PT2343077E

PT2343077E - Derivados de glicosaminoglicanos totalmente n-dessulfatados como inibidores da heparanase, capazes de atividade antiangiogénica e desprovidos de efeito anticoagulante

Info

Publication number: PT2343077E
Application number: PT101838324T
Authority: PT
Inventors: Claudio Pisano; Benito Casu; Giangiacomo Torri; Giuseppe Giannini; Annamaria Naggi; Sergio Penco
Original assignee: Sigma Tau Res Switzerland Sa
Priority date: 2001-09-12
Filing date: 2001-09-12
Publication date: 2013-08-29
Also published as: EP1427427B1; HUP0401693A3; SI1427427T1; PT1427427E; SK288335B6; EP1427427A1; CN1547477A; BR0117124A; CA2457719A1; CN1547477B; ES2431362T3; EP2343077B1; CZ307433B6; SK1602004A3; EP2343077A1; AU2001292231B2; DK1427427T3; US20050137167A1; ATE511846T1; HK1069537A1

Description

DESCRIÇÃO

DERIVADOS DE GLICOSAMINOGLICANOS TOTALMENTE N-DESSULFATADOS COMO INIBIDORES DA HEPARANASE, CAPAZES DE ATIVIDADE ANTIANGIOGÉNICA E DESPROVIDOS DE EFEITO ANTICOAGULANTE A invenção aqui descrita diz respeito a heparinas totalmente N-dessulfatadas e N-Meacetiladas, aos processos para a sua preparação, à sua utilização como ingredientes ativos para a preparação de medicamentos úteis em condições patológicas, tais como tumores, incluindo as formas metastáticas, e para qualquer indicação terapêutica com beneficio na inibição da heparanase e a composições farmacêuticas que os contêm.

Estado da técnica - Os estudos realizados na Tumor Biological Research Unit of the Hadassah-Hebrew University Hospital-Israel (Isr. Med. Chem. Assoe. J. 2000, 2, 37-45, J. Med.

Chem. 2000, 43, 2591-600 ; Invasion Metastasis 1994-95, 14, 290-302 ; Exp. Cell Res. 1992, 201, 208-15 ;) focam sobre o envolvimento de fatores de crescimento de ligação à heparina, sulfato de heparan e enzimas (heparanase) que degradam sulfato de heparan na angiogénese e metástase tumoral. Estes estudos têm sido aplicados ao rastreio e identificação de derivados de heparina e de heparina / sulfato de heparan miméticos com atividade inibidora potente de heparanase (Nature Med. 1999, 5, 735-6; Science, 1999, 285, 33-4].

As células de tumor libertam a enzima heparanase, uma endo-β-D-glucuronidase que degrada a cadeia de polissacarídeos de proteoglicanos de sulfato de heparan na superfície celular e na matriz extracelular. O envolvimento da heparanase na angiogénese tumoral tem sido correlacionado com a capacidade de libertação de bFGF (FGF-2) e outros fatores de crescimento a partir do seu armazenamento 1 dentro da ECM (matriz extracelular). Estes fatores de crescimento proporcionam um mecanismo para a indução de neovascularização em situações normais e patológicas. A heparanase pode, assim, não só facilitar a invasão de células tumorais e metástase, mas também a angiogénese do tumor, ambos passos críticos na progressão tumoral.

Os inibidores específicos da enzima heparanase impedem a liberação e ativação de fatores de crescimento armazenados pelo sulfato de heparan, bem como a disrupção de MEC, e são consideradas uma abordagem muito promissora para o desenvolvimento de drogas anticancerígenas.

Assim, uma das possíveis abordagens terapêuticas para um fármaco antiangiogénico é o desenvolvimento de um inibidor de heparanase potente e seletivo.

Pode ser feita referência, para uma discussão da angiogénese, ao documento WO 01/55221, em nome do presente requerente.

Outro envolvimento da heparanase é quer a inflamação quer a autoimunidade. Na verdade, a atividade de heparanase também se correlaciona com a capacidade das células ativas do sistema imunitário para deixarem a circulação e provocarem ambas as respostas inflamatória e autoimune. A interação das plaquetas, granulócitos, , linfócitos T e B, macrófagos e mastócitos com o ECM subendotelial está associada com a degradação do sulfato de heparan pela atividade da heparanase. A enzima é libertada a partir de compartimentos intracelulares (isto é, lisossomas, grânulos específicos) em resposta a vários sinais de ativação, sugerindo o seu envolvimento e presença regulamentada nos locais de inflamação e lesões autoimunes. O tratamento de animais 2 experimentais com inibidores da heparanase (ou seja, as espécies não-anticoagulantes de heparina de baixo peso molecular - HBPM) reduziu acentuadamente a incidência da encefalomielite autoimune experimental (EAE), artrite adjuvante e a rejeição do enxerto em animais experimentais, indicando que os inibidores da heparanase podem ser aplicados para inibir a doença autoimune e inflamatória.

