CZ307433B6 - Deriváty částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů jako inhibitory heparanázy mající antiangiogenní účinky a zabraňující antikoagulačnímu působení - Google Patents

Deriváty částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů jako inhibitory heparanázy mající antiangiogenní účinky a zabraňující antikoagulačnímu působení Download PDF

Info

Publication number
CZ307433B6
CZ307433B6 CZ2004-255A CZ2004255A CZ307433B6 CZ 307433 B6 CZ307433 B6 CZ 307433B6 CZ 2004255 A CZ2004255 A CZ 2004255A CZ 307433 B6 CZ307433 B6 CZ 307433B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
heparin
partially
residues
modified
acetylation
Prior art date
Application number
CZ2004-255A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2004255A3 (cs
Inventor
Benito Casu
Giangiacomo Torri
Annamaria Naggi
Giuseppe Giannini
Sergio Penco
Claudio Pisano
Original Assignee
Leadiant Biosciences Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leadiant Biosciences Sa filed Critical Leadiant Biosciences Sa
Publication of CZ2004255A3 publication Critical patent/CZ2004255A3/cs
Publication of CZ307433B6 publication Critical patent/CZ307433B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C08B37/0078—Degradation products

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)

Abstract

Jsou popsány deriváty částečně desulfátovaného heparinu, majícího antiangiogenní účinky.

