tieto zlúčeniny sú vhodné ako neantikoagulačné inhibítory heparanázy. WO 95/09637 a WO 96/09828 (Glycomed) opisujú vysoko sulfátované maltooligosacharidové zlúčeniny s vlastnosťami podobnými heparínu. WO 95/30424 (Glycomed) sa týka 6-O-desulfátovaného heparínu alebo jeho fragmentov s inhibičnou aktivitou proti heparanáze. WO 96/33726 (Univ. Australian Nat.) opisuje sulfátované oligosacharidy ako heparan mimetiká, ktoré vykazujú inhibičnú aktivitu proti heparanáze. WO 01/35967 (Knoll AG) uvádza spôsob liečenia srdcovej insuficiencie a podobných stavov, podávaním inhibítora heparanázy. Uvádza sa heparín, ktorý má čiastočne redukované COOH skupiny alebo ktorý je aspoň čiastočne N-desulfátovaný a N-acetylovaný, alebo je aspoň čiastočne N,O-de.sulfátovaný a N-resulfátovaný, alebo je O-acetylovaný.

Podstata vynálezu

Predmetný vynález opisuje čiastočne alebo úplne N-desulfátovaný, N-reacetylovaný heparín vzorca (I)

kde U kruh má nasledovný význam:

kde R a Ri sú acetylové zvyšky;

X a X' sú -CH2-D skupina, kde D je hydroxyl;

n a m, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne, môžu byť v rozsahu od 1 do 40; súčet n+m je v rozsahu od 6 do 40; pomer m:n je v rozsahu od 10:2 do 1:1, symbol l/j znamená, že jednotky označené m a n sú štatisticky distribuované pozdĺž polysacharidového reťazca a nie sú nevyhnutne v sekvencii, vybraný zo skupiny obsahujúcej:

- čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MH) 11 200, polydisperzným indexom 1,3, stupňom desulfátácie 1,6 (vyjadrené ako molárny pomer SO₃‘ : COO ), percentom modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami približne 30 %, pričom 50 % z celkového počtu R a Rj tvorí acetyl,

- nízko molekulový čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou Mn 4780, MH 10000, polydisperzným indexom 2,092, percentom modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami približne 30 %, pričom 50% z celkového počtu R a Ri tvorí acetyl,

- čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, s percentom modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami približne 30 %, pričom 27 % z celkového počtu R a Ri tvorí acetyl,

- čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, s percentom modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami približne 30 %, pričom 39 % z celkového počtu R a Ri tvorí acetyl, čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, s percentom modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami približne 30 %, pričom 64 % z celkového počtu R a R! tvorí acetyl.

Tiež je opísaný spôsob prípravy čiastočne alebo úplne N-desulfátovaného, N-reacetylovaného heparínu vzorca (I), ktorý zahŕňa:

a) N-desulfátáciu solvolytickou hydrolýzou sulfoamínových zvyškov v DMSO:H₂O = 95:5 (objem/objem) pri laboratórnej teplote počas 0,5 až 8 hodín, za dosiahnutia celkovej alebo čiastočnej eliminácie sulfátových skupín v polohe 2 glukozoamínových zvyškov;

b) N-acyláciu uvedených celkovo alebo čiastočne desulfátovaných skupín v polohe 2 glukozoamínových zvyškov pôsobením acylačného činidla v alkalickom vodnom roztoku (pH 8-9), za vzniku úplne alebo čiastočne acylovaných skupín v polohe 2 glukozoamínových zvyškov;

c) oxidáciu diolov periodatom sodným, čím dochádza k otvoreniu glykozidového kruhu a k tvorbe dvoch aldehydových skupín na jeden modifikovaný zvyšok;

d) redukciu uvedených aldehydových skupín na primárny alkohol;

e) prípadnú kyslú hydrolýza zlúčenín získaných v kroku d) za vzniku oligosacharidov s obvyklými sek venci ami; alebo

f) vystavenie produktov získaných v kroku d) čiastočnej enzymatickej hydrolýze enzýmami vybranými zo skupiny obsahujúcej lyázu, haparinázu, heparitinázu alebo za vzniku oligosacharidov, výhodne tetra- alebo oktasacharidov s neredukujúcim koncovým zvyškom, ktorý obsahuje nenasýtenú idurónovú kyselinu, redukujúci zvyšok obsahujúci N-sulfoglukozoamín a najmenej jeden zvyšok otvorenej idurónovej kyseliny.

Cieľom predkladaného vynálezu je zistiť optimálne glykozaminoglykanové štruktúry s antiangiogenetickou aktivitou na základe inhibície heparanázy a/alebo mechanizmov inhibície FGF rastového faktora. Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť liek s antiangiogenetickou aktivitou, ktorý nemá v zásade typické vedľajšie účinky derivátov heparínu, ako je napríklad antikoagulačná aktivita.

WO 01/55221 (autorom je predkladáte!’ tejto žiadosti) opisuje glykozaminoglykány, predovšetkým desulfátovaný heparín, kde stupeň desulfátácie nie je vyšší ako 60 % všetkých jednotiek kyseliny urónovej. Tieto deriváty majú antiangiogenetickú aktivitu a nemajú antikoagulačnú aktivitu. Uvedené zlúčeniny vykazujú antiangiogenetickú aktivitu na základe inhibície FGF. Nebola pozorovaná žiadna aktivita v zmysle inhibície heparanázy.

Všeobecne, WO 01/55221 tiež poskytuje modifikovaný heparín s glykozamínovými zvyškami s rôznym stupňom N-desulfátácie a s možnou následnou celkovou alebo čiastočnou acetyláciou. Všeobecne však táto literatúra explicitne neopisuje kroky N-desulfátácie a možnej následnej celkovej alebo čiastočnej acetylácie.

Zistilo sa, že po vystavení glykozaminoglykánu, ako je heparínu podobný glykozaminoglykán, heparín alebo modifikovaný heparín, obsahujúci glukózamínové zvyšky s rôznym stupňom N-desulfátácie a možnou následnou celkovou alebo čiastočnou N-acyláciou (výhodne N-acetylácia), kontrolovanej 2-O-desulfátácii idurónových jednotiek až do stupňa desulfátácie nie väčšej ako 60 % všetkých urónových jednotiek, si zachováva angiogenetické vlastnosti sprostredkované rastovým faktorom.