Heparina A heparina é uma mistura heterogénea de polissacáridos de ocorrência natural de vários tamanhos e de vários graus de sulfatação que possui atividade anticoagulante e é segregada pelos mastócitos do tecido conjuntivo presentes no fígado (a partir do qual foi isolado pela primeira vez), nos músculos, pulmões, timo e baço.

Em adição à sequência regular, uma sequência correspondente ao local ativo para a atividade da antitrombina foi identificada na heparina. A atividade antitumoral e antimetastática da heparina e dos seus derivados é, devido à sua capacidade para inibir a heparanase, bloquear os fatores de crescimento e regular a angiogénese.

Sulfatos de heparan (HS)

Os sulfatos de heparan (HS) são proteínas ligantes ubíquas. As proteínas ligam-se às cadeias de HS para uma variedade de ações da simples imobilização ou proteção contra a ação de degradação proteolítica a modulações específicas de atividades biológicas, tais como a angiogénese. 3 0 esqueleto de hidratos de carbono, tanto na heparina e no sulfato de heparan (HS), consiste na alternância de D-glucosamina (GlcN) e ácidos hexurónicos (GlcA ou IdoA).

Na heparina, os resíduos GlcN são principalmente N-sulfatados, enquanto que no HS ambos são N-sulfatados e N-acetilados, com uma pequena quantidade de grupos NH2 não substituídos. 0 HS também é, em média, menos O-sulfatado do que a heparina. A utilização de heparina no tratamento de distúrbios da angiogénese, tais como tumores, em particular as metástases, é substancialmente limitada pela atividade anticoagulante da heparina.

As modificações químicas têm sido feitas para a heparina, de modo a reduzir a sua capacidade anticoagulante, preservando ao mesmo tempo as suas propriedades antitumorais. A abertura de uma unidade de ácido glucurónico no local da antitrombina reduz a afinidade da heparina para a antitrombina: desta forma, as heparinas podem ser usadas com efeitos anticoagulantes reduzidos, mas mantendo ainda as propriedades antiangiogénicas.

Heparanases

As heparanases são enzimas pertencentes a uma família de endoglicosidases (uma endo-p-D-glucuronidase) que hidrolisam as ligações glicosídicas internas das cadeias de sulfato de heparan (HS) e heparina. 4

Estas endoglicosidases estão envolvidas na proliferação de células tumorais, em metástases e na neovascularização de tumores. Essas enzimas são alvos biológicos para a atividade antiangiogénica. Na literatura cientifica, há um grande número de estudos de correlação de estrutura/atividade (ver, por exemplo, F. Lapierre et al. , Glycobiology, vol. 6, (3), 355-366, 1996) . Embora muitos aspetos ainda precisem ser esclarecidos, têm sido relatados estudos sobre a inibição da heparanases pela heparina e seus derivados, usando testes específicos que levaram ao surgimento de considerações de tipo estrutural que podem servir como guias para a obtenção de derivados novos, mais seletivos.

Na obra supramencionada de Lapierre et al., os derivados de heparina são descritos como tendo sido obtidos por 2-0 dessulfonação ou por "separação de glicol" (oxidação com periodato e subsequente redução com borohidreto de sódio). Estes derivados, aqui definidos como "heparina 2-0-desulfonada" e "RO-heparina", respetivamente, mantêm, em parte, a atividade antiangiogénica da heparina tal como avaliado por meio do teste CAM na presença de corticosteróides (ibid. página 360).

Os derivados N-acil de heparina, que são mímicos de sulfato de heparan mais próximos do que a heparina, têm sido relatados para inibir a heparanase apenas um pouco menos do que os derivados de N-sulfato. (Irimira T., Biochemistry 1986, 25, 5322-5328; Ishai-Michaeli R., et al, Biochemistry 1992, 31, 2080-2088) .

As heparinas e FGF FGF regulam vários processos fisiológicos, tais como o crescimento e a diferenciação celular, mas também as funções 5 envolvidas em processos patológicos tais como a angiogénese tumoral. FGFs são fatores de crescimento (uma família de mais de 10 polipéptidos, do qual o ácido (FGF-1) e FGF básico (FGF-2) são os que têm sido mais estudados, ) os quais requerem um cofator polissacárido, ou heparina HS, para se ligarem ao recetor de FGF (FGFR) e ativá-lo.

Embora seja desconhecido o mecanismo exato pelo qual a heparina e HS ativam FGF, sabe-se, no entanto, que a heparina/FGF/ FGFR formam uma "trimolécula" ou um complexo "ternário".

Um mecanismo postulado é que a heparina e HS induzem a chamada dimerização sanduíche de FGF, e este último, assim dimerizado, forma um complexo estável com FGFR.

Atividade antimetastática de derivados de heparina A capacidade de um tumor primário para gerar células metastáticas é, talvez, o principal problema a terapia anticancerígena.