Description

Oblast techniky
Zde popisovaný vynález se týká derivátů částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů zvláště heparinů.
Dosavadní stav techniky
Studie provedené v Biologické výzkumné jednotce pro nádory nemocnice university HadassahHebrew v Izraeli (Isr. Med. Assoc. J„ 2, 37 - 45, 2000; J. Med. Chem., 43, 2591 - 2600, 2000; Invasion Metastasis, 14, 290-302, 1994-1995; Exp. Cell Res., 201, 208 - 215, 1992) se zaměřují na zapojení růstových faktorů vázajících heparin, heparan sulfát a enzymy degradující heparansulfát (heparanáza) při angiogenezi nádorů a metastázách. Tyto studie byly použity na prověřování a na identifikaci heparinových derivátů a mimetik heparin/heparan sulfátu s potenciálními účinky na inhibici heparanázy (Nátuře Med., 5, 735 - 736, 1999; Science, 285, 33 -34, 1999).
Nádorové buňky uvolňují enzym heparanázu, endo-p-D-glukuronidázu, která degraduje polysacharidový řetězec proteoglykanu heparan sulfátu na povrchu buňky a v extracelulámí matrici.
Zapojení heparanázy do angiogeneze nádoru bylo porovnáváno se schopností uvolnit bFGF (FGF-2) a další růstové faktory z jejich nahromadění v ECM (extracelulámí matrice). Tyto růstové faktory se starají o mechanismus navození neovaskularizace při normálních i patologických situacích.
Heparanáza tak může napomáhat nejen invazi nádorové buňky a metastáz, ale také angiogenezi nádoru, tedy obou kritických stupňů v progresi nádoru.
Specifické inhibitory enzymu heparanázy zabraňují uvolňování a aktivaci růstových faktorů nahromaděných heparan sulfátem, rovněž tak jako rozpadu ECM a pohlíží se na nějako na velmi slibné látky pro výrobu protirakovinových léčiv.
Jedním z možných terapeutických přínosů pro antiangiogenní léčiva je tak vývoj silného a selektivního inhibitoru heparanázy. Co se týká diskuse o angiogenezi, lze odkázat na WO 01/55221, náležející současnému přihlašovateli.
Další důležitou komplikací heparanázy je jak zánět, tak autoimunita. Účinky heparanázy mají také vztah k její schopnosti aktivovat buňky imunitního systému, aby opustily oběh a vyvolaly jak zánět, tak autoimunní odezvu. Interakce krevních destiček, granulocytů, T a B lymfocytů, makrofágů a žímých buněk se subendotheliální EMC je působením heparanázy spojena s degradací heparan sulfátu. Enzym se uvolňuje z nitrobuněčných tělísek (tj. lysosomů, specifických granulí) jakožto odezva na různé aktivační signály dávajíc tak podnět k jeho řídicí účasti a přítomnosti v zánětlivých místech a autoimunních lezích. Léčba pokusných zvířat heparanázovými inhibitory (tj. neantikoagulačními druhy nízkomolekulámího heparinů LMWH) značně omezila u pokusných zvířat výskyt pokusně vyvolané autoimunní encefalomyelitidy (EAE), adjuvantní arthritidy a odmítání transplantátů, což ukazovalo na to, že lze heparanázové inhibitory použít k inhibici autoimunních a zánětlivých onemocnění.
Heparin
Heparin je heterogenní směs přirozeně se vyskytujících se polysacharidů různé délky řetězce a různého stupně sulfatace, mající antikoagulační účinky, a je vylučován žírnými buňkami
- 1 CZ 307433 B6 pojivové tkáně přítomnými v játrech (odkud byl poprvé izolován), svalech, plicích, brzlíku a slezině.
V heparinu byla vedle normální sekvence identifikována navíc sekvence odpovídající aktivní poloze pro antithrombinové působení.
Protinádorový a antimetastatický účinek heparinu a jeho derivátů pochází od jeho schopnosti inhibovat heparanázu, schopnosti blokovat růstové faktory a regulovat angiogenezi.
Heparan sulfáty (HS)
Heparan sulfáty (HS) jsou všudypřítomné proteinové ligandy. Proteiny se vázají na řetězce HS při mnoha akcích od jednoduché imobilizace nebo ochrany proti účinkům proteolytické degradace až po specifickou modulaci biologických činností, jakou je angiogeneze.
Uhlohydrátový skelet jak heparinu, tak heparan sulfátů (HS) sestává ze střídajícího se Dglukosaminu (GlcN) a kyselin hexuronových (GIcA nebo IdoA).
V heparinu jsou GlcN zbytky ponejvíce N-sulfatované, zatímco v HS jsou jak N-sulfatované, tak N-acetylované, s malým počtem nesubstituovaných NH2 skupin.
HS je v průměru také méně O-sulfatovaný než heparin.
Používání heparinu při léčbě angiogenních poruch, jako jsou nádory, a zvláště metastázy, je podstatně omezováno jeho antikoagulačními účinky.
Byly prováděny takové úpravy heparinu, aby se omezila jeho antikoagulační mohutnost, a současně byly zachovány jeho ochranné protinádorové vlastnosti.
Otevření jednotky kyseliny glukuronové v antithrombinové poloze snižuje afinitu heparinu k antithrombinu: takto může být heparin použit jako látka se sníženými antikoagulačními účinky, ale stále ještě zachovávající si antiangiogenní vlastnosti.
Heparanázy
Heparanázy jsou enzymy náležející do skupiny endoglykosidáz (endo-fi-D-glukuronidáza), které hydrolyzují vnitřní glykosidovou vazbu řetězců heparan sulfátů (HS) a heparinu.
Tyto endoglykosidázy se angažují při proliferaci nádorových buněk, při metastázách a při neovaskularizaci nádorů. Tyto enzymy jsou biologickými cíly pro antiangiogenní působení. Ve vědecké literatuře existuje velký počet studií zabývajících se vztahem struktury a jejích účinků (viz například Lapierre, F., et al., Glycobiology, 6, (3), 355 — 366, 1996). I když ještě mnoho stránek věci musí být vyjasněno, byly uváděny studie týkající se inhibice heparanáz heparinem a jeho deriváty, za použití specifických zkoušek, které vedly k naléhavým úvahám o strukturních typech, které mohou sloužit jako vodítka k získání nových, selektivnějších derivátů.
Ve výše uvedené práci Lapierra, et al., jsou popisovány deriváty heparinu získané 2-0 desulfataci nebo rozštěpením glykolu (oxidace perjodátem a následnou redukcí borohydridem sodným). Těmto derivátům zde uváděným jako 2-O-desulfatovaný heparin a RO-heparin zůstává částečně zachován antiangiogenní účinek heparinu, což bylo prokázáno zkouškou CAM v přítomnosti kortikosteroidů (tamtéž, strana 360).
Byly popsány deriváty N-acylheparinu, které jsou bližšími mimetiky heparan sulfátu než heparin, které inhibují heparanázu jen o něco méně než N-sulfatované deriváty. (Irimira, T., Biochemistry, 25, 5322 - 5328, 1986; Ishai-Michaeli, R., et al., Biochemistry, 31, 2080 - 2088, 1992).
-2 CZ 307433 B6
Hepariny a FGF
FGF regulují četné fysiologické pochody, jako například růst buněk a jejich diferenciaci, ale také funkce týkající se patologických pochodů, jako je například nádorová angiogeneze.
FGF jsou růstové faktory (skupina více než 10 polypeptidů), jejichž kyselé (FGF-1) a bazické FGF (FGF-2) jsou jediné, které byly ponejvíce studovány, které vyžadují polysacharidový kofaktor, heparin nebo HS, aby se mohly navázat na FGF receptor (FGFR) a aktivovaly jej.
I když přesný mechanismus, kterým heparin a HS aktivoval FGF není znám, je přesto známo, že heparin, FGF a FGFR vytváří třímolekulový nebo ternámí komplex.
Jedním z předpokládaných mechanismů je ten, kde heparin a HS vyvolává tak zvanou sendvičovou dimerizaci FGF a potom, takto dimenzovaný vytváří s FGFR stabilní komplex.
Antimetastatické účinky heparinových derivátů
Schopnost primárního nádoru generovat metastázované buňky je patrně hlavním problémem, kterému protirakovinová terapie čelí.
Zdá se, že heparinové deriváty s velkou schopností blokovat heparanázu, jsou schopné rovněž inhibovat angiogenezi jak primárních nádorů, tak metastáz.
Inhibice heparanázy navíc snižuje schopnost nádorových buněk migrovat z primárního nádoru k dalším orgánům.
