CN114901702B - 一种糖胺聚糖衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种糖胺聚糖衍生物及其应用，本申请所述的糖胺聚糖衍生物具有如式I所示结构。本申请的糖胺聚糖衍生物具有良好的乙酰肝素酶抑制活性，可用于具有乙酰肝素酶抑制活性的药物的开发。此外，本申请所述糖胺聚糖衍生物具有良好的抗肿瘤转移活性，可用作抗肿瘤药物。

Description

一种糖胺聚糖衍生物及其应用
技术领域
本申请属于生物材料技术领域，涉及一种糖胺聚糖衍生物及其应用。
背景技术
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)是一类糖复合物，该类物质具有两部分：核心蛋白和以共价键方式连接在核心蛋白上的一条或者多条硫酸乙酰肝素糖链。细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)是指由细胞分泌的，位于上皮或内皮细胞下层和结缔组织细胞周围，为组织、器官提供力学支持和物理强度的物质。细胞膜是位于原生质体外围、紧贴细胞壁的膜结构，能够防止细胞外物质自由进入细胞，保证细胞内环境的相对稳定。HSPGs是ECM和细胞膜的主要成分之一，且HSPGs上的硫酸乙酰肝素结合有大量的生长因子，比如成纤维生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子和肝细胞生长因子。HSPGs在生长、发育、炎症反应、微生物和病毒的侵袭和感染以及肿瘤的发生发展等不同的生理病理过程中均有重要作用。在体内，硫酸乙酰肝素糖链一般被内源性乙酰肝素酶特异性切割。
乙酰肝素酶是一种内源性的β(1→4)糖苷内切酶，是唯一能降解HSPGs的内源糖苷酶。在正常组织细胞中，乙酰肝素酶主要分布于胎盘、脾脏、血小板及中性粒细胞、单核细胞、活化T/B淋巴细胞内，而在心脏、脑、肺、骨骼肌、肾脏、胰腺中不表达，普遍存在于转移性恶性肿瘤细胞中。乙酰肝素酶可以促进肿瘤侵袭和转移，还可抑制肿瘤细胞凋亡，参与神经轴突生长、自身免疫以及肿瘤血管形成等一系列生理、病理活动。
乙酰肝素酶在胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤中表达异常升高，其过表达通常与肿瘤的预后不良正相关，表现在肿瘤细胞的生物学行为上就是促进肿瘤细胞的侵袭和转移。乙酰肝素酶能够特异性地切割位于细胞表面和ECM中的硫酸乙酰肝素糖链，破坏细胞外基质和基底膜的稳定结构，从而使得肿瘤细胞的侵袭和转移变得容易。
同时，乙酰肝素酶将长的硫酸乙酰肝素糖链切割成小的片段，这些片段一般由20-30个糖残基组成，有证据表明这些寡糖链的生物功能比完整的硫酸乙酰肝素糖链强，不同的降解产物在肿瘤的发展过程中的作用不同。
此外，细胞外基质和细胞膜上的硫酸乙酰肝素被乙酰肝素酶切割成小片段之后，结合在糖链上的各种生成因子被释放出来，促进肿瘤细胞生长和肿瘤血管生成。
早在20世纪80年代，人们就开始研究乙酰肝素酶引起的糖链降解在肿瘤发生发展过程中的作用，目前已经有了比较明确的认识，越来越多的证据证实乙酰肝素酶是一个癌症治疗的合适靶标。
肝素又称普通肝素，因首先从肝脏发现而得名，是一种由葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸与葡萄糖胺交替组成的粘多糖，通过α(1→4)糖苷键连接，肝素属于在结构上不均一，在聚合程度上高度分散的一类聚阴离子糖胺聚糖，肝素带有大量负电荷，相对分子质量在1200-40000Da。肝素除具有抗凝作用外，还具有多种生物活性和临床用途，包括抗炎、抗血管生成及抗肿瘤作用等。肝素与乙酰肝素酶的天然底物HS(硫酸乙酰肝素)结构相似，能够竞争性结合乙酰肝素酶，抑制肿瘤细胞乙酰肝素酶活性表达。通过抑制乙酰酶活性，一方面抑制肿瘤细胞降解细胞外基质，从而降低肿瘤细胞侵入周围组织的能力。另一方面阻断由乙酰肝素酶从细胞外基质中释放生长因子的能力，进而抑制了肿瘤细胞的生长和肿瘤血管的生长。但是，肝素在治疗肿瘤，特别是肿瘤转移方面的应用受到了肝素抗凝活性的严重限制。目前已有较多研究对肝素进行了化学修饰，以降低其抗凝能力，同时保存其抗肿瘤活性。
CN102924627A公开了一种具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法，其以肝素为起始物，进行完全脱硫酸化，然后进行N位重新硫酸化，采用PAPS再生系统，通过AST-IV、6-OST-1和2-OST组合酶法合成特定位点硫酸化肝素，最后再将上述肝素衍生物进行N位脱硫酸化，最终得到具有低抗凝活性的专一抗肿瘤作用的肝素衍生物。
CN1547477A公开了一种部分脱硫酸糖胺聚糖衍生物及其制备方法，其以肝素为原料，将其葡糖胺残基中2位部分N-脱磺酸基，再将部分N-脱磺酸基后生成的游离氨基进行N-重乙酰化，随后使用高碘酸钠氧化糖醛酸残基中的2、3位邻二醇结构生成醛基，然后将醛基还原成伯醇，从而得到抗凝活性降低的乙酰肝素酶抑制剂。此乙酰肝素酶抑制剂可进一步通过酸水解或者酶解获得低分子量的乙酰肝素酶抑制剂。
CN105744940A公开一种羧基化糖胺聚糖衍生物及其制备方法和应用，该衍生物至少部分残基为具有三个羧基的裂解的残基。用于制备所述羧基化糖胺聚糖衍生物的方法包括：将糖胺聚糖的敏感非硫酸化残基上相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2有效转化为醛，随后在适宜条件下，将醛基继续氧化得到两个新羧基。起始糖胺聚糖是天然或合成的糖胺聚糖，优选自肝素、低分子肝素或硫酸类肝素。由该方法制备的肝素和低分子量肝素衍生物在体外和在体内多发性骨髓瘤实验模型中表现出对类肝素酶活性的有效抑制。
CN105814086A公开了一种糖胺聚糖衍生物及其制备方法和应用，所述衍生物的起始原料是天然或合成的糖胺聚糖，首先进行N-脱硫酸化和任选地2-O脱硫酸化，然后其中至少部分相邻的二醇和OH/NH2被转化为相应的醛，最后将所述醛还原为相应的醇。所得糖胺聚糖衍生物可作为用于治疗诸如多发性骨髓瘤和其他癌症的病理病况的药物活性成分。