Os derivados de heparina, com uma capacidade substancial para bloquear a heparanase parecem ser igualmente capazes de inibir a angiogénese tanto em tumores primários como nas metástases.

Além disso, a inibição da heparanase reduz a capacidade de migração das células tumorais do tumor primário para outros órgãos. 6

Verificou-se que a atividade antimetastática em modelos animais possui correlação com a capacidade inibidora de heparanase da heparina e dos derivados de heparina (Bitan M. et al, Isr. J. Med. Chem. Sei. 1995, 31, 106-108) assim como de outros polissacáridos sulfatados (Miao, H. Q. et al, Int. Sei. 1995, 31, 106-108), (Miao, HQ et ai, Int. J. Câncer 1999, 83, 424-431, e referências). Os estudos sobre a dependência do peso molecular da atividade antimetastática, também indicaram que as heparinas de PM muito baixo (Sciumbata, T. et al Invasion Metastasis 1996, 16, 132-143) e os oligossacáridos polisulfatos (Parish, RC, et al, Câncer Res. 1999, 59, 3433-3441) retém significativamente a atividade antimetastática. Embora, em geral, a remoção de grupos N-sulfato (N-desulfonação) diminuao potencial antimetastático das heparinas, esta atividade é parcialmente restaurada mediante a N-acilação (N-acetilação, N-hexanoilação (Bitan M., 1995), e N-succinilação (Sciumbata, T., 1996), dos grupos resultantes NH2 livres. Verificou-se que a atividade antimetastática das heparinas está inversamente correlacionada com os seus graus de 0-sulfatação. (Bitan M., 1995). No entanto, a 2-O-desulfatação seletiva de resíduos de ácido idurónico não envolve uma forte redução da atividade antimetastática da heparina (Lapierre, F., Glycobiology 1996, 6, 355-366).

De um modo geral, tanto o inibidor de heparanase e a atividade antimetastática da heparina e de outros polissacáridos sulfatados diminuem com a diminuição do peso molecular e do grau de sulfatação (Bitan M., 1995; Parish, CR, 1999) . Contudo, estas atividades também dependem do hidrato de carbono da espinha dorsal do polissacarídeo (tipo de resíduos e posição das ligações glicosídicas) (Parish, CR, 1999) . Uma vez que a estrutura tridimensional do local ativo da heparanase ainda não é conhecido, é difícil prever quais 7 as espinhas dorsais de polissacáridos e os padrões de sulfatação inibem mais eficazmente a enzima.

Com base no conhecimento atual, os requisitos estruturais de moléculas semelhantes à heparina, que favorecem a ação de inibição da angiogénese podem ser agrupados em duas categorias com base no alvo que se pretende bloquear: a) inibição da heparanase: embora esta enzima reconheça e clive a heparina e as sequências HS de pelo menos oito unidades de monossacárido que contém ácido N-acil-glucosamina-glucurónico (ou resíduos N-sulfatados de glucosamina ver, por exemplo, D. Sandback-Pikas et al J. Biol. Chem., 273, 18.777-18.780 (1998) e referências citadas), a sua inibição pode ser eficientemente realizada por fragmentos de heparina mais longos do que tetradecasacarido (Bitan M., 1995) ou por oligossacáridos extensivamente sulfatados, mais curtos, tais como o sulfato de maltohexaose (MHS) e sulfato de fosfomanopentose (PI-88) (Parish, CR, 1999). No entanto, ambos os fragmentos longos de heparina e oligossacarídos sulfatados mais pesados são anticoagulantes, uma propriedade que deve ser evitada em potenciais medicamentos antimetastáticos; b) inibição de fatores de crescimento angiogénicos (tipo fibroblastos: FGF-1 e FGF-2; endotélio vascular tipo: VEGF; permeabilidade vascular tipo: VPF) : para esse fim os compostos heparina preferencialmente sequências de pelo menos cinco unidades de monossacarídeos, contendo ácido 2-idurónico sulfatado e N,6-glucosamina sulfatada (ver, por exemplo, M. Maccarana et al. J. Biol. Chem., 268, 23.989-23.905 (1993)). 8 A literatura descreve péptidos pequenos (5-13 aminoácidos) com atividade antiangiogénica (Patente dos EUA 5.399.667, da Universidade de Washington) , que atuam por ligação a um recetor de trombospondina, ou péptidos mais longos (cerca de 50 aminoácidos.). São conhecidos fatores de modificação de plaquetas (EP 0 589 719, Lilly) , capazes de inibir a proliferação endotelial, com IC5o = 7 nM.

Os fragmentos de oligossacarideos com atividade antiangiogénica também têm sido amplamente descritos: verificou-se, de facto, que através da variação da sequência de hidratos de carbono pode ser aumentada a seletividade de interação.