Na zvířecích modelech bylo zjištěno, že antimetastatický účinek koreluje s heparanázovou inhibiční schopností heparinu a jeho derivátů (Bitan, M., et al., Isr. J. Med. Sci., 31, 106 - 108, 1995), rovněž tak jako dalších sulfatovaných polysacharidů (Miao, H. Q., et al., Int. J. Cancer, 83, 424 - 431, 1999 a zde uvedené odkazy). Provedené studie závislosti antimetastatických účinků na molekulové hmotnosti ukazují, že i velmi nízkomolekulámí hepariny (Sciumbata, T., et al., Invasion Metastasis, 16, 132 - 143, 1996) a polysulfáty oligosacharidů (Parish, C. R., et al., Cancer Res., 59, 3433 - 3441, 1999) si udržují významné antimetastatické působení. I když globální odstranění N-sulfátových skupin (N-desulfatace) sníží antimetastatickou mohutnost heparinu, ta se částečně obnoví N-acylací (N-acetylace, N-hexanoylace) (Bitan, M., 1995) a Nsukcinylací (Sciumbata, T., 1996) výsledných volných skupin NH2. Bylo zjištěno, že antimetastatické účinky heparinu jsou nepřímo úměrné stupni jejich O-sulfatace (Bitan, M., 1995). Selektivní 2-O-desulfatace zbytku kyseliny iduronové nemá za následek výrazné snížení antimetastatických účinků heparinu (Lapierre, F., Glycobiology, 6, 355 - 366, 1996).
Obecně, jak heparanázová inhibice, tak antimetastatické účinky heparinu a dalších sulfatovaných polysacharidů se zmenšují se zmenšující se molekulovou hmotností a stupněm sulfatace (Bitan, M., 1995; Parish, C. R., 1999). Tyto účinky však také závisejí na karbohydrátovém skeletu polysacharidů (typ zbytků a poloha glykosidických vazeb) (Parish, C. R., 1999). Jelikož dosud není známa trojrozměrná struktura aktivních poloh heparanázy, je obtížné předpovídat, který polysacharidový skelet a které sulfatační polohy inhibují enzym nejůčinněji.
Na základě současných znalostí lze strukturální požadavky látek podobných heparinu, které by měly příznivé účinky na inhibici angiogeneze, rozdělit do dvou kategorií na základě cíle, který mají blokovat:
a) inhibici heparanázy: i když tento enzym rozpozná a rozštěpí heparinové a HS sekvence nejméně na osm monosacharidových jednotek skládajících se z kyseliny N-acyl-glukosaminglukuronové (nebo N-sulfatovaných zbytků glukosaminu, viz například Sandback-Pikas, D., et al., J. Biol. Chem., 273, 18777 - 18780, 1998 a citované odkazy), může být jeho inhibice účinně dosaženo heparinovými fragmenty delšími než jsou tetradekasacharidové (Bitan, M., 1995), nebo vysoce sulfatovanými kratšími oligosacharidy, jako je sulfát maltohexosy (MHS) a sulfát fosfomannopentosy (PI-88) (Parish, C. R., 1999). Přes to jsou jak dlouhé heparinové fragmenty, tak vysoce sulfatované oligosacharidy antikoagulanty, tedy látky s vlastností, které se má u potenciálních antimetastatických léčiv předcházet;
-3 CZ 307433 B6
b) inhibici angiogenních růstových faktorů (fibroblastového typu: FGF-1 a FGF-2; vaskulárního endotheliálního typu: VEGF; typu vaskulární permeability: VPF): až potud měly sloučeniny podobné heparinu sekvence dlouhé nejlépe alespoň pět monosacharidových jednotek, obsahující 2-sulfatovanou kyselinu iduronovou a N-6-sulfatovaný glukosamin (viz například Maccarana, M., et al., J. Biol. Chem., 268, 23989 - 23905, 1993).
Literatura uvádí malé peptidy (5 až 13 aminokyselin) s antiangiogenními účinky patent patent US 5,399,667 z University of Washington), které působí vazbou na thrombospondinový receptor, nebo delší peptidy (přibližně 50 aminokyselin).
Jsou známy i modifikované faktory krevních destiček - (EP 0589719, Lilly), schopné inhibovat endotheliální proliferaci s IC50 = 7 nM.
Oligosacharidové fragmenty s antiangiogenními účinky byly též popsány bohatě: bylo zjištěno, že změnami sekvence cukrů lze zvýšit interakční selektivitu.
Heparin může být navíc použit jako vehikulum pro látky, které samy o sobě jsou antiangiogenní, jakými jsou například některé steroidy, využívající afinitu heparinu k vaskulámím endotheliálním buňkám; viz například WO 93/18793 z University of Texas a Imperiál Cancer Research Technology, kde jsou hepariny nárokovány s látkami vazebně labilními na působení takových kyselin, jako je hydrazid kyseliny adipové vázaný na kortisol. Antiangiogenní účinek konjugovaných molekul je větší než účinek nekonjugovaných molekul, a to i pokud jsou podávány souběžně.
V Biochim. Biophys. Acta, 1310, 86 - 96, 1996 je popsána vazba heparinu vázaných na steroidy (např. kortisol) s hydrazonovou skupinou na C-20, která vykazuje větší angiogenní účinky než obě konjugované sloučeniny.
EP 0246654 od Daiichi Sc. popisuje sulfatované polysacharidy s angiogenními účinky se studiemi fáze II. EP 0394971 od Pharmacia & Upjohn - Harvard Coll. popisuje hexasacharidy s fragmenty heparinu o malé sulfataci, které jsou schopné inhibovat růst endotheliálních buněk a angiogenezi stimulovanou FGF-1. EP 0618234 od Alfa Wasserman popisuje metodu přípravy semisyntetických glykosaminoglykanů s heparinovou nebo heparanovou strukturou nesoucí nukleofilní skupinu. WO 95/05182 od Glycomed popisuje různé sulfatované oligosacharidy s antikoagulačními, antiangiogenními a protizánětlivými účinky. US 5,808,021 od Glycomed popisuje metodu přípravy v podstatě nedepolymerizovaného 2-O, 3-0 desulfatovaného heparinu s procentem desulfatace kyseliny iduronové v poloze 2 (I, 2-O) a poloze 3 glukosaminové jednotky (A, 3-O) přibližně od 99 do přibližně 75 % původní hodnoty. Tento způsob předpokládá desulfataci vedenou v přítomnosti kationtů dvojmocného kovu, jehož příkladem je vápník nebo měď, po níž následuje lyofilisace získaného produktu. Desulfátované hepariny mají antiangiogenní účinky. EP 0251134 od Yeda Res & Dev Co Ltd, et al., popisuje použití tak velké dávky heparinu nebo jeho derivátů, které jsou ještě pod hranicí koagulace, k prevenci odmítání aloimplantátu a k léčbě autoimunních onemocnění. Účinek heparinu je dán inhibici heparanázy. WO 88/05301 z Univ. Australian Nat., popisuje antimetastatické a/nebo protizánětlivé přípravky obsahující sulfatovaný polysacharid, který je inhibitorem heparanázy. Je použit heparin, fucoidan, pentosan sulfát a dextran sulfát. WO 92/01003 z Univ. Texas Systém popisuje použití derivátu heparinu, který zabraňuje antikoagulačnímu působení, jako inhibitoru heparanázy. Tyto deriváty mají sulfamino nebo O-sulfátové skupiny, m. hm. 1000 až 15000 a každá terminální monomemí jednotka je monomerní, opakováním jednotky s terminálním atomem O vázaným na blokovací skupinu. WO 94/14851 a WO 96/06867 od Glycomed používá 2-O, 3-0 desulfátovaný mukózní heparin nebo jeho fragmenty, které jsou alespoň z 96,7 % desulfátované v poloze 2-0 a alespoň ze 75 % desulfátované v poloze 3-0, které jsou vhodné jako neantikoagulační heparanázové inhibitory. WO 95/09637 a WO 96/09828 od Glycomed popisují vysoce sulfatované maltooligosacharidové sloučeniny s vlastnostmi podobnými heparinu. WO 95/30424 od Glycomed používá 6-O-desulfátovaný heparin nebo jeho fragmenty majícími heparanázové inhibiční účinky. WO 96/33726 z Univ. Australian Nat., popisuje sulfatované
-4CZ 307433 B6 oligosacharidy jako heparanová mimetika, mající heparanázové inhibiční účinky. WO 01/35967, od Knoll AG, uvádí metodu léčby srdeční nedostatečnosti a odpovídajících stavů podáváním heparanázových inhibitorů, mezi nimiž jsou zmiňovány heparin, který má částečně redukované skupiny COOH, nebo je alespoň částečně N-desulfátovaný a N-acylovaný, nebo je alespoň částečné Ν,Ο-desulfátovaný a N-resulfátovaný, neboje O-acetylovaný.