V už uvedenom WO 01/55221 sa prekvapivo ukázalo, že deriváty 2-O-desulfátovaného heparínu sú tiež inhibítory heparanázy. Zistilo sa, že táto vlastnosť môže byť ďalej zvýšená po odštiepení glykolu z nesulfátovaných zvyškov kyseliny urónovej. Odštiepenie glykolu predstavuje chemickú modifikáciu, ktorá spôsobuje dramatické zníženie antikoagulačnej aktivity (Času B. a spol., Arzneim. Forsch. (Drug Res.) 1986, 36, 637-642) a výrazné zvýšenie inhibície heparanázy čiastočne N-acetylovaných heparínov získaných 50 % N-desulfátáciou a následnou N-acetyláciou výsledných troch aminoskupín a 2-O-desulfátovaných zlúčenín.

Desulfátácia uskutočnená v podmienkach podľa predkladaného vynálezu vedie k tvorbe idurónových jednotiek s oxyranovým kruhom v polohe 2,3. Otvorenie oxyranového kruhu za podmienok opísaných v tomto predkladanom vynáleze poskytuje zvýšenie L-idurónových alebo L-galakturónových jednotiek.

Predmetom predkladaného vynálezu je použitie uvedených derivátov glykozaminoglykánu na prípravu lieku s inhibičnou aktivitou proti heparanáze a/alebo FGF rastovým faktorom.

Podľa predkladaného vynálezu, uvedený derivát glykozaminoglykánu je výhodne heparínu podobný glykozaminoglykán. Ďalej, podľa predkladaného vynálezu, uvedený derivát glykozaminoglykánu je modifikovaný heparín obsahujúci glykozamínové zvyšky s rôznym stupňom N-desulfátácie a možnou následnou celkovou alebo čiastočnou N-acetyláciou.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sú charakterizované vysokou účinnosťou na inhibíciu heparanázy s pozoruhodnými antiangiogenetickými vlastnosťami. Sú preto užitočné ako aktívne zložky na prípravu liekov na liečenie patologických stavov, v ktorých sa využíva ich inhibičná aktivita proti heparanáze. Podkladom patologických stavov je abnormálna angiogenéza a tieto zlúčeniny sú zvlášť účinné pre liečenie metastáz.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu inhibujú tiež FGF.

Výhodne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu vykazujú znížené alebo žiadne antikolagulačné vlastnosti, čím sa eliminujú alebo znížia vedľajšie účinky typické pre heparíny. Ďalšou výhodou je skutočnosť, že zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť charakterizované analytickými technikami, ako je NMR spektroskopia, čo umožňuje kontrolu, ktorá je absolútne potrebná pre priemyselnú výrobu.

V prípade modifikovaných heparínov má molekulová hmotnosť (MH) tiež veľmi dôležitú úlohu pri príprave inhibítorov angiogenézy. Je dobre známe, že zníženie molekulovej hmotnosti až do hodnôt zodpovedajúcich pentasacharidovým jednotkám, nevedie k strate antiangiogenetickej aktivity. Na druhej strane je všeobecne akceptované, že heparínové reťazce určitej dĺžky inhibujú aktiváciu FGF a sú dokonca lepšími inhibítormi heparanázy ako kratšie reťazce. Avšak optimálna dĺžka pre inhibíciu heparanázy závisí na štruktúre inhibítora (uhľohydráte vá kostra, poloha väzby, druh sulfatácie) a mala by byť stanovená pre každý nový typ inhibítorov.

Zlúčeniny podľa vynálezu obsahujú glykozamínové zvyšky s rôznym stupňom N-desulfátácie a možnou následnou celkovou alebo čiastočnou acetyláciou sú nárokované ako nové zlúčeniny.

Stupeň desulfátácie znamená percento nesulfátovaných idurónových kyselín vo vzťahu k všetkým uránovým kyselinám prítomných v pôvodnom heparíne. Výhodný rozsah percenta desulfátácie je v rozsahu 40 až 60%.

Medzi zlúčeninami vzorca (I) je prvou výhodnou zlúčeninou čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín, ktorý má molekulovú hmotnosť 11200 a disperzný index D=l,3, stupeň desulfátácie 1,99 (vyjadrené ako SO₃_ : COO' molárny pomer), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je približne 50 %. Uvedená zlúčenina (tu tiež nazývaná STÍ514) je vyjadrená vzorcom (I), kde medzi inými príslušnými definíciami, m:n =1:1 a jednotky označené m a n sú rozmiestnené pravidelne po dĺžke polysacharidového reťazca striedavým spôsobom.

Druhou výhodnou zlúčeninou je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MH) 3050. Táto zlúčenina má polydisperzný index 2,2 a stupeň desulfátácie 1,99 (vyjadrený ako molárny pomer S0₃_:C000‘), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je asi 50 %. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST2010) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami, m:n =1:1 a jednotky označené m a n sú rozmiestnené pravidelne po dĺžke polysacharidového reťazca striedavým spôsobom. Táto zlúčenina sa získa depolymerizáciou ST1514 kyselinou dusičnou, potom nasleduje redukcia aldehydických skupín, preto väčšina jej zvyškov na redukujúcom zakončení sú anhydromanózové zvyšky.

Treťou výhodnou zlúčeninou je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s nízkou molekulovou hmotnosťou Mn= 5 800, Mw = 7 520. Táto zlúčenina má polydisperzný index 1,294, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je 50 %. Táto zlúčenina (tu ďalej označovaná ako ST2184) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami, m:n = 1:1 a jednotky označené m a n sú rozmiestnené pravidelne po dĺžke polysacharidového reťazca striedavým spôsobom. Táto zlúčenina sa získa depolymerizáciou STÍ514 kyselinou dusičnou, potom nasleduje redukcia aldehydických skupín, preto väčšina jej zvyškov na redukujúcom zakončení sú anhydromanózové zakončenia.