Além disso, a heparina pode ser utilizada como um veiculo para as substâncias que são elas próprias antiangiogénicas, tal como alguns esteróides, explorando a afinidade da heparina para as células endoteliais vasculares, ver, por exemplo, WO 93/18793 da Universidade do Texas, e Imperial Câncer Research Technology, onde as heparinas são reivindicadas com ligantes lábeis de ácido, tal como a hidrazina de ácido adipico, ligada ao cortisol. O efeito anti-angiogénico das moléculas conjugadas é maior do que o das moléculas não conjugadas, mesmo quando administradas em simultâneo.

Em Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310, 86-96, são descritas heparinas ligado aos esteróides (por exemplo, cortisol), com um grupo hidrazona em C-20 que apresentam maior atividade antiangiogénica do que as duas moléculas não conjugadas. 9 A ΕΡ Ο 246 654 pela Daiichi Sc. descreve polissacarídeos sulfatados com atividade antiangiogénica com estudos de Fase II. A EP 0 394 971 por Pharmacia & Upjohn - Harvard Coll. descreve hexasacarideos - fragmentos de heparina - com baixa sulfatação, capazes de inibir o crescimento de células endoteliais e a angiogénese estimulada por FGF-1. A EP 0 618 234 por Alfa Wasserman descreve um método para a preparação de glicosaminoglicanas semisintéticas com estrutura de heparina ou de heparan, tendo um grupo nucleofilico. A WO 95/05182 por Glycomed descreve vários oligossacarideos sulfatados com atividade anticoagulante, antiangiogénica e antinflamatória. A EUA 5.808.021 por Glycomed descreve um método para a preparaçãode 2-0, 3-0 heparina dessufatada substancialmente não despolimerizada com uma percentagem dessulfatação nas posições 2 do ácido idurónico (I, 2-0) e na posição 3 da unidade glucosamina ( A, 3-0), que varia de aproximadamente de 99 a aproximadamente 75% da percentagem inicial. Este método prevê a dessulfatação conduzida na presença de um catião de um metal bivalente, exemplificado pelo cálcio ou cobre, seguido de liofilização do produto obtido. As heparinas desulfatadas têm atividade antiangiogénica. A EP 0 251 134, Yeda Res. & Dev. Co Ltd et al. descreve o uso de dosagens subcoagulante de heparina ou dos seus derivados para a prevenção da rejeição de homotransplantes e tratamento de doenças autoimunes. A atividade da heparina é dada pela inibição da heparanase. A WO 88/05301, Univ. Australian Nat., revela composições antimetastáticas e/ou antinflamatórias contendo um polissacárido sulfatado, que é inibidor da heparanase. São fornecidos heparina, fucoidina, sulfato de pentosano, sulfato de dextrano. A WO 92/01003, Univ. Texas System, revela a utilização de um derivado de heparina, o qual é desprovido de atividade anticoagulante, como inibidor da heparanase. Estes derivados têm sulfamina ou grupos O-sulfato, PM 1000-15000 e 10 cada unidade monomérica terminal é uma unidade de repetição monomérica com um átomo de 0 terminal ligado a um de grupo de bloqueio. As WO 94/14851 e WO 96/06867, Glycomed, proporcionam heparina da mucosa 2-0, 3-0-de-sulfatada, ou os seus fragmentos, sendo, pelo menos, 96,7% dessulfatada na posição 2-0 e pelo menos 75% dessulfatada na posição 3-0, úteis como não-anticoagulantes inibidores de heparanase. As WO 95/09637 e WO 96/09828, Glycomed, descrevem compostos de malto-oligossacárido altamente sulfatados com propriedades de heparina. A WO 95/30424, Glycomed, fornece heparina 6-0-desulfatada ou os seus fragmentos com atividade de inibição da heparanase. A WO 96/33726, Univ. Australian Nat., divulga oligossacáridos sulfatados como miméticos de heparan que possuem atividade inibidora da heparanase. A WO 01/35967, Knoll AG, proporciona um método para o tratamento da insuficiência cardíaca e doenças relacionadas pela administração de um inibidor de heparanase, entre os quais, é mencionado a heparina, que tem grupos COOH parcialmente reduzidos, ou está, pelo menos, parcialmente N-desulfatada e N-acetilada ou está, pelo menos em parte, N, 0-dessulfatada e N- ressulfatada ou está O-acetilada. 0 objetivo da invenção aqui descrito é encontrar estruturas glicosaminoglicanas ótimas para gerar atividade antiangiogénica com base na inibição da heparanase e/ou mecanismos de inibição do fator de crescimento FGF. Um objetivo adicional da invenção aqui descrito é proporcionar um medicamento com atividade antiangiogénica que é essencialmente desprovido dos efeitos secundários típicos dos derivados de heparina, tais como, por exemplo, a atividade anticoagulante. 0 documento WO 01/55221, em nome do gi icosaminoglicanas, particularmente requerente, uma uma descreve heparina 11 dessulfatada, com um grau dessulfatalão não maior do que 60% do total das unidades urónicas. Estes derivados são fornecidos com uma atividade antiangiogénica e são desprovidos de atividade anticoagulante. Os referidos compostos exercem a sua atividade antiangiogénica, com base na inibição do FGF. Não estava prevista nenhuma atividade para a inibição da heparanase.