Požadavkem zde popisovaného vynálezu je nalezení optimální glykosaminoglykanové struktury vytvářející antiangiogenní působení založené na mechanismu inhibice heparanázy a/nebo inhibice růstového faktoru FGF. Dalším požadavkem zde popisovaného vynálezu je připravení léčiva s antiangiogenními účinky, které jsou nezbytné ke zbavení se typických vedlejších účinků heparinových derivátů, jakými jsou například antikoagulační účinky.
WO 01/55221 podaný jménem přihlašovatele popisuje glykosaminoglykany, a to zvláště desulfátovaný heparin, s desulfatačním stupněm ne vyšším než 60 % z celkového počtu uranových jednotek. Tyto deriváty jsou vybaveny antiangiogenními účinky a jsou zbaveny antikoagulačních účinků. Jmenované sloučeniny vykazují antiangiogenní účinky, které jsou založeny na inhibici FGF. Žádné účinky inhibice heparanázy nebyly předvídány.
Zcela obecně: WO 01/55221 uvádí také upravený heparin obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a případné následné celkové nebo částečné acetylaci.
Obecně uvedené jmenované odkazy nepopisují jednoznačně N-desulfataci a případné následné kroky celkové nebo částečné acetylace.
Podstata vynálezu
Nyní bylo zjištěno, že vystavení takovémuto glykosaminoglykanů, jakým je například glykosaminoglykan podobný heparinu, heparin nebo modifikovaný heparin, obsahujícího glukosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a případně následně celkově nebo částečně N-acylované (nejlépe N-acetylované), řízené 2-O-desulfataci iduronových jednotek, a to až do stupně desulfatace ne většího než 60 % z celkového počtu iduronových jednotek, zachová angiogenní vlastnosti zprostředkované růstovým faktorem.
2-O-Desulfatované hepariny uvedené výše ve WO 01/55221 jsou překvapivě také inhibitory heparanů. Bylo zjištěno, že tato vlastnost je u glykolového štěpení nesulfátovaných zbytků uranových kyselin dalším zlepšením. Bylo také zjištěno, že glykolové štěpení, tedy chemická úprava vedoucí k dramatické ztrátě antikoagulačního účinku (Času, B., etal., Arzneim. Forsch. (Drug Res.), 36,637 - 642, 1986), dramaticky zlepší heparanázové inhibiční vlastnosti částečně N-acetylovaných heparinu získaných 50 % N-desulfatací, po které následuje N-acetylace výsledných volných aminoskupin a 2-O-desulfátovaných sloučenin.
Desulfatace prováděná za podmínek popisovaných v předloženém vynálezu vytváří také iduronové jednotky s oxyranovým kruhem v poloze 2 a 3. Otevřením oxyranového kruhu za podmínek popisovaných v předloženém vynálezu vzniknou L-iduronové nebo L-galakturonové jednotky.
Předmětem zde popisovaného vynálezu je modifikovaný heparin obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a následné N-acetylace připravitelný podrobením heparinu způsobu, který sestává z následujících kroků:
a) N-desulfatace pomocí solvolytické hydrolýzy sulfaminových zbytků ve směsi DMSO:H2O v objemovém poměru 95:5, při teplotě místnosti, po dobu v rozmezí od 0,5 do 8 hodin, čímž se dosáhne úplné nebo částečné eliminace sulfátových skupin v poloze 2 glukosaminových zbytků;
-5CZ 307433 B6
b) N-acetylace uvedených úplně nebo částečně desulfátovaných skupin v poloze 2 glukosaminových zbytků reakcí s acetylačním činidlem v alkalickém vodném roztoku o pH 8-9, čímž se získají úplně nebo částečně acetylované skupiny v poloze 2 glukosaminových zbytků;
c) oxidace diolů pomocí jodistanu sodného, čímž se dosáhne otevření glykosidového kruhu za vzniku dvou aldehydových skupin na každý modifikovaný zbytek;
d) redukce uvedených aldehydových skupin na primární alkohol;
e) případná hydrolýza sloučenin získaných v kroku d) za vzniku oligosacharidů odpovídajících pravidelným sekvencím;
nebo alternativně
f) podrobení produktů získaných v kroku d) parciální enzymatické hydrolýze pomocí enzymu vybraného ze skupiny sestávající z lyázy, heparinázy, heparitinázy nebo ekvivalentního enzymu, za vzniku oligosacharidů s neredukujícím koncovým zbytkem sestávajícím z nenasycené iduronové kyseliny, redukujícím zbytkem sestávajícím z N-sulfoglukosaminu a obsahujících alespoň jeden zbytek otevřené iduronové kyseliny.
Modifikovaný heparin, který je předmětem vynálezu, je charakterizován vysokou mohutností inhibice heparanázy se zajímavými antiangiogenními vlastnostmi, a je proto vhodný jako účinná složka při přípravě léčiv k léčbě patologických stavů prospěšných pro inhibici heparanázy, patologických stavů na základě abnormální angiogeneze a zvláště k léčbě metastáz. Modifikovaný heparin podle předloženého vynálezu inhibuje také FGF.
Modifikovaný heparin podle předloženého vynálezu vykazuje výhodně snížené, pokud ne zcela chybějící antikoagulační vlastnosti, a tak se předchází vedlejším účinkům typickým pro hepariny. Další výhodou modifikovaného heparinu podle předloženého vynálezu je, že může být charakterizován instrumentálními analytickými technikami, jakými jsou například NMR spektroskopie, což umožňuje kontrolu postupu, která je z průmyslového hlediska zcela nutná.
I v případě modifikovaných heparinu má molekulová hmotnost (m.hm.) velmi důležitou funkci při výrobě inhibitorů angiogeneze. Je dobře známo, že zmenšení molekulové hmotnosti (m. hm.) až k hodnotám odpovídajícím pentasacharidovým jednotkám nevede ke ztrátě antiangiogenního účinku. Na druhé straně však bylo stanoveno, že nad určitou délku heparinového řetězce, jsou lepšími inhibitory při srovnání s inhibici aktivace FGF, než kratší řetězce. Optimální délka řetězce pro inhibici heparanázy závisí na struktuře inhibitoru (charakter skeletu cukru, vazby v určité poloze, charakter sulfatace) a tu lze upravit pro každý nový typ potenciálního inhibitoru.
Jak již bylo uvedeno výše, předmětem tohoto vynálezu je modifikovaný heparin obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a následné N-acetylace připravitelný podrobením heparinu způsobu, který sestává z následujících kroků:
a) N-desulfatace pomocí solvolytické hydrolýzy sulfaminových zbytků ve směsi DMSO:H2O v objemovém poměru 95:5, při teplotě místnosti, po dobu v rozmezí od 0,5 do 8 hodin, čímž se dosáhne úplné nebo částečné eliminace sulfátových skupin v poloze 2 glukosaminových zbytků;
b) N-acetylace uvedených úplně nebo částečně desulfátovaných skupin v poloze 2 glukosaminových zbytků reakcí s acetylačním činidlem v alkalickém vodném roztoku o pH 8-9, čímž se získají úplně nebo částečně acetylované skupiny v poloze 2 glukosaminových zbytků;
c) oxidace diolů pomocí jodistanu sodného, čímž se dosáhne otevření glykosidového kruhu za vzniku dvou aldehydových skupin na každý modifikovaný zbytek;
-6CZ 307433 B6
d) redukce uvedených aldehydových skupin na primární alkohol;
e) případná hydrolýza sloučenin získaných v kroku d) za vzniku oligosacharidů odpovídajících pravidelným sekvencím;
nebo alternativně
f) podrobení produktů získaných v kroku d) parciální enzymatické hydrolýze pomocí enzymu vybraného ze skupiny sestávající z lyázy, heparinázy, heparitinázy nebo ekvivalentního enzymu, za vzniku oligosacharidů s neredukujícím koncovým zbytkem sestávajícím z nenasycené iduronové kyseliny, redukujícím zbytkem sestávajícím z N-sulfoglukosaminu a obsahujících alespoň jeden zbytek otevřené iduronové kyseliny.