Štvrtá výhodná zlúčenina je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MW) 11 200. Táto zlúčenina má polydisperzný index 1,3, stupeň desulfátácie je 1,6 (vyjadrený ako molárny pomer SO₃.:COOO), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je 30 %. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako STÍ518) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 50 % všetkých R a Ri je N-acetyl.

Piatou výhodnou zlúčeninou je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s nízkou molekulovou hmotnosťou Mn = 4 780, Mw = 10 000. Táto zlúčenina má polydisperzný index 2,092, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je približne 30 %. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST2168) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 50 % všetkých R a R] je N-acetyl.

Šiestou výhodnou zlúčeninou je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou Mn = 10 890, Mw = 22 370. Táto zlúčenina má polydisperzný index 2,054. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST2037) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 27 % všetkých R a Ri je N-acetyl.

Siedmou výhodnou zlúčeninou je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou Mn = 10 210, Mw = 21 270. Táto zlúčenina má polydisperzný index 2,083. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST2038) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 39 % všetkých R a Ri je N-acetyl.

Ôsmou výhodnou zlúčeninou je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou Mn = 11 070, Mw = 22 000. Táto zlúčenina má polydisperzný index 1,987. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST2041) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 64 % všetkých RaRj je N-acetyl.

Deviatou výhodnou zlúčeninou je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je približne 30 %. Táto zlúčenina má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 27 % všetkých R a R! je N-acetyl (ST2185).

Desiatou výhodnou zlúčeninou je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je približne 30 %. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST2186) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 39 % všetkých R a Rj je N-acetyl.

Jedenástou výhodnou zlúčeninou je čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je približne 30 %. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST2187) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami 64 % všet kých R a Ri je N-acetyl.

Dvanástou výhodnou zlúčeninou je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MW) 12 900 Daltonov. Táto zlúčenina má polydisperzný index D = 1,5, stupeň desulfátácie je 1,9 (vyjadrený ako molárny pomer SO₃.:COOO‘), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných urónových zvyškov. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST1513) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami m:n = 1:1 a jednotky označené ako m a n sú pravidelne rozmiestnené pozdĺž polysacharidového reťazca pravidelným spôsobom.

Trinástou výhodnou zlúčeninou je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MW) 9 200 Daltonov. Táto zlúčenina má polydisperzný index D = 1,5, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je: 11 % epoxidových skupín, 27,5 % oxidovaných a redukovaných urónových zvyškov. Táto zlúčenina (ďalej označovaná ako ST1515) má vzorec (I), kde medzi inými príslušnými definíciami m:n =1:1 a jednotky označené ako m a n sú pravidelne rozmiestnené pozdĺž polysacharidového reťazca pravidelným spôsobom.

Štrnástou výhodnou zlúčeninou je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MW) 11 000 Daltonov. Táto zlúčenina má polydisperzný index D = 1,5, stupeň desulfátácie je 1,93 (vyjadrený ako molárny pomer SO₃.:COOO ), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní so všetkými urónovými kyselinami je: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných urónových zvyškov.

Príprava zlúčenín ST1514, ST1513, ST1516 a ST1515 je opísaná vo WO 01/55221.

Čiastočne 2-O-desulfátované deriváty podľa predkladaného vynálezu sú pripravené tak, ako je opísané v uvedenom WO 01/55221.

Čo sa týka N-desulfátovaných a prípadne N-acetylovaných glykozaminoglykanov podľa predkladaného vynálezu, môžu byť pripravené pomocou postupu, ktorý umožňuje prípravu 2-O- čiastočne desulfátovaných heparínov:

a) N-desulfátácia solvolytickou hydrolýzou sulfoaminových zvyškov v DMSO:H₂O = 95:5 (objem/objem) pri laboratórnej teplote počas 0,5 až 8 hodín, výhodnejšie počas asi 2 hodín, za vzniku úplnej alebo čiastočnej eliminácie síranových skupín v polohe 2 glukozamínových zvyškov;

b) N-acylácia uvedených úplne alebo čiastočne desulfátovaných skupín v polohe 2 glukozamínových skupín sa uskutoční v alkalickom vodnom roztoku (pH 8-9) pôsobením acylačného činidla, ako sú acylanhydridy, za vzniku úplne alebo čiastočne acylovaných skupín v polohe 2 glukozamínových zvyškov; získané zlúčeniny sú potom vystavené krokom c), d) alebo e) a f-g), alebo priamo kroku f);

c) základné spracovanie sa uskutoční pri teplote v rozsahu laboratórnej teploty až 100 °C, výhodne pri teplote v rozsahu 50 až 70 °C, výhodnejšie pri teplote 65 °C, čo umožní elimináciu kontrolovaného percenta síranových skupín v polohe 2 idurónovej kyseliny a tvorbu epoxidových skupín; a keď je želateľné

d) otvorenie uvedeného epoxidového kruhu pri pH 7, pri teplote v rozsahu 50 až 100 °C, výhodne pri teplote 70 °C, poskytuje zvyšky galakturónovej kyseliny; alebo

e) otvorenie uvedeného epoxidového kruhu pri teplote v rozsahu 0 až 30 °C, výhodne pri teplote 25 °C, poskytuje zvyšky idurónovej kyseliny; a keď je želateľná

f) oxidácia diolov periodatom sodným, čím dochádza k otvoreniu glykozidového kruhu a k tvorbe dvoch aldehydických skupín na jeden modifikovaný zvyšok; a keď je želateľná

g) redukcia uvedených aldehydických skupín na primárny alkohol a, keď je želateľná transformácia D skupiny na skupinu inú, ako je hydroxyl, ako je znázornené inými znakmi vo vzorci (I);

h) prípadná kyslá hydrolýza zlúčenín získaných v kroku g) za vzniku oligosacharidov so správnymi sekvenciami, výhodne deamináciou pôsobením kyseliny dusičnej. Táto reakcia, ktorá sa zvyčajne použije na získanie heparínu nízkej molekulovej hmotnosti, štiepi väzbu medzi N-síran glukozamínovými zvyškami a susediacou uránovou kyselinou za vzniku zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá má na neredukujúcom zakončení zvyšok obsahujúci uránovú kyselinu a na redukujúcom zakončení zvyšok anhydro manózy. Tento zvyšok môže byť ďalej modifikovaný redukciou na anhydromanitol pôsobením borohydridu. Získané zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou obsahujú najmenej jeden zvyšok idurónovej kyseliny s odštiepeným glykolom; alebo

i) vystavenie produktov získaných v kroku g) čiastočnej enzymatickej hydrolýze enzýmami vybratými zo skupiny obsahujúcej lyázu, heparinázu, heparitinázu alebo podobných, za vzniku oligosacharidov, výhodne tetra- alebo oktasacharidov s neredukujúcimi koncovými zvyškami, ktoré obsahujú nenasýtenú idurónovú kyselinu, redukujúci zvyšok obsahuje N-sulfoglukozamín a najmenej jeden zvyšok otvorenej idurónovej kyseliny.

