CN1997657A - 治疗性肝素及其与白细胞介素4和5以及pecam－1的结合 - Google Patents

Abstract

本发明总地涉及用于预防和/或治疗疾病状况的化学试剂，特别是慢性疾病状况例如炎症包括过敏性疾病、转移癌和由病原体包括细菌、病毒或寄生虫导致的感染。更明确地，本发明提供的化学试剂选自衍生自更大的糖胺聚糖(GAG)的糖胺聚糖分子、GAG样分子和具有GAG样复合结构的分子以及和GAG、GAG样分子或GAG样复合分子一样结合相同位点的试剂，所述GAG样分子在其一些特征上类似GAG，但其可衍生自更大的非GAG多糖。本发明也提供了鉴定GAG和GAG样治疗剂(包括GAG样复合结构)以及其类似物、同源物和直向同源物的测定法。

Description

治疗性肝素及其与白细胞介素4和5以及PECAM-1的结合

发明背景

发明领域

本发明总地涉及用于预防和/或治疗疾病状况的化学试剂，特别是慢性疾病状况例如炎症包括过敏性疾病、转移癌和由病原体包括细菌、病毒或寄生虫引起的感染。更明确地，本发明提供的化学试剂选自衍生自更大的糖胺聚糖(GAG)的糖胺聚糖分子、GAG样分子和具有GAG样复合结构的分子以及和GAG、GAG样分子或GAG样复合分子一样结合相同位点的试剂，所述GAG样分子在其一些特征上类似GAG，但其可衍生自更大的非GAG多糖。本发明也提供了鉴定GAG和GAG样治疗剂(包括GAG样复合结构)以及其类似物、同源物和直向同源物的测定法。

现有技术的描述

在本说明书的结尾部分汇集本说明书中由著者参考的出版物的详细书目。

本说明书中对任何现有技术的参考不被和不应当被当作承认或任何形式的暗示，即该现有技术在任何国家构成了公知常识的一部分。

宿主中许多疾病状况的发生涉及细胞或病毒实体或由其产生的分子和特定的宿主中的细胞之间的相互作用。一种透彻研究的相互作用是HIV、gp120和淋巴细胞CD4受体之间的相互作用[Eckert和Kim，Annu.Rev.Biochem.70：777-810，2001]。尽管在拮抗或促进这些相互作用上获得一些成功，然而，鉴定表现足够广谱的活性的拮抗剂一直非常困难。

在导致本发明的工作中，本发明者研究了肝素样糖胺聚糖(HLGAG)例如肝素和硫酸乙酰肝素以及由其衍生的寡糖。糖胺聚糖(GAG)普遍存在于人体内并在其中许多炎症过程中起着关键作用。这些大分子量多糖促进这些过程如癌症转移、关节炎、移植排斥、过敏性鼻炎和哮喘，从而对这些过程的更多的理解导致产生改进的用于治疗这些疾病状况的药物。目前，其中一种了解最多的GAG是肝素家族的硫酸化多糖，这些分子的抗凝活性已了解得十分清楚。

然而，HLGAG是不均一的分子组群[Conrad，Heparin bindingproteins.Academic Press，San Diego，1998；Lander和Selleck，J.Cell Biol.148(2)：227-232，2000]。肝素和硫酸乙酰肝素，如所有HLGAG一样，是长线性多糖[Sasisekharan和Venkataraman，Curr.Opin.Chem.Biol.4(6)：626-631，2000；Casu，Ann.N.Y.Acad.Sci.556：1-17，1989；Casu，Ady.Carbohydr.Chem.Biochem.43：51-134，1985]。其以重复二糖单位(所述二糖单位包含葡糖醛酸(G1cA)和葡糖胺(G1cN))的非硫酸化链的形式合成，在高尔基体中，所述链沿着其长度方向在许多位点被修饰。肝素被修饰的程度高于硫酸乙酰肝素，大部分G1cN单位被硫酸基团修饰成N-硫酸化G1cN，大部分G1cA单位通过差向异构酶的作用被转化成艾杜糖醛酸(IdoA)。由于对硫酸链的修饰通常是不完全的，因此HLGAG是不均一的。结果是广泛区域的中间修饰。

因此，例如，硫酸乙酰肝素链由高度硫酸化、富含2-O-硫酸化艾杜糖醛酸的结构柔软的结构域和主要由N-乙酰G1cN和G1cA构成的具有刚性结构的低硫酸化区域交替排布构成。

HLGAG的硫酸化模式非常复杂，特别是在6-O-硫酸的定位上。因此，并非所有的HLGAG分子都是完全相同的。类似地，来自特定细胞或组织的HLGAG制剂中并非所有分子都是完全相同的；更确切地说，这些制剂代表分子家族。

是硫酸化模式在很大程度上决定了特定HLGAG的蛋白结合特性。一些蛋白只和HLGAG链内的特定的结构基序结合，反过来一些GAG只结合蛋白上的特定位点或区域。例如，抗凝血酶III结合展现特定硫酸基团排布的独特的五糖序列，而肝素五糖结合抗凝血酶III蛋白上的特异性位点[Whisstock等人，J.Mol.Biol.301：1287-1305，2000]。碱性成纤维细胞衍生的生长因子(FGF-2)和肝细胞生长因子(HGF)都结合肝素，但对于各生长因子，结合所必需的肝素结构大不相同，并且和抗凝血酶III所需要的结构不同[Maccaranaet等人，J.Biol.Chem.268(32)：23898-23905，1993；Lyon等人，J：Biol.Chem.269：11216-11223，1994]。此外，已显示肝素结合FGF-2上的特定区域[Faham等人，Science 271：1116-1120，1996]。在抗凝级联反应中硫酸化的GAG和蛋白的结合非常复杂，肝素和血小板因子IV(PF-IV)的相互作用在一些治疗应用中已产生问题。精巧的工作已显示，尽管肝素-PF-IV是非常高的亲和相互作用，但是特异性也非常高，因此，通过加入对肝素结合无害但对PF-IV结合有害的官能团，可获得一些选择性(Petitou等人，Nature 398：417，1999.)。通过将高度硫酸化区域的数目最小化至末端上的4-5个糖单位和使不带电的寡糖间隔物分隔带电荷的部分而实现了该目的。

FGF-2识别在确定的位置中包含单个IdoA 2-O-硫酸的基序，而对于HGF，G1cN 6-O-硫酸基的定位非常重要。制剂中的一些肝素分子将携带抗凝血酶III结合五糖和FGF-2结合基序，而其他肝素具有HGF结合基序和FGF-2基序，但没有抗凝血酶III结合五糖。事实上，在肝素的制剂中平均只有三分之一的分子具有抗凝血酶III结合五糖[Conrad，1998，同上]。

因此，HLGAG制剂中的分子在蛋白结合位点的顺序上、数量上和类型上都不同。挑战是在结构上鉴定结合目的蛋白的HLGAG基序和蛋白上的HLGAG结合位点。该HLGAG基序的分离和纯化应当提供在其结合行为上有效和更特异的试剂。一旦了解该基序的糖结构后，就可能制造可以包含或可以不包含GAG作为其结构组成部分和可临床使用的结构类似物或直向同源物(即，功能等同的结构)。

存在于从天然来源(猪的肥大细胞)分离的肝素中的不均一性产生许多副作用。对不具有抗凝活性或具有减少的抗凝活性的GAG或结构类似物的寻找可为获得对上述炎性疾病状况更有效的治疗法铺平道路。

GAG多糖的来源包括来自天然来源以及合成的或半合成的来源。

许多“天然”类型的糖苷键占主导，作为负责这些寡糖的生物合成的各种酶系统的功能。从天然来源获取大量的这些复杂寡糖，需要重复通过层析进行纯化，由于许多这些寡糖的相似性的原因，难以获得均一的样品。

来自大肠肝菌K5(E.coli K5)的荚膜多糖由交替的α-N-乙酰葡糖胺(α-G1cNAc)和β-葡糖醛酸(β-G1cA)单位构成并且不包含硫酸或其他带电荷的基团(参见图17)。肝素主链由下列具有不同硫酸化程度的基序α-G1cNAc、β-G1cA、α-G1cNAc，β-艾杜糖醛酸(β-IdoA)构成。G1cA和IdoA之间的唯一不同在于C-5上的羧酸基团的构型不同，因此肝素主链和大肠杆菌K5主链在结构上极其相似(图17)。事实上K5多糖表现出非常低的免疫原性。大肠杆菌K5能够从生长培养基中产生大约50mg/L(多糖)，从而理想地适合用于想要的肝素样主链的多克量产生。

用于生产K5多糖的大肠杆菌的合适菌株是NCDC Bi 626-42和NCDC Bi 8337-41，两者都可从美国模式培养物保藏所(ATCC)获得。许多出版物描述了K5多糖的分离。参见，例如，Leali等人，J.Biol.Chem.276：37900-37908，2001；和Finke等人，J.Bacteriol.173：4088-4094，1991。简而言之，使用富含甘油优于葡萄糖的培养基培养细菌。从晚对数生长期培养物中收集条件培养基并使用10,000Da截止值的超滤膜进行浓缩。通过丙酮沉淀回收多糖，用蛋白酶II消化任何蛋白，使用超滤和沉淀回收多糖。一些方法也建议采用阴离子交换层析步骤(美国专利号5,341,876)。

根据本发明，鉴定与靶配体例如细胞因子或生长因子相互作用的GAG和GAG样分子，包括GAG样复合分子。这些分子，包括其化学类似物、同源物或直向同源物，据认为具有有用的治疗或诊断特性。

发明概述

在整个说明书中，除非上下文另外要求，术语“包含/包括”或变化形式，理解为表示包括提到的要素或整数或要素或整数的组，而不是排除任何其他的要素或整数或要素或整数的组。

本发明部分地基于对这样的化学试剂的鉴定，所述化学试剂抑制细胞表面HLGAG和无细胞配体或细胞结合的配体之间、或细胞外HLGAG和细胞结合的配体之间的相互作用，或抑制细胞外HLGAG和无细胞配体之间的相互作用。方便地，所述化学试剂是无细胞GAG分子，包括无细胞GAG分子的家族或GAG样分子或其“功能性”类似物、同源物或直向同源物。此上下文中的“功能性”是指实体表现出亲本GAG分子的结合特性或表现出抗亲本GAG的拮抗特性。GAG样分子包括具有GAG或GAG样组分和非GAG组分的GAG样复合结构。GAG或GAG样分子或GAG样复合分子可从天然存在的HLGAG衍生或可通过化学修饰非GAG多糖的方法获得或可以是可能只是部分包含糖主链的复合结构。

这些GAG或GAG样寡糖或GAG样复合分子一般被当作半合成物并产生自大的聚合物多糖。半合成寡糖可具有不同程度的带电基团，例如硫酸和/或磷酸基团。此外，化合物可接受许多其他的修饰，包括修饰例如侧链的加入和GAG寡糖的磷酸化。也可制备复合结构的文库。在该情况下，在类似GAG的带负电荷的单位的长度上存在不同，在接头的长度和组成上存在不同以及在接头的角度和柔性上存在不同，所述接头连接类似GAG的带负电荷的区域。公开了通过确定充当参与疾病状况的蛋白和其他分子的配体的GAG寡糖、或GAG样寡糖(其可以是或可以不是分枝的)来筛选文库的方法。从而这些级分的鉴定允许开发一系列调节所述相互作用的拮抗剂或激动剂。据认为这些分子在预防和/或治疗疾病状况上是有用的，所述疾病状况例如但不限于，炎症性疾病状况、转移癌、过敏性疾病状况如过敏性鼻炎和哮喘以及包括由细菌、病毒或寄生虫病原体引起的感染的疾病。疾病状况包括由HIV、SARS病毒引起的感染和流感。

因此，本发明的一个方面涉及具有下式的GAG寡糖：

       ₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]    (I)

或GAG样寡糖、GAG样复合物(composite)或式(I)的GAG寡糖的化学类似物、同源物或直向同源物(ortholog)；

其中：

A是包含糖例如但不限于葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式的寡糖、二糖或单糖单体单位；

B可以与A相同或是包含葡糖胺残基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙酰化的形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的单体单位；

其中单体单位A和B通过糖苷键连接；

_i[A-B]是相同或不同的A-B二糖构建部件，i表示从一端开始测量的沿着链排列的二糖的位置，其中i是整数，1≤i≤n；

_n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖构建部件，n表示位于₁[A-B]的相反末端的构建部件；和

n是从大约2至大约10，其表示重复A-B单位的链的长度；

条件是₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]不是全长HLGAG分子；

其中所述GAG寡肽、GAG样寡糖、GAG样复合物或类似物、同源物或直向同源物结合配体。

本发明的另一个方面提供了具有下式的GAG样复合分子：

            (₁P-_mX)_q-_q+1P    (II)和

            (₁X-_mP)_q-_q+1X    (III)

或式(II)或(III)的分子的化学类似物、同源物或直向同源物；

其中X是由以下通式定义的分子：

          ₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]    (I)

或GAG样寡糖、式(I)的GAG寡糖的GAG样化学类似物、同源物或直向同源物；

其中：

A是包含糖例如但不限于葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式的寡糖或单糖单体单位；

B可以与A相同或是包含葡糖胺残基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙酰化的形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的单体单位；

其中单体单位A和B通过糖苷键连接；

_i[A-B]是相同或不同的A-B二糖构建部件，i表示从一端开始测量，沿着链排列的二糖的位置，其中i是整数，1≤i≤n；

_n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖构建部件，n表示位于₁[A-B]的相反末端的构建部件；和

n是从大约2至大约10，其表示重复A-B单位的链的长度；

或GAG样寡糖、GAG样复合物或其化学类似物、同源物或直向同源物；

条件是₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]不是全长HLGAG分子；

P是肽、多肽或蛋白、化学部分、饱和或不饱和脂肪酸、脂、树状分子(dendrimer)、糖、多元醇、葡聚糖、聚乙二醇或者分枝或不分枝的、饱和的或不饱和的烃链或柔性接头；

1和m是整数，如1，m＝1...q；

q是整数，1≤q≤9；

其中所述GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合物或类似物、同源物或直向同源物结合配体。

本发明还提供了GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子，后几种物质结合的配体上的靶位点与GAG寡糖结合的靶位点相同。

优选的配体是肽、多肽或蛋白，例如细胞因子或生长因子。此处包括的配体包括选自以下的配体：βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体。特别优选的配体是IL-5、IL-4和PECAM-1、gp120、IL-5受体的βc链和亲环蛋白A。

GAG寡糖可附加单个糖，从而产生长度为[A-B]_n-A或B-[A-B]_n的寡糖。

B也可以具有附着至羟基例如但不限于第6位羟基或末端糖中的羟基的单糖、二糖或三糖，从而产生分枝结构；这些附着的糖单位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。当A是葡糖胺时，那么A也可具有附着至羟基例如但不限于第6位羟基或末端糖中的羟基的单糖、二糖或三糖，从而产生分枝结构；这些附着的糖单位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

_i[A-B]可以具有这样的末端糖，该糖是4-脱氧-L-苏型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)或通过用亚硝酸处理产生的葡糖胺的衍生物，例如2，5-脱水-D-甘露醇或2，5-脱水-D-甘露糖或其衍生物。

本发明的另一个方面提供了组合物，该组合包含GAG寡糖、GAG样寡糖和/或GAG样复合分子中的一种或多种，和一种或多种药物可接受的载体或稀释剂。

本发明还扩展至配体上的位点和特别是GAG、GAG样分子或GAG样复合物或其部分与其相互作用的线性或构象结构。

本发明还提供了GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子，包括结合肽、多肽或蛋白上的靶位点与GAG寡糖所结合的靶位点相同的其化学类似物、同源物或直向同源物。

特别优选的靶是IL-4、IL-5、亲环蛋白A和PECAM-1。

靶配体IL-5和GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子与IL-5上的一个或多个残基限定的三维位点相互作用，所述残基选自：R32、R67、K70、K76、K77、K83、K84、K85、E88、E89、R90、R91和/或R92。

在其他优选的实施方案中，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子包含糖结构ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₅或是其类似物、同源物或直向同源物，或和ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₅一样结合相同的位点。

靶配体PECAM-1和GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子结合由在PECAM-1上的结构域2、3、5或6中任何一个或多个结构域形成的三维结构。在其他优选的实施方案中，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子和PECAM-1上的结构域2和/或3或由其形成的三维结构相互作用。

靶配体IL-4和GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子与IL-4上的一个或多个残基限定或形成的三维结构相互作用，所述残基选自：E9、K12、R53、E60、K61、H74、R75、K77、Q78、R81、R84、R85、D87和/或R88。在其他优选的实施方案中，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子包含选自以下的糖结构：

ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₄、ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₃-UAG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS、ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、或其类似物、同源物或直向同源物或和上述GAG分子一样结合相同的位点。