Sloučeniny podle vynálezu odvozené od heparinu, se připravují z výchozího heparinu například N-desulfatací, po které následuje N-acylace za využití technik známých odborníkům z oboru. Tak například N-desulfatace se provádí solvolýzou v roztoku DMSO a H2O v poměru 95 : 5 (obj./obj.) za laboratorní teploty po dobu sahající od 0,5 do 8 hodin, po ní následuje N-acylace v alkalickém prostředí, například acylanhydridy (tj. acetyl-, hexanoyl-, sukcinylpivaloylanhydrid).
Následující 2-O-desulfatace se provádí v přítomnosti alkalie, jakou je například hydroxid sodný, a to za teplot sahajících od teploty okolí do teploty 100 °C, přednostně však od 50 do 70 °C, například při 60 °C, a to po dostatečně dlouhou dobu, k získání požadovaného 2-Odesulfatovaného produktu. 2-O-desulfatace se reguluje působením na parametry postupu, jakými jsou například koncentrace reakčních látek, teplota a reakční doba. Jedním z příkladů, kterému se dává přednost spočívá v udržování stálé koncentrace substrátu (glykosaminglykanu) na 80 mg.ml ’ a koncentrace NaOH na 1M, stálé teploty 60 °C a řízení desulfatace reakční dobou od 15 do 60 minut. Odborníci znalí oboru mohou měnit podmínky, například zvýšením reakční teploty a zkrácením reakční doby na základě v praxi běžně pokusně používaného systému pokusomyl a na základě svých obecných znalostí věci.
Ve výhodném provedení je modifikovaný heparin podle tohoto vynálezu vybraný ze skupiny sestávající z
- částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu s a molekulovou hmotností, MW, 11 200, polydisperzním indexem 1,3, stupněm desulfatace 1,6, vyjádřeným jako molámí poměr SO3-:COO-, procentuálním podílem modifikovaných uranových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uranových kyselin 30 %, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 50 %,
- částečně N-desulfatovaného a N—reacetylovaného heparinu o nízké molekulové hmotnosti, LMW, s molekulovou hmotností Mn=4780, Mw=10000, polydisperzním indexem 2,092, procentuálním podílem modifikovaných uranových kys, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 50 %,
- částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu, s procentuálním podílem modifikovaných uranových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uranových kyselin 30 %, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 27 %,
- částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu, s procentuálním podílem modifikovaných uranových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uranových kyselin 30%, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 39 %;
- částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu, s procentuálním podílem modifikovaných uranových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uranových kyselin 30 %, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 64 %.
-7 CZ 307433 B6
Dále se tento vynálezu týká použití modifikovaného heparinu podle tohoto vynálezu pro přípravu léčiva, které má inhibiční účinky na heparanázu, přičemž výhodně má toto léčivo antiangiogenní účinky aještě výhodněji je určeno pro léčbu zánětů a/nebo autoimunitních onemocnění.
Mezi uvedená onemocnění patří primární nádory, metastázy, diabetické retinopatie, psoriáza, retrolentikulámí fibroplázie, restenóza po angioplastice, koronární by-pass, zánět, artritida, autoimunintní onemocnění, odmítnutí aloimplantátu, kardiovaskulární onemocnění, fibroproliferativní onemocnění, onemocnění vyvolávaná abnormální agregací krevních destiček, onemocnění vyvolávaná proliferací hladkého svalu, Goodpasteureův syndrom, akutní glomerulonefritida, neonatální pulmonální hypertenze, astma, městnavé selhání srdce, puimonální hypertenze dospělých, renální vaskulární hypertenze, proliferativní retinopatie, roztroušená skleróza, experimentální autoimunitní encefalomyelitida, inzulín-dependentní diabetes, zánětlivé onemocnění střev, vředová kolitida, Crohnova nemoc.
V dalším aspektu je předmětem tohoto vynálezu farmaceutická kompozice obsahující jako aktivní složku alespoň jeden modifikovaný heparin podle tohoto vynálezu, ve směsi s farmaceuticky přijatelnými vehikuly a excipienty.
Sloučeniny podle předloženého vynálezu vydatně zabraňují vedlejším účinkům, typickým pro heparin. Sloučeniny podle předloženého vynálezu vydatně zabraňují antikoagulačnímu účinku. Vydatným zabráněním takovým účinkům musejí z pohledu klinického využití chápat odborníci z oboru buď žádný, nebo jen zanedbatelný účinek.
Účinek inhibující heparanázu byl stanoven metodou stanovenou skupinou Vlodavského (Bitan, M., et al., 1995). Metoda je založena na hodnocení nadbytečné fragmentace proteoglykanů heparan sulfátu řetězce heparan sulfátu (HSPG) způsobeného heparanázou. Jako zdroj HSPG se obvykle používá sulfátem značená extracelulární matrice (ECM). Sulfátem značená ECM se inkubuje s rekombinantní heparanázou při pH 6,2 v nepřítomnosti a v přítomnosti zvyšujících se koncentrací zkoušené sloučeniny.
K hodnocení nastalé degradace proteoglykanů se inkubační medium odebírá a pro gelovou filtraci nanáší na kolonu se Sepharosou 6B (0,9 x 30 cm). Frakce (0,2 ml) se eluují PBS při průtoku 5 ml.IT1 a měří se radioaktivita. Vyloučený objem (Vo) se obarví dextranovou modří a celkový nanesený objem (Vt) fenolčervení. Degradované fragmenty postranních řetězců HS se eluují ze Sepharosy 6B při 0,5 < Kav < 0,8 (peak II). Za uváděných pokusných podmínek dobré heparanázové inhibitory inhibují fragmentaci HS při koncentracích 10 pg.ml1 nebo nižších.
Výsledky jsou v níže uvedené tabulce 1.
Tabulka 1
Inhibice heparanázy v dávkách sahajících od 25 pg.mE1 do 5 pg.mF1
-8CZ 307433 B6
inhbice
dávka 25 pg.mr1 10 pg.ml·1 5 pg.ml·1
heparin 100% nestanoveno >100%
ST 1516 heparin 40 % RO 100% nestanoveno >85 %
ST1514 heparin ~50 % RO 100% 100% >85 %
ST1515 heparin 27,5 % RO 100% 100% 100%
ST1518 50 % NAc heparin 30 % RO 100% 100% >85 %
Stojí za zmínku, že ST 1518 má velký inhibiční účinek i při koncentraci 1 pg.ml '.
Sloučeniny podle předloženého vynálezu a zvláště pak nové sloučeniny, byly zkoušeny na své účinky vzhledem k růstovým faktorům FGF podle stejného pokusného modelu, který byl popsán ve WO 01/55221, a vykazovaly účinky srovnatelné s účinky uvedenými v citovaném odkazu. Následující příklady ještě dále vynález objasní.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
ST 1518
K vodnému roztoku 1 g heparinu předem eluovanému z kolony s Amberlitem IR 120, byl přidán nadbytek pyridinu. Roztok byl za sníženého tlaku odpařen; výsledná pyridinová sůl heparinu byla rozpuštěna v 50 ml směsi DMSO/voda v poměru 95 : 5 a mícháno při 20 °C po dobu 2 hodin k získání desulfatačního stupně okolo 50 %.
Potom byl roztok zředěn stejně velkým objemem nasyceného roztoku NaHCO3. Tento roztok byl na membráně dialyzován proti destilované vodě (odebráno 1000 až 2000 D). Výsledný produkt byl izolován odpařením za sníženého tlaku.
N-acetylovaný heparin byl připraven N-acetylací 50 % N-desulfátovaného heparinu. 1 g heparinu bylo rozpuštěno v 10 ml destilované vody; roztok byl ochlazen na 4 °C a nasycen hydrogenuhličitanem sodným; k tomuto roztoku bylo přidáno 625 μΐ anhydridu kyseliny octové a směs míchána po dobu 2 hodin při 4 °C. Během reakce bylo pH sledováno a udržováno na hodnotě okolo 8 přidáváním hydrogenuhličitanu sodného. Potom byl získaný roztok dialyzován přes membránu proti destilované vodě (odebráno 2000 - 1000 D).