i) zlúčenina získaná v kroku c) alebo produkt získaný v kroku d) je prípadne modifikovaný čiastočnou enzymatičkou hydrolýzou; a keď je želateľné

j) vystavenie produktov z krokov b), c) a f) čiastočnej 6-O-desulfátácii; alebo

k) vystavenie pôvodného heparínu čiastočnej alebo úplnej 6-desulfátácii v krokoch b), c) a f).

2-O-desulfátované deriváty podľa predkladaného vynálezu sa získajú opísaným spôsobom vynechaním krokov a) a b).

Spôsob podľa predkladaného vynálezu je tiež znázornený v nasledujúcej schéme:

čiastočný epoxid H. čiastočný 2-O-DcsulfH.

(ST1509-ST1525) (ST1527-ST1528) f!]

UWftMteprin —

Východiskový heparín _____________RedQx_________~___ (Štiepenie na nesulfátovaných idurónových kyselinách pôvodne prítomných vo východiskovom heparihe)

RO-Heparln

1)Py 2)DMSO/MeOH

NaOH hydrolýza

------- Epox ——2-O-desulphate ” Zvýšenie stupňa 2-O-desulfatácie

RadOx

N-desuffatovaný heparín «čiastočne _f 2-O-des-RO-H.

i j Hydrolýza

L s enzýmami |₍ alebosHNOj

LMW-2-O-des-RO-Heparin ηΑο,Ο

2) Na^CCVHjO

Epox _Hy*Ä 2-o.d^w, _^qx _s

Zvýšenie stupňa 2-O-desulfatácie

N-acyl-Heparin

RedOx (Štiepenie na nesulfátovaných idurónových kyselinách pôvodne prítomných vo východiskovom heparihe)

N-AcyhRO-Heparin

Hydrolýza

Is enzýmami alebo s HNO₂

LMW-N-Acyt-RO-Heparin

Výhodnými zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu sú:

- čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín získaný opísaným spôsobom, kde kroky a) a b) sú vynechané, krok c) sa uskutoční pri teplote 60 °C počas 45 minút, a krok d) sa uskutoční pri teplote 70 °C pri pH 7, ktorý má molekulovú hmotnosť (MW) 11 200, polydisperzný index D = 1,3, stupeň desulfátácie 1,99 (vyjadrený ako molárny pomer SO₃.:COO), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovým množstvom urónových kyselín je približne 50 % (sa ďalej označuje ako STÍ514);

- čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín nízkej molekulovej hmotnosti, získaný opísaným spôsobom, kde kroky a) a b) sú vynechané, krok c) sa uskutoční pri teplote 60 °C počas 45 minút a krok d) sa uskutoční pri teplote 70 °C pri pH 7, nasleduje deaminácia v krokoch f), g) a h), ktorý má molekulovú hmotnosť (MW) 3 050, polydisperzný index D = 2,2, stupeň desulfátácie 1,99 (vyjadrený ako molárny pomer SO₃.:COO ), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovým množstvom urónových kyselín je približne 50 % (sa ďalej označuje ako ST2010);

- čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín nízkej molekulovej hmotnosti, získaný opísaným spôsobom, kde kroky a) a b) sú vynechané, krok c) sa uskutoční pri teplote 60 °C počas 45 minút a krok d) sa uskutoční pri teplote 70 °C pri pH 7, potom nasleduje deaminácia v krokoch f), g) a h), ktorý má molekulovú hmotnosť Mn = 5 800, Mw = 7 520, polydisperzný index D = 1,294, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovým množstvom urónových kyselín je približne 50 % (tu sa ďalej označuje ako ST2184);

- N-acetyl heparín (50 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e) sú vynechané, krok f) sa uskutoční pri teplote 4 °C cez noc, krok g) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 3 hodín, ktorý má molekulovú hmotnosť (MW) 11 200, polydisperzný index D = 1,3, stupeň desulfátácie 1,6 (vyjadrený ako molárny pomer SO₃jCOO), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovým množstvom urónových kyselín je približne 30 % (ďalej sa označuje ako STÍ518);

N-acetyl heparín nízkej molekulovej hmotnosti (50 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e) sú vynechané, krok f) sa uskutoční pri teplote 4 °C cez noc, krok g) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 3 hodín, krok h) predstavuje deamináciu kyselinou dusičnou pri teplote 4 °C počas 17 minút, potom nasleduje redukcia aldehydických skupín borohydridom pri laboratórnej teplote počas 3 hodín, ktorý má molekulovú hmotnosť Mw = 4 780, Mn = 10 000, polydisperzný index D = 2,092, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovým množstvom urónových kyselín je približne 30 % (ďalej sa označuje ako ST2168);

- N-acetyl heparín (27 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e), f), g), h) sú vynechané, ktorý má molekulovú hmotnosť Mn = 10 890, Mw = 22 370, polydisperzný index D = 2,054 (ďalej sa označuje ako ST2037);

- N-acetyl heparín (39 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e), f), g), h) sú vynechané, ktorý má molekulovú hmotnosť Mn = 10 210, Mw = 21 270, polydisperzný index D = 2,083 (ďalej sa označuje ako ST2038);

- N-acetyl heparín (64 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e), f), g), h) sú vynechané, ktorý má molekulovú hmotnosť Mn = 11 070, Mw = 22 000, polydisperzný index D = 1,987 (ďalej sa označuje ako ST2041);

- N-acetyl heparín (27 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e), f), g), h) sú vynechané a ktorý má percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými urónovými kyselinami približne 30 %, (ďalej sa označuje ako ST2185);

- N-acetyl heparín (39 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e), f), g), h) sú vynechané, ktorý má percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými urónovými kyselinami približne 30 % (ďalej sa označuje ako ST2186);

N-acetyl heparín (64 %), získaný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutoční pri laboratórnej teplote počas 2 hodín, krok b) sa uskutoční pri teplote 4 °C počas 2 hodín a kroky c), d), e), f), g), h) sú vynechané a ktorý má percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými urónovými kyselinami približne 30 %, (ďalej sa označuje ako ST2187).