然而，如上这些现有技术中乙酰肝素酶抑制剂的活性还有待进一步提高。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种糖胺聚糖衍生物。本申请的糖胺聚糖衍生物具有较高的乙酰肝素酶抑制剂活性，抗凝活性低，具有良好的抗肿瘤转移活性。
为达此目的，本申请采用以下技术方案：
第一方面，本申请提供一种糖胺聚糖衍生物，所述糖胺聚糖衍生物具有如下式I所示结构：
其中，W环包含下列式A、式B、式C、式D和式E所示的结构：
其中R1为SO3 -或H；R2为SO3 -或H；R3为SO3 -、乙酰基或H；
R为烷基、环烷基、芳基、环烷基烷基、芳基烷基或-CH(R4)-COOH；其中，R4为H、CH3-、CH3-CH2-CH(CH3)-、(CH3)2CH-、(CH3)2CH-CH2-、HOOC-CH2-、H2N-CO-CH2-、HN＝C(NH2)-NH-(CH2)3-、HS-CH2-、H2N-CO-(CH2)2-、H2N-(CH2)4-、CH3-S-(CH2)2-、Ph-CH2-、HO-CH2-、CH3-CH(OH)-、HO-p-Ph-CH2-或HOOC-(CH2)2-；所述烷基、环烷基、芳基、环烷基烷基和芳基烷基任选地被1、2或3个选自氢原子、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羟基、氨基、氰基、硝基、甲基、乙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基和三氟甲氧基的基团所取代。
在一些实施方案中，所述R为C1-6烷基、C3-8环烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基-C1-6烷基、C6-10芳基-C1-6烷基或-CH(R4)-COOH；其中，所述R4为H、CH3-、CH3-CH2-CH(CH3)-、(CH3)2CH-、(CH3)2CH-CH2-、HOOC-CH2-、H2N-CO-CH2-、HN＝C(NH2)-NH-(CH2)3-、HS-CH2-、H2N-CO-(CH2)2-、H2N-(CH2)4-、CH3-S-(CH2)2-、Ph-CH2-、HO-CH2-、CH3-CH(OH)-、HO-p-Ph-CH2-或HOOC-(CH2)2-；所述烷基、环烷基、芳基、环烷基烷基和芳基烷基任选地被1、2或3个选自氢原子、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羟基、氨基、氰基、硝基、甲基、乙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基和三氟甲氧基的基团所取代。
在另一些实施方案中，所述R为甲基、三氟甲基、羟甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基、环丙基甲基、环丁基甲基、环己基甲基、苄基、苯乙基、苯丙基、对甲基苄基、对羟基苄基、对甲基苯乙基、-CH2-COOH或-CH(CH3)-COOH。
在本申请中，所述糖胺聚糖为未分级肝素、低分子肝素或硫酸乙酰肝素。
在本申请中，所述糖胺聚糖衍生物的分子量为4000-20000，例如4000、4300、4500、5000、6000、8000、9000、10000、12000、14000、16000、18000或20000。
在一些实施方案中，所述糖胺聚糖衍生物的分子量为8000-18000，在另一些实施方案中，所述糖胺聚糖衍生物的分子量为10000-16000。
在本申请中，所述式E所示的结构占W环所示结构的比例为20％～90％，例如20％、23％、25％、28％、30％、35％、38％、40％、43％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，所述式E所示的结构占W环所示结构的比例为30％～70％。在另一些实施方案中，所述式E所示的结构占W环所示结构的比例为40％～60％。
第二方面，本申请提供了一种糖胺聚糖衍生物，所述糖胺聚糖衍生物通过以下方法制备得到：
(1)糖胺聚糖的2-O-脱硫酸化：在碱性条件下，糖胺聚糖化合物2-位磺酸化艾杜糖醛酸C2-C3位经过环氧化反应形成环氧基团，然后环氧基团开环生成C2-C3位邻二醇结构；
(2)将糖醛酸C2-C3位邻二醇结构氧化开环并生成二醛；
(3)将步骤(2)的反应产物与胺类化合物NH2-R发生醛胺缩合反应，然后还原得到所述糖胺聚糖衍生物；
其中，所述R为烷基、环烷基、芳基、环烷基-烷基-、芳基-烷基-或-CH(R4)-COOH；其中，R4为H、CH3-、CH3-CH2-CH(CH3)-、(CH3)2CH-、(CH3)2CH-CH2-、HOOC-CH2-、H2N-CO-CH2-、HN＝C(NH2)-NH-(CH2)3-、HS-CH2-、H2N-CO-(CH2)2-、H2N-(CH2)4-、CH3-S-(CH2)2-、Ph-CH2-、HO-CH2-、CH3-CH(OH)-、HO-p-Ph-CH2-或HOOC-(CH2)2-；所述烷基、环烷基、芳基、环烷基烷基和芳基烷基任选地被1、2或3个选自氢原子、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羟基、氨基、氰基、硝基、甲基、乙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基和三氟甲氧基的基团所取代。