本发明的另一个方面提供了产生GAG寡糖或GAG样寡糖(其可以是或可以不是分枝的)或GAG复合结构的文库的方法和鉴定结合特定蛋白的GAG寡糖和/或其部分或局部(portion)、或GAG样寡糖(其可以是或可以不是分枝的)、或GAG复合结构的方法。据本发明的方法产生的GAG或其他结构可应用于治疗任何涉及GAG样分子和配体例如蛋白之间的相互作用的疾病。GAG或其他结构特别适合用于治疗炎性或过敏性疾病状况和转移癌以及由病原体例如细菌、病毒或寄生虫引起的感染。

本发明的GAG、GAG样和GAG样复合分子可通过截短和去乙酰化、硫酸化、去硫酸化、磷酸化和侧链的附着中的至少之一而从多聚体衍生。

除其他以外，优选的起始多聚体特别包括大肠杆菌K5多糖、壳多糖或壳聚糖。

在本发明的另一个实施方案中，通过这样的方法产生GAG寡糖，该方法包括按大小分级分离起始多聚体例如肝素、硫酸乙酰肝素分子、K5多糖、壳多糖或壳聚糖的群体以产生与配体相互作用的非全长级分。肝素在其中一些二糖单位中包含葡糖醛酸和艾杜糖醛酸的混合物，其硫酸化的程度也是变化的。可通过任何常规的方法例如通过凝胶过滤柱进行分级分离，并且其基于不同长度糖链，一般但非排他地从DP4至大约DP20(包括DP5，DP6，DP7，DP8，DP9，DP10，DP11，DP12，DP13，DP14，DP15，DP16，DP17，DP18，DP19或DP20)。分离的另一种形式基于硫酸化的程度。分离也可以基于这两种参数的组合。

本发明的另一个方面是提供了6-O-磷酸化GAG寡糖。当产生GAG寡糖的文库时，通过包括磷酸化步骤产生这些分子。预计可对从多聚体例如大肠杆菌K5多聚体、壳多糖或壳聚糖产生的半合成寡糖和通过HLGAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的分级分离或其他多聚体例如K5、壳多糖或壳聚体的分级分离产生的寡糖进行该磷酸化步骤和可能是必需的任何相关的去硫酸化步骤。

本发明的另一个方面提供了生产用于在受治疗者中治疗疾病状况的药物的方法，所述方法包括根据本发明的方法产生一系列GAG寡糖或GAG样寡糖或复合结构，和就与配体相互作用或调节配体的能力筛选各GAG或GAG样寡糖或复合结构。鉴定与配体相互作用或调节配体的GAG寡糖，将该寡糖或其类似物、激动剂或拮抗剂用于生产药物。

本发明的另一个方面涉及在受治疗者中治疗疾病状况的方法，所述疾病由所述宿主中细胞表面上的HLGAG和配体之间、或所述宿主中细胞外基质中的HLGAG和配体(该配体可以和或可以不和细胞结合)之间的相互作用、或所述宿主中的蛋白-配体相互作用造成的，所述蛋白-配体相互作用可被HLGAG破坏，其中所述蛋白可以是和细胞结合而配体是可溶性的或者蛋白和配体都可以是和细胞结合的，所述方法包括给所述受治疗者施用有效量的药物，所述药物是根据本发明生产和鉴定的与所述配体相互作用的GAG寡糖、或GAG样寡糖、或复合结构，将所述级分掺入药物，或获得其化学类似物或同源物并将其掺入所述药物中。

附图概述

图1是显示肝素的部分肝素酶I消化的大小排阻层析的图解说明。峰尖的数字是指DP。

图2A-2D是显示BIAcore HLGAG-结合检测法的图解说明。将以指定浓度的蛋白注射在固定化到链霉抗生物素蛋白传感芯片上的肝素上。在结合和解离阶段期间监测结合数据。小图A，rhIL-4。小图B，rhIL-5。小图C，flag-PECAM-1。小图D，CypA。

图3是显示rhIL-4 HLGAG滤膜结合试验的图解说明。将10nmol(◆)或20nmole(■)rhIL-4和各种量的荧光标记的肝素温育。通过离心除去未结合的肝素，用2M NaCl重新溶解结合的肝素。用Wallac Victor1420 96孔板读板计确定结合的肝素的量，使用在相同缓冲液中稀释的荧光肝素的标准溶液进行定量。数据是两次独立实验的平均值。

图4A和4B是显示IL-4/IL-5肝素相互作用的竞争抑制的图解说明。将IL-4或IL-5和摩尔数远远过量的指定大小的HLGAG片段一起温育。将这些混合物注射至载有固定的HLGAG的BIAcore传感芯片上，记录结合水平，并与在无抑制剂的蛋白情况下观察到的结合比较。小图A-IL-4。小图B-IL-5。针对可减少结合超过50％的片段集库(pool)以作进一步分析。

图5A-5C是显示蛋白和固定的HLGAG片段的直接结合的图解说明。通过其还原末端将所述片段生物素化并将其固定在链霉抗生物素蛋白传感芯片上。将目的蛋白的标准溶液注射到表面上，确定结合的量。小图A，rhIL-4。小图B，flag-PECAM-1。小图C，CypA。结合数据是三个单独的结合实验的平均值±标准误差。

图6是显示DP10大小集库(浅色曲线)和经IL-4亲和纯化的DP10的亚级分(深色曲线)的阴离子交换层析的图解说明。标记A-C表示通过MALDI MS分析的级分。

图7是显示DP12大小的集库(浅色曲线)和经IL-5亲和纯化的DP12的亚级分(深色曲线)的阴离子交换层析的图解说明。

图8是显示DP10级分A(来自图6中的层析图)的MALDI质谱分析的图解说明。寡糖的质量由肽和肽-寡糖复合物的质量推出。

图9是显示使用Baf-IL-5细胞的生物学测定法的图解说明。小图A：在5μg/mL和50μg/mL肝素、或5μg/mL硫酸软骨素C存在的情况下或不加入GAG的情况下以显示的浓度加入rhIL-5。48小时后，测量萤光素酶的活性并表示为每秒的计数(CPS)。显示的数据为两次重复的平均值。小图B显示在6ng/ml rhIL-5存在的情况下各种肝素浓度对Baf-IL-5细胞增殖的影响。数据表示为和无肝素的对照相比，在各种浓度的肝素存在的情况下增殖的抑制百分比。

图10是显示肝素(0.4μM)、肝素片段的DP12集库(1μM)和选择的DP12集库的亚级分(各为1μM)对Ba/F-IL-5细胞的IL-5(0.07ng/ml)依赖性增殖的影响的图解说明。这些亚级分表现出很强的对IL-5的结合(DP12.10)，或其具有低结合活性(DP12.1)。数据表示为相对于在肝素或肝素片段不存在的情况下观察到的增殖的百分比抑制作用。最少三个重复的平均值和标准偏差。

图11是显示5μg/mL的肝素和5μg/mL和10μg/mL的硫酸软骨素C对TF1.8细胞的IL-4诱导增殖的影响。数据表示为以每秒计数(CPS)测量的萤光素酶的活性(A)。(B)中的数据计算为相对于用合适浓度的细胞因子但在GAG不存在的情况下获得的增殖的抑制百分比。

图12是显示flag-PECAM-1结合A2058黑色素瘤细胞的图解说明。在虚线直方图中显示由抗PECAM-1多克隆抗体和FITC缀合的抗兔二抗组成的阴性对照。在无肝素酶III处理的情况下(粗体直方图)和在肝素酶III处理后(细线)，用抗PECAM-1多克隆抗体和FITC缀合的抗兔二抗检测的flag-PECAM-1结合。小图B显示对A2058细胞的氯酸盐处理对flag-PECAM-1结合这些细胞的能力的影响。通过在用抗PECAM-1多克隆抗体和FITC缀合的二抗显象后用流式细胞仪测量flag-PECAM-1的结合。阳性对照是flag-PECAM-1结合未处理的A2058细胞，阴性对照是无flag-PECAM-1的抗PECAM-1多克隆抗体和FITC缀合的二抗。

图13是显示影响IL-5结合HLGAG的氨基酸突变的位置的图解说明。汇集影响IL-5-HLGAG结合水平的氨基酸变化，并在三维蛋白模型上作图。已显示rhIL-5上的几个氨基酸对HLGAG的结合非常重要，即赖氨酸84、赖氨酸85的突变。结合位点沿着C螺旋延伸并且包括赖氨酸77、赖氨酸76、赖氨酸70和精氮酸67。也可涉及相邻的β折叠片上的氨基酸即精氨酸90和精氨酸91。

图14是IL-4靶1的示意说明图，其由规则重复的三硫酸化二糖构成。

图15是IL-4靶2的示意说明图。

图16是IL-5靶1的示意说明图，其由规则重复的三硫酸化二糖构成。

图17是大肠杆菌K5荚膜多糖和非硫酸化肝素主链多糖的图解说明。

图18是显示在2.5μM外源肝素存在或不存在的情况下，PECAM-1的结构域D1-D6结合肝素芯片的BIAcore检测法的结果的图解说明。在这些实验中使用1μM纯化的PECAM-1。

图19是使用Flag表达系统(小图A)和融合蛋白表达系统(小图B)的各种PECAM-1构建体的图解说明。

图20是图解说明，在小图A中，显示表明PECAM-Fc结构域缺失蛋白的纯度的电泳凝胶；而在小图B中，显示PECAM-Fc融合蛋白与固定在生物传感芯片上的肝素的结合。图例说明：I：D1-Fc；II：D1-2-Fc；III D1-3-Fc；IV：D1-4-Fc；V：D1-5-Fc和VI：D1-6-Fc。

图21是显示Flag-PECAM-1结构域构建体与固定在BIAcore芯片上的肝素的结合的图解说明。要了解各标示的蛋白中包含的结构域，参考图19。

图22是显示BIAcore测定法的结果的图解说明，其调查外源肝素对Flag-PECAM-1构建体与固定在生物传感芯片上的肝素的结合的影响。注意，所有构建体与生物传感芯片的结合几乎完全被加入2.5μM肝素所抑制。在所有情况下使用1μM的蛋白。

图23是显示Flag-PECAM-1细胞外结构域和A2058黑色素瘤细胞结合的图解说明。A：Flag-PECAM-1 D1-6；B：Flag-PECAM-1 D1-3；C：Flag-PECAM D1-2。Flag-PECAM-1结构域(实线)、对照(点线)、Flag-PECAM-1结构域加50μg肝素(虚线)。用抗PECAM-1多克隆抗体和FITC标记的二抗检测PECAM-1结构域的结合，通过流式细胞仪定量。

图24是描述不同浓度的IL-4和固定在生物传感器芯片上的肝素的结合(如使用BIAcore测量的)的图解说明。

图25显示使用杆状病毒表达系统表达的IL-4突变体和通过亲和层析在抗IL-4(11B4.6)柱上纯化的蛋白的图解说明。将突变体和肝素偶联的生物传感芯片的结合与62.5nM-1μM浓度范围的野生型IL-4的所述结合进行比较。将野生型IL-4的结合设置为100％。

图26是描述由三硫酸化二糖(Ido2SG1cNS6S)重复构成的肝素五糖结合IL-4的分子模型的图解说明。显示了20个最佳结合位置。已显示蛋白的螺旋结构，以空间结构模型标示据认为对肝素结合位点有贡献的氨基酸。

图27是当IL-5在经3-OST-3修饰的硫酸乙酰肝素存在或不存在的情况下通过固定的肝素时使用BIAcore 2000获得的感应图的图解说明。

图28是当IL-5在经3-OST-3修饰的DP12片段存在或不存在的情况下通过固定的肝素时使用BIAcore 2000获得的感应图的图解说明。

              优选的实施方案的详细描述

本发明总地涉及GAG分子的制备和涉及可用于治疗许多疾病状况的GAG分子的单个成员或级分，包括GAG样寡糖和由GAG样结构和非GAG接头构成的GAG复合分子以及其化学类似物、同源物或直向同源物，所述疾病状况例如炎性或过敏性疾病状况如过敏性鼻炎和哮喘、转移癌或由病原体引起的感染，所述病原体包括细菌、病毒和寄生虫例如HIV、冠状病毒包括SARS病毒、禽流感病毒或疟原虫。提到“GAG”分子包括提到GAG样分子，包括在非GAG主链上产生的GAG样分子。本发明也涉及和GAG分子或GAG复合分子结合的配体上的位点。一般地，由配体的三维构型决定该结合位点。

在详细地描述本发明之前，要理解，除非另外指出，本发明不限定于组分的特定制剂、生产方法、剂量方案等，因为这些都是可以改变的。也要理解此处所用的术语只是为了描述特定的实施方案，而不是想限定。

必须指出的是，如本说明书中所用的，除非上下文清楚地指出不是这样，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数方面。因此，例如，提到一个“GAG”，包括单个GAG，也包括2个或更多个GAG；提到“一种活性剂”，包括单一活性剂，也包括2种或更多种活性剂；等等。

在描述本发明和权利要求中，按照下面提供的定义使用下列术语。

术语“化合物”、“活性剂”、“化学试剂”、“药理学活性剂”、“药物”、“活性物质”和“药”在此可交换使用，其是指诱导想要的药理学和/或生理学效应的化合物。所述术语也包括此处明确提到的这些活性剂的药物可接受的和具有药理学活性的成分，其包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药物、活性代谢物、类似物等。当使用术语“化合物”、“活性剂”、“化学试剂”、“药理学活性剂”、“药物”、“活性物质”和“药”时，那么要理解这包括活性剂本身以及药物可接受的、具有药理学活性的盐、酯、酰胺、前体药物、代谢物、类似物等。

提到“化合物”、“活性剂”、“化学试剂”、“药理学活性剂”、“药物”、“活性物质”和“药”包括两种或更多种活性物质例如两种或更多种GAG分子或GAG复合分子或GAG分子和另一种治疗剂的组合。“组合”也包括多部分例如两部分药物组合物，其中分开地提供药剂和分开地给药或分配药或在分配前混合在一起。

例如，多部分药物包装可具有GAG或GAG的群体和一种或多种抗微生物剂或抗病毒药剂。

此处使用的术语药剂“有效量”和“治疗有效量”是指这样的量的药剂，该量足以提供想要的治疗或生理学效果。不想要的效果，例如副作用，有时伴随想要的治疗效果显现出来；因此，医生在确定合适的“有效量”时要平衡潜在的益处和潜在的风险。所需要的确切的量随受治疗者的不同而变化，这依赖于受治疗者的物种、年龄和一般身体状况、给药的模式等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，可由本领域技术人员只使用常规的实验确定在任一个体情况下的合适的“有效量”。

“药物可接受的”载体、赋形剂或稀释剂是指由非生物学或非其他不想要的材料构成的药物载体，即可将该材料和选择的活性剂一起给受治疗者施用而不产生任何或明显的不良反应。载体可包括赋形剂和其他添加剂例如稀释剂、去污剂、着色剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。依赖于制剂，也可将药物组合物描述为疫苗组合物。

类似地，化合物(此处提供的)的“药理学可接受的”盐、酯、酰胺、前体药物或衍生物是非生物学的或非其他不想要的盐、酯、酰胺、前体药物或衍生物。

此处使用的术语“治疗”和“疗法”是指疾病状况或感染的症状的严重程度和/或频率上的减少、症状和/或潜在的病因的消除、疾病状况或感染的症状的发生和/或其潜在病因的阻止以及疾病状况或感染引起的伤害的改善或补救。

“治疗”患者可包括在易感个体中预防疾病状况或感染或其他疾病状况或不良的生理事件以及通过抑制病原体(例如病毒、原核生物或真核生物)引起的疾病状况或感染或下游病况来治疗具有临床症状的个体。因此，例如，“治疗”患有感染或具有发病倾向的患者的本方法包括预防感染或其他疾病状况和治疗已产生的感染或其他疾病状况。在任何情况下，本发明提供了对由病原体生物或病毒引起的感染的治疗或预防或对另一种疾病状况的治疗。原核生物的示例包括沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、芽孢杆菌属(Bacillus)(包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、支原体(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、放线菌属(Actinomyces)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、衣原体(Chlamydia)、Chlamydophila、钩端螺旋体属(Leptospira)、螺旋体属(Spirochaeta)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、密螺旋体属(Treponema)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、Dichelobacter、嗜血杆菌属(Haemophilus)、Ralstonia、黄单胞菌属(Xanthomonas)、摩拉氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、金氏杆菌属(Kingella)、欧氏杆菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、Arozona、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、变形杆菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、耶尔森菌属(Yersinia)、志贺菌属(Shigella)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、弧菌(Vibrio)、立克次氏体(Rickettsia)、柯克斯氏体属(Coxiella)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、Arcobacteria、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、毛滴虫属(Trichomonas)、拟杆菌(Bacterioides)、Coccidiomyces、肺囊虫(Pneumocystis )、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、Porphyromonas、放线杆菌属(Actinobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillua)、Zymononas、酵母菌(Saccharomyces)、丙酸菌属(Propionibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、青霉属(Penicillum)、奈瑟球菌属(Neisseria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弯曲菌属(Campylobacter)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)或螺杆菌属(Helicobacter)。病毒的示例包括人免疫缺陷病毒(HIV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、鼻病毒、埃可病毒群、柯萨奇[肠道]病毒、巨细胞病毒、黄病毒、埃博拉病毒、副粘病毒属、流感病毒、肠道病毒、EB病毒、马尔堡病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、风疹病毒、天花病毒、麻疹病毒、痘病毒、腺病毒、冠状病毒包括SARS病毒、流感病毒包括禽流感病毒和轮状病毒。在优选的实施方案中，所述疾病是过敏性鼻炎。