g 50 % N-acetylovaného heparinu bylo rozpuštěno ve 25 ml destilované vody a ochlazeno na 4 °C. Po přídavku 25 ml 0,2 M roztoku NalO4 byl roztok ponechán míchat v temnu 20 hodin a reakce byla zastavena přídavkem ethylenglykolu a sole byly odstraněny tangenciální ultrafiltrací. K odsolenému roztoku přidáváno 400 mg NaBH4 rozděleného na několik dávek. Roztok byl ponechán míchat po dobu 3 hodin při okolní teplotě, potom zneutralizován zředěnou HC1 a odsolen tangenciální ultrafiltrací. nC-NMR spektrum sloučeniny je znázorněno na obrázku 1.
-9CZ 307433 B6
Příklad 2
ST 2010 a ST 2184 g heparinu bylo rozpuštěno v 63 ml roztoku IN NaOH. Roztok byl ponechán míchat po dobu 45 minut při 60 °C, ochlazen a zneutralizován zředěnou HC1. Potom byl roztok míchán ještě 48 hodin při 70 °C, ochlazen a dialyzován přes membránu proti vodě (odebráno 2000 - 1000 D).
g 2-O-desulfátovaného heparinu bylo rozpuštěno v 50 ml destilované vody a ochlazeno na 4 °C. Po přídavku 50 ml 0,2 M roztoku NalO4 byl roztok ponechán míchat v temnu 20 hodin a reakce byla zastavena přídavkem ethylenglykolu a sole byly odstraněny tangenciální ultrafiltrací. Potom bylo k odsolenému roztoku přidáváno 800 mg NaBH4 rozděleného na několik dávek. Roztok byl ponechán míchat po dobu 3 hodin při okolní teplotě, potom zneutralizován zředěnou HC1 a odsolen tangenciální ultrafiltrací.
400 mg oxidovaného a redukovaného heparinu bylo rozpuštěno ve 25 ml destilované vody. Po přídavku 7 mg NaNO2 bylo pH nastaveno zředěnou HCI na hodnotu 2 a roztok ponechán míchat 17 minut při 4 °C. Reakce byla zastavena zneutralizováním. Potom bylo k odsolenému roztoku přidáváno 60 mg NaBH4 rozděleného na několik dávek. Roztok byl ponechán míchat po dobu 3 hodin při okolní teplotě, potom zneutralizován zředěnou HCI a frakcionován gelovou filtrací. Byly izolovány dvě frakce o rozdílné molekulové hmotnosti: ST 2010 mající Mw = 3050 a ST 2184 mající Mn = 5800 a Mw = 7520.
I3C-NMR spektrum sloučeniny ST 2010 je znázorněno na obrázku 2.
Příklad 3
ST 2041
K vodnému roztoku 2 g heparinu předem eluovanému z kolony s Amberlitem IR 120, byl přidán nadbytek pyridinu. Roztok byl za sníženého tlaku odpařen; výsledná pyridinová sůl heparinu byla rozpuštěna ve 100 ml směsi DMSO/H2O v poměru 95:5a mícháno při 20 °C po dobu 4 hodin k získání desulfatačního stupně okolo 64 %.
Potom byl roztok zředěn stejně velkým objemem nasyceného roztoku NaHCC^. Tento roztok byl na membráně dialyzován proti destilované vodě (odebráno 1000 až 2000 D). Výsledný produkt byl izolován odpařením za sníženého tlaku.
13C-NMR spektrum sloučeniny ST 2041 je znázorněno na obrázku 3.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Modifikovaný heparin obsahující glykosaminové zbytky o různém stupni N-desulfatace a následné N-acetylace připravitelný podrobením heparinu způsobu, který sestává z následujících kroků:
    a) N-desulfatace pomocí solvolytické hydrolýzy sulfaminových zbytků ve směsi DMSO:H2O v objemovém poměru 95:5, při teplotě místnosti, po dobu v rozmezí od 0,5 do 8 hodin, čímž se dosáhne úplné nebo částečné eliminace sulfátových skupin v poloze 2 glukosaminových zbytků;
    b) N-acetylace uvedených úplně nebo částečně desulfatovaných skupin v poloze 2 glukosaminových zbytků reakcí s acetylační činidlem v alkalickém vodném roztoku o pH 8-9, čímž se získají úplně nebo částečně acetylované skupiny v poloze 2 glukosaminových zbytků;
    - 10CZ 307433 B6
    c) oxidace diolů pomocí jodistanu sodného, čímž se dosáhne otevření glykosidového kruhu za vzniku dvou aldehydových skupin na každý modifikovaný zbytek;
    d) redukce uvedených aldehydových skupin na primární alkohol;
    e) případná hydrolýza sloučenin získaných v kroku d) za vzniku oligosacharidů odpovídajících pravidelným sekvencím;
    nebo alternativně
    f) podrobení produktů získaných v kroku d) parciální enzymatické hydrolýze pomocí enzymu vybraného ze skupiny sestávající z lyázy, heparinázy, heparitinázy nebo ekvivalentního enzymu, za vzniku oligosacharidů s neredukujícím koncovým zbytkem sestávajícím z nenasycené iduronové kyseliny, redukujícím zbytkem sestávajícím z N-sulfoglukosaminu a obsahujících alespoň jeden zbytek otevřené iduronové kyseliny.
  2. 2. Heparin podle nároku 1 vybraný ze skupiny sestávající z:
    - částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu s a molekulovou hmotností, MW, 11 200, polydisperzním indexem 1,3, stupněm desulfatace 1,6, vyjádřeným jako molámí poměr SC3-:COO-, procentuálním podílem modifikovaných uronových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uronových kyselin 30 %, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 50 %,
    - částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu o nízké molekulové hmotnosti, LMW, s molekulovou hmotností Mn=4780, Mw=10 000, polydisperzním indexem 2,092, procentuálním podílem modifikovaných uronových kys, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 50 %,
    - částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu, s procentuálním podílem modifikovaných uronových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uronových kyselin 30 %, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 27 %,
    - částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu, s procentuálním podílem modifikovaných uronových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uronových kyselin 30%, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 39 %;
    - částečně N-desulfatovaného a N-reacetylovaného heparinu, s procentuálním podílem modifikovaných uronových kyselin vzhledem k celkovému obsahu uronových kyselin 30 %, přičemž glykosaminové zbytky mají stupeň N-acetylace 64 %.
  3. 3. Použití heparinu podle nároku 1 nebo 2 pro přípravu léčiva, které má inhibiční účinky na heparanázu.
  4. 4. Použití podle nároku 3, kde léčivo má antiangiogenní účinky.
  5. 5. Použití podle kteréhokoli z nároků 3 až 4, kde uvedené léčivo je užitečné pro léčbu zánětů.
  6. 6. Použití podle kteréhokoli z nároků 3 až 5, kde uvedené léčivo je užitečné pro léčbu autoimunitních onemocnění.
  7. 7. Použití podle kteréhokoli z nároků 3 až 6, kde onemocnění, které má být léčeno, je vybrané ze skupiny, kterou tvoří primární nádory, metastázy, diabetické retinopatie, psoriáza, retrolentikulámí fibroplázie, restenóza po angioplastice, koronární by-pass, zánět, artritida, autoimunintní onemocnění, odmítnutí aloimplantátu, kardiovaskulární onemocnění, fibro
    - 11 CZ 307433 B6 proliferativní onemocnění, onemocnění vyvolávaná abnormální agregací krevních destiček, onemocnění vyvolávaná proliferací hladkého svalu, Goodpastureův syndrom, akutní glomerulonefritida, neonatální pulmonální hypertenze, astma, městnavé selhání srdce, pulmonální hypertenze dospělých, renální vaskulární hypertenze, proliferativní retinopatie, 5 roztroušená skleróza, experimentální autoimunitní encefalomyelitida, inzulín-dependentní diabetes, zánětlivé onemocnění střev, vředová kolitida, Crohnova nemoc.
  8. 8. Farmaceutická kompozice obsahující alespoň jednu sloučeninu podle nároku 1 nebo 2 jako aktivní složku ve směsi farmaceuticky přijatelnými vehikuly a excipienty.
CZ2004-255A 2001-09-12 2001-09-12 Deriváty částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů jako inhibitory heparanázy mající antiangiogenní účinky a zabraňující antikoagulačnímu působení CZ307433B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IT2001/000472 WO2003022291A1 (en) 2001-09-12 2001-09-12 Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2004255A3 CZ2004255A3 (cs) 2004-11-10
CZ307433B6 true CZ307433B6 (cs) 2018-08-22