在一些实施方案中，所述R为C1-6烷基、C3-8环烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基-C1-6烷基-、C6-10芳基-C1-6烷基-或-CH(R4)-COOH；其中，所述R4为H、CH3-、CH3-CH2-CH(CH3)-、(CH3)2CH-、(CH3)2CH-CH2-、HOOC-CH2-、H2N-CO-CH2-、HN＝C(NH2)-NH-(CH2)3-、HS-CH2-、H2N-CO-(CH2)2-、H2N-(CH2)4-、CH3-S-(CH2)2-、Ph-CH2-、HO-CH2-、CH3-CH(OH)-、HO-p-Ph-CH2-或HOOC-(CH2)2-；所述烷基、环烷基、芳基、环烷基烷基和芳基烷基任选地被1、2或3个选自氢原子、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羟基、氨基、氰基、硝基、甲基、乙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基和三氟甲氧基的基团所取代。
在另一些优选的实施方案中，所述R为甲基、三氟甲基、羟甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基、环丙基甲基、环丁基甲基、环己基甲基、苄基、苯乙基、苯丙基、对甲基苄基、对羟基苄基、对甲基苯乙基、-CH2-COOH或-CH(CH3)-COOH。
在本申请中，步骤(1)所述碱性条件为0.5M～2.0M(例如0.5M、0.8M、1.0M、1.2M、1.5M、1.8M或2.0M)的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
在本申请中，步骤(1)中所述环氧化反应的反应温度为20℃至100℃(例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃)，反应时间为20分钟至120分钟(例如20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、100分钟、110分钟或120分钟)。在一些优选的实施方案中，所述环氧化反应的反应温度为40℃至80℃，反应时间为20分钟至60分钟；在另一些优选的实施方案中，所述环氧化反应的反应温度为40℃、50℃或60℃，反应时间为20分钟、30分钟、45分钟或60分钟。
在本申请中，步骤(1)中所述环氧基团开环反应的pH值为5.0至9.0(例如5.0、5.3、5.5、5.8、6.0、6.4、6.8、7.0、7.4、7.8、8.0、8.3、8.5、8.8或9.0)，反应温度为30℃至100℃(例如30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃)。在一些优选的实施方案中，步骤(1)中所述环氧基团开环反应的pH值为6.0至8.0，反应温度为40℃至80℃；在进一步优选的实施方案中，步骤(1)中所述环氧基团开环反应的pH值为6.5至7.5，反应温度为40℃、50℃、60℃或70℃。
在本申请中，步骤(2)中氧化反应使用的氧化剂为高碘酸钠。在一些优选的实施方案中，高碘酸钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的10～30倍(例如10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、22倍、25倍、28倍或30倍)。在进一步优选的实施方案中，高碘酸钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的15倍、18倍、20倍、22倍或25倍。
在本申请中，步骤(3)中胺类化合物NH2-R的用量与步骤(1)中糖胺聚糖化合物的用量按摩尔量/质量比计算为5～20mmol/g，例如5mmol/g、6mmol/g、7mmol/g、8mmol/g、9mmol/g、10mmol/g、12mmol/g、14mmol/g、16mmol/g、18mmol/g或20mmol/g。在一些优选的实施方案中，步骤(3)中胺类化合物NH2-R的用量与步骤(1)中糖胺聚糖化合物的用量按摩尔量/质量比计算为8～20mmol/g，其中，R具有本申请所述的含义。
在本申请中，步骤(3)中还原反应使用的还原剂为硼氢化钠。
在一些实施方案中，所述硼氢化钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的0.1～0.5倍，例如0.1倍、0.15倍、0.18倍、0.2倍、0.23倍、0.25倍、0.28倍、0.3倍、0.35倍、0.38倍、0.4倍、0.45倍、0.48倍或0.5倍，在一些优选的实施方案中，硼氢化钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的0.15～0.3倍。
在本申请中，所述糖胺聚糖化合物为未分级肝素、低分子肝素或硫酸乙酰肝素。在一些实施方案中，所述低分子肝素为依诺肝素钠、达肝素钠或那曲肝素钙。
第三方面，本申请提供了如第一方面或者第二方面所述的糖胺聚糖衍生物在制备具有乙酰肝素酶抑制活性的药物中的应用。
本申请所述的糖胺聚糖衍生物具有良好的乙酰肝素酶抑制活性，可用于具有乙酰肝素酶抑制活性的药物的开发。并且本申请所述的糖胺聚糖衍生物抗凝活性远远小于肝素钠等糖胺聚糖化合物。
第四方面，本申请提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面或者第二方面所述的糖胺聚糖衍生物作为活性成分。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药用载体和/或赋形剂。
第五方面，本申请提供了如第一方面或者第二方面所述的糖胺聚糖衍生物或者第四方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本申请所述糖胺聚糖衍生物具有良好的抗肿瘤转移活性，可用作抗肿瘤药物或者用于抗肿瘤药物的开发。
相对于现有技术，本申请取得了以下有益效果：
本申请的糖胺聚糖衍生物具有良好的乙酰肝素酶抑制活性，可用于具有乙酰肝素酶抑制活性的药物的开发。并且本申请所述的糖胺聚糖衍生物抗凝活性远远小于肝素钠等糖胺聚糖化合物。此外，本申请所述糖胺聚糖衍生物具有良好的抗肿瘤转移活性，可用作抗肿瘤药物或者用于抗肿瘤药物的开发。