此处所用的“患者”是指可从本发明的药物制剂和方法获得益处的动物，优选地是指哺乳动物，更优选地是人。对可从目前描述的药物制剂和方法获得益处的动物的类型没有限定。患者，无论人或非人动物，可以称为个体、受治疗者、动物、宿主或接受者。本发明的化合物和方法在人医学、兽医学以及一般地，驯养或野生动物饲养管理上具有用途。为了方便，“动物”包括禽类例如家禽、鸟禽(aviary bird)或猎禽(game bird)。家禽例如鸭子是禽类的优选示例。

如上面所指出的，优选的动物是人或其他灵长类动物例如猩猩、大猩猩、狨猴、家畜类动物、实验室实验动物、伴侣动物或抓获的野生动物以及禽类。

实验室实验动物的示例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和仓鼠。兔子和啮齿动物例如大鼠和小鼠，提供了方便的实验系统或动物模型。家畜动物包括绵羊、牛、猪、山羊、马和驴。也包括非哺乳动物例如禽类(例如鸭子)、斑马鱼、两栖类(包括cane toads)和果蝇类例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。

在本说明书中，术语“GAG”用于在属类上确定糖胺聚糖类的分子，其确定性结构特征对于本领域技术人员来说是熟知的。如本说明书中所用的，术语GAG寡糖是任何这样的GAG分子，如通过单糖残基的数目所测量的，所述分子比对应的其衍生来源的GAG多糖短。如上面所指出的，“GAG”包括GAG样分子，如在非GAG主链上产生的分子，以及包含一个或多个由非GAG接头连接的GAG样部分的GAG样复合分子。

因此，本发明的一个方面涉及具有下式的GAG寡糖：

            (₁P-_mX)_q-_q+1P    (II)和

            (₁X-_mP)_q-_q+1X    (III)

或式(II)或(III)的分子的化学类似物、同源物或直向同源物；

其中X是由以下通式定义的分子：

        ₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]    (I)

或GAG样寡糖、式(I)的GAG寡糖的GAG样化学类似物、同源物或直向同源物；

其中：

A是包含糖例如但不限于葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖尿病、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式的寡糖或单糖单体单位；

B可以和A相同或是包含葡糖胺残基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化形式和/或其乙酰化形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的单体单位；

其中单体单位A和B通过糖苷键连接；

_i[A-B]是相同或不同的A-B二糖构建部件，i表示从一端开始测量的沿着链排列的二糖的位置，其中i是整数，1≤i≤n；

_n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖构建部件，n表示位于₁[A-B]的相反末端的构建部件；和

n是从大约2至大约10，其表示重复A-B单位的链的长度；

或GAG样寡糖、GAG样复合物或其化学类似物、同源物或直向同源物；

条件是₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]不是全长HLGAG分子；

P是肽、多肽或蛋白、化学部分、饱和或不饱和脂肪酸、脂质、树状分子、糖、多元醇、葡聚糖、聚乙二醇或者分枝或不分枝的、饱和的或不饱和的烃链或柔性接头；

1和m是整数，如1，m＝1...q；

q是整数，1≤q≤9；

其中所述GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合物或类似物、同源物或直向同源物结合配体，例如但不限于这样的配体，所述配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1、-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体。特别优选的配体是IL-4、IL-5和PECAM-1、gp120、IL-5受体的βc链和亲环蛋白A。

寡糖可附着单个糖，从而产生长度为_n[A-B]-A或B-_n[A-B]的寡糖。

B也可在羟基例如但不限于6位或末端糖上的羟基上附着单糖、二糖或三糖，从而产生分枝的结构；这些附着的糖单位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。当A是葡糖胺时，则A也可也在羟基例如但不限于6位或末端糖上的羟基上附着单糖、二糖或三糖，从而产生分枝结构；这些附着的糖单位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

_i[A-B]可以具有这样的末端糖，该糖是4-脱氧-L-苏型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸或通过用亚硝酸处理产生的葡糖胺的衍生物例如2，5-脱水-D-甘露醇或2，5-脱水-D-甘露糖或其衍生物。

本发明还提供了GAG寡糖，结合肽、多肽或蛋白上的靶位点和GAG寡糖结合的靶位点相同的GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子。

在一个优选的实施方案中，靶蛋白是IL-5，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子和IL-5上的一个或多个残基限定的三维位点相互作用，所述残基选自；R32、R67、K70、K76、K77、K83、K84、K85、E88、E89、R90、R91和/或R92。在其他优选的实施方案中，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子包含糖结构△UA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₅或其类似物、同源物或直向同源物、或和结构△UA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₅一样与相同的位点结合或相互作用的分子。

在另一个优选的实施方案中，靶蛋白是PECAM-1，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子结合PECAM-1上的结构域2、3、5或6中任何一个或多个结构域所限定或促成的三维位点。在其他优选的实施方案中，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子和PECAM-1上的结构域2和/或3相互作用。

在另一个优选的实施方案中，靶蛋白是IL-4，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子和IL-4上的任何一个或多个残基限定的三维位点相互作用，所述残基选自：E9、K12、R53、E60、K61、H74、R75、K77、Q78、R81、R84、R85、D87和/或R88。在其他优选的实施方案中，GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子包含这样的糖结构，该糖结构选自：

ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₄、ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₃-UAG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS、ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、或其类似物、同源物或直向同源物、或和这样的三维结构结合或相互作用的分子，该三维结构由上述GAG分子的结合限定。

就其结合肝素和就其诱导生长因子依赖性细胞系TF1.8的增殖的能力对一组IL-4突变体的分析表明，肝素结合位点和IL-4Rα结合位点重叠。对于两者都极其重要的残基是R88。参与肝素结合和IL-4Rα结合的其他残基是R81、R84、R53和可能地E9。E9是IL-4Rα结合的关键性残基但其在肝素结合位点的边缘。

术语“HLGAG”(肝素样糖胺聚糖)用作表示普通细胞表面GAG分子的术语。如在本上下文中所用的，该术语是指该类型的全长分子例如肝素和硫酸乙酰肝素。是这些细胞表面GAG与配体相互作用和可导致疾病状况如炎性疾病、转移癌或对由病原体引起的感染的易感性。

肝素和硫酸乙酰肝素由重复的二糖单位构成，所述二糖单位包括彼此连接和通过1→4键连接至其他二糖的己糖醛酸(HexA)和D-葡糖胺(G1cN)。糖醛酸可以是β-D-葡糖醛酸(G1cA)或α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)。两者作为未衍生的单糖或作为2-O-硫酸化残基存在。葡糖胺(G1cNAc)可以被N-硫酸化或N-乙酰化、或极少以游离胺存在。N-硫酸-葡糖胺可在C3(极少)、或在C6、或在C3和C6被O-硫酸化，或不含有硫酸基团。类似地，N-乙酰化的葡糖胺可以在C6上被O-硫酸化或未被硫酸化。

本发明部分基于化学试剂的鉴定，所述化学试剂抑制细胞表面HLGAG和无细胞配体或细胞结合的配体之间、或细胞外HLGAG和细胞结合的配体之间、或细胞外HLGAG和无细胞配体之间的相互作用。便利地，首先使用无细胞GAG分子或无细胞GAG分子的家族鉴定所述化学试剂，其可以从天然存在的HLGAG产生或通过对非GAG多糖的化学修饰的方法产生。

到目前为止，特别方便的HLGAG分子是硫酸乙酰肝素或肝素。硫酸乙酰肝素和肝素是不同长度分子的不均一混合物，其具有不同的硫酸化模式，其中重复性二糖HLGAG的糖醛酸组分也可以是艾杜糖醛酸。作为不均一性混合物的结果，不容易显现负责与配体相互作用的级分。从而，不容易显现与该配体相互作用的分子的部分。

提到“GAG”或“GAG的群体”可以指同一种实体。因此，GAG可以包含相同的或不同的GAG的群体。然而，一般地，GAG代表GAG分子包括GAG样分子的不均一性群体。

因此，在第一实施方案中，本发明提供了产生GAG寡糖文库的方法和鉴定GAG寡糖或其能够结合配体的部分或区域的方法。根据本发明的方法产生的GAG可用于治疗任何这样的疾病，该疾病涉及GAG样分子和配体之间的相互作用。优选的疾病包括炎性或过敏性疾病和转移癌以及由病原体引起的感染。

优选地，配体是肽、多肽或蛋白，尽管本发明扩展至配体为糖、脂质、糖蛋白或从天然产物筛选或从化学文库获得的分子。蛋白配体的示例包括，但不限于：细胞因子包括白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或IL-15)、干扰素(例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素)或生长因子包括但不限于G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、KC、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、胰岛素等；酶；趋化因子例如嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1、-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合的或病毒结合的受体。

可从许多糖多聚体中的任一种产生本发明的GAG寡糖。在本发明的优选的实施方案中，预期作为起始材料的多糖包括大肠杆菌K5多糖或来自另一种原核生物或真核生物的其等同物、壳多糖和/或壳聚糖。此外，起始材料可以是不同结构的多糖例如葡聚糖。基于非GAG多糖的分子和通过非GAG结构连接的非GAG样部分(其可以是或可以不是GAG)构成的分子在此处被称为“GAG复合分子”或“复合分子”。

如此处所用的，术语“GAG复合”结构或分子或“复合物”结构或分子可交换使用；在一个实施方案中，GAG复合结构包含结合靶蛋白的糖结构。优选地，糖结构包含通过接头隔开的2种或更多种高度带电荷(例如硫酸化的或磷酸化的)的三糖或二糖或四糖或五糖或己糖或七糖或八糖或这些糖的任何组合。优选地所述接头不基于GAG样主链。相反地，接头例如烷基链或多元醇结构或聚乙二醇是优选的。此外，高度带电荷的糖不必基于GAG结构。其他糖，例如甘露聚糖、或壳聚糖、或葡聚糖，可用作在其上展现带电荷的基团的骨架。

通过截短和至少一次去乙酰化、硫酸化、去硫酸化、磷酸化和/或侧链的附着从这些多聚体产生本发明的寡糖。

除了只使用上述衍生作用中的一种外，还可使用2、3、4或所有5种所述衍生步骤。

这些衍生步骤中没有一种需要以任何特定的顺序发生。特定寡糖的产生依赖于文库的制备中所使用的额外步骤的顺序和数目。

可通过许多机制实现将多糖截短成寡糖。例如可在不同阶段获得K5荚膜多糖的截短：在天然的多糖上、在去N-乙酰化的多糖上或在硫酸化的多糖上。用于截短多糖的方法包括酶促、化学、热和超声波方案，例如由Alban和Franz，Biomacromolecules 2：354，2001描述的方法。

也可能在不同的阶段酶促截短多糖。肝素酶III、肝素酶II和肝素酶I切割硫酸化的K5多糖，从而产生更低分子量的片段。肝素酶III可将天然的K5多糖截短成想要的聚合长度(Nader等人，Glycoconjugate Journal 16：265-270，1999)。β-D-葡糖苷酸酶和软骨素酶AC也降解天然的未经修饰的K5多糖(Lidholt等人，J.Biol.Chem.272：2682，1997)。

葡糖胺单位上的N-乙酰基的存在，在当其暴露于亚硝酸时有效地保护该糖苷键免受切割。可通过本领域已知的方法实现通过肼的介导选择性地除去N-乙酰基。参见，例如，Shaklee和Conrad，Biochem.J.235：225，1986；Shively和Conrad，Biochemistry15：3932-3939，1976；和Shaklee和Conrad，Biochem.J.217：187-197，1984。然后可能通过使用能够使葡糖胺残基的α糖苷键断裂的亚硝酸来截短K5葡糖胺-葡糖醛酸多聚体。通过改变反应条件，可能获得不同大小的衍生于K5的寡糖。使用大小排阻层析能够获得合理量由K5衍生的DP4-DP20。

壳多糖内葡糖胺单位上的N-乙酰基的存在，在当其暴露于亚硝酸时有效地保护该糖苷键免受切割。通过肼的介导选择性地除去N-乙酰基在本领域是熟知的操作。参见Shaklee和Conrad，1986，同上；Shively和Conrad，1976，同上；和Shaklee和Conrad，1984，同上。然后可能使用能够使硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和硫酸软骨素中的α糖苷键断裂的亚硝酸来截短己糖胺多聚体。壳聚糖的糖苷键是β糖苷键，因此可产生不同于α糖苷键的反应性和断裂反应。

已经详尽地研究了肝素型寡糖主链的化学硫酸化作用。使用改变的反应条件已获得一些程度的选择性，已确定了某些羟基的反应性(参见Ogamo等人，Carbohydr.Res.193：165-172，1989)。此外，首先通过使寡糖过硫酸化，然后选择性地使某些位置去硫酸化，已获得一些选择性。

本发明人的研究，目标在于确定蛋白结合所必需的硫酸化程度，已显示一些非硫酸化区域可提高GAG-配体结合事件的特异性。为了能实现对寡糖的硫酸化程度的一些控制，使用受控肼解，递送部分去N-乙酰化的多糖。在亚硝酸切割期间，N-乙酰基的存在为相邻的糖苷键提供了保护作用，并不被硫酸化。因此，一些N-乙酰基的存在导致在整个寡糖中一些非硫酸化区域。在抗凝级联反应中硫酸化GAG和蛋白的结合是非常复杂的，肝素和血小板因子IV(PF-IV)的相互作用在一些治疗性应用中已产生一些问题。然而，尽管肝素-PF-IV相互作用以极高的亲和力发生，但特异性也非常高，因此通过加入对肝素结合无害而对PF-IV结合有碍的官能团可获得一定的选择性。Petitou等人，1999，同上描述了这一点。可通过使高度硫酸化区域的数目最小化至末端上的4-5个糖单位并使不带电荷的寡糖分隔子分隔带电荷部分来实现该目的。

实现6-OH的选择性保护，这样可使2和4羟基得以选择性地硫酸化。可选择地，6-O硫酸是最具反应性的和最易水解的，从而提供了获得游离的6-OH的另一种方法。此外，可使用铜(II)离子实现2-氨基和3-羟基的保护，从而可使6-OH选择性硫酸化(Terbojevich等人，Makromol.Chem.190：2847-2855，1989)。

此外，游离6-OH基的存在是进一步将单糖、二糖或三糖附着至游离OH基以产生分枝结构的机会。已显示β-1，3硫酸葡聚糖的分枝版本展现比对应的具有相同分子量和硫酸化程度的线性版本更高的抗凝血活性(Alban和Franz，Biomacromolecules 2：354-361，2001)。这些附着的糖单位按需要可以是硫酸化或非硫酸化的、或可以是磷酸化的或非磷酸化的。

硫酸化K5，然后肼解，以除去NHAc但留下O-硫酸化和N-硫酸化保持完整，然后选择性地N-硫酸化，为K5的去乙酰化然后N和O-硫酸化提供了不同的硫酸化模式。

已详尽地研究了壳聚糖类型寡糖主链的化学硫酸化作用。参见，例如，Hirano等人，Chitin.Nat.Tecnol.，[Proc.Int.Conf.Chitin Chitosan]，第3版，(Pub 1986)461-468，1985)。首先通过使寡糖过硫酸化，然后以类似于针对肝素乙酰硫酸和K5多糖的方式(Baumann等人，Carbohydr.Res.308：381-388，1998)选择性地使某些位置去硫酸化来获得一些选择性。

在本发明的备选实施方案中，通过这样的方法产生GAG寡糖，该方法包括按大小分级分离肝素或硫酸乙酰肝素分子或其他多聚体例如K5多糖、壳多糖或壳聚糖的群体以产生与配体相互作用的非全长级分。肝素在其中一些二糖单位中包含葡糖醛酸和艾杜糖醛酸的混合物，并且在硫酸化程度上也是变化的。可通过任何便利的方法例如凝胶过滤柱进行分级分离，分级分离基于一般但非排外地从DP4至大约DP20(如DP5，DP6，DP7，DP8，DP9，DP10，DP11，DP12，DP13，DP14，DP15，DP16，DP17，DP18或DP19)的不同长度的糖链。分离的另一种形式基于硫酸化的程度。分离也可以基于这两种参数的组合。