Prípravy zlúčenín ST1514, ST1513, ST1516 a ST1515 sú špecificky opísané vo WO 01/55221.

Molekulové hmotnosti boli stanovené HPLC-GPC (vysokoúčinná kvapalná chromatografia - gélová permeačná chromatografia). Stupeň desulfátácie bol stanovený konduktometriou a percento modifikovaných urónových kyselín pomocou ¹³C NMR.

Mw je molekulová hmotnosť, D je polydisperzný index vyjadrený ako MW/Mn.

Východzím produktom sú podľa predkladaného vynálezu glykozaminoglykany rôzneho pôvodu, výhodne prirodzene sa vyskytujúce heparíny. Je tiež možné použitie chemicky modifikovaných heparínov s percentuálnym obsahom N,6 disulfátu v rozsahu 0 až 100 %. Keď východiskové produkty majú iný obsah 6-O-sulfatovaného glukozamínu, je možné modulovať dĺžku pravidelnej sekvencie medzi otvorenou idurónovou kyselinou a inými zložkami. Podľa predkladaného vynálezu glykozaminoglykany, ktoré majú otvorený kruh glykozidu, sa bežne nazývajú RO deriváty, čo znamená, že glykozidický kruh je otvorený pôsobením oxidácie, potom nasleduje redukcia (Reduction-Oxidation - RO). Toto otvorenie glykozidického kruhu sa bežne nazýva odštiepenie glykolu, nazýva sa tak preto, že dochádza k tvorbe dvoch primárnych hydroxylov prítomných na otvorenom kruhu. Tu uvádzané zlúčeniny sa tiež nazývajú RO alebo Glykol odštiepené deriváty.

V inom uskutočnení vynálezu aldehydy a primárny hydroxyl odvodené z reakcie otvorenia opísanej skôr (odštiepenie glykolu) vedú k následnej účinnosti. Preto zlúčeniny vzorca (I) môžu tiež obsahovať rovnaké alebo rozdielne skupiny, ako je definované pre X a X', na primárnom hydroxyle odvodenom z odštiepeného glykolu, napríklad, oligosacharid alebo peptidové skupiny, v rozsahu jednoduchého sacharidu alebo aminokyseliny až k viac ako jednej jednotke dĺžky, výhodne 2 alebo 3 jednotky.

Zlúčeniny vzorca (I), kde X a X' sú -C_h2OH, môžu byť tiež použité ako vehikulá pre lieky iného typu tým, že sa vhodne viažu s heparínovou časťou, ktorá je schopná vytvoriť stabilnú väzbu v normálnych podmienkach výroby a skladovania pripraveného lieku. Týka sa to však aj transportu lieku, výhodne do blízkosti cieľového orgánu. Príklady liekov, ktoré môžu byť transportované, sú steroidné a nesteroidné protizápalové lieky, kortikosteroidy a iné lieky s antimetastatickým účinkom. V tomto prípade bude výhodné zvýšenie antimetastatického účinku ako výsledok súčtu samostatných vnútorných aktivít zlúčenín podľa predkladaného vynálezu a antimetastatickej látky, ku ktorej sú naviazané. Výhodou bude vyššia cielená selektivita a nižšia systémová toxicita. Príkladmi takýchto liekov sú inhibítory metaloproteináz. Iné lieky, ktoré môžu byť transportované, sú tie, ktoré pôsobia na úrovni endotelu. Zlúčeniny vzorca (I), kde X a X’ sú iné ako hydroxy alebo aldehyd, môžu byť použité ako vehikulá pre lieky, v ktorých X a X' budú pôsobiť ako spacery medzi transportovanou molekulou. Znamená to, že glykozaminoglykan podľa predkladaného vynálezu a molekula pôsobiaca ako vehikulum, v prípade keď je to želateľné, môže byť žiaduca z dôvodov farmakokinetiky alebo farmakodynamiky.

V prípade zlúčenín podľa predkladaného vynálezu, ktoré sú odvodené od heparínu, sú tieto zlúčeniny pripravené z heparínu N-desulfátáciou, po ktorej nasleduje N-acylácia spôsobmi, ktoré sú dobre známe odborníkom. Napríklad, N-desulfátácia sa uskutoční solvolýzou v DMSO:H2O roztoku 95:5 (objermobjem) pri laboratórnej teplote v časovom rozsahu 0,5 až 8 hodín, po ktorej nasleduje N-acylácia v alkalických podmienkach, napríklad, acylanhydridov (napríklad, acetyl, hexanoyl, sukcinyl, pivaloyl).

Nasledujúca 2-O-desulfátácia sa uskutoční v prítomnosti alkalických látok, ako je hydroxid sodný, pri teplote v rozsahu od laboratórnej teploty do 100 °C, výhodne od 50 do 70 °C, napríklad pri teplote 60 °C, dostatočne dlhý čas na dosiahnutie 2-O-desulfátácie. 2-O-desulfátácia je kontrolovaná meraním parametrov, ako sú koncentrácie reaktantov, teplota a reakčný čas. Výhodným príkladom je udržiavanie konštantných koncentrácií substrátu (glykozaminoglykanu) na hodnote 80 mg/ml a NaOH pri koncentrácii 1 M, konštantnej teplote 60 °C a kontrola desulfátácie v čase 15 až 60 minút. Odborníci môžu zmeniť podmienky, napríklad zvýšenie reakčnej teploty a skrátenie reakčného času, na základe normálnej skúšky a chýb pri uskutočnení vynálezu a na základe jeho alebo jej všeobecných vedomostí o danom predmete.