术语定义
除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
术语“烷基”表示饱和直链或支链一价碳氢化合物原子团。除非另外详细说明，烷基基团含有1-10个碳原子；在一些实施例中，烷基基团含有1-8个碳原子；在另一些实施例中，烷基基团含有1-6个碳原子；在一些实施例中，烷基基团含有1-4个碳原子；在另一些实施例中，烷基基团含有1-3个碳原子。烷基基团的实例包含，但并不限于，甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)、异丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)、正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)、异丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)、仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)、叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)，正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)，3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)，2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)、正庚基、正辛基，等等。
术语“环烷基”表示含有3-12个碳原子的，单价或多价的饱和单环、双环或三环体系。环烷基基团的实例进一步包括，但绝不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等等。
术语“环烷基烷基”表示烷基基团可以被一个或多个环烷基基团所取代，其中烷基和环烷基基团具有如本申请所述的含义，这样的实例包括，但并不限于，环丙基乙基，环戊基甲基，环己基甲基等等。
术语“芳基”表示含有6-14元环的单环、双环或三环的碳环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含3-7元环，且只有一个附着点与分子的其余部分相连。芳基可以包括但不限于苯基和萘基等等。
术语“芳基烷基”表示烷基基团可以被一个或多个芳基基团所取代，其中烷基和芳基基团具有如本申请所述的含义，这样的实例包括，但并不限于，苯甲基、2-苯基乙基等等。
术语“任选地被……所取代”，可以与术语“未取代或被……所取代”交换使用，即所述结构是未取代的或者被一个或多个本申请所述的取代基取代。
一般合成方法
一般地，本申请的化合物可以通过本申请所描述的方法制备得到，除非有进一步的说明，其中取代基的定义如式I所示。
(1)C2、C3环氧化
糖胺聚糖化合物的片段a中糖醛酸C2、C3位在碱的作用下，在合适的溶剂中反应生成含环氧结构的片段b；所述碱包含有机碱和无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾等；所述合适的溶剂包含但不限于水；所述反应可在室温下或加热至40℃-120℃进行，例如60℃。
(2)环氧结构开环
片段b在合适的溶剂中加热搅拌反应得到片段c，所述合适的溶剂包含但不限于水。
(3)C2-C3键氧化开环
糖胺聚糖化合物中片段a’和片段c和d在氧化剂的作用下，在合适的溶剂中反应得到C2-C3键断裂开环的片段e；所述氧化剂包含但不限于NaIO4；所述合适的溶剂包含但不限于水。
(4)醛胺缩合
片段e在合适的溶剂中与胺类化合物反应得到片段f；所述合适的溶剂包含但不限于水。
(5)还原
片段f在还原剂的作用下被还原得到片段g；所述还原剂包含但不限于硼氢化钠；所述合适的溶剂包含但不限于水。
检测方法
核磁测定在25℃下，利用配备5mm TCI冷冻探头的Bruker Avance 600MHz核磁共振波谱仪采集核磁谱图。使用Bruker TopSpin 3.0软件处理谱图并对谱峰进行积分。本申请MTC系列化合物具有醛基与伯胺缩合还原得到仲胺的特征结构，在1H-13C HSQC谱图中仲胺连接的脂肪烃及芳香烃具有特定的化学位移，参考“Qualification of HSQC methodsfor quantitative composition of heparin and low molecular weight heparins”(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis136(2017)92–105)对核磁谱图进行分析，通过核磁检测可确定MTC系列化合物的结构特征，结构特征的说明如表1所示。
表1
分子量(Mw)测试分子量通过HPLC-GPC(高效液相色谱-凝胶渗透层析)测定。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本申请，不应视为对本申请的具体限制。
实施例1
在本实施例中，制备糖胺聚糖衍生物MTC1，制备方法包括以下步骤：
(1)C2、C3环氧化
将肝素钠成品(10.0g，分子量Mw＝17086Da)溶于水(60mL)中，搅拌使其完全溶解，然后加入NaOH溶液(2mol/L，60mL)，加热至60℃，反应30分钟。反应结束后，冷却至室温，用HCl溶液(6M)调pH至7.0。
(2)环氧结构开环
向步骤(1)得到的产物溶液中加水(360mL)稀释，然后加热至70℃，反应24小时；中间体分子量Mw＝14671Da。
(3)高碘酸钠氧化开环
将步骤(2)反应得到的产物溶液冷却至4℃，加入NaIO4水溶液(0.2mol/L，200.87g)，然后于4℃下避光搅拌反应16小时；加入乙二醇(20.0mL)，继续搅拌1小时终止反应，反应溶液最后经中空纤维柱除盐。中间体分子量Mw＝13315Da。
(4)醛胺缩合