本发明的另一个方面是提供了新的磷酸化GAG寡糖。当产生GAG寡糖的文库时，通过包括磷酸化步骤产生这些分子。可对从多聚体例如大肠杆菌K5多聚体、壳多糖或壳聚糖产生的半合成寡糖和通过对HLGAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的分级分离产生的寡糖进行该磷酸化步骤和可能是必需的任何相关的去硫酸化步骤。

6-O硫酸是最容易水解的O-硫酸，从而提供了获得游离的6-OH的方法。然后对游离6-OH磷酸化以产生6-O磷酸。已显示硫酸酯和磷酸酯在许多化合物中等效，尽管在其他化合物中磷酸化改变了活性。也可能N磷酸化葡糖胺残基。

通过使用氨基磷酸酯氧化法(Vieira de Almeida等人，Tetrahedron 55：7251-7270，1999；Dubreuil等人，Tetrahedron 55：7573-7582，1999，及其中引用的参考文献)容易地获得羟基的选择性磷酸化。该方法已广泛地用于形成磷酸肌醇、核苷酸和寡核苷酸。可选择地，可使用几种其他更快速的引入磷酸基团的方法，例如在吡啶存在的情况下磷酰基氯氧化物，然后再进行水解。也可能通过混杂的己糖激酶的作用酶促地磷酸化这些寡糖。

然后就其与配体相互作用或与配体结合的能力检测根据以上描述的方法产生的各寡糖集库(pool)。基于寻求治疗剂的疾病状况选择配体。例如，IL-4和IL-5是用于过敏性鼻炎和哮喘的配体，PECAM-1是用于炎症和黑色素瘤的配体，gp120或亲环蛋白A是用于HIV感染的配体。很明显，可使用和特定疾病状况关联的任何蛋白或非蛋白配体。

因此，本发明的另一个方面提供了用于鉴定与配体相互作用的GAG寡糖的群体的方法。

可通过任何常规的方法鉴定与配体的相互作用，所述方法是例如凝胶阻留法、亲和共电泳法、生物发光共振能量转移(BRET)测定法、荧光共振能量转移(FRET)测定法、荧光偏振(FP)测定法、闪烁迫近测定法或在生物芯片或其他表面(包括与质谱检测偶联的表面)上的固定。

可通过首先将GAG寡糖固定在芯片上，然后加入配体来进行后一种方法。可选择地，可将配体固定在芯片上，使用其筛选GAG寡糖与其结合的能力。

另一种选择是将HLGAG例如肝素固定在固体支持物上，然后筛选根据上述方法产生的GAG寡糖抑制配体和固定的肝素结合的能力。

因此，特别有用的测定法是将配体和GAG寡糖混合并筛选GAG寡糖抑制配体和结合在芯片上的HLGAG(例如，肝素或硫酸乙酰肝素)结合的能力。

因此，本发明的另一个方面提供了产生与配体例如蛋白相互作用的GAG寡糖或GAG样复合分子的方法，所述方法包括产生GAG寡糖、或GAG复合分子的文库，然后就与所述配体相互作用或抑制配体和已知与所述配体相互作用的HLGAG之间的相互作用的能力筛选所述文库的各成员。

在一个优选的实施方案中，GAG寡糖或GAG样复合分子结合分泌的细胞产物，该产物可以是蛋白，这样就抑制了配体和HLGAG例如肝素之间的相互作用。

当然，存在许多其他测定法，所述测定法可用于筛选GAG寡糖或GAG样复合分子和配体之间相互作用或用于筛选对配体和已知结合该配体的HLGAG之间的相互作用的抑制作用。另一个测定法是滤膜结合测定法。在该测定法中，用能够提供可鉴定的信号的报告分子例如荧光染料标记GAG寡糖或GAG样复合分子、或配体中的一种，使两种分子在溶液中相互作用。然后将所得的混合物通过能够阻滞GAG寡糖或GAG样复合分子或配体中的一种分子或只阻滞GAG寡糖-配体复合物或GAG样复合分子-配体复合物的滤膜。

在一个实施方案中，该滤膜是例如阻滞蛋白的硝酸纤维素滤膜。在该情况下，如果由报告分子标记的GAG级分不能通过滤膜，那么滤膜中存在报告信号就表明GAG和蛋白的结合。

在另一个实施方案中，用报告分子标记肝素或硫酸乙酰肝素并在不同的GAG寡糖或GAG样复合分子存在的情况下将其与蛋白反应。肝素或硫酸乙酰肝素通过滤膜表明GAG寡糖或GAG样复合分子已抑制了肝素/硫酸乙酰肝素与蛋白之间的相互作用。

不同的GAG会和不同的配体相互作用，或不同的配体会和不同的GAG相互作用或两种情况同时存在。因此，另一种测定法包括使用载有固定的配体的亲和柱。然后将GAG寡糖或GAG样复合分子通过该柱，并确定GAG寡糖的阻滞的存在。便利地使用盐梯度来洗脱结合的GAG寡糖或GAG样复合分子。一旦鉴定结合柱子上的配体的级分后，可进一步分析该级分以获得其中不同结构实体的数目的指示。这样的分析可包括，例如，阴离子交换层析、质谱或电泳。

本发明不限定于此处描述的步骤的任何特定顺序。

关于该后一种实施方案，在一个示例中，在IL-5亲和柱上检测肝素的级分。根据本发明已确定包含DP12的GAG寡糖的级分结合IL-5。更明确地，对所述DP12级分的随后的阴离子交换层析显示，在整个DP12级分/集库中只有一个亚组的结构结合IL-5。可能在该结合IL5的结构亚组中存在分别的实体，这些分别的实体可能在其硫酸化的模式上存在差异。

在另一个示例中，在通过固定IL-4制备的亲和柱上检测肝素的级分。根据本发明已确定包含DP10的GAG的级分结合IL-4。随后对DP10级分的阴离子交换层析显示在整个DP10级分中只有一个结构亚组结合IL-5。根据质谱分析证明这些结构在其硫酸化的模式上存在差异。

IL-4上结合肝素的位点和IL-4上结合IL-4Rα所需的位点被提出是重叠的。这对于寻靶和功能分析非常重要。

一旦鉴定结合特定配体的GAG寡糖后，该级分本身可用作抑制蛋白(或其他配体)和细胞表面HLGAG(例如，肝素或硫酸乙酰肝素)之间相互作用的治疗剂。所述蛋白(或其他配体)可以是不合细胞的或和细胞或病毒例如细胞表面或病毒表面结合的。所述GAG寡糖也可用作调节分泌的细胞产物和细胞外基质组分之间或细胞表面蛋白和细胞外基质组分之间、或蛋白和其配体(两者或其中任一者可以是细胞表面的或细胞结合的)之间相互作用的治疗剂。可选择地，GAG寡糖可用作鉴定天然的产物或来自化学文库的产物的靶，所述产物在结合配体方面模拟GAG寡肽或者抑制或促进HLGAG和配体之间的相互作用。这些分子可以是GAG的拮抗剂或激动剂或化学类似物。因此“类似物”扩展至和包括功能上等同的任何结构，其功能等同性在于其以类似的方式结合和/或调节配体。

此处提到“调节”或“调控”扩展至和包括抑制和/或促进相互作用。

因此，本发明的另一个方面涉及用于产生用于在受治疗者中治疗疾病状况的药物的方法，所述方法包括根据本发明的方法生产一系列GAG寡糖或GAG样复合分子，并就和配体相互作用或调节配体的能力筛选各GAG。鉴定与配体相互作用或调节配体的GAG寡糖，在所述药物的生产中使用其或其类似物、激动剂或拮抗剂。

在一个优选的实施方案中，调节是抑制。

此处预计的配体的类型包括上面列出的类型例如PECAM-1、亲环蛋白A、gp120和细胞因子例如白细胞介素(IL)-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12和13、G-CSF、GM-CSF、LIF和M-CSF以及趋化因子例如嗜酸细胞活化趋化因子-1、嗜酸细胞活化趋化因子-2和嗜酸细胞活化趋化因子-3。此处涉及的疾病包括过敏性鼻炎、哮喘、特应性皮炎和其他过敏性疾病、HIV(人、犬科动物、猫科动物、马科动物等)、炎性疾病、深静脉血栓形成和黑色素瘤和其他癌症。

被治疗的受治疗者包括人、家畜动物(例如，牛、绵羊、猪、马、驴)、实验室实验动物(例如，兔子、豚鼠、小鼠、大鼠)和伴侣动物(例如，狗、猫)。

在本发明的另一个方面提供了在受治疗者中治疗疾病状况的方法，所述疾病状况由所述宿主中细胞表面上的HLGAG和配体之间、或所述宿主中细胞外基质中的HLGAG和配体(其可以是或可以不是和细胞结合的)之间的相互作用、或所述宿主中可被HLGAG破坏的蛋白-配体相互作用(其中，所述蛋白可以和细胞结合而配体是可溶性的，或蛋白和配体都可以和细胞结合)造成的，所述方法包括给所述受治疗者施用有效量的药物，所述药物是根据本发明产生和鉴定的与所述配体相互作用的GAG寡糖，和将所述级分掺入药物中，或获得其化学类似物或同源物并将其掺入所述药物中。

本发明的另一个方面提供了组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种：

(i)此处所定义的GAG寡糖；

(ii)此处所定义的GAG样复合分子；

(iii)此处所定义的GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子；

(iv)(i)、(ii)或(iii)的激动剂；

(v)(i)、(ii)或(iii)的拮抗剂；

(vi)(i)或(ii)或(iii)或(iv)或(v)的化学类似物、同源物或直向同源物；和/或

(vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)的天然或化学文库类似物、同源物或直向同源物。

所述组合物也包含一种或多种药物可接受载体和/或稀释剂。

所有上面这些试剂被称为“活性成分”，建议将所述组合物用作药物。

适合用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液(可溶于水的情况下)、用于临时配制无菌注射液的无菌粉剂和可吸入形式。优选地这些形式在生产和贮存的条件下是稳定的，而且一般进行防腐处理以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或稀释介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可通过例如使用表面活性剂保持恰当的流动性。可通过使用各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、柳硫汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选地包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。

通过将所需量的活性成分以及所需的任选地其他活性成分一起掺入合适的溶剂，然后通过灭菌或至少这样的方法来制备无菌注射液，该方法将污染性病毒、细菌或其他生物学实体减少至对于给人或动物受治疗者施用是可接受的水平。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性成分和任何其他想要的成分的粉剂。

当活性成分受到适当的保护时，其可经口施用，例如，用惰性稀释剂或用可吸收食用的载体进行保护，或其可被包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或其可被压制成片剂。对于口服治疗施用，可将活性成分掺入赋形剂并以可摄入的片剂、口含片剂、药锭、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、纸囊剂等形式使用。这些组合物和制剂按重量计算应当包含至少1％的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，便利地，可在单位的重量的大约5至大约80％之间。这些治疗上有用的组合物中的活性成分的量是可获得合适的剂量的量。这样制备本发明的优选的组合物或制剂以使口服剂量单位形式包含大约0.1μg至200mg的活性化合物。可选择的剂量包括从大约1μg至大约1000mg和从大约10μg至大约500mg。这些剂量可以是每个体或每kg体重。施用可以是每秒、每分钟、每小时、每天、每周、每月或每年。

片剂、药锭、丸剂和胶囊剂等也可包含下面列出的成分。可加入粘合剂例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式为胶囊时，除了上述类型的材料，其还可包含液体载体。各种其他材料可以包衣的形式存在或以其它方式修饰剂量单位的物理形式。例如，可用紫胶、糖或两者同时包被片剂、丸剂或胶囊。糖浆剂或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、染料和调味剂例如樱桃或柑橘调料。当然，用于配制任何单位剂型的任何材料应当是药物纯的并且以施用量基本上无毒。此外，可将活性化合物掺入持续释放的制备物和制剂。

药物可接受载体和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。这些用于药物活性物质的介质和试剂的用途在本领域是熟知的，除了和所述活性物质不相容的任何常规介质或试剂外，预期其在治疗性组合物中的应用。也可将补充性活性成分整合入组合物。

也可配制供局部或外用施用的组合物。可在″Remington′sPharmaceutical Sciences″，Mack Publishing Co.，Easton PA.，第16版，1980，Ed.By Arthur Osol中查找到配制和施用的技术。因此，对于局部或外用给药，可以任何适合的方式配制本组合物，包括但不限于，乳膏剂、凝胶、油脂、软膏剂、溶液、混悬液、粉剂、喷雾剂或气雾剂。对于透粘膜给药，在制剂中使用适合于要透过的屏障的渗透剂。这些渗透剂在本领域中是公知的，包括但不限于苯扎氯铵、洋地黄皂甙、二氢细胞松弛素B和癸酸。

以洗剂、乳膏剂或凝胶形式存在的本发明的组合物可包含提供想要的质地、稠度、粘度和外观的可接受的稀释剂或载体。可接受的稀释剂和载体对本领域技术人员来说是熟知的，其包括，但不限于，乙氧基化和非乙氧基化的表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、碳氢油(例如棕榈油、椰子油和矿质油)、可可脂蜡、硅油、缓冲剂、纤维素衍生物、乳化剂例如非离子有机和无机碱、防腐剂、蜡酯、甾醇、甘油三酯、磷脂例如卵磷脂和脑磷脂、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水性羊毛脂衍生物和亲水性蜂蜡衍生物。

在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了可吸入的药物组合物。

一旦鉴定结合特定配体的GAG寡糖或GAG样复合分子后、或在获得化学类似物或在获得天然产物类似物(其以和GAG寡糖相同的方式起作用，或充当激动剂或拮抗剂)后，产生能够和该特定分子或分子群相互作用的免疫学试剂可能是非常有用的。产生其中抗原性区域对应于配体的HLGAG结合区或其部分的免疫学试剂也是有用的。优选的免疫学试剂是抗体，这些抗体特别适合用于免疫测定法。这些免疫测定法可用于监测靶试剂的水平、纯化靶试剂或抑制靶试剂的功能。

单克隆抗体在免疫测定法中的应用是特别优选的，因为能大量产生和产物的均一性。可通过本领域技术人员熟知的技术制备用于单克隆生产的杂交瘤细胞系，通过将永生化细胞系和针对免疫原制剂致敏的淋巴细胞融合来产生所述杂交瘤细胞系。(参见，例如，Douillard和Hoffman，Basic Facts about Hybridomas，in Compendium ofImmunology第2卷，ed.by Schwartz，1981；Kohler and Milstein，Nature 256：495-499，1975；Kohler和Milstein，EuropeanJournalof Immunology 6：511-519，1976)。

本发明的另一个方面提供了用于在样品中检测HLGAG级分的方法，所述方法包括将所述样品和对于所述HLGAG级分或其同源物或类似物特异性的抗体在足以形成抗体-HLGAG复合物的条件下接触一段时间，然后检测所述复合物。在下面的描述中，“HLGAG”分子或其类似物或同源物被称为“抗原”。也可使用标记的结合HLGAG或其类似物或同源物的蛋白检测HLGAG分子或其类似物或同源物。用于该用途的理想的蛋白是抗生物素蛋白或乳铁蛋白。这些蛋白可用荧光衍生物例如荧光素或Alexafluor 488标记。

可通过许多方法例如通过Western印迹法和ELISA法进行HLGAG级分的检测。可获得许多免疫测定技术，如通过参考美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653可看到的技术。

夹心测定法是其中最有用和最广泛使用的测定法之一，本发明也有利地使用这种方法。存在许多夹心测定法技术的变体，本发明包含所有变体。简而言之，在一般的正向测定法中，将未标记的抗体固定在固体基质上，将含有待检测的抗原的待测样品与结合的分子接触。在适合的温育时间(该时间段足以使抗体-抗原复合物形成)后，然后加入二抗(该二抗对于抗原是特异性的，标记有能够产生可检测信号的报告分子)并进行温育，使时间足以形成另一种复合物：抗体-抗原-标记的抗体。洗去任何未反应的材料，通过观察由报告分子产生的信号确定抗原的存在。可通过可视信号的简单观察对结果定性，或可通过和含有已知量的抗原的对照样品比较来进行定量。正向测定法中的变体包括同时测定法，在于向结合的抗体中同时加入样品和标记的抗体。这些技术对于本领域技术人员来说是熟知的，包括很容易看出的任何小的变化。

固体表面一般是玻璃或聚合物，最普遍使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以管、珠子、盘或微量培养板、或适合进行免疫测定法的任何其他表面的形式存在。

如在本说明书中所用的，“报告分子”是因其化学性质提供允许检测结合抗原的抗体的可分析鉴定的信号的分子。检测可以是定性的或可以是定量的。在该类型的测定法中最普遍使用的报告分子是酶、荧光团或包含放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化学发光分子。