Em termos muito gerais, a WO 01/55221 também prevê uma heparina modificada, contendo resíduos de glicosamina, com diferentes graus de N-dessulfatação e subsequente opcional acetilação parcial ou total. A referida referência não descreve explicitamente a N-dessulfatação e os passos posteriores opcionais de acetilação total ou parcial.

Em WO 01/55221 a N-dessulfatação e N-acetilação é realizada após a 2-O-dessulfatação nas unidades idurónicas. Na fórmula I descrita nesta referência, a unidade "U" é uma das quatro opções.

Lapierre F et al., Glycobiology, Oxford University Press, US, vol. 6, n. 3,1 Janeiro 1996, páginas 355-366 lidaram com as modificações químicas da heparina que diminuem o seu efeito anticoagulante mas presenvam as suas propriedades de inibição da heparanase e antitumorais revelando que os produtos com quebra glicol-ROH possuem uma elevada atividade anti-heparanase mas não são desprovidos de efeito de hemorragia. Além disso , Lapierre. F et al. , revelam que substituir os grupos N-sulfato nas heparins por grupos N-acetil reduz a sua atividade anti-heparanase.

Resumo da invenção 12 A dessulfatação realizada nas condições descritas na presente invenção também produz a formação de unidades idurónicas com um anel oxiranico na posição 2,3. A abertura do anel oxiranico nas condições descritas na presente invenção dá origem a unidades L-idurónico ou L-galacturónico. É um objeto da invenção agui descrita de acordo com a presente invenção que é referida a glicosaminoglicana uma eparina modificada, seja totalmente n-desfultada e subsequentemente N-acetilada. A invenção aqui descrita refere-se ao composto de fórmula (I) no qual o anel U pode ter o seguinte significado:

G X e X', são o grupo -CH2-D , em que D é hidroxilo; R e Ri, são residuos de acetilo; nem, que podem ser iguais ou diferentes, podem variar de 1 a 40, a soma de n + m varia de 6 a 40, a razão m: n varia entre 10:2 e 1:1; O símbolo indica que as unidades marcadas m e n estão estatisticamente distribuídas ao longo da cadeia de polissacarídeo e não estão necessariamente em sequência.

Os compostos que constituem o objeto da invenção aqui descrita, são caracterizados por um elevado poder de inibição da heparanase com propriedades antiangiogénicas interessantes, e são portanto úteis como substâncias ativas 13 para a preparação de medicamentos para o tratamento de patologias que beneficiam da inibição da heparanase, patologias com base na angiogénese anormal, e particularmente para o tratamento de metástases.

Os compostos de acordo com a presente invenção também inibem FGF.

Vantajosamente, os compostos de acordo com a presente invenção mostram propriedades anticoagulantes reduzidas, se não inexistentes, evitando ou reduzindo os efeitos colaterais típicos dos heparinas. Uma vantagem adicional deriva do facto de que os compostos de acordo com a invenção podem ser caracterizados com técnicas analíticas instrumentais, tais como a espectroscopia de RMN, permitindo assim o controlo do processo, que é absolutamente desejável do ponto de vista industrial.

Também no caso das heparinas modificadas, o peso molecular (MW) tem uma função muito importante quando se fazem os inibidores de angiogénese. É bem conhecido, de facto, que uma redução do peso molecular (MW) até valores correspondentes a unidades de pentassacarídeos não conduz a uma perda de atividade antiangiogénica. Por outro lado, verificou-se que, para além de um certo comprimento das cadeias de heparina favorecer vez de inibir a ativação de FGF, são ainda melhores do que os inibidores da heparanase de cadeias mais curtas. No entanto, o comprimento ótimo de cadeia para a inibição da heparanase depende da estrutura do inibidor (da espinha dorsal de hidratos de carbono, das ligações posicionais, do padrão de sulfatação) e deve ser estabelecida para quaisquer novos tipos de potenciais inibidores.

Descrição detalhada da invenção 14

Os compostos de acordo com a presente invenção, contendo os resíduos de glicosamina totalmente N-dessulfatados e subsequente e totalmente acetilados são aqui especificamente descritos e reivindicados como compostos novos.