向步骤(3)反应除盐后的溶液中加入正戊胺(12mL，9.0g，100mmol)，用HCl溶液(6M)将反应液调pH至7.0，室温下搅拌反应7小时。反应结束后，反应溶液做除盐处理。中间体分子量Mw＝12791Da。
(5)硼氢化钠还原
向步骤(4)反应除盐后的溶液中加入硼氢化钠(2.0g)，室温下搅拌反应16h。反应结束后，用HCl溶液(6M)调pH至4，继续搅拌1小时，最后用NaOH溶液(0.1M)调pH至中性。采用多次醇沉法除盐，在480g溶液中加入25％NaCl溶液(20g)，然后加入乙醇(1000g)进行沉淀；所得沉淀再用水(96g)重新溶解，加入25％NaCl溶液(4g)，然后加入乙醇(200g)进行沉淀，沉淀冻干得到MTC1；分子量Mw＝12091Da。通过核磁测定gsU-NHR(R＝-(CH2)4CH3,46％)、G/I+GalA(9％)、C2/C3 epox(7％)和I2S(38％)占总糖醛酸单糖残基的百分比。
实施例2
在本实施例中，制备糖胺聚糖衍生物MTC2，制备方法包括以下步骤：
(1)C2、C3环氧化
将肝素钠成品(10.0g，分子量Mw＝17498Da)溶于水(60mL)中，搅拌使其完全溶解，然后加入NaOH溶液(2mol/L，60mL)，加热至80℃，反应30分钟。反应结束后，冷却至室温，用HCl溶液(6M)调pH至7.0。
(2)环氧结构开环
向步骤(1)得到的产物溶液中加水(360mL)稀释，然后加热至70℃，反应24小时；中间体分子量Mw＝13892Da。
(3)高碘酸钠氧化开环
将步骤(2)反应得到的产物溶液冷却至4℃，加入NaIO4水溶液(0.2mol/L，256.32g)，然后于4℃下避光搅拌反应20小时；加入乙二醇(20.0mL)，继续搅拌1小时终止反应，反应溶液最后经中空纤维柱除盐。中间体分子量Mw＝12536Da。
(4)醛胺缩合
向步骤(3)反应除盐后的溶液中加入正戊胺(12mL，9.0g，100mmol)，用HCl溶液(6M)将反应液调pH至7.0，室温下搅拌反应12小时。反应结束后，反应溶液做除盐处理。中间体分子量Mw＝13005Da。
(5)硼氢化钠还原
向步骤(4)反应除盐后的溶液中加入硼氢化钠(2.0g)，室温下搅拌反应16小时。反应结束后，用HCl溶液(6M)调pH至4，继续搅拌1小时，最后用NaOH溶液(0.1M)调pH至中性。采用多次醇沉法除盐，在480g溶液中加入25％NaCl溶液(20g)，然后加入乙醇(1004g)进行沉淀；所得沉淀再用水(96g)重新溶解，加入25％NaCl溶液(4g)，然后加入乙醇(210g)进行沉淀，沉淀冻干得到MTC2；分子量Mw＝13843Da。通过核磁测定gsU-NHR(R＝-(CH2)4CH3,55％)、G/I+GalA(7％)、C2/C3 epox(6％)和I2S(32％)占总糖醛酸单糖残基的百分比。
实施例3
在本实施例中，制备糖胺聚糖衍生物MTC3，制备方法包括以下步骤：
(1)C2、C3环氧化
将肝素钠成品(10g，分子量Mw＝16533Da)溶于水(60mL)中，搅拌使其完全溶解，然后加入NaOH溶液(2mol/L，60mL)，加热至40℃，反应30分钟。反应结束后，冷却至室温，用HCl溶液(6M)调pH至7.0。
(2)环氧结构开环
向步骤(1)得到的产物溶液中加水(360mL)稀释，然后加热至70℃，反应24小时；中间体分子量Mw＝15560Da。
(3)高碘酸钠氧化开环
将步骤(2)反应得到的产物溶液冷却至4℃，加入NaIO4水溶液(0.2mol/L，198.36g)，然后于4℃下避光搅拌反应16小时；加入乙二醇(20.0mL)，继续搅拌1小时终止反应，反应溶液最后经中空纤维柱除盐。中间体分子量Mw＝14098Da。
(4)醛胺缩合
向步骤(3)反应除盐后的溶液中加入正戊胺(12mL，9.0g，100mmol)，用HCl溶液(6M)将反应液调pH至7.0，室温下搅拌反应7小时。反应结束后，反应溶液做除盐处理。中间体分子量Mw＝14923Da。
(5)硼氢化钠还原
向步骤(4)反应除盐后的溶液中加入硼氢化钠(1.9g)，室温下搅拌反应16小时。反应结束后，用HCl溶液(6M)调pH至4，继续搅拌30min，最后用NaOH溶液(0.1M)调pH至中性。采用多次醇沉法除盐，在480g溶液中加入25％NaCl溶液(19.8g)，然后加入乙醇(1024g)进行沉淀；所得沉淀再用水(92g)重新溶解，加入25％NaCl溶液(3.8g)，然后加入乙醇(218g)进行沉淀，沉淀冻干得到MTC3；分子量Mw＝15026Da。通过核磁测定gsU-NHR(R＝-(CH2)4CH3,39％)、G/I+GalA(8％)、C2/C3 epox(5％)和I2S(48％)占总糖醛酸单糖残基的百分比。
实施例4
在本实施例中，制备糖胺聚糖衍生物MTC4，制备方法包括以下步骤：
(1)C2、C3环氧化
将肝素钠成品(10.0g，分子量Mw＝16582Da)溶于水(60mL)中，搅拌使其完全溶解，然后加入NaOH溶液(2mol/L，60mL)，加热至60℃，反应20分钟。反应结束后，冷却至室温，用HCl溶液(6M)调pH至7.0。
(2)环氧结构开环
向步骤(1)得到的产物溶液中加水(360mL)稀释，然后加热至70℃，反应24小时；中间体分子量Mw＝14671Da。
(3)高碘酸钠氧化开环
将步骤(2)反应得到的产物溶液冷却至4℃，加入NaIO4水溶液(0.2mol/L，200.87g)，然后于4℃下避光搅拌反应16小时；加入乙二醇(20.0mL)，继续搅拌1h终止反应，反应溶液最后经中空纤维柱除盐。中间体分子量Mw＝13315Da。
(4)醛胺缩合
向步骤(3)反应除盐后的溶液一半加入苯乙胺(5mL，4.82g，40mmol)，用HCl溶液(6M)将反应液调pH至7.0，室温下搅拌反应19小时。反应结束后，反应溶液做除盐处理。中间体分子量Mw＝13678Da。
(5)硼氢化钠还原