在酶免疫测定的情况下，通常通过戊二醛或高碘酸的方法将酶缀合至二抗。然而，容易地看出，存在多种不同的本领域技术人员可容易获得的缀合技术。除其他以外，普遍使用的酶特别包括辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。和特定的酶一起使用的底物一般根据在被对应酶水解后产生可检测的显色变化来选择。合适的酶的示例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可能使用产生荧光的底物，该底物产生荧光产物而不是上面指出的显色底物。在所有情况下，将酶标记的抗体加入至一抗-抗原复合物，使其结合，然后洗去过量的试剂。然后向抗体-抗原-抗体的复合物中加入包含合适底物的溶液。底物将和被连接至二抗的酶反应，产生定性可视的信号，也可对其进一步定量(一般通过分光光度计)，从而给出存在于样品中的肝素的量的指示。“报告分子”也扩展至使用细胞凝集或凝集反应的抑制，例如胶乳珠上的红细胞等。

可选择地，可将荧光化合物，例如荧光素和罗丹明通过化学方法偶联至抗体而不改变其结合能力。当被特定波长的光照射激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发态，然后发射可用光学显微镜可视检测的特征颜色的光。如在EIA中，让荧光标记的抗体结合第一抗体-抗原复合物。在洗去未结合的试剂后，将剩下的三元复合物暴露于合适波长的光，观察到的荧光表明目的抗原的存在。在本领域中已建立了完善的免疫荧光和EIA技术，该技术特别优选地适合于本方法。然而，也可使用其他报告分子，例如放射性同位素、化学发光剂或生物发光分子。

此外，可使用识别配体的GAG结合区域或其部分的抗体测定保留在外源配体上的GAG结合位点的比例来间接地检测GAG的存在。

对广泛的不同类型的蛋白上的肝素结合位点存在相当大的兴趣，已有许多描述在蛋白一级序列中的肝素结合基序的尝试。Cardin和Weintraub首先将肝素结合基序描述为XBBBXXBX和XBBXBX，其中B是碱性残基，X是亲水性(hydropathic)残基(Cardin和Weintraub，Arteriosclerosis 9：21-32，1989)。Hileman等人将这些基序扩展至包括将碱性相互作用残基拉近的转角并描述了新的共有序列，TXXBXXTBXXXTBB，其中T是转角(Hileman等人，Bioessays 20：156-67，1998)。然而，这些基序不适合于所有蛋白，因为GAG结合位点由蛋白的溶液结构决定并且肝素结合位点不显示对特定序列或蛋白折叠的绝对依赖性。正是肝素上的硫酸基团和恰当地分布在蛋白表面上的碱性斑片(patches)相互作用。因为溶液中沿肝素螺旋一侧的硫酸簇之间的距离是17，所以溶液中蛋白表面上其间具有17的间隔的两片碱性残基是朝向定位肝素结合位点的良好起始点(Mulloy和Forster，Glycobiology 10：1147-56，2000)。

为了鉴定靶蛋白上的GAG结合区域，必需表征该蛋白的一级、二级、三级和四级结构。除了其他以外，这将要求考虑：

1.酸性/碱性残基的数目和位置。

2.极性/非极性残基的数目和位置。

3.带电荷的/不带电荷的残基的数目和位置。

4.疏水性/亲水性残基的数目和位置。

5.天然存在的残基化学修饰的数目和位置，所述修饰即，羟化、磷酸化、甲基化、乙酰化、甲酰化、糖的加入、脂质的加入和辅因子例如吡哆醛-5-磷酸和亚铁血红素的共价附着。

6.共价和非共价结合(即二硫键、氢键、离子键、疏水键、范德瓦尔斯力等)的数目和位置。

7.个体和/或成组残基之间的物理距离。

8.残基的立体异构作用。

9.α螺旋和β折叠形成的数目和位置。

10.形成同型二聚体和异二聚体的潜能。

此外，也可就诸如以下的特征来表征碳水化合物结合伴侣(例如GAG)的特征：

1.链长即聚合的程度。

2.侧链的修饰。

3.立体异构作用。

4.环结构的数目和位置。

5.糖苷键的数目和位置。

6.二级结构(如果存在)，即螺旋。

在分析蛋白和碳水化合物结合伴侣的特征中，所用的方法可包括：

1.比较序列分析。

2.醇母双杂交研究。

3.免疫共沉淀技术和其他亲和方法。

4.核磁共振(NMR)。

5.X射线晶体学。

6.计算机建模。

7.定点诱变和结构域缺失研究。

8.配体和GAG的化学交联。

结构域缺失分析是低分辨率方法，该方法用于大的蛋白，例如PECAM-1，以确定蛋白上对于结合GAG是重要的总体区域。结构域缺失包括蛋白的DNA编码序列的截短，这样，可使表达的蛋白缩短确定的长度。使用在本文中描述的测定法，就其结合GAG的能力筛选整个分子长度内的系列结构域缺失。包含GAG结合位点的区域将结合GAG，但该位点被删除的区域不能结合GAG。通过检查丧失HLGAG结合的结构域缺失，可鉴定对GAG结合非常重要的整个蛋白上相对较小的区域[Conrad，1998，同上]。可分离表达该区域以进行进一步分析，例如定点诱变或NMR研究。

定点诱变包括蛋白的DNA编码序列内的一个或多个核苷酸的突变以使表达的蛋白在至少一个氨基酸上发生了改变。然后在本文描述的肝素结合测定法中就对肝素结合的影响筛选突变体。可将影响肝素结合的突变体在二维或三维蛋白模型上作图以确定其彼此相对位置，和其相对于蛋白整体的位置。该技术可用于任何GAG结合蛋白以收集关于该蛋白上的任何GAG结合位点的信息[Tsiang等人，J.Biol.Chem.270：16854-16863，1995]。

使用NMR收集关于蛋白和其他分子的三维结构信息。用非放射性同位素例如¹³C和¹⁵N标记要研究的分子，之后将分子接受强磁场。将这些磁场中的分子的行为用于收集关于所述分子的结构信息。为使用NMR确定蛋白上的GAG结合位点，首先确定无GAG时的蛋白的结构。然后在GAG存在的情况下确定结构，比较两种结构。其结构受到最大干扰的氨基酸很可能是结合GAG的氨基酸。可对分子量低于20kDa的蛋白例如IL-4和PECAM-1的单个结构域进行NMR研究[Chuang等人，Biochem.39：3542-3555，2000]。

其他用于确定结合位点的方法包括使用这样的肽进行的结合的竞争抑制，该肽模拟靶蛋白内的推定的肝素结合序列。可通过肽合成或通过特定的内切蛋白酶或化学试剂例如溴化氰切割靶蛋白来产生这些肽。然后可通过反相HPLC[Conrad，1998，同上]纯化所述肽。可选择地，在某些条件下可将GAG和蛋白直接交联。在碳化二亚胺催化剂存在的情况下用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化糖醛酸的羧基。活化的GAG与靶蛋白结合。如果活化的GAG与蛋白(该蛋白的GAG结合位点在非常临近的范围内包含赖氨酸)结合，那么将发生共价交联[Lyon等人，J.Biol Chem.277(2)：1040-1046，2002]。可就修饰的位点检查HLGAG-蛋白复合物以说明蛋白内和GAG链交联的赖氨酸。可将这些赖氨酸在二维或三维蛋白模型上作图以确定其在蛋白上的位置，相对于其他碱性氨基酸(所述碱性氨基酸可能是对GAG结合有贡献的候选者)的位置。

因此，本发明提供了鉴定目的配体上的GAG结合区域的方法，所述方法包括获得配体的一个或多个变体形式以及将配体的所述变体形式和GAG分子的结合与野生型配体和相同GAG分子的结合相比较，其中和野生型变体与相同的GAG分子的结合相比，变体配体和该GAG分子之间的结合亲和力的降低表示配体的该变体形式在该配体的GAG结合位点中包含改变。

优选地，目的配体是蛋白，甚至更优选地，所述蛋白是细胞因子、白细胞介素、干扰素或可溶性的或细胞结合或病毒结合的受体。

如此处所用的，关于目的配体的术语“变体”是指结构上区别于或不同于野生型目的配体的配体分子的任何形式，该野生型配体是就结合亲与力和变体进行比较的配体。提供了本发明包括的结构变化的示例。优选地，配体是蛋白质性质的分子，在本方法的本实施方案中，“变体”配体包括这样的蛋白，相对该蛋白的野生型，其包含一个或多个氨基酸插入、缺失或置换。变体蛋白配体中的结构域插入、缺失或置换也可构成这些氨基酸置换。

本发明还扩展至配体上的位点和特别是GAG或其部分与之相互作用的线性或构象结构。

本发明还提供了GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子，所述GAG样寡糖、GAG样复合分子或非GAG或非GAG样分子结合肽、多肽或蛋白上的位点和GAG寡糖结合的位点相同。

通过下列非限定性实施例进一步描述本发明。

                      实施例1

来自大肠杆菌K5多聚体的DP4-DP20寡糖的文库的产生

大肠杆菌K5多聚体的长度的裁减

在各阶段中的一个阶段截短K5荚膜多糖：在天然的多糖上、去N-乙酰化的多糖上或硫酸化的多糖上。用于截短多糖的方法包括酶促、化学、热和超声波方案。(Alban和Franz，2001，同上)。

酶促截短

也可能在各阶段进行多糖的酶促截短。肝素酶III、肝素酶II和肝素酶I切割硫酸化的K5多糖，从而产生更低分子量的片段。肝素酶III将天然的K5多糖截短成想要的聚合长度(Nader等人，1999，同上)。β-D-葡糖醛酸糖苷酶和软骨素酶AC将降解天然的未修饰的K5多糖(Lidholt等人，1997，同上)。

酶促截短

化学截短

葡糖胺单位上的乙酰基的存在，在当其暴露于亚硝酸时，有效地保护该糖苷键免受切割。通过肼的介导选择性地除去N-乙酰基对本领域技术人员来说是熟知(Shaklee和Conrad，1986，同上；Shively和Conrad，1976，同上；和Shaklee和Conrad，1984，同上)。可能通过使用能够使葡糖胺残基的α糖苷键断裂的亚硝酸来截短葡糖胺-葡糖醛酸多聚体。通过改变反应条件，可能获得不同大小的衍生自K5的寡糖，使用大小排阻层析获得适当量的衍生自K5的DP4-DP20。

大肠杆菌K5寡糖/多糖的硫酸化

目标在于确定蛋白结合所需的硫酸化程度的初步研究已显示，一些非硫酸化区域可提高结合的特异性。为了实现对DP12寡糖的硫酸化程度的一些控制，使用受控肼解反应递送部分去N-乙酰化的多糖。在亚硝酸切割期间N-乙酰基的存在为相邻的糖苷键提供了保护作用，并且其不被硫酸化。因此，一些N-乙酰基的存在导致在整个寡糖中产生一些非硫酸化区域。

本领域技术人员知道用于选择性保护6-OH的方法，该保护从而使得能够选择性地硫酸化2和4位羟基。可选择地，6-O硫酸是最活跃的和最易水解的，从而提供了获得游离的6-OH的另一种方法。

此外，游离6-羟基的存在为将其他单糖、二糖或三糖附着至游离羟基，从而产生分枝结构提供了机会。已显示β-1，3硫酸葡聚糖的分枝版本展现出比对应的具有相同分子量和硫酸化程度的线性版本更高的抗凝活性(Alban和Franz，2001，同上)。这些附着的糖单位可以是硫酸化的或非硫酸化的、或磷酸化的或非磷酸化的。

R＝H、SO₃、PO₃ ^2-、糖部分、烷基、保护基团。

其他化学修饰

硫酸化K5，然后肼解，以除去NHAc(但保留O-硫酸化和N-硫酸化的完整性)，然后选择性N硫酸化，可用来产生与K5的去乙酰化后N和O-硫酸化不同的硫酸化模式。

                    实施例2

来自壳聚糖的DP4-DP20寡糖的文库的产生

裁减壳聚糖多糖的长度

酶促截短

使用壳多糖酶对壳多糖和壳聚糖的酶促降解是公知的[Horwitz等人，Chitin，Chitosan and related enzymes，Zikakis J.，(ed.)Academic Press，Orlando，F.L.(1984)]。

化学截短

壳多糖内葡糖胺单位上的乙酰基的存在，在当其暴露于亚硝酸时，有效地保护该糖苷键免受切割。通过肼的介导选择性地除去N-乙酰基是公知的方法(Shaklee和Conrad，1986，同上；Shively和Conrad，1976，同上；和Shaklee和Conrad，1984，同上)。

然后通过使用能够使硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和硫酸软骨素中的α糖苷键断裂的亚硝酸来截短葡糖胺多聚体。壳聚糖的糖苷键是β糖苷键，因此可产生不同于α糖苷键的反应性和断裂反应。然而，对截短的硫酸化壳聚糖片段已对此进行了描述(Terbojevich等人，1989，同上)。

壳聚糖多糖的硫酸化

已详尽地研究了壳聚糖类型的寡糖主链的化学硫酸化(Hirano等人，1985，同上)。首先通过过硫酸化寡糖，然后以类似于针对硫酸乙酰肝素和K5多糖的方式(Baumann等人，1998，同上)选择性地使某些位置去硫酸化来获得一些选择性。此外，通过使用铜(II)离子获得2-氨基和3-羟基的保护，从而使得能够选择性硫酸化6-OH(Terbojevich等人，1989，同上)。

目标在于确定蛋白结合所需的硫酸化程度的初步研究已显示，一些非硫酸化区域可提高结合的特异性。为了实现对DP12寡糖的硫酸化程度的一些控制，受控肼解产生部分去N-乙酰化的多糖。在亚硝酸切割期间，N-乙酰基的存在为相邻的糖苷键提供了保护作用，并且其不被硫酸化。因此，一些N-乙酰基的存在导致在整个寡糖上产生一些非硫酸化区域。

                      实施例3

                  GAG寡糖的磷酸化

6-O硫酸是最容易水解的O-硫酸，从而提供了获得游离6-OH的途径。然后磷酸化游离6-OH以产生6-O磷酸。已显示硫酸酯和磷酸酯在许多化合物中是等效的。也可能N磷酸化葡糖胺残基。

使用氨基磷酸酯氧化法(Vieira de Almeida等人，1999，同上；Dubreuil等人，1999，同上，此处引用作为参考)容易地获得对羟基的选择性磷酸化。该方法已广泛地用于形成磷酸肌醇、核苷酸和寡核苷酸。可选择地，可使用几种其他更快速的引入磷酸基团的方法，例如在吡啶存在的情况下使用磷酰基氯氧化物，然后再进行水解。也可能通过混杂的己糖激酶的作用酶促地磷酸化这些寡糖。

                       实施例4

            肝素和硫酸乙酰肝素寡糖的文库的制备

可通过许多方法部分消化HLGAG，所述方法包括用肝素酶的酶促消化和使用试剂例如亚硝酸的化学消化、碱性β-消除和氧化联合碱性解聚作用[Conrad，1998，同上]。肝素酶I和肝素酶III在肝素/硫酸乙酰肝素链上的特定位点进行切割：肝素酶I在N-硫酸化g1cN结构域中的IdoA残基处切割，肝素酶III在非硫酸化的N-乙酰G1cN结构域中的G1cA残基处切割。

按照Turnbull等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(6)：2698-2703，1999)描述的方法解聚硫酸乙酰肝素，按照Chai等人(Anal.Chem.70(10)：1998)描述的方法解聚肝素。简而言之，将肝素(5g)和白蛋白(4mg)溶解在50ml包含3mM CaCl₂的30mM CH₃CO₂Na中并用0.2M NaHCO₃将pH调节为7。加入肝素酶I，EC 4.2.2.7，(2 IU)，将混合物在30℃下温育16小时。将该混合物煮沸3分钟，等分至小体积(5ml)中，然后冷冻。融化等分，在注入(1ml)大小排阻层析系统之前进行离心和过滤。

在两个串联连接的90×1.5cm玻璃柱上进行SEC。用P6 fine装填第一根柱子，用P10 fine装填第二根柱子。使用Gilson model 307钛泵(Middleton，Wisconsin，USA)以0.25ml/分钟的流速用0.25MNaCl洗脱柱子，用Shimadzu RID-10折光率检测器(Melbourne，Victoria，Australia)监测流出物。使用Gilson Unipoint软件获得数据。图1显示代表性层析图。收集1ml的级分。汇集临近峰最大值的级分，进行冷冻干燥并在快速脱盐柱上脱盐。冻干已脱盐的片段，将其重新溶解在水中并在-20℃下贮存。使用5500mol^-1cm^-1的消光系数在232nm处在30mM HCl中通过分光光度计确定各片段的浓度。使用MALDI MS(见下文)证实寡糖的大小。

然后将均一糖数目的肝素和硫酸乙酰肝素片段的文库用于筛选测定法

                       实施例5

                       筛选测定

(1)BIAcore检测

该技术使用表面等离子共振(surface plasmon resonance)的光学现象来监测分子之间的物理相互作用。使蛋白溶液通过传感器表面(该表面偶联配体)来监测蛋白和固定的配体的实时结合。通过测量非常靠近传感器表面的折光率的改变来进行检测。当折光率改变时，等离子共振发生的角度改变，该改变直接和与表面相互作用的蛋白的量关联。BIAcore 2000使用方便。其非常灵敏，其微流控技术确保只需要少量的材料。