As heparinas totalmente N-dessulfatadas e totalmente N-acetiladas de acordo com a presente invenção, podem ser preparadas submetendo as heparinas no processo, que consiste nas seguintes etapas: a) N-dessulfatação solvótica por hidrólise de resíduos sulfamina em DMSO: H20 a 95:5 em v:v, à temperatura ambiente, durante 0,5 a 8 horas, e ainda mais preferencialmente durante cerca de 2h, para se obter a totalidade ou eliminação parcial dos grupos sulfato na posição 2 dos resíduos de glucosamina; b) N-acetilação de um dos referidos grupos totalmente dessulfatado na posição 2 dos resíduos de glucosamina por tratamento em solução aquosa alcalina (pH 8-9) com um agente de acetilação, tal como anidridos de acetilo, para originar grupos totalmente acetilados na posição 2 dos resíduos da glucosamina; c) oxidação dos dióis com periodato de sódio, para originar a abertura do anel glicósido e a formação dos dois grupos aldeído por resíduo modificado, e, d) redução de um dos referidos grupos aldeído em álcool primário e) a hidrólise ácida opcional dos compostos obtidos no passo d) para obter oligossacárideos que correspondem às sequências regulares, de preferência, por desaminação com ácido nitroso. Esta reação, que é normalmente aplicada para obter heparina 15 LMW por meio de clivagem da ligação N-sulfato entre os resíduos de glucosamina e do próximo ácido urónico, conduz a um composto LMW tendo na extremidade não redutora um resíduo constituído por um ácido urónico e na extremidade redutora um resíduo de manose anidra, este último pode ser ainda modificado para anidromanitol, por redução com hidreto de boro. Os compostos LMW obtidos contêm pelo menos um resíduo de clivagem de ácido idurónico-glicol, ou em alternativa f) submeter o produto obtido no passo d) a uma hidrólise enzimática parcial, com uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de liase, heparinase, heparitinase, ou equivalente para originar oligossacarídeos, de preferência, tetra-ou octa-sacarídeos, com o resíduo terminal não redutor constituído por ácido idurónico insaturado, o resíduo reduzido constituído por um grupo N-sulfoglucosamina e contendo pelo menos um resíduo de ácido idurónico aberto. 0 processo de acordo com a presente invenção é também ilustrado pelos esquemas abaixo: 16

I

Sw*eNsw!a· Οβ-HtSkA I» ί çusefMrtM EM M^SlííL f} *6»® .

Heparirsa inicial «Ji&f

Separisia H-dessulfatada ήΜΑ S-acil- heparinã B&so*: U***Mc*ww*j»t* S-acil- hsparina (Queila nos ácidos urónicos não sulfatados origlnalssente prasatM n» Heparina Inicial)

Hidrólise cosa enzimas oa i cosí HNOl IMSí- H-acil- hepa riria

Os pesos moleculares são determinados por HPLC-GPC (cromatografia líquida de alta pressão- cromatografia de permeação em gel) . 0 grau dessulfatação é determinado por condutimetria e a percentagem dos ácidos urónicos modificados por 13C-RMN. MW é o peso molecular, e D é o índice de polidispersão expresso como Mw/Mn. 17

De acordo com a invenção aqui descrita, os produtos de partida são as heparinas de ocorrência natural. Também é possivel a utilização de heparinas quimicamente modificadas com um teor percentual de N, 6 dissulfato que varia de 0 a 100%. Começando a partir de produtos com um teor de glucosamina 6-O-sulfatada diferente, é possivel modular o comprimento das sequências regulares entre um ácido idurónico aberto e outro. As heparinas, de acordo com a presente invenção, que possuem abertura do anel de glicosideo são convencionalmente chamadas derivados RO pelos especialistas na matéria, entendendo-se por isso que o anel glicósido foi aberto por meio de uma ação de oxidação, seguido de uma redução (redox - RO) . Esta abertura do anel glicósido também é convencionalmente chamada "split-glicol", assim chamado por causa da formação dos dois hidroxi primários presentes no anel aberto. Os compostos aqui mencionados, também são chamados derivados glicólicos "RO" ou "split".

As heparinas da invenção também podem ser utilizadas como veículos para outros tipos de fármacos, por meio de ligação adequadas, com a porção de heparina, que é capaz de proporcionar uma ligação estável em condições normais de fabrico e armazenamento de um medicamento formulado, o qual, no entanto, liberta o fármaco transportado no corpo, de preferência na proximidade do órgão alvo. Exemplos de fármacos que podem ser transportados são drogas esteroides e não esteroides, corticosteroides, anti-inflamatórios e outros fármacos com uma ação antimetastática, caso em que haverá um aumento vantajoso do efeito antimetastático, como resultado da soma das atividades intrínsecas separadas dos compostos de acordo com a invenção e do agente antimetastático ligado ao mesmo, com as vantagens relacionadas com uma maior seletividade do alvo e toxicidade sistémica baixa. Exemplos destes fármacos são os inibidores de metaloproteinase. Outros 18 medicamentos que podem ser utilmente transportados são aqueles que atuam em nivel endotelial.

Os compostos de acordo com a invenção a partir de derivados de heparina, são preparados a partir de heparina, tal como por meio de N-dessulfatação seguida por N-acetilação utilizando as técnicas conhecidas para os especialistas na técnica. Por exemplo, a N-dessulfatação é conduzida por solvólise em solução DMSO: H2O a 95:5 em v: v, à temperatura ambiente durante o tempo de 0,5 a 8 horas, seguido por N-acilação em condições alcalinas, por exemplo, acetilanidrido.