向步骤(4)反应除盐后的溶液中加入硼氢化钠(1.1g)，室温下搅拌反应6小时。反应结束后，用HCl溶液(6M)调pH至4，继续搅拌1小时，最后用NaOH溶液(0.1M)调pH至中性。采用多次醇沉法除盐，在240g溶液中加入25％NaCl溶液(10g)，然后加入乙醇(500g)进行沉淀；所得沉淀再用水(48g)重新溶解，加入25％NaCl溶液(2g)，然后加入乙醇(100g)进行沉淀，沉淀冻干得到MTC4；分子量Mw＝13256Da。通过核磁测定gsU-NHR(R＝-CH2Ph,37％)、G/I+GalA(7％)、C2/C3 epox(5％)和I2S(51％)占总糖醛酸单糖残基的百分比。
实施例5
在本实施例中，制备糖胺聚糖衍生物MTC5，制备方法包括以下步骤：
(1)C2、C3环氧化
将肝素钠成品(10.0g，分子量Mw＝17452Da)溶于水(60mL)中，搅拌使其完全溶解，然后加入NaOH溶液(2mol/L，60mL)，加热至60℃，反应45分钟。反应结束后，冷却至室温，用HCl溶液(6M)调pH至7.0。
(2)环氧结构开环
向步骤(1)得到的产物溶液中加水(360mL)稀释，然后加热至70℃，反应24小时；中间体分子量Mw＝14552Da。
(3)高碘酸钠氧化开环
将步骤(2)反应得到的产物溶液冷却至4℃，加入NaIO4水溶液(0.2mol/L，200.06g)，然后于4℃下避光搅拌反应18小时；加入乙二醇(20.0mL)，继续搅拌1小时终止反应，反应溶液最后经中空纤维柱除盐。中间体分子量Mw＝12305Da。
(4)醛胺缩合
向步骤(3)反应除盐后的溶液一半加入苯乙胺(6mL，5.78g，48mmol)，用HCl溶液(6M)将反应液调pH至7.0，室温下搅拌反应20小时。反应结束后，反应溶液做除盐处理。中间体分子量Mw＝12598Da。
(5)硼氢化钠还原
向步骤(4)反应除盐后的溶液中加入硼氢化钠(1.1g)，室温下搅拌反应6小时。反应结束后，用HCl溶液(6M)调pH至4，继续搅拌1小时，最后用NaOH溶液(0.1M)调pH至中性。采用多次醇沉法除盐，在240g溶液中加入25％NaCl溶液(10g)，然后加入乙醇(500g)进行沉淀；所得沉淀再用水(48g)重新溶解，加入25％NaCl溶液(2g)，然后加入乙醇(100g)进行沉淀，沉淀冻干得到MTC5；分子量Mw＝12078Da。通过核磁测定gsU-NHR(R＝-CH2Ph,53％)、G/I+GalA(8％)、C2/C3 epox(6％)和I2S(33％)占总糖醛酸单糖残基的百分比。
实施例6
在本实施例中，制备糖胺聚糖衍生物MTC6，制备方法包括以下步骤：
(1)C2、C3环氧化
将肝素钠成品(10.0g，分子量Mw＝17358Da)溶于水(60mL)中，搅拌使其完全溶解，然后加入NaOH溶液(2mol/L，60mL)，加热至60℃，反应60分钟。反应结束后，冷却至室温，用HCl溶液(6M)调pH至7.0。
(2)环氧结构开环
向步骤(1)得到的产物溶液中加水(360mL)稀释，然后加热至70℃，反应24小时；中间体分子量Mw＝13799Da。
(3)高碘酸钠氧化开环
将步骤(2)反应得到的产物溶液冷却至4℃，加入NaIO4水溶液(0.2mol/L，199.85g)，然后于4℃下避光搅拌反应20小时；加入乙二醇(20.0mL)，继续搅拌1小时终止反应，反应溶液最后经中空纤维柱除盐。中间体分子量Mw＝10989Da。
(4)醛胺缩合
向步骤(3)反应除盐后的溶液一半加入苯乙胺(6mL，5.78g，48mmol)，用HCl溶液(6M)将反应液调pH至7.0，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，反应溶液做除盐处理。中间体分子量Mw＝11537Da。
(5)硼氢化钠还原
向步骤(4)反应除盐后的溶液中加入硼氢化钠(1.1g)，室温下搅拌反应6小时。反应结束后，用HCl溶液(6M)调pH至4，继续搅拌1小时，最后用NaOH溶液(0.1M)调pH至中性。采用多次醇沉法除盐，在240g溶液中加入25％NaCl溶液(10g)，然后加入乙醇(500g)进行沉淀；所得沉淀再用水(48g)重新溶解，加入25％NaCl溶液(2g)，然后加入乙醇(100g)进行沉淀，沉淀冻干得到MTC6；分子量Mw＝11096Da。通过核磁测定gsU-NHR(R＝-CH2Ph,57％)、G/I+GalA(7％)、C2/C3 epox(8％)和I2S(28％)占总糖醛酸单糖残基的百分比。
实施例7
在本实施例中，制备糖胺聚糖衍生物MTC7，制备方法包括以下步骤：
(1)C2、C3环氧化
将肝素钠成品(5.0g，分子量Mw＝16680Da)溶于水(30mL)中，搅拌使其完全溶解，溶液升温至60℃左右，加入NaOH溶液(2mol/L，30mL)，继续升温至60℃后，反应30分钟。反应结束后，冷却至室温，用HCl溶液(6M)调pH至7.0。
(2)环氧结构开环
向步骤(1)反应得到的产物溶液中加水(180mL)，所得溶液加热至70℃，搅拌反应24小时。中间体分子量Mw＝15592Da。
(3)高碘酸钠氧化开环
将步骤(2)反应得到的溶液降温至5℃，加入NaIO4溶液(0.2mol/L，100g)，然后于4℃下避光搅拌反应16h；加入乙二醇(10.0mL)，继续搅拌1h，终止反应，透析除盐。中间体分子量Mw＝12405Da。
(4)醛胺缩合
向步骤(3)反应除盐后的溶液中分批加入甘氨酸(3.5g,47mmol)，室温下搅拌5h。反应结束后做除盐处理。中间体分子量Mw＝12162Da。
(5)硼氢化钠还原
向步骤(4)反应初验后的溶液中分批加入硼氢化钠(1.2g)，室温下搅拌3h。反应结束后，用HCl溶液(6M)调pH至4，继续搅拌10分钟，最后用NaOH溶液(0.1M)调pH至中性。然后中空纤维柱除盐，浓缩冻干得到MTC7；分子量Mw＝12289Da。通过核磁测定gsU-NHR(R＝-CH2COOH,35％)、G/I+GalA(9％)、C2/C3 epox(8％)和I2S(48％)占总糖醛酸单糖残基的百分比。
实施例8
在本实施例中，对于制备得到的糖胺聚糖衍生物进行乙酰肝素酶抑制活性测试。