Family

ID=11133723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2004-255A CZ307433B6 (cs) 2001-09-12 2001-09-12 Deriváty částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů jako inhibitory heparanázy mající antiangiogenní účinky a zabraňující antikoagulačnímu působení

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20050137167A1 (cs)
EP (2) EP2343077B1 (cs)
JP (1) JP2005506326A (cs)
KR (1) KR100855331B1 (cs)
CN (1) CN1547477B (cs)
AT (1) ATE511846T1 (cs)
AU (1) AU2001292231B2 (cs)
BR (1) BR0117124A (cs)
CA (1) CA2457719C (cs)
CY (2) CY1112551T1 (cs)
CZ (1) CZ307433B6 (cs)
DK (1) DK1427427T3 (cs)
ES (2) ES2431362T3 (cs)
HK (1) HK1069537A1 (cs)
HU (1) HU230385B1 (cs)
MX (1) MXPA04002217A (cs)
PT (2) PT1427427E (cs)
SI (1) SI1427427T1 (cs)
SK (1) SK288335B6 (cs)
WO (1) WO2003022291A1 (cs)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005092348A1 (ja) * 2004-03-29 2005-10-06 Kringle Pharma Inc. ヘパリン様オリゴ糖含有ｈｇｆ産生促進薬剤
AU2007312880A1 (en) * 2006-10-20 2008-04-24 The Australian National University Inhibition of degradation of extracellular matrix
WO2009007224A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Low molecular weight heparin derivatives having neuroprotective activity
US8569262B2 (en) 2007-11-02 2013-10-29 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide compositions and methods of use for the treatment and prevention of disorders associated with progenitor cell mobilization
US8592393B2 (en) 2007-11-02 2013-11-26 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide compositions and methods of use for the treatment and prevention of disorders associated with progenitor cell mobilization
EP2205642B1 (en) * 2007-11-02 2016-01-27 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Non-anticoagulant polysaccharide compositions
FI20085308A0 (fi) * 2008-04-11 2008-04-11 Polysackaridforskning I Uppsal Heparanaasittomia ihmiskuntaan kuulumattomia nisäkkäitä
FR2949115B1 (fr) * 2009-08-14 2012-11-02 Sanofi Aventis OLIGOSACCHARIDES N-SULFATES ACTIVATEURS DES RECEPTEURS DES FGFs, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE
CA2792610A1 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 The Australian National University Heparan sulfate replacement therapy
WO2011130697A2 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Tissue targeting
WO2011159770A2 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating hair growth
FR2970969B1 (fr) * 2011-01-27 2013-10-18 Sanofi Aventis Oligosaccharides 3-o-alkyles activateurs des recepteurs des fgfs, leur preparation et leur application en therapeutique
KR101522604B1 (ko) * 2013-03-21 2015-05-26 대한민국 곤충 글라이코자미노글라이칸 유래 헤파린 단편 및 이의 제조 방법
WO2014185858A1 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 Agency For Science, Technology And Research Heparan sulphates
US10016449B2 (en) 2013-05-28 2018-07-10 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions
ITLO20130005A1 (it) * 2013-10-31 2015-05-01 He E Biochimiche G Ronzonr S R Derivati di glucosamminoglicani n-desolfatati e loro uso come farmaci
ITLO20130006A1 (it) * 2013-11-06 2015-05-07 He E Biochimiche G Ronzoni S R Derivati carbossilati di glucosamminoglicani e loro uso come farmaci
US10576101B2 (en) 2015-03-06 2020-03-03 Leadiant Biosciences Sa Roneparstat combined therapy of multiple myeloma
US11787783B2 (en) 2016-12-13 2023-10-17 Beta Therapeutics Pty Ltd Heparanase inhibitors and use thereof
CA3046997A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Beta Therapeutics Pty Ltd Heparanase inhibitors and use thereof
CN108424474B (zh) * 2017-02-15 2023-07-25 清华大学 去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗
CN110612305B (zh) * 2017-03-23 2023-11-28 维多利亚林克有限公司 硫酸乙酰肝素糖模拟化合物及其医药与化妆品用途
EP3388439A1 (en) 2017-04-11 2018-10-17 Leadiant Biosciences SA Biotin-conjugated n-acetyl glycol split heparin
US11225531B2 (en) 2018-02-02 2022-01-18 Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co., Ltd. Glycosaminoglycan derivative and preparation method therefor and use thereof
EP3705126A1 (en) 2019-03-05 2020-09-09 Leadiant Biosciences S.p.A. Roneparstat for the treatment of amyloidosis
CN114901702B (zh) * 2019-12-27 2024-01-09 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 一种糖胺聚糖衍生物及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0254067A2 (en) * 1986-06-26 1988-01-27 Hadassa Medical Organization Composition for metastasis prevention
WO1988001280A1 (en) * 1986-08-21 1988-02-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Glycosaminoglycan derivatives and their use as inhibitors of tumor invasiveness or metastatic profusion
WO1992001003A1 (en) * 1990-07-10 1992-01-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Glycosaminoglycan derivatives and their use as inhibitors of tumor invasiveness or metastatic profusion-ii
US5296471A (en) * 1992-12-22 1994-03-22 Glycomed Incorporated Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby
WO1995002613A2 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Italfarmaco S.P.A. Heparin derivatives having antimetastatic activity
WO1996006867A1 (en) * 1994-09-01 1996-03-07 Glycomed Incorporated Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby
WO2001055221A1 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62265998A (ja) * 1986-03-10 1987-11-18 ボ−ド　オブ　リ−ジエンツ　ザ　ユニヴア−シテイ　オブ　テキサス　システム ヘパラン硫酸エンドグリコシダーゼアッセイ
IE61758B1 (en) 1986-05-23 1994-11-30 Daiichi Seiyaku Co Use of a sulfated polysaccharide
IL79254A0 (en) 1986-06-26 1986-09-30 Hadassah Med Org Compositions for preventing graft rejection
IL85145A (en) 1987-01-23 1994-08-26 Univ Australian Anti-metastatic pharmacological or veterinary preparations containing modified herpin with reduced anticoagulant activity
FR2614026B1 (fr) * 1987-04-16 1992-04-17 Sanofi Sa Heparines de bas poids moleculaire, a structure reguliere, leur preparation et leurs applications biologiques
PT93847A (pt) 1989-04-24 1990-11-20 Harvard College Processo para a preparacao de oligossacaridos de baixo peso molecular derivados de heparina ou de sulfato de heparano despolimerizados e de composicoes farmaceuticas que os contem
US5474765A (en) 1992-03-23 1995-12-12 Ut Sw Medical Ctr At Dallas Preparation and use of steroid-polyanionic polymer-based conjugates targeted to vascular endothelial cells
IL107040A0 (en) 1992-09-25 1993-12-28 Lilly Co Eli Modified platelet factor-4
US5399667A (en) 1993-03-05 1995-03-21 Washington University Thrombospondin receptor binding peptides
IT1264101B1 (it) 1993-03-29 1996-09-10 Alfa Wassermann Spa Processo per la sintesi di glicosaminoglicani semisintetici a struttura eparinica od eparanica modificati nella posizione 2
WO1995005182A1 (en) 1993-08-13 1995-02-23 Glycomed Incorporated Bridged oligosaccharides and sulfated derivatives thereof
US5739115A (en) 1993-10-07 1998-04-14 Glycomed Incorporated Sulfated maltooligosaccharides with heparin-like properties
JPH09503510A (ja) 1993-10-07 1997-04-08 グリコメド・インコーポレイテッド ヘパリン様特性を有する高硫酸化マルトオリゴ糖
JPH09512822A (ja) 1994-05-06 1997-12-22 グリコメド・インコーポレイテッド Ｏ−脱硫酸化ヘパリン誘導体とその製造法および使用
AUPN261895A0 (en) 1995-04-28 1995-05-18 Australian National University, The Preparation and use of sulfated oligosaccharides
JP4051099B2 (ja) * 1997-01-31 2008-02-20 生化学工業株式会社 低分子化ヘパリン、その製造法及び医薬組成物
WO2001055521A1 (fr) * 1998-09-22 2001-08-02 Nippon Eisei Center Co., Ltd. Raccord metallique de renforcement parasismique
DE19955803A1 (de) 1999-11-19 2001-05-23 Knoll Ag Verwendung von Heparanase-Inhibitoren zur Behandlung von Hersinsuffizienz