Pôsobenie alkalických činidiel poskytuje väčšie množstvo medziproduktu, ktorý je charakterizovaný prítomnosťou epoxidového kruhu na desulfátovanej jednotke. Prekvapivo sa dokázalo, že tieto medziprodukty vykazujú inhibičné vlastnosti proti heparanáze a sú podobné zlúčeninám vzorca (I). Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je derivát čiastočne 2-O-desulfátovaného heparínu. Je to heparín s redukovaným nábojom, predovšetkým heparín s nie viac ako 60 % 2-O-desulfátáciou, ktorý má epoxidový kruh na desulfátovanom mieste. Tie zlúčeniny, ktoré sú charakterizované epoxidovým kruhom, sú tiež cieľom predkladaného vynálezu.

Po vytvorení epoxidového kruhu je tento kruh otvorený známymi postupmi. Percento vytvoreného epoxidu sa vypočíta z pomeru medzi plochami ¹³C-NMR signálov pri 55 ppm, znakov uhlíkov 2 a 3 kruhu urónovej kyseliny obsahujúcej epoxid a celkovým počtom anomérnych signálov (C1 zvyškov glukozamínu a uránovej kyseliny). Keď otvorenie nastane za tepla, získa sa zvyšok galakturónovej kyseliny, ale keď otvorenie epoxidového kruhu sa uskutoční za studená, získa sa zvyšok kyseliny idurónovej. Výhodnými príkladmi zlúčenín obsahujúcich epoxidový kruh sú tie, ktoré sa získajú opísaným spôsobom a ktoré obsahujú epoxidovanú kyselinu uránovú v množstve 14 % (ďalej označované ako STÍ509), 24 % (ďalej označované ako STÍ525) a 30 % (ďalej označované ako 1526).

Čiastočne desulfátovaný heparín je potom vystavený odštiepeniu glykolu (v skratke RO) opísaným spôsobom a Smithovou degradáciou (v skratke SD).

Zlúčeniny vzorca (I) môžu byť tiež získané bez toho, aby vznikol epoxidový medziprodukt, znamená to priamym odštiepením glykolu a následnou Smithovou degradáciou.

Opísaný spôsob vedie k tvorbe zlúčenín vzorca (I), kde obe skupiny X a X' sú -CH₂OH.

Keď X a X' sú iné ako -CH₂OH, odborníci poznajú spôsoby transformácie hydroxylovej skupiny inými skupinami v zmysle uvedených definícií (pozri, napríklad, schému na strane 26, zlúčeniny STÍ828, STÍ829, ST1917 a ST1919). Napríklad, konjugácia s aminokyselinami alebo peptidmi sa môže uskutočniť tak, že aldehyd medziproduktu po odštiepení glykolu je redukčné aminovaný (Hoffmann J. a spol. Carbohydrate Research, 117, 328-331 (1983)) vo vodnom rozpúšťadle a zachováva pritom heparínovú štruktúru.

Keď je želateľné, a čo predstavuje ďalší predmet predkladaného vynálezu, zlúčeniny vzorca (I) môžu byť ďalej degradované kyslým činidlom v sulfatačne vhodnom pH, napríklad, pri pH 4, za vzniku zmesi oligosacharidov, ktoré si zachovávajú antiangiogenetické vlastnosti.

Rovnako predmetom predkladaného vynálezu sú zlúčeniny získané jedným z krokov g), h), i) aj), spôsobov opísaných skôr.

Predmety predkladaného opísaného vynálezu sú farmaceutické kompozície obsahujúce ako aktívnu zložku najmenej jednu zlúčeninu vzorca (I), samotnú alebo v kombinácii s jednou zlúčeninou alebo viacerými zlúčeninami vzorca (I), alebo zlúčeninu vzorca (I) alebo zlúčeniny v kombinácii s N-acyl-desulfátovanými heparínmi opísanými skôr, to znamená epoxidované medziprodukty; tieto medziprodukty môžu byť tiež použité samostatne ako aktívne zložky vo farmaceutických kompozíciách. Aktívna zložka podľa predkladaného vynálezu bude v zmesi s vhodným vehikulom a/alebo základom bežne používaným vo farmaceutickej technológii, ako sú napríklad opísané v Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, posledné vydanie. Kompozície podľa predkladaného vynálezu budú obsahovať terapeuticky účinné množstvo aktívnej zložky. Dávky budú stanovené odborníkom, napríklad klinikom alebo praktickým lekárom podľa typu ochorenia a stavu pacienta alebo v závislosti od súčasne podávaných iných aktívnych látok. Napríklad, môžu byť použité dávky 0,1 až 100 mg/kg.

Príklady farmaceutických kompozícií sú tie, ktoré môžu byť podávané ústne alebo parenterálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, transdermálne alebo vo forme nosných alebo ústnych sprejov. Vhodné sú farmaceutické kompozície ako tablety, tvrdé alebo mäkké kapsule, prášky, roztoky, suspenzie, sirupy a pevné formy improvizovaných kvapalných prípravkov. Kompozície na parenterálne podanie sú, napríklad všetky intramuskulárne, intravenózne a subkutánne injekčné formy a rovnako roztoky, suspenzie a emulzie. Treba tiež spomenúť formy lipozómov. Tablety tiež zahrňujú formy na kontrolované uvoľňovanie aktívnej zložky, či už sú vo forme ústneho podania, alebo ako tablety pokryté vhodnými vrstvami, mikroenkapsulované prášky, komplexy s cyklodextrínmi, depotné formy, napríklad, subkutánne formy, depotné injekcie alebo implantáty.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu majú antiheparanázovú aktivitu a antiangiogenetickú aktivitu. Tieto vlastnosti sú vhodné na prípravu liekov vhodných na liečenie objektov, všeobecne cicavcov a predovšetkým ľudských jedincov, ktorí trpia zmenou angiogenézy, alebo subjektov, ktorí potrebujú liečenie založené na inhibícii heparanázy.