参照“Development of a colorimetric assay for heparanase activitysuitable for kinetic analysis and inhibitor screening”(Anal Biochem.396(1),2010.,112-116)中公开的体外测定乙酰肝素酶抑制活性的方法，对本申请MTC系列化合物的乙酰肝素酶抑制活性进行测试，方法如下：
测定溶液(100μL)包含40mM乙酸钠缓冲液pH 5.0和100mM磺达肝素(GlaxoSmithKline)，其含有或不含有测试样品。加入乙酰肝素酶至140pM的终浓度以开始所述测定。将板用黏带密封，并在37℃下孵育2-24小时。通过加入100μL的1.69mM4-[3-(4-碘苯基)-1H-5四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-1，Aspep，Melbourne，澳大利亚)在0.1M NaOH溶液中停止测定。将板用黏带再密封，并在60℃下显影60分钟。在584nm下测量吸光度(Fluostar,BMG,Labtech)。在各板中，在相同的缓冲液和体积下，在2-100μM的范围下制备用D-半乳糖作为还原糖标准物构建的标准曲线，测定IC50值。
测试结果数据如表2所示，根据表2的结果可以看出，本申请MTC系列化合物其IC50值在7-53ng/mL，甚至是能够达到7-22ng/mL，具有良好的乙酰肝素酶抑制活性。
表2
实施例9
在本实施例中，对制备得到的糖胺聚糖衍生物进行抗凝效价测试，使用APTT测定法。
APTT(Activated partial thromboplastin time，活化部分凝血活酶时间)测定原理为血浆样本与适量的磷脂以及能激活内源性凝血途径的带负电荷的触酶剂进行共同孵育，在37℃孵育一定时间后，加入钙离子，启动凝血过程，并记录血浆凝固所需时间，即为活化部分凝血活酶时间。本申请使用Stago公司的STA-R全自动血凝分析仪，通过APTT法检测肝素衍生物的抗凝活性。
具体方法为：取50μL肝素钠或供试品的盐水溶液和50μL血浆于37±1℃温度下水浴反应30秒。加入50μL APTT试剂(37±1℃水浴锅预热)，混匀并立即启动血凝仪上的秒表。秒表读数为3分钟后，通过自动加样器立即加入50μL的氯化钙(0.025M)(37±1℃水浴锅预热)。STA-R全自动血凝分析仪自动记录凝血时间。测得的凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反应平行线测定法计算效价。
实验结果如表3所示，由表3数据可以看出，本申请MTC系列化合物的抗凝效价在22-47IU/mg，表明本申请MTC系列化合物抗凝作用显著低于肝素钠。
表3
实施例10
在本实施例中，对制备得到的糖胺聚糖衍生物进行B16小鼠黑色素瘤肺转移模型上的药效研究，方法如下：
B16细胞(购买于中科院上海生命科学研究院细胞库)用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基、在含5％CO2的37℃培养箱中培养、传代，当细胞增殖处于对数增长期时，即可进行接种准备。
取C57小黑鼠，雌性，根据体重随机分组：模型对照组和实验组，尾静脉注射相应剂量(2.5mg/kg)的样品，模型对照组药物以生理盐水代替。
给药30分钟后进行尾静脉接种黑色素瘤细胞。每日观察小鼠活动状态、体重变化情况、是否有异常表现。
接种后第14天结束实验，处死所有实验小鼠，取鲜肺称重，用Bouin固定液固定小鼠肺组织，观察小鼠肺部肿瘤转移灶分布情况，计算小鼠肺部肿瘤转移抑制率。
肿瘤转移抑制率＝(模型对照组肿瘤转移灶数量-给药组转移灶数量)/模型对照组肿瘤转移灶数量×100％
实验结果：
MTC1、MTC2、MTC5、MTC6在2.5mg/kg的给药剂量下对黑色素瘤肺转移的抑制率分别为54％、56％、72％和63％，显示出良好的肿瘤转移抑制活性。
申请人声明，本申请通过上述实施例来说明本申请的糖胺聚糖衍生物及其应用，但本申请并不局限于上述实施例，即不意味着本申请必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本申请产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。

Claims (31)

1.一种糖胺聚糖衍生物，其具有如式I所示结构：
其中，W环包含下列式A、式B、式C、式D和式E所示的结构：
其中，R1为SO3 -或H；R2为SO3 -或H；R3为SO3 -、乙酰基或H；
所述R为C1-6烷基、C6-10芳基或C6-10芳基-C1-6烷基；其中，所述C1-6烷基、C6-10芳基、和C6-10芳基-C1-6烷基任选地被1、2或3个选自氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羟基、氨基、氰基、硝基、甲基、乙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基和三氟甲氧基的基团所取代；
所述式E所示的结构占W环所示结构的比例为37％～90％。
2.根据权利要求1所述的糖胺聚糖衍生物，其中，所述R为甲基、三氟甲基、羟甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、苯基、苄基、苯乙基、苯丙基、对甲基苄基、对羟基苄基或对甲基苯乙基。
3.根据权利要求1或2所述的糖胺聚糖衍生物，其中，所述糖胺聚糖为未分级肝素、低分子肝素或硫酸乙酰肝素。
4.根据权利要求1所述的糖胺聚糖衍生物，其中，所述糖胺聚糖衍生物的分子量为4000-20000。
5.根据权利要求1所述的糖胺聚糖衍生物，其中，所述糖胺聚糖衍生物的分子量为8000-18000。
6.根据权利要求1所述的糖胺聚糖衍生物，其中，所述糖胺聚糖衍生物的分子量为10000-16000。
7.根据权利要求1所述的糖胺聚糖衍生物，其中，所述式E所示的结构占W环所示结构的比例为37％～70％。