As heparinas da invenção podem ser ainda mais degradadas com agentes ácidos em condições de pH adequado, por exemplo a pH 4, para produzir uma mistura de oligossacáridos que mantêm as propriedades antiangiogénicas.

Os objetos da invenção aqui descritos são as composições farmacêuticas que contêm como ingrediente ativo, pelo menos, uma heparina modificada aqui divulgada. O ingrediente ativo de acordo com a presente invenção estará numa mistura com veículos adequados e / ou excipientes normalmente utilizados na tecnologia farmacêutica, tal como, por exemplo, os descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", edição mais recente. As composições de acordo com a presente invenção conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente ativo. As doses irão ser determinadas pelo especialista na área, por exemplo, o clínico ou o médico de cuidados primários de acordo com o tipo de doença a ser tratada e da condição do paciente, ou concomitantemente com a administração de outros ingredientes ativos. A título de exemplo, podem ser indicadas doses que variam de 0,1 a 100 mg/kg. 19

Os exemplos de composições farmacêuticas são aqueles que podem ser administradas oralmente ou por via parentérica, por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, ou na forma de vaporizadores nasais ou orais. As composições farmacêuticas adequadas para este fim são comprimidos, cápsulas moles ou duras, pós, soluções, suspensões, xaropes e formas sólidas para preparações liquidas extemporâneas. As composições para administração parentérica são, por exemplo, todas as formas injetáveis intramusculares, intravenosas e subcutâneas, bem como soluções, suspensões e emulsões. As formulações de lipossomas também devem ser mencionadas. Os comprimidos incluem também formas para a libertação controlada do ingrediente ativo, quer seja como formas de administração oral, comprimidos revestidos com camadas adequadas, pós microencapsulados, complexos com ciclodextrinas, formas de depósito, por exemplo, as formas subcutâneas, tais como injeções de depósito ou implantes.

Os compostos de acordo com a invenção aqui descritos possuem atividade antiheparanase e antiangiogénica. Isto torna-os adequados para a preparação de medicamentos úteis para o tratamento de mamíferos, em geral, e particularmente seres humanos, que sofrem de angiogese alterada ou sujeitos que necessitem de um tratamento de inibição da atividade heparanasica.

Os exemplos de doenças tratadas com o medicamento que é o objeto da presente invenção são os tumores primários, metástases, retinopatia diabética, psoriase, fibroplasia retrolenticular, restenose após angioplastia, by-pass coronário, inflamação, artrite, doenças autoimunes, rejeição de homotransplante, doenças cardiovasculares, doenças fibro-proliferativas, as doenças induzidas por agregação anormal de plaquetas, doenças induzidas por proliferação de músculo 20 liso, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite aguda, hipertensão pulmonar neonatal, asma, insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão pulmonar do adulto, a hipertensão vascular renal, retinopatia proliferativa, encefalomielite autoimune experimental, esclerose múltipla, diabetes insulino-dependentes, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn.

Vantajosamente, os compostos de acordo com a presente invenção são substancialmente desprovidos dos efeitos colaterais típicos da heparina. Em particular, os compostos de acordo com a invenção são substancialmente desprovidos de atividade anticoagulante. Por substancialmente desprovido de tal atividade para o especialista na área não significa nenhuma ou apenas atividade insignificante a partir do ponto de vista do seu uso clínico.

A atividade inibidora de heparanase foi determinada de acordo com um método estabelecido pelo grupo de Vlodavsky (Bitan M. et al, 1995) . 0 método baseia-se na avaliação do grau de fragmentação das cadeias de sulfato de heparan de proteoglicanos de sulfato de heparan (HSPG) causadas por heparanases. Os sulfatos da matriz extracelular marcados (ECM) são os mais vulgarmente utilizados como fonte de HSPG.Os sulfatos de ECM marcados são incubados com proteína recombinante heparanase, a pH 6,2, na ausência e na presença de concentrações crescentes do composto de teste. Para avaliar a ocorrência da degradação de proteoglicanos, o meio de incubação é recolhido e aplicado por filtração em gel em colunas de Sepharose 6B (0,9 x 30 cm). As frações (0,2 ml) são eluidas com PBS a um caudal de 5 ml h e contada a radioatividade. O volume excluído (V0) é marcado por azul de dextrano e o volume total incluído (VT) pelo vermelho de fenol. Os fragmentos de degradação das cadeias laterais de HS 21 são eluídos a partir de Sepharose 6B, 0,5 <Kav <0,8 (pico II). Sob as condições experimentais relatados, bons inibidores da heparanase inibem a fragmentação da HS em concentrações de 10 μ9/πι1 ou menos.