将HLGAG固定在生物传感芯片上。使用sulfo-NHS-生物素，通过氨基或还原性末端(该末端通过还原性胺化反应被氨修饰)来生物素化完整的HLGAG。将生物素化的HLGAG固定在偶联链霉抗生物素蛋白的传感芯片上。将包含目的蛋白的溶液注入传感芯片表面上，实时测量结合(Fernig，In：Proteoglycan protocols，Ed.R.V.Iozzo，Humana Press，Totowa，NJ，USA，2001)。本发明者已证明杆状病毒和大肠肝菌表达的人IL-4(rhIL-4)、杆状病毒表达的人IL-5(rhIL-5)、Cos-7细胞表达的人PECAM-1融合蛋白(flag-PECAM-1和PECAM-Fc)以及大肠杆菌表达的亲环蛋白A(CypA)容易地结合通过本方法固定的肝素(图2)。此外，有初步的证据显示IL-5受体链βc结合肝素。在所有情况下，结合是特异性的，因为极少有或没有缺乏肝素的传感芯片和任何被靶向的蛋白的相互作用，并且结合被外源肝素抑制。初步分析表明rhIL-5和肝素的结合具有从50-5×10^-9的数量级的亲和常数。因为来自不同组织的硫酸乙酰肝素中可变地存在未被取代的胺，所以为硫酸乙酰肝素芯片推荐另一备选的生物素标记的方法。在该情况下，使用生物素基-LC-肼通过氧化的顺式二醇残基标记硫酸乙酰肝素。

(2)滤膜结合测定法

在EDC存在的情况下通过糖醛酸的羧基、通过N-未取代的葡糖胺、或通过还原性末端，用报告分子标记HLGAG。将标记的HLGAG和目的蛋白混合，让其在硝酸纤维素96孔滤板中平衡。低速离心该混合物以过滤混合物。滤膜吸附蛋白或蛋白-GAG复合物，但不吸附单独的GAG。将标记的GAG重新溶解在含有2M NaCl的缓冲液中，使用合适的检测设备确定保留在小孔中的报告分子的量。使用肝素-报告分子的标准溶液确定各样品中的结合肝素的量。该方法已用于评估rhIL-4的肝素结合(图3)和用于其他目的蛋白。

                       实施例6

                      文库的筛选

使用BIAcore，就其分别抑制靶蛋白和肝素或硫酸乙酰肝素的结合的能力对均一糖数目的肝素和硫酸乙酰肝素寡糖的制剂进行检验(图4)。

在用报告分子标记之后，可使用滤膜试验、FRET或FP测定直接的寡糖结合。也可通过直接的还原性胺化作用将寡糖生物素化并将其固定在链霉抗生物素蛋白传感芯片上，以估量蛋白的结合(Delehedde，J.Biol.Chem.277：12456-12462，2002)。该方法已用于估量结合rhIL-4、PECAM-1和cypA所需的最短HLGAG长度(图5)。

该最初的筛选显示很好地结合靶蛋白的最小寡糖。通过强阴离子交换(SAX)层析(mini-Q柱和SMART系统)基于这些寡糖的硫酸化的模式对其进行分离。SMART HPLC系统对于该用途是理想的，因为其微流控技术确保非常高的分辨率和非常小的体积增加。再次就其结合靶蛋白的能力对产生的级分进行筛选。如果糖数目相同但硫酸化模式不同的片段具有不同的活性，那么得出，靶蛋白结合肝素/硫酸乙酰肝素链中的特定基序。将这些级分贮存在96孔阵列中以在其他筛选中进行检测。

                       实施例7

                   活性寡糖的表征

通过在用特定靶蛋白偶联的基质上进行亲和层析来富集活性寡糖以用于功能测定和用于进一步的结构分析。通过伯胺直接偶联，将大肠杆菌表达的rhIL-4固定到HiTrap NHS-活化的柱子上。在偶联前，通过和N-乙酰化肝素温育防止参与肝素结合的氨基酸和柱子反应。以相似的方式固定CypA。通过对rhIL-5的糖部分上的高碘酸氧化的顺式二醇将rhIL-5固定到AffiGel Hz支持物上。可以两种方式中的任一种方式固定PECAM-1，或可将其固定在载有抗flag标签抗体的柱子上。

将DP10大小的寡糖装载至磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的rhIL-4柱子上。用PBS洗涤与柱子结合的寡糖片段，用2M NaCl洗脱。将大小DP12的寡糖装载至hepes缓冲液(包含100mM NaCl、0.002％v/vTween 20和50M ZnSO₄)中的rhIL-5柱子上。用相同的但包含200mMNaCl的缓冲液洗涤与柱子结合的寡糖片段，用1M NaCl洗脱。汇集洗脱的寡糖以作进一步分析。使用类似的方法分离结合flag-PECAM-1或亲环蛋白A的寡糖片段。

如果需要，用水稀释洗脱的级分以将盐浓度减少至低于0.4M，通过阴离子交换层析法直接对其进行分析。Gilson(Middleton，Wisconsin，USA)色谱仪由2个307型肽泵、805型测压组件、811型肽动力搅拌器、215型自动取样机/级分收集器和151型UV检测仪组成。层析在Gilson Unipoint软件的控制下。使用250×4.5mmDionex(Sunnyvale，California，USA)Propac PA1柱，并在Eppendorf(Alltech Associates，Sydney，Australia)TC-40柱加热器中保持在40℃下。用从两种缓冲液形成的二元梯度以1.0mL/分钟洗脱柱子。缓冲液A是10mM被调节至pH7.0的Na₂HPO₄。缓冲液B是10mM Na₂HPO₄加2M NaCl，pH被调节至7.0。梯度最初为10％，进行3分钟，在6分钟时线性增加至40％，在75分钟时70％，在76分钟时100％，在此处保持4分钟。在注入之间平衡柱子7分钟。在232nm处监测流出物。在图6中将获得的和IL-4亲和柱结合的DP10级分的层析图和总DP10集库的层析图比较。在图7中将获得的和IL-5亲和柱结合的DP12级分的层析图和总DP12集库的层析图比较。

然后，通过制备型阴离子交换层析制备更多的寡糖。处理后，使用Venkataraman等人(Science 286(5439)：537-542，1999)描述的方法通过基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-TOF)分析级分。通过Auspep(Melbourne，Australia)将碱性肽(RG)₁₉R制备为三氟乙酸盐。向冰冷的50μM肽等分(100μL)中加入大约20mg氢氧化物形式的AG-1 X2阴离子交换树脂(Biorad，Sydney，Australia)。短暂离心所得的悬浮液并将其保持在冰浴中。将肽的等分(1μL)和50％v/v乙腈(8μL)中的10mg/mL咖啡酸以及5-100μM样品(1μL)混合，将1μL点在不锈钢样品板上并让其干燥。通过使用配有337nm氮激光的PerSeptive Biosystems(Applied Biosystems，Melbourne，Australia)Voyager reflectron飞行时间质谱仪以线性模式获得MALDI MS质谱。使用延迟extraction增加分辨率(22kV，栅极93％，导丝0.15％，脉冲迟延150ns，低质量门极2000，平均50shots)。通过用厂商提供的肽校准混合物进行外校准来获得质量校准。通过减去对该样品观察到的(RG)₁₉R肽的质量推导出寡糖的质量。

对层析图的A-C级分获得的质量表明存在包含9至13个，和可能更多个硫酸基团的寡糖。级分A的质谱显示于图8中。

                        实施例8

    活性寡糖对过敏性鼻炎和哮喘蛋白靶IL-5的功能分析

本发明人已显示肝素和某些硫酸乙酰肝素抑制IL-5反应性细胞系的增殖。该抑制以非常低的剂量发生并且不是由于HLGAG的毒性效应产生的，因为其他结构不同的硫酸乙酰肝素制剂在HLGAG和IL-5的相同浓度下增强IL-5反应性细胞系的增殖。此外，以和肝素相同的浓度使用的GAG-硫酸软骨素C对细胞增殖不具作用(图9)。使用IL-5反应性细胞TF-1.8和Ba/F-IL-5细胞的克隆进行这些实验。TF-1.8细胞是经选择以在IL-4或IL-5中生长的TF-1细胞的亚克隆。TF-1细胞最初是从患有严重的全血细胞减少症的男性的骨髓样品建立的。这些细胞的长期生长依赖于IL-3或GM-CSF，并且这些细胞对多种细胞因子包括IL-4有反应(但不对IL-5反应)。Ba/F-IL-5细胞由Ba/F3细胞系衍生。

通过用pGL3对照载体(Promega，USA)和pEE6hcmv-IL-5Rα共转染细胞使Ba/F3细胞系转化成既具IL-5依赖性又表达萤光素酶。对照载体，pGL3，表达在SV40启动子和增强子直接控制下的经修饰的萤光素酶，但其不包含选择标志物。为制备pEE6hcmv-hIL-5Rα，通过RT PCR从HL60细胞克隆全长人IL-5受体α链(hIL-5R-α)。已由Coombe等人(Coombe等人，Journal of Immunological Methods 215：145-150，1998)描述了Ba/F-IL-5细胞的制备。可通过用pPGK-嘌呤霉素-萤光素酶(其是包含在SV40启动子控制之下的萤光素酶、具有选择标志物嘌呤霉素的载体)进行共转染来进一步修饰Ba/F-IL-5细胞(Coombe等人，1998，同上)。

转染后，在3μg/ml嘌呤霉素中选择阳性转染子。然后克隆阳性转染子以产生具有良好萤光素酶表达的细胞系。在适合于增殖检测法的96孔微量板(Falcon)中进行该检测。该孔是平底的，具有白色的侧面和透明的底部。洗涤细胞以除去生长培养基中的任何细胞因子，然后重悬浮于RPMI/5％w/v FCS。用Coulter Multisizer(CoulterElectronics，England)计数细胞，常规地将1.6×10⁴细胞加入至不包含IL-5(阴性对照)或包含各种稀释度的IL-5的微量板小孔。当测量HLGAG、硫酸软骨素C、或特定长度的肝素级分、或特定长度和结构的肝素片段的作用时，小孔也包含各种浓度的这些分子。

在湿润的空气中在37℃下所述细胞增殖48小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.8、15mM MgSO4、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM萤光素钠、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％v/v Triton X-100)测量萤光素酶活性。在加入萤光素酶缓冲液后，立即就萤光素酶活性对板进行检测。在Victor 1420Multilabel计数器(Wallac，Turku，Finland)上检测光的发射。获得的数据类型的示例显示于图9。

通过使用这些检测法，已证明肝素片段的DP12集库抑制IL-5依赖性Ba/F-IL-5细胞增殖。更小的肝素片段，DP4和DP6，具有很少的或没有抑制IL-5依赖性Ba/F-IL-5细胞增殖的能力。此外，DP12集库内的不同结构表现出不同的抑制IL-5依赖性Ba/F-IL-5细胞增殖的能力(图10)。

也检测HLGAG和各种大小的肝素片段阻断荧光标记的IL-5与其受体结合的能力。就其阻断荧光标记的IL-5与其受体结合的能力检测可结合或不结合IL-5的特定大小的肝素片段级分。使用IL-5反应性细胞TF-1.8和Ba/F-IL-5进行这些实验。

因为肝素和肝素片段可能不直接阻断IL-5结合其受体，但可以干扰IL-5受体复合物形成和信号传导，所以检测肝素和肝素片段对IL-5结合其高亲和受体(IL-5受体α链(IL-5Rα))的能力的影响。简而言之，将IL-5Rα固定在BIAcore芯片上并确定IL-5结合其的能力。在任何肝素或GAG寡糖或GAG复合分子不存在的情况下和在各种浓度的肝素、或GAG寡糖和/或GAG复合分子存在的情况下测定IL-5结合。

为了全面了解寡糖对IL-5活性的影响，检查对IL-5起反应的原代细胞。通过CD16阴性选择方案从健康供体分离人外周血嗜酸性粒细胞。评估嗜酸性粒细胞活化的常用方法是监测其对固定的IgG的附着。和单独的IL-5相比，当IL-5和选择的寡糖、或和肝素或硫酸乙酰肝素一起呈现时，通过测量髓过氧化物酶的活性来确定结合固定的IgG的嗜酸性粒细胞的数量。在细胞因子不存在的情况下，分离自外周血的嗜酸性粒细胞存活不超过4天。在一系列细胞因子浓度下评估IL-5、IL-5和选择的寡糖或完整的HLGAG对嗜酸性粒细胞存活的相对能力。在碘化丙啶染色法后通过流式细胞仪确定嗜酸性粒细胞的存活。

                       实施例9

    活性寡糖对过敏性鼻炎和哮喘靶蛋白IL-4的功能分析

本发明者已显示肝素抑制IL-4反应性细胞系的增殖。该作用以非常低的剂量发生并且不是由于HLGAG的毒性作用产生的，因为其他结构不同的GAG，例如硫酸软骨素C，在IL-4和GAG相同的浓度下不具作用。这些实验使用TF-1.8细胞。TF-1.8细胞是经选择以在IL-4或IL-5中生长的TF-1细胞的亚克隆。TF-1细胞最早建立自患有严重全血细胞减少症的男性的骨髓样品。这些细胞的长期生长依赖于IL-3或GM-CSF并对多种细胞因子包括IL-4但不包括IL-5作出反应。

已用表达载体pPGK-嘌呤霉素-荧光酶素中包含的萤火虫萤光素酶基因转染TF-1.8细胞(Coombe等人，1998，同上)。克隆阳性转染子以产生具有良好萤光素酶表达的细胞系。在适合于增殖检测法的96孔微量培养板(Falcon)中进行该检测。该孔是平底的，具有白色的侧面和透明的底部。洗涤细胞以除去生长培养基中的任何细胞因子，然后重悬浮于RPMI/5％w/v FCS。用Coulter Multisizer(CoulterElectronics，England)计数细胞，常规地将2.5×10⁴细胞加入至没有包含IL-4(阴性对照)或包含各种稀释度的IL-4的微量培养板小孔。当要测量HLGAG、硫酸软骨素C、或特定长度的肝素级分、或特定长度和结构的肝素片段的作用时，小孔也包含各种浓度的这些分子。

在湿润的空气中在37℃下所述细胞增殖48小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.8、15mM MgSO₄、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM萤光素钠、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％v/v Triton X-100)测量萤光素酶活性。在加入萤光素酶缓冲液后，立即就萤光素酶活性对板进行检测。在Victor 1420Multilabel计数器(Wallac，Turku，Finland)上检测光的发射。获得的数据类型的示例显示于图11。

通过使用这一检测法，本发明者证明大小DP10的肝素片段产生良好的抑制活性，而小片段，DP4和DP6，显示具有很少的或没有抑制TF-1.8细胞的IL-5依赖性增殖的能力。使用该检测法证明DP10集库中结构不同的肝素片段具有不同的抑制TF-1.8细胞的IL-4依赖性增殖的能力。

在肝素、特定聚合程度的肝素片段和特定聚合程度及结构的肝素片段存在或不存在的情况下，测定荧光标记的IL-4结合其受体的能力。使用不同浓度的IL-4和肝素或肝素片段进行这些实验。和显示在抑制TF-1.8细胞的IL-4依赖性增殖上无活性的其他GAG例如硫酸软骨素C的比较，证明了广泛的特异性。聚合程度相同、结构不同的肝素片段例如DP10之间的比较证明，肝素片段的结构决定肝素片段是否能够抑制IL-4与其受体的相互作用。

                    实施例10

不同大小的肝素片段对IL-4和IL-5依赖性细胞增殖的影响

表1显示由肝素酶I消化产生的不同大小的肝素片段在其抑制IL-5和IL-4依赖性细胞增殖的能力上存在差异。数据表示为具有与0.4μM未消化的肝素等同的活性所需的各种肝素片段的浓度。

表1-肝素酶I产生的肝素片段的活性

肝素片段的大小	等同0.4μM肝素活性所需的肝素片段浓度
		活性概括-IL-5：DP4片段DP6片段DP8片段DP12片段	＞50μM＞50μM10μM2-4μM
活性概括-IL-4：DP4片段DP6片段DP8片段DP10片段DP12片段	＞50μM8μM4-8μM4μM0.3μM