8.根据权利要求1所述的糖胺聚糖衍生物，其中，所述式E所示的结构占W环所示结构的比例为40％～60％。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的糖胺聚糖衍生物的制备方法，其通过以下方法制备得到：
(1)糖胺聚糖的2-O-脱硫酸化：在碱性条件下，糖胺聚糖化合物2-位磺酸化艾杜糖醛酸C2-C3位经过环氧化反应形成环氧基团，然后环氧基团开环生成C2-C3位邻二醇结构；
(2)将糖醛酸C2-C3位邻二醇结构氧化开环并生成二醛；和
(3)将步骤(2)的反应产物与胺类化合物NH2-R发生醛胺缩合反应，然后经还原反应得到所述糖胺聚糖衍生物；
其中，所述R为C1-6烷基、C6-10芳基或C6-10芳基-C1-6烷基-；其中，所述C1-6烷基、C6-10芳基和C6-10芳基-C1-6烷基任选地被1、2或3个选自氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、羟基、氨基、氰基、硝基、甲基、乙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基和三氟甲氧基的基团所取代。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述R为甲基、三氟甲基、羟甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、苯基、苄基、苯乙基、苯丙基、对甲基苄基、对羟基苄基或对甲基苯乙基。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(1)所述碱性条件为0.5M～2.0M的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(1)中所述环氧化反应的反应温度为20℃至100℃，反应时间为20分钟至120分钟。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述环氧化反应的反应温度为40℃至80℃，反应时间为20分钟至60分钟。
14.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述环氧化反应的反应温度为40℃、50℃或60℃，反应时间为20分钟、30分钟、45分钟或60分钟。
15.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(1)中所述环氧基团开环反应的pH值为5.0至9.0，反应温度为30℃至100℃。
16.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(1)中所述环氧基团开环反应的pH值为6.0至8.0，反应温度为40℃至80℃。
17.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(1)中所述环氧基团开环反应的pH值为6.5至7.5，反应温度为40℃、50℃、60℃或70℃。
18.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(2)中氧化反应使用的氧化剂为高碘酸钠。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，高碘酸钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的10～30倍。
20.根据权利要求18所述的制备方法，其中，高碘酸钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的15倍、18倍、20倍、22倍或25倍。
21.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(3)中胺类化合物NH2-R的用量与步骤(1)中糖胺聚糖化合物的用量按摩尔量/质量比计算为5～20mmol/g。
22.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(3)中胺类化合物NH2-R的用量与步骤(1)中糖胺聚糖化合物的用量按摩尔量/质量比计算为8～20mmol/g。
23.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤(3)中还原反应使用的还原剂为硼氢化钠。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其中，所述硼氢化钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的0.1～0.5倍。
25.根据权利要求23所述的制备方法，其中，所述硼氢化钠的用量按质量计算为步骤(1)中糖胺聚糖化合物用量的0.15～0.3倍。
26.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述糖胺聚糖化合物为未分级肝素、低分子肝素或硫酸乙酰肝素。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其中，所述低分子肝素为依诺肝素、达肝素钠或那曲肝素钙。
28.根据权利要求1-8中任意一项所述的糖胺聚糖衍生物在制备具有乙酰肝素酶抑制活性的药物中的应用。
29.一种药物组合物，其包含权利要求1-8中任意一项所述的糖胺聚糖衍生物。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括药用载体和/或赋形剂。
31.根据权利要求1-8中任意一项所述的糖胺聚糖衍生物或权利要求29或30所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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