Os resultados dos exemplos de referência estão apresentados na Tabela 1, abaixo:

Inibição de heparanase numa dose que varia de 25 μρ / ml a 5 μρ / ml Inibição Dose 2 5 μς/ ml 10 μg/ ml 5 μς/ ml Heparina 100% nd > 100% ST1516 * Heparina 40% RO 100% nd > 85% ST1514 * Heparina ~ 50% RO 100% 100% > 85% ST1515 * Heparina 27,5% RO 100% 100% 100% ST1518 * * 50% NAc heparina 30% RO 100% 100% > 85% composto de referência descrito em WO 01/55221 composto de referência descrito em EP 1427427

Digno de notar, ST1518 tem uma elevada atividade de inibição, mesmo na concentração de 1 μg/ml.

Os compostos de acordo com a presente invenção, e em particular um novo, foram testados quanto à sua atividade em relação a fatores de crescimento de FGF, com o mesmo modelo experimental tal como descrito em WO 01/55221 e mostraram uma atividade comparável com as descritas na referência citada. 22

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Heparina totalmente N-dessulfatada e N-reacetilada de fórmula (1)

em que o anel U possui o seguinte significado

c R e Ri são residuos de acetilo; X e X', são o grupo -CH2-D em que D é hidroxilo; nem, que podem ser iguais ou diferentes, podem variar de 1 a 40; a soma de n + m varia de 6 a 40; a razão m: n varia entre 10:2 e 1:1; o simbolo indica que as unidades marcadas m e n estão estatisticamente distribuídas ao longo da cadeia de polissacarideo e não são necessariamente em sequência.
2. Processo para a preparação de compostos da reivindicação 1 que compreende os seguintes passos: a) N-dessulfatação solvótica por hidrólise de resíduos sulfamina em DMSO: H20 a 95:5 em v:v, à temperatura ambiente, durante 0,5 a 8 horas, e ainda mais preferencialmente durante 23 cerca de 2h, para se obter a totalidade ou eliminação parcial dos grupos sulfato na posição 2 dos resíduos de glucosamina; b) N-acetilação de um dos referidos grupos totalmente dessulfatado na posição 2 dos resíduos de glucosamina por tratamento em solução aquosa alcalina (pH 8-9) com um agente de acetilação, tal como anidridos de acetilo, para originar grupos totalmente acetilados na posição 2 dos resíduos da glucosamina; c) oxidação dos dióis com periodato de sódio, para originar a abertura do anel glicósido e a formação dos dois grupos aldeído por resíduo modificado, e, d) redução de um dos referidos grupos aldeído em álcool primário e) a hidrólise ácida opcional dos compostos obtidos no passo d) para obter oligossacárideos que correspondem às sequências regulares, de preferência, por desaminação com ácido nitroso. Esta reação, que é normalmente aplicada para obter heparina LMW por meio de clivagem da ligação N-sulfato entre os resíduos de glucosamina e do próximo ácido urónico, conduz a um composto LMW tendo na extremidade não redutora um resíduo constituído por um ácido urónico e na extremidade redutora um resíduo de manose anidra, este último pode ser ainda modificado para anidromanitol, por redução com hidreto de boro. Os compostos LMW obtidos contêm pelo menos um resíduo de clivagem de ácido idurónico-glicol, ou em alternativa f) submeter o produto obtido no passo d) a uma hidrólise enzimática parcial, com uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de liase, heparinase, heparitinase, ou equivalente para originar oligossacarídeos, de preferência, tetra-ou octassacarídeos, com o resíduo terminal não redutor 24 constituído por ácido idurónico insaturado, o resíduo reduzido constituído por um grupo N-sulfoglucosamina e contendo pelo menos um resíduo de ácido idurónico aberto.
3. Utilização do composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento que possui inibição da atividade da heparanase.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, na qual o referido medicamento possui atividade antiangiogénica.
5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-4, na qual o referido medicamento é útil para o tratamento de inflamação.
6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-5, na qual o referido medicamento é útil para o tratamento de doenças auto-imunes.
7. Utilização de acordo com qualquer uma das revindicações 3-6, na qual a doença a ser tratada é selecionada entre o grupo que consiste em tumores primários, metástases, retinopatia diabética, psoríase, fibroplasia retrolenticular, restenose após angioplastia, by-pass coronário, inflamação, artrite, doenças autoimunes, rejeição de homotransplante, doenças cardiovasculares, doenças fibro-proliferativas, as doenças induzidas por agregação anormal de plaquetas, doenças induzidas por proliferação de músculo liso, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite aguda, hipertensão pulmonar neonatal, asma, insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão pulmonar do adulto, a hipertensão vascular renal, retinopatia proliferativa, encefalomielite autoimune experimental, esclerose múltipla, diabetes insulino- 25 dependentes, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn.
8. Composição farmacêutica que contêm pelo menos um composto da reivindicação 1 como ingrediente ativo numa mistura de veiculos farmacologicamente aceitáveis e excipientes. 26