Príkladmi chorôb, ktoré lieči liek, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, sú primárne nádory, metastázy, diabetické retinopatie, psoriázy, retrolentikulárna fibroplázia, restenóza po angioplastike, koronárny by-pass, zápal, artritída, autoimúnne ochorenia, odmietnutie štepu, kardiovaskulárne ochorenia, fibroproliferatívne ochorenia, ochorenia spojené s abnormálnym zhlukovaním trombocytov, ochorenia v dôsledku proliferácie hladkých svalov, Goodpasture syndróm, akútna glomerulonefritída, neonatálna pulmonárna hypertenzia, astma, kongestívne zlyhanie srdca, pulmonárna hypertenzia dospelých, renálna vaskulárna hypertenzia, proliferatívne retinopatie, experimentálne autoimúnne encefalomyelitídy, skleróza multiplex, diabetes závislý na inzulíne, zápalové ochorenia čriev, vredová kolitída, Crohnova choroba.

Výhodne zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu nemajú vedľajšie účinky typické pre heparín. Predovšetkým zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu nemajú antikoagulačnú aktivitu. Keďže nemajú túto aktivitu, pre odborníkov to znamená žiadnu alebo nepatrnú aktivitu pri klinickom použití.

Inhibičná aktivita proti heparanáze bola stanovená podľa spôsobu Vlodavského skupiny (Bitan M. a spol., 1995). Metóda je založená na vyhodnotení rozsahu fragmentácie reťazcov heparan sulfátu v heparan sulfát proteoglykanoch (HSPG) pôsobením heparanázy. Ako zdroj HSPG sa všeobecne používa síranom označený extracelulárny matrix (ECM). Sulfátom označený ECM je inkubovaný s rekombinantnou heparanázou pri pH 6,2 v neprítomnosti alebo v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií testovanej zlúčeniny. Na vyhodnotenie prítomnosti degradovaného proteoglykanu je inkubačné médium prefiltrované cez kolónu s gélom Sepharose 6B (0,9 x 30 cm). 0,2 ml frakcie sú eluované PBS pri nízkej rýchlosti (5 ml/h). Meria sa rádioaktivita frakcií.

Vylúčený objem (V_o) je označený dextranom a celkový objem (V_t) je označený fenolovou červeňou. Degradačné fragmenty HS reťazcov sú eluované z kolóny pri 0,5 < K_av < 0,8 (vrchol II). V týchto pokusných podmienkach, dobré inhibítory heparanázy inhibujú fragmentáciu HS v koncentrácii 10 pg/ml alebo nižšej.

Výsledky sú zaznamenané v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Inhibícia heparanázy v dávkovom rozsahu 25 pg/ml až 5 pg/ml

		Inhibícia
	Dávka	25pg/ml	ΙΟμ/ml	5 pg/ml
	HEPARÍN	100 %	n. d.	> 100
ST1516	Heparín 40 % RO	100 %	n. d.	> 85 %
ST1514	Heparín ~50 % RO	100%	100%	> 85 %
ST1515	Heparín 27,5 % RO	100 %	100%	100 %
Stl518	50 % NAc heparín 30 %	100%	100%	> 85 %

Je vhodné poznamenať, že ST1518 má vysokú inhibičnú aktivitu dokonca aj v koncentrácii 1 pg/ml.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu a predovšetkým nové zlúčeniny boli testované na ich aktivitu smerom k FGF rastovým faktorom na rovnakom experimentálnom modeli, ako je opísané vo WO 01/55221, a vykazujú porovnateľnú aktivitu so zlúčeninami uvedenými v citovanej literatúre.

Nasledujúce príklady ilustrujú vynález.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku 1 je ¹³C NMR spektrum zlúčeniny ST1518.

Na obrázku 2 je ¹³C NMR spektrum zlúčeniny ST2010.

Na obrázku 3 je ¹³C NMR spektrum zlúčeniny ST2041.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

ST1518

Nadbytok pyridínu bol pridaný do vodného roztoku 1 g heparínu, ktorý vytiekol z kolóny Amberitu IR 120. Roztok bol odparený pri zníženom tlaku; výsledná pyridínová soľ heparínu bola rozpustená v 50 ml zmesi DMSO/H₂O 95:5 a premiešavaná 2 hodiny pri teplote 20 °C. Získal sa tak desulfátačný stupeň asi 50 %.

Roztok bol potom zriedený rovnakým objemom nasýteného roztoku NaHCO₃. Vzniknutý roztok bol dialyzovaný proti destilovanej vode v membránach (1 000 - 2 000 D). Výsledný produkt bol izolovaný odparením pri zníženom tlaku.

N-acetylovaný heparín bol pripravený N-acetyláciou 50 % desulfátovaného heparínu. 1 g heparínu bol rozpustený v 10 ml destilovanej vody; roztok bol ochladený na teplotu 4 °C a nasýtený kyslým uhličitanom sodným; k tomuto roztoku bol pridaný roztok 625 μΐ anhydridu kyseliny octovej a zmes bola miešaná 2 hodiny pri teplote 4 °C. Počas reakcie bolo kontrolované pH a toto bolo udržiavané pri hodnote okolo 8 pridaním kyslého uhličitanu sodného. Potom bol získaný roztok dialyzovaný proti destilovanej vode v membránach (2 000 až 1 000 D).

g heparín 50 % N-acetylovaný heparín je rozpustený v 25 ml destilovanej vody a ochladený na teplotu 4 °C. Po pridaní 25 ml roztoku NaIO₄ 0,2 M, roztok bol miešaný 20 hodín v tme a reakcia bola zastavená pridaním etylénglykolu a soli boli odstránené centrifugáciou v uhlovej ultracentrifúge. K odsolenenému roztoku bolo pridaných 400 mg NaBH₄ a bol rozdelený do niekoľkých častí. Roztok sa potom miešal 3 hodiny pri laboratórnej teplote, potom bol neutralizovaný zriedenou HC1 a odsolený v uhlovou ultrafiltráciou.

¹³C NMR spektrum zlúčeniny je na obrázku 1.