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0254067A2 (en) * 1986-06-26 1988-01-27 Hadassa Medical Organization Composition for metastasis prevention
WO1988001280A1 (en) * 1986-08-21 1988-02-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Glycosaminoglycan derivatives and their use as inhibitors of tumor invasiveness or metastatic profusion
WO1992001003A1 (en) * 1990-07-10 1992-01-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Glycosaminoglycan derivatives and their use as inhibitors of tumor invasiveness or metastatic profusion-ii
US5296471A (en) * 1992-12-22 1994-03-22 Glycomed Incorporated Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby
WO1994014851A1 (en) * 1992-12-22 1994-07-07 Glycomed Incorporated Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby
US5808021A (en) * 1992-12-22 1998-09-15 Glycomed Incorporated Method for controlling O-desulfation of heparin
WO1995002613A2 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Italfarmaco S.P.A. Heparin derivatives having antimetastatic activity
WO1996006867A1 (en) * 1994-09-01 1996-03-07 Glycomed Incorporated Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby
WO2001055221A1 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. Lapierre a kol: "Chemical modification of heparin that diminish its anticoagulant but preserve its heparanase-inhibitory, angiostatic, antitumor and anti-metastatic propertis" Glycobiology 6(3) s. 355-366 (1996) *

Also Published As

Publication number Publication date
CY1114544T1 (el) 2016-10-05
PT1427427E (pt) 2011-09-13
HU230385B1 (hu) 2016-03-29
EP2343077A1 (en) 2011-07-13
CN1547477A (zh) 2004-11-17
AU2001292231B2 (en) 2008-06-05
DK1427427T3 (da) 2011-09-19
ES2431362T3 (es) 2013-11-26
HK1069537A1 (en) 2005-05-27
CA2457719A1 (en) 2003-03-20
BR0117124A (pt) 2004-09-28
JP2005506326A (ja) 2005-03-03
SK1602004A3 (en) 2004-08-03
PT2343077E (pt) 2013-08-29
HUP0401693A2 (hu) 2004-12-28
CY1112551T1 (el) 2016-02-10
KR20040048404A (ko) 2004-06-09
SI1427427T1 (sl) 2011-10-28
MXPA04002217A (es) 2004-07-08
CA2457719C (en) 2012-01-03
EP1427427A1 (en) 2004-06-16
EP2343077B1 (en) 2013-07-17
CZ2004255A3 (cs) 2004-11-10
ATE511846T1 (de) 2011-06-15
US20050137167A1 (en) 2005-06-23
KR100855331B1 (ko) 2008-09-04
WO2003022291A1 (en) 2003-03-20
EP1427427B1 (en) 2011-06-08
HUP0401693A3 (en) 2009-06-29
ES2367778T3 (es) 2011-11-08
SK288335B6 (sk) 2016-02-02
CN1547477B (zh) 2010-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ307433B6 (cs) Deriváty částečně desulfátovaných glykosaminoglykanů jako inhibitory heparanázy mající antiangiogenní účinky a zabraňující antikoagulačnímu působení
Caputo et al. Design, synthesis, and biomedical applications of synthetic sulphated polysaccharides
US7781416B2 (en) Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect
Casu et al. Non-anticoagulant heparins and inhibition of cancer
Toida et al. Structure and bioactivity of sulfated polysaccharides
AU2001292231A1 (en) Derivatives of partially desulphated glycogaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect
JP6132302B2 (ja) 抗血管新生活性を有し、抗凝血効果を有さない、ヘパラナーゼ阻害剤としての部分的に脱硫酸化されたグリコサミノグリカンの誘導体
ITMI970678A1 (it) Glicosaminoglicani aventi elevata attivita&#39; antitrombotica
EP2025687A1 (en) Process for the preparation of heparanase-inhibiting sulfated hyaluronates and products obtained thereby
DK3063177T3 (en) DERIVATIVES OF N-DESULPHATED GLYCOSAMINOGLYCANES AND USE AS MEDICINES
Sampaio et al. Heparins and heparans sulfates. Structure, distribution and protein interactions
Wijnhoven et al. Anti-proteinuric effects of glycosaminoglycan-based drugs
KR20160106559A (ko) 카르복실화된(carboxylated) 글루코스아미노글리칸 유도체 및 약물로서의 용도
US20080139503A1 (en) Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect
JP2016014148A (ja) 抗血管新生活性を有し、抗凝血効果を有さない、ヘパラナーゼ阻害剤としての部分的に脱硫酸化されたグリコサミノグリカンの誘導体
AU2008202261B2 (en) Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect
PL212357B1 (pl) Zmodyfikowana heparyna, jej zastosowanie i zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna
Garg et al. Heparin as a potential therapeutic agent to reverse vascular remodeling

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20010912