                       实施例11

      活性寡糖对黑色素瘤蛋白靶PECAM-1的功能分析

本发明者已显示，作为融合蛋白(Flag-PECAM-1)表达的重组的人PECAM-1非常有效地结合黑色素瘤细胞表面，该结合通过黑色素瘤细胞表面硫酸乙酰肝素介导。融合蛋白由融合至Flag标签的PECAM-1细胞外结构域构成。如下进行和定量Flag-PECAM-1与黑色素瘤细胞表面的结合。使用A2058黑色素瘤细胞进行这些实验。HepSS-1单克隆抗体的结合的定量显示，这些细胞在其细胞表面具有大量的硫酸乙酰肝素。HepSS-1单克隆抗体识别硫酸乙酰肝素链中包含的硫酸化的表位(Kure和Yoshie，Journal of Immunology 137：3900-3908，1986)。为检测Flag-PECAM-1的结合，使用2.5mM在PBS中的EDTA收获A2058细胞，在包含150mM NaCl(Bistris缓冲液)和0.5％w/v BSA的10mMBistris(pH6.3)中洗涤和重悬细胞。用于各结合反应的细胞的数目是1×10⁵。在适合在流式细胞仪上使用的聚苯乙烯管中沉淀这些细胞，将60μg在Bistris缓冲液中的Flag-PECAM-1和所述细胞混合并在室温下进行结合1小时。然后使用Bistris缓冲液洗去过量的Flag-PECAM-1。

使用抗人PECAM-1多克隆抗体和FITC缀合的抗兔二抗检测结合的Flag-PECAM-1。使用Coulter EPICS XL流式细胞仪(CoulterElectronics，UK)确定荧光的水平。为进行抑制实验，在向细胞中加入前，向Flag-PECAM-1中加入250μg肝素溶液或硫酸软骨素C溶液。可通过滴定测出Flag-PECAM-1和A2058细胞的结合，肝素能够阻断结合，然而硫酸软骨素C无效。

肝素阻断Flag-PECAM-1结合的能力依赖于所用的肝素的浓度。已发现，在评估Flag-PECAM-1结合之前，用1milli国际单位的肝素酶III(Grampian Enzymes)在37℃处理A2058细胞30分钟显著地减少了结合的Flag-PECAM-1的量(图12)。类似地，用氯酸盐(硫酸腺苷酰转移酶的抑制剂，且因此抑制硫酸乙酰肝素链的硫酸化)处理A2058细胞显著地降低与细胞表面结合的Flag-PECAM-1的量。使用该检测法评估肝素寡糖对PECAM-1和黑色素瘤细胞结合的抑制。

对黑色素瘤细胞结合PECAM-1的抑制可能影响黑色素瘤细胞穿过毛细血管内皮(血细胞渗出)和影响循环中围绕黑色瘤细胞的保护性血小板聚集物的形成。内皮细胞和血小板都表达PECAM-1。血细胞渗出和血小板聚集对转移性疾病是至关重要的。已开发了利用生长在transwell小室的膜上的人脐静脉内皮细胞单层的血细胞渗出模型。将黑色素瘤细胞置于内皮单层上的上层室中，使用CyQuant assay试剂盒(Molecular Probes)对其进入低层室的迁移进行定量，在Victor1420 Multilabel计数器(Wallac，Turku，Finland)上读出荧光。通过将黑色素瘤细胞置于血小板单层上来检测黑色素瘤细胞和血小板的相互作用和通过显微镜检查其附着和扩散，在如其他人(Varon等人，Blood 91：500-507，1998)描述的细胞外基质上或在3-氨丙基三乙氧基硅烷包被的表面(Rainger等人，Thromb.Haemost.79：1177-1183，1998)上制备所述血小板单层。检测在流动的条件下黑色素瘤细胞和内皮细胞层的相互作用、血小板和内皮细胞层的相互作用以及黑色素瘤细胞和血小板的相互作用。设计流动条件以模拟血流的条件。评估寡糖在血细胞渗出模型中干扰黑色素瘤细胞迁移的能力和干扰黑色素瘤细胞和血小板的相互作用的能力。

                        实施例12

        活性寡糖对炎症蛋白靶PECAM-1的功能分析

本发明者制备了显示与单核细胞系U937的表面结合的荧光硫酸乙酰肝素复合物。使用该荧光硫酸乙酰肝素复合物和荧光肝素复合物结合外周血白细胞的表面。通过使用sulfo-NHS-LC-生物素对HLGAG进行生物素标记来制备这些复合物，所述sulfo-NHS-LC-生物素与沿着糖链分布的裸露的胺反应。将生物素标记的HLGAG以这样的比例和缀合AlexaFluor 488的链霉抗生物素蛋白反应，该比例可产生平均每个链霉抗生物素蛋白分子4个GAG链。通过凝胶过滤步骤从HLGAG-链霉抗生物素蛋白-AlexaFluor-488复合物(HLGAG复合物)中分离未整合的缀合AlexaFluor 488的链霉抗生物素蛋白。然后将所述复合物在室温下和2.5×10⁴细胞反应1小时，在用1％w/v多聚甲醛固定后，通过流式细胞仪测量荧光的水平。

使用U937细胞的实验已证明，硫酸乙酰肝素形式的复合物结合细胞表面，结合被游离的未标记的硫酸乙酰肝素阻断，但不被硫酸软骨素阻断。

当监测白细胞表达的PECAM-1对HLGAG复合物的结合的贡献时，在10mM Bistris(pH6.3)(包含150mM NaCl(Bistris缓冲液)和0.5％w/v BSA)中进行该测定法。评估多克隆抗PECAM-1抗体阻断结合的能力。类似地，将评估均一聚合程度的肝素片段和均一聚合程度的结构明确的肝素片段阻断复合物结合的能力。

已证明PECAM-1参与白细胞响应炎性刺激从而穿过内皮的迁移(Muller和Randolph，Journal of Leukocyte Biology 66：698-704，1999)。据信PECAM-PECAM相互作用参与该迁移。此外，已显示PECAM-1参与白细胞通过内皮细胞下面的基板的迁移。还未确定参与的PECAM-1配体。本发明者提出，基板中的硫酸乙酰肝素参与该PECAM-1依赖性迁移。此外，外源肝素或肝素片段与内皮细胞上或白细胞上的PECAM-1的结合可干扰PECAM-PECAM相互作用。

使用transwell测定法检测白细胞穿过内皮细胞层的迁移。将人脐静脉内皮细胞生长在transwell的上表面，使用CyQuant assay试剂盒(Molecular Probes)对白细胞穿过该细胞层进入底层室的迁移进行定量，在Victor 1420 Multilabel计数器(Wallac)上读出荧光。可用炎性细胞因子例如TNFα和IL-1β刺激内皮细胞，并可将趋化因子如N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)、RANTES(在激活时受调控的，正常T细胞表达和分泌的)、IL-8和其它加入至底层室以指导白细胞迁移。评估肝素和肝素片段抑制白细胞迁移穿过内皮细胞层的能力。也评估肝素和肝素片段阻断白细胞迁移穿过基板的能力。

在这些实验中，可将内皮细胞培养在胶原凝胶上并确定白细胞迁移入凝胶的水平，或可从胶原凝胶上剥离内皮细胞，从而暴露下层基板，检查白细胞的迁移。也可使用transwell测定法，在该测定法中，将内皮细胞培养在transwell的上表面，然后除去内皮细胞，从而使得能够监测白细胞直接通过基板的迁移。

                       实施例13

                       专用试剂

(1)寡糖标准

使用这些标准确定各寡糖片段中糖单位的数目。所述标准产生自肺乙酰肝素(几乎均一地IdoA2S-G1cN6S)。该肝素通过HNO₂(pH3)切割，硼氢化物还原，并分离成DP2至大约18的寡糖。

(2)IL-5和IL-4

使用杆状病毒表达系统制备重组人IL-4和IL-5。也在大肠杆菌表达系统中表达重组人IL-4。使用杆状病毒表达系统表达携带定点突变的重组人IL-4或IL-5。然后在HiTrap活化的NHS柱上通过亲和层析纯化所得的蛋白，该柱子用肼衍生并偶联识别IL-5的单克隆抗体H30或识别IL-4的单克隆抗体11B4。

(3)PECAM-1

通过对Cos-7细胞的瞬时转染来制备PECAM-1融合蛋白，flag-PECAM-1并通过在偶联抗flag标签的Sepharose柱子上的亲和层析纯化，其由融合至flag亲和标签的PECAM-1的细胞外结构域构成。此外，本发明人使用携带Flag-PECAM-1融合蛋白的截短形式的表达载体，该截短形式使得能够进行对PECAM-1的单个Ig样结构域的结合分析。

(4)亲环蛋白A

已通过RT-PCR从细胞克隆了亲环蛋白A，将DNA连接入大肠杆菌表达载体。将CypA表达入内含体，用6M尿素溶解，通过对稀释缓冲液进行充分透析来重折叠CypA。通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和大小排阻层析的组合从其他细菌蛋白中纯化重折叠的CypA。

(5)IL-3、IL-5和GM-CSF的共同受体β(βc)

通过对Cos-7细胞的瞬时转染来制备IL-3、IL-5和GM-CSF的共同受体β(βc)，并通过在偶联抗flag标签的Sepharose柱子上的亲和层析纯化其由融合至flag亲和标签的该受体的细胞外结构域构成。

                        实施例14

                          ELISA

原理

使用偶联至96孔塑料测定板的孔的肝素或肝素片段选择性地固定细胞因子或其他肝素结合蛋白。根据对于目的细胞因子或蛋白特异性的抗体的结合来确定被固定的蛋白的身份。发展了用于将完整肝素，但后来是肝素或乙酰肝素片段偶联至板上的方法学。

检查许多不同的方法以确定将肝素偶联至板上而不(a)减少肝素的蛋白结合活性、或(b)干扰蛋白特异性的抗体的检测的最好方法。在国际专利公开号WO03/01476中列出了用于将GAG和GAG样分子例如肝素偶联至固体基质的示例性方法，特别参见实施例4、5和6。此处引用该文献作为参考。用于将肝素偶联至固体基质上的方法的其他示例包括：

(1)将肝素和与三(十二烷基)甲基铵(TDMAC)复合，然后将该复合物吸附至板上。TDMAC的烃链与板形成强疏水性结合，留下铵部分和肝素形成了离子键。

(2)通过肝素的还原性末端将其固定至用甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(MMAC)包被的微量滴定板。使用己二酸二酰肼引入MMAC包被板的肼基提供了稳定地将肝素偶联至板的方法。使用还原性胺化使肼基与糖上的甲酰基反应。

(3)使用可聚合的阳离子脂质，二烯丙基(二油烯基)溴化铵(DADOA)通过离子复位作用固定肝素。DADOA由长链疏水性部分和具有双键的亲水头部构成，该双键使其能够聚合。肝素与DADOA形成离子复合物，该复合物通过疏水性结合保留在塑料表面上。

                     实施例15

                   口服活性肝素

一般说来，未通过口服施用肝素，因为其难以从胃肠道中吸收。然而，最近的数据[Money和York，Cardiovascular Surgery9：211-218，2001)已表明向肝素中加入有机化合物N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸酯(SNAC)显著地增加了其吸收。NMR数据表明肝素在靠近肝素链上的OH基团的点上与递送试剂相当非特异性地相互作用。肝素的口服递送将大大地扩展该药的用途，对于长期治疗尤其如此。

                      实施例16

              合成的肝素模拟物/类似物

已成功地生产了合成的肝素模拟物/类似物。该分子化学结构上的轻微变化已改变了和肝素类似物结合的蛋白。该发现肯定了本发明者的想法，即通过调整肝素类似物的化学结构，可能选择性地结合特定的蛋白。此外，合成的肝素类似物的活性明显地超过天然肝素的活性，再次肯定了本发明者的想法，即通过选择正确的结构，可能获得具有和天然肝素一样或更好的活性，同时具有减少的副作用。进行GAG复合结构的开发以促进与配体上的GAG结合位点的结合。然而这些复合结构具有低于天然肝素的副作用，例如和天然肝素相比，减少了对血小板因子IV的结合。

                        实施例17

                          IL-4

就对IL-4的结合能力对大小DP10的片段进行筛选。因为片段由肝素酶I消化产生，所以其在非还原末端含有不饱和性。此外，其中一些衍生的结构被特别高度地硫酸化。所述片段在活性上显示出分等级，在靶中可能存在对于结合不是严格必需的成分(即，硫酸)。使用三个靶，即：

靶1：

该结构(片段10.8.1.5)包含5个三硫酸化二糖的重复单位，即AUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₄。在图14中对其进行了示意性说明。

靶2：

该结构(片段10.7.2.4)包含4个三硫酸化二糖的重复单位，在还原性末端具有二硫酸化二糖，即ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₃-UAG1cNS6S。在图15中对其进行了示意性描述。

靶3：

该片段(10.9.1.2)包括下列4种可能的包含8O-硫酸和4N-硫酸的结构中的一个：

(1)ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S；

(2)ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS；

(3)ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S；

(4)ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S。

对于上面的靶1-3，“UA2S”是指2-O-硫酸-糖醛酸，“G1cNS6S”是指6-O-硫酸-N-硫酸葡糖胺，“G1cNAc6S”是指6-O-硫酸-N-乙酰葡糖胺。Δ是指“不饱和的”，从而ΔUA是指不饱和糖醛酸，在该情况下是酶促断裂的结果。

                      实施例18

                        IL-5

对结合IL-5的片段的关注集中在大小DP12的片段上。该片段在非还原性末端具有不饱和性。已在倒数第2集库中发现下列结构。活性的排列是12.8.3＞12.9.1～12.9.2＞12.9.4～12.9.3＞12.8.1～12.10.2＞12.2.3。

靶1：

级分12.8.3的主要组分是12.8.3.5+6，其是重复的三硫酸化二糖的序列，即△UA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₅，其中“UA2S”是指2-O-硫酸-糖醛酸，“G1cNS6S”是指6-O-硫酸-N-硫酸葡糖胺，而“G1cNAc6S”是指6-O-硫酸-N-乙酰葡糖胺。Δ表示“不饱和的”，因而ΔUA表示不饱和糖醛酸，在该情况下，其是酶促断裂的结果。在图16中示意性地描述了该结构。

大体上，剩下的序列与靶1相比较少被硫酸化，尽管各情况中的主要组分是三硫酸化二糖(≥50％)。这些序列内的共同基序是DP6亚序列UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S。

                      实施例19

由3-O-磺基转移晦-3产生的结构对于IL-5结合具有高度活性

硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶为硫酸乙酰肝素中的葡糖胺残基的3-O位加上了硫酸。硫酸乙酰肝素的3-O硫酸化在自然状态下是稀有的修饰，其组成硫酸乙酰肝素的生物合成途径的最后步骤。硫酸乙酰肝素生物合成酶，包括3-O-磺基转移酶，以许多不同的同种型存在，各同种型具有稍微不同的底物特异性并识别不同的单糖序列。称为3-O-磺基转移酶-3(3-OST-3)的同种型将硫酸转移至四糖UA2S-G1cNS-IdoA2S-G1cNH₂6S或UA2S-G1cNS-IdoA2S-G1cNH₂中N-未取代葡糖胺的3-O位置(Liu等人，J.Biol.Chem.274：38155-38162，1999)。鉴定了人3-OST-3和3’-磷酸腺苷5′-磷酸(PAP)以及四糖ΔUA2S-G1cNS6S-IdoA2S-G1cNS6S的三元复合物的晶体结构。由于3-OST-3活性的结果，该四糖的中心G1cNS6S被修饰成3-O-硫酸化(Moon等人，J.Biol.Chem.279：45185-45193，2002)，表明寡糖中的G1cNS单位也可被3-OST-3取代。扭船型构型中葡糖胺任一侧面连接IdoA2S似乎对3-OST-3的识别至关重要。

由3-OST-3修饰的硫酸乙酰肝素在抑制IL-5与固定在生物传感芯片上的肝素和硫酸乙酰肝素的结合极其有效。通过对硫酸乙酰肝素的肝素酶III断裂获得的和用该酶修饰的DP12片段具有相似的活性(图27和28)。这些图显示当IL-5(在含有20μM ZnSO₄的HEPES缓冲盐水中)在3-OST-3修饰的硫酸乙酰肝素或3-OST-3修饰的DP12存在或不存在的情况下通过固定的肝素时，使用BIAcore 2000获得的感应图。这些数据表明含有作为3-OST-3活性的结果产生的结构的寡糖远比不含有该修饰的硫酸乙酰肝素更容易结合IL-5，从而非常有效地抑制IL-5与肝素结合。根据公开的方法(Liu等人，1999同上)用3-OST-3修饰硫酸乙酰肝素和DP12硫酸乙酰肝素寡糖。简而言之，将由硫酸乙酰肝素(或硫酸乙酰肝素寡糖)、[³⁵S]PAPS、50mM MES pH7.0、2mM MnCl₂、1mM MgCl₂、牛血清白蛋白和1％v/v Triton X-100(v/v)组成的反应混合物在37℃温育1.5小时。通过加入2倍所得体积的终止缓冲液(50mM醋酸钠pH5.0、150mM NaCl、0.1％v/v Triton X-100、6M尿素和1mM EDTA)终止反应。通过DEAE层析，使用1M NaCl洗脱，分离[³⁵S]硫酸乙酰肝素或[³⁵S]硫酸乙酰肝素寡糖。将洗脱的材料对20mM碳酸氢铵进行透析，然后冷冻干燥。