Príklad 2

ST2010 a ST2184 g heparínu je rozpustených v 63 ml roztoku NAOH, 1 N. Roztok sa ponechá miešať 45 minút pri teplote 60 °C, a potom je neutralizovaný zriedenou HC1. Roztok je potom miešaný 48 hodín pri teplote 70 °C, následne je ochladený a dialyzovaný proti vode v membránach (2 000 až 1 000 D).

g 2-0-desulfátovaného heparínu je rozpustených v 50 ml destilovanej vody a ochladených na teplotu 4 °C. Po pridaní 50 ml roztoku NaIO₄, 0,2 M bol roztok miešaný 20 hodín v tme a reakcia bola zastavená pridaním etylénglykolu. Soli boli odstránené uhlovou ultracentrifugáciou. Potom bolo k roztoku pridaných 800 mg NaBH₄, rozdelených na niekoľko častí. Roztok bol následne miešaný 3 hodiny pri laboratórnej teplote, potom bol neutralizovaný zriedenou HC1 a odsolený uhlovou ultracentrifugáciou.

400 mg oxidovano-redukovaného heparínu je rozpustených v 25 ml destilovanej vody. Po pridaní 7 mg NaNO₂, bolo pH upravené na hodnotu 2 pridaním zriedenej HC1. Roztok bol miešaný 17 minút pri teplote 4 °C. Reakcia bola zastavená neutralizáciou. K odsolenému roztoku bol pridaný NaBH₄ v niekoľkých dávkach. Potom bol roztok miešaný 3 hodiny pri laboratórnej teplote a následne neutralizovaný pridaním zriedenej HC1. Nasledovala frakcionácia gélovou filtráciou.

Izolované boli dve frakcie s rozdielnymi molekulovými hmotnosťami: ST2010 s molekulovou hmotnosťou Mw = 3 050 a ST2184 s Mn = 5 800, Mw = 7 520.

¹³C NMR spektrum zlúčeniny ST2010 je na obrázku 2.

Príklad 3

ST2041

Nadbytok pyridínu bol pridaný k vodnému roztoku 2 g heparínu, ktorý bol eluovaný z kolóny Amberlitu IR 120. Roztok bol odparený pri zníženom tlaku; výsledná pyridínová soľ heparínu bola rozpustená v 100 ml zmesi DMSO/H₂O 95:5 a roztok bol miešaný 4 hodiny pri teplote 20 °C. Získal sa tak stupeň desulfátácie asi 64 %.

Roztok bol potom zriedený rovnakým objemom nasýteného roztoku NaHCO3 a potom dialyzovaný proti destilovanej vode v membránach (1 000 až 2 000 D). Výsledný produkt bol izolovaný odparením pri zníženom tlaku.

Claims

1. Čiastočne alebo úplne N-desulfátovaný, N-reacetylovaný heparín vzorca (I)

kde U kruh má nasledovný význam:

C kde R a R! sú acetylové zvyšk;

X a X' sú -CH₂-D skupina, kde D je hydroxyl;

- čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MH) 11 200, polydisperzným indexom 1,3, stupňom desulfátácie 1,6 (vyjadrené ako molárny pomer SO₃‘ : COO ), percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní so všetkými uránovými kyselinami približne 30 %, pričom 50 % z celkového počtu R a R_t tvorí acetyl,

- nízkomolekulový čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín s molekulovou hmotnosťou Mn 4780, MH 10000, polydisperzným indexom 2,092, percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní so všetkými uránovými kyselinami približne 30 %, pričom 50 % z celkového počtu R a R] tvorí acetyl,

- čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, s percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní so všetkými uránovými kyselinami približne 30 %, pričom 27 % z celkového počtu R a Ri tvorí acetyl,

- čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, s percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní so všetkými uránovými kyselinami približne 30 %, pričom 39 % z celkového počtu R a R! tvorí acetyl, čiastočne N-desulfátovaný a N-reacetylovaný heparín, s percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní so všetkými uránovými kyselinami približne 30 %, pričom 64 % z celkového počtu R a Rj tvorí acetyl.

2. Spôsob prípravy zlúčeniny podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:

d) redukciu uvedených aldehydových skupín na primárny alkohol;

e) prípadnú kyslú hydrolýzu zlúčenín získaných v kroku d) za vzniku oligosacharidov s obvyklými sekvenciami; alebo

f) vystavenie produktov získaných v kroku d) čiastočnej enzymatickej hydrolýze enzýmami vybranými zo skupiny obsahujúcej lyázu, heparinázu, heparitinázu alebo za vzniku oligosacharidov, výhodne tetra- alebo oktasacharidov s neredukujúcim koncovým zvyškom, ktorý obsahuje nenasýtenú idurónovú kyselinu, redukujúci zvyšok obsahujúci N-sulfoglukozoamín a najmenej jeden zvyšok otvorenej idurónovej kyseliny.

3. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na prípravu liečiva majúceho inhibičný účinok na heparanázu.

4. Použitie podľa nároku 3, kde uvedené liečivo má antiangiogénny účinok.

5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 4, kde uvedené liečivo je vhodné na liečbu zápalov.

6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 5, kde uvedené liečivo je vhodné na liečbu autoimúnnych ochorení.

7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 6, kde ochorenie ktoré má byť liečené je vybrané zo skupiny zahrnujúcej primárne nádory, metastázy, diabetické retinopatie, psoriázy, retrolentikulárna fibroplázia, restenóza po angioplastike, koronárny by-pass, zápal, artritída, autoimúnne ochorenia, odmietnutie štepu, kardiovaskulárne ochorenia, fibro-proliferatívne ochorenia, ochorenia spojené s abnormálnym zhlukovaním trombocytov, ochorenia v dôsledku proliferácie hladkých svalov, Goodpasture syndróm, akútna glomerulonefritída, neonatálna pulmonárna hypertenzia, astma, kongestívne zlyhanie srdca, pulmonárna hypertenzia dospelých, renálna vaskulárna hyper-tenzia, proliferatívne retinopatie, experimentálne autoimúnne encefalomyelitídy, skleróza multiplex, diabetes závislý na inzulíne, zápalové ochorenia čriev, vredová kolitída, Crohnova choroba.

8. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej jednu zlúčeninu podľa nároku 1 ako účinnú zložku v zmesi s farmaceutický prijateľným vehikulom a excipientmi.