                       实施例20

               IL-5上肝素结合位点的确定

使用以截短的形式表达的、或携带点突变的蛋白确定对于与肝素相互作用重要的氨基酸。按照所描述的方法纯化改变的蛋白和在所描述的HLGAG结合检测法中筛选。汇集合有影响肝素结合水平的氨基酸改变的蛋白，并在三维蛋白模型上进行作图。使用该方法，已显示rhIL-5上的几个氨基酸对于HLGAG结合非常重要。即，当将1μM溶液注射在肝素表面上时，组氨酸38、赖氨酸39、组氨酸41、赖氨酸84或赖氨酸85的突变都减少rhIL-5结合超过50％。在IL-5表面上，这些氨基酸相互之间全都定位十分靠近。然而，组氨酸38和组氨酸41可能是IL-5上锌结合位点的组分。锌是肝素结合IL-5所必需的，因此锌结合能力的丧失降低于肝素结合能力。这些氨基酸以间接的方式对肝素结合IL-5起作用，而氨基酸赖氨酸84和赖氨酸85是肝素结合位点的关键组分并直接与GAG链相互作用。对IL-5上的GAG结合位点有贡献的其他氨基酸包括K77、K70、R67、R90和R91。这些氨基酸在C螺旋和相邻的β折叠片的暴露表面上，该表面由一个IL-5单体的C-D环和另一个单体的A-B环组成(Milbum等人，Nature 363：172-176，1993)。因为IL-5是同型二聚体蛋白，所以在蛋白表面有两个相同的能潜在地与HLGAG相互作用的区域(图13)。

已显示CD环中带电荷的残基E88、E89、R90、R91和R92参与IL-5受体α链(IL-5Rα)的结合(Tavernier等人，Proc Natl Acad SciU SA 92：5194-8，1995；Wu等人，J Biol Chem 274：20479-88，1999)。有趣的是，R90似乎是IL-5Rα结合的关键性残基，暗示着其他带电荷的氨基酸起着提供一个净正电荷的静电平衡的作用(Wu等人，J BiolChem 274：20479-88，1999)。使用实施例8中描述的测定法确定肝素阻碍IL-5结合其受体的能力。肝素抑制IL-5依赖性细胞增殖(图9)的事实支持IL-5上的肝素结合位点与IL-5Rα的结合位点重叠的结论。异二聚体IL-5受体由IL-5Rα和βc(IL-3、IL-5和GM-CSF的受体共同的β链)组成。该受体不在细胞表面上预先形成，而是IL-5结合IL-5Rα并且该复合物与βc相互作用(Scibek等人，AnalBiochem 307：258-65，2002)。因此，干扰IL-5结合IL-5Rα也就干扰了功能性IL-5受体的形成，干扰了受体的信号传导。

                       实施例21

           PECAM-1上的肝素结合位点的确定

已使用以截短的形式表达的PECAM-1定位肝素结合结构域。

图18显示结合固定在生物传感芯片上的肝素的PECAM-1细胞外结构域的BIAcore曲线。阴性对照是PECAM-1结合葡聚糖芯片(无固定的肝素)。2.5μM肝素的加入显著地阻断了结合。在这些实验中，使用1μM纯化的PECAM-1。在FLAG表达系统中表达PECAM-1的细胞外结构域(1-6)，其中Flag-标签附着至蛋白的氨基末端，并且蛋白在结构域6的末端被截短。

为了确定PECAM-1的GAG结合区域，制备使用Flag表达系统和融合蛋白表达系统的各种PECAM-1构建体(参见图19)。在融合蛋白表达中，用人IgG1的Fc区域(即CH3和CD2结构域以及铰链区)融合PECAMl的细胞外结构域。已选择性地缺失各种细胞外结构域，表达和纯化所示的构建体。

使用这些蛋白的结合实验已显示肝素结合的PECAM-1结构域。使用两种检测法：其中将PECAM-1和已固定肝素的BIAcore生物传感芯片反应的检测法，第二种检测法是PECAM-1和细胞表面上的硫酸乙酰肝素的结合。

融合蛋白的BIAcore分析

图20显示PECAM-Fc融合蛋白和固定在生物传感芯片上的肝素的结合。在银染凝胶上显示蛋白的纯度。这些数据表明在结构域3中存在肝素结合区域，因为D1-Fc、D1-2-Fc不结合但D1-3-Fc确实结合。更长的构建体的结合动力学上的差异暗示着在结构域5-6中可能存在第二个肝素结合区域。

Flag表达系统蛋白的BIAcore分析

将各种Flag-PECAM-1结构域构建体和固定在BIAcore芯片上的肝素结合。BIAcore分析的结果显示于图21中。如图21的小图A中所示，尽管使用不同的肝素芯片，但很清楚的是Flag-D1-3很好地结合芯片，但Flag-F1-2不结合。比较图21中的小图A中显示的D1-D3的反应单位(RU)评分和小图B中的数据提示，尽管结构域3以其自身的能力结合，但当结构域2存在时会产生更好的结合。具体而言，小图A中显示的FlagD1-D3具有大约2000的RU评分，而小图B中显示的D1+D3具有大约425的RU评分。也存在包括结构域5和6的更弱的结合区域的证据。

调查外源加入的肝素对PECAM-1和肝素生物传感芯片的结合的影响。如图22中所示，2.5μM肝素的加入几乎完全抑制了Flag-构建体，D1+5-6、D1+4-6和D1-D3与肝素生物传感芯片的结合。

这些实验已显示在PECAM-1上似乎有两个肝素结合区域。一个结合区域需要PECAM-1 Ig样结构域3，而另一个区域位于近膜结构域，最可能在PECAM-1 Ig样结构域5和/或6中。

PECAM-1蛋白与细胞表面的结合

Flag表达系统中表达的PECAM-1细胞外结构域(1-6)结合A2058黑素瘤细胞的表面。如通过HepSS-1抗体所证明的，A2058黑素瘤细胞表达显著水平的硫酸乙酰肝素。通过抗PECAM-1多克隆抗体和FITC标记的二抗检测PECAM-1，通过流式细胞仪对其进行定量。

图12中提供的数据表明PECAM-1是通过细胞表面硫酸乙酰肝素结合这些细胞的，因为在加入PECAM-1之前用肝素酶III处理所述细胞将减少结合(小图B)。对细胞的氯酸盐处理也消除PECAM-1结合(小图A)。氯酸盐是ATP硫酸化酶的抑制剂，从而抑制了PAPS的产生，PAPS是磺基转移酶的活性供体。因此，用氯酸盐处理细胞使得在其表面上不具有正确硫酸化的硫酸乙酰肝素。这表明PECAM-1识别由细胞表面上表达的硫酸乙酰肝素展示的硫酸。

图23显示Flag-PECAM-1细胞外结构域结合A2058细胞。图24中显示的数据表明D1-D6和D1-D3可结合肝素芯片，而D1-D2不结合。此外，已证明外源肝素可抑制D1-D6以及D1-D3蛋白的结合。这些数据进一步支持了观点，即用于肝素结合的PECAM-1的至关重要的结构域是结构域3。

                      实施例22

             IL-4上的肝素结合位点的确定

图24显示野生型IL-4结合固定在生物传感芯片上的肝素的BIAcore结合曲线。显示了许多不同浓度的IL-4。亲和常数的计算显示了5-10nM范围内的估计KD。

对IL-4进行定点诱变。将提出的肝素结合位点中的碱性残基改变成丙氨酸和使用杆状病毒表达系统表达该蛋白。一个例外是R88，其被改变为缬氨酸。在抗IL-4亲和柱上纯化昆虫细胞表达的蛋白，并通过SDS-PAGE和银染检查其纯度。就其结合固定在生物传感芯片上的肝素的能力检查突变的IL-4蛋白，使用BIAcore 2000评估结合。这些结果，表示为和以相同浓度的野生型IL-4相比相对结合的百分比，显示于图25。这些数据表明R75、K77、R81、R84、R85和R88是IL-4上的肝素结合位点的部分-该数据符合我们的分子建模预测。

也值得注意的是E60A突变体显示了增加的结合肝素的能力。这可能是因为除去了靠近或存在于结合区域中的酸性残基，由此产生更有利于肝素结合的带电区域而造成的。相同的解释也适用于D87A突变体。

图26显示肝素五糖(其由三硫酸化二糖(Ido2SG1cNS6S)的重复构成)结合IL-4的分子模型。显示了20个最佳结合位置。已展现了蛋白的螺旋结构，以空间结构模型标示据认为对肝素结合位点有贡献的氨基酸。结合位点的建模非常符合从定点诱变研究获得的数据。

在IL-4中，具有两个长末端对末端环的螺旋(A、B、C、D)是反向平行和并列的，环AB和CD通过位于和螺旋B和D相对的短β折叠连接。高亲和受体链IL-4Rα的结合位点位于螺旋A和C上，主要的结合决定子是E9和R88(Wang等人，Proc Natl Acad Sci USA 94：1657-62，1997)。然而低亲和受体链γc和IL-13Rα1的结合位点位于螺旋A和D上。E9和R88对IL-4与IL-4Rα的结合的非常大的贡献是因为E9和R88的相互作用侧链都被较小的决定子的壳包围。围绕E9的疏水性壳由IL-4残基I5、K12、T13和N89以及IL-4Rα上的一组残基构成，而围绕R88的壳由IL-4上的R53、Y56和W91与IL-4Rα上的对应的一组残基构成(Mueller等人，Biochim Biophys Acta 1592：237-50，2002)。人IL-4的螺旋AC面由于几个碱性残基即K12、R53、R75、K77、R81、K84、R85和R88的原因而具有大正电荷。相反地，IL-4Rα上的结合区域包含系列酸性残基。据认为该电荷互补性操控着IL-4至IL-4Rα上的缔合，结果缔合速度常数非常高(Mueller等人，同上)。我们的来自定点诱变研究的数据(图25和26)表明IL-4上的肝素结合位点确实与参与结合IL-4Rα的位点重叠。该结论受到证明肝素抑制IL-4依赖性细胞增殖(图11)的生物学数据支持。

                  实施例23

                 IL-4-肝素结合的动力学

IL-4-肝素结合的动力学表明K77和R88的关键作用(表2)。R85A产生比野生型(WT)更强的结合，表明体积大的精氨酸可能抑制结合。R81和R84对于结合似乎也是重要的，有来自K61和R53作出的贡献。除去酸性残基D87和E60增加结合。对于E9也是如此，但程度相对较低。R75不朝向这一面-R75A的增加的KD可能归因于其他至关重要的氨基酸的改变的朝向。

包含C螺旋和相邻的B螺旋的部分的浅沟描绘了IL-4上的肝素结合位点。

本领域技术人员认识到除了明确描述的以外，此处描述的发明容易进行改变或修改。应当理解本发明包括所有这些变化和修改。本发明也包括在本说明书中个别或一起提到或说明的所有步骤、特征、组合物和化合物，和所述步骤或特征的任何两个或多个的任何和所有组合。

表2

IL-4结合的动力学

	动力学
				ka	kd	KD(nM)
	WT	5.68E+04	2.88E-03				52.7
E9A				1.72E+05	8.45E-03	49.3
	K12A	5.03E+04	3.95E-03				78.5
K21A				4.86E+04	2.53E-03	52.1
	K42A	4.63E+04	2.50E-03				53.9
R53A				5.83E+04	5.40E-03	92.5
	E60A	8.44E+04	2.76E-03				32.7
K61A				4.96E+04	3.99E-03	80.5
	H74A	2.05E+04	6.37E-04				31.1
R75A				3.32E+04	3.63E-03	109
	K77A	6.42E+03	2.24E-03				349
R81A				2.43E+04	2.37E-03	97.8
	K84A	3.06E+04	2.57E-03				83.9
R85A				1.04E+05	2.42E-03	23.4
	D87A	4.42E+04	1.59E-03				36
R88V				1.05E+04	3.92E-03	372
	R121A	5.13E+04	2.13E-03				41.5
K77A/K12A				1.65E+04	3.44E-03	209
	K77A/R53A	1.79E+04	3.08E-03				172
K77A/R81A				9.82E+03	1.55E-03	158
	K77A/K84A	1.26E+04	2.23E-03				176
K77A/R85A				1.51E+04	1.78E-03	117
	K77A/R88V	1.36E+04	1.94E-03				142

就其支持TF1.8细胞的增殖的能力将IL-4突变体与WT进行比较。绘制各突变体的滴定曲线，确定支持50％的细胞生长所需的浓度。

在受试的突变体中，E9A和R88V具有显著降低的增殖活性。少数其他的突变体也具有轻微减少的增殖活性，特别是R53A和R81A以及可能地K84A。尽管所有突变体既结合多克隆又结合单克隆抗IL-4抗体，但仍可能有一些构象差异。E60A可能属于该范畴。

除了E60A外，已知显示减少的活性的所有突变体都对IL-4受体α(IL-4Rα)结合位点具有贡献。IL-4Rα结合的关键性残基是E9和R88，但这些残基被也作出贡献的较小决定子的壳包围(Mueller等人Biochim.Biophys.Acta 1592：237-250，2002)。

在本专利的第87页第15-20行描述了IL-4Rα结合位点，我们的数据(表3)符合已公开的数据。

               表3

TF1.8生物测定
			50％生长所需的浓度
	ng/ml
				平均	标准偏差
IL4wt	0.99	0.22
			E9A	76.1	26.7
K12A	0.6	0.21
			K21A	1.36	0.18
K42A	0.67	0.25
			R53A	9.39	0.87
E60A	19.37	3.09
			K61A	2.4	0.57
R75A	0.63	0.13
			K77A	1.55	0.37
R81A	4.85	1.25
			K84A	2.95	0
R85A	0.71	0.23
			R88V	415	87
R121A	1.01	0.34
			K77A/K84A	1.69	0.56
K77A/R53A	11.3	1.04
			K77A/R81A	1.65	0.25

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Claims (57)

1.具有下式的GAG寡糖：

₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]    (I)

或GAG样寡糖、GAG样复合物或式(I)的GAG寡糖的化学类似物、同源物或直向同源物；

其中：

A是寡糖、二糖或单糖单体单位，包含糖，例如但不限于，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式；

B可以与A相同或是包含葡糖胺残基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙酰化的形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的单体单位；

其中单体单位A和B通过糖苷键连接；

_i[A-B]是相同或不同的A-B二糖构建部件，i表示从一端开始测量的沿着链排列的二糖的位置，其中i是整数，1≤i≤n；

_n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖构建部件，n表示在_i[A-B]的相反末端的构建部件；和

n是从大约2至大约10，其表示重复A-B单位的链的长度；

条件是₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]不是全长HLGAG分子；

其中所述GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合物或其类似物、同源物或直向同源物结合配体，所述配体选自：βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1、-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体。

2.权利要求1的GAG寡糖，其中寡糖[A-B]_n附加选自A和B的单个糖以产生选自[A-B]_n-A和B-[A-B]_n的寡糖。

3.权利要求1的GAG寡糖，其中B具有一个或多个附着至6位的羟基的单糖、二糖或三糖单位，从而产生分枝的结构，其中所述糖单位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

4.权利要求1的GAG寡糖，其中A是葡糖胺，一个或多个A具有附着至羟基的单糖、二糖或三糖单位，从而产生分枝的结构；且其中所述糖单位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

5.权利要求1的GAG寡糖，其中寡糖具有这样的末端糖，该末端糖是4-脱氧-L-苏型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸或通过用亚硝酸处理产生的葡糖胺的衍生物。

6.权利要求5的GAG寡糖，其中所述末端糖选自2，5-脱水-D-甘露醇、2，5-脱水-D-甘露糖和其衍生物。

7.权利要求1或5或6的GAG寡糖，其中任一个或两个末端糖或其衍生物可以是中性的、带电荷的、亲水性的或疏水性的。

8.权利要求7的GAG寡糖，其中电荷是正的、负的或两性离子的。

9.权利要求1的GAG寡糖，其中配体选自IL-4、IL-5、PECAM-1、gp120、亲环蛋白A、βc和IL-4。

10.具有选自以下的通式的GAG样复合分子：

(_lP-_mX)_q-_q+1P    (II)和

(_lX-_mP)_q-_q+1X    (III)

或式(II)或式(III)的分子的化学类似物、同源物或直向同源物；

其中X是由以下通式定义的分子：

₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]    (I)

或式(I)的GAG寡糖的GAG样寡糖、GAG样化学类似物、同源物或直向同源物；

其中：

A是寡糖或单糖单体单位，包含糖，例如但不限于，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式；

B可以与A相同或是包含葡糖胺残基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙酰化的形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的单体单位；

其中单体单位A和B通过糖苷键连接；

_i[A-B]是相同或不同的A-B二糖构建部件，i表示从一端开始测量的沿着链排列的二糖的位置，其中i是整数，1≤i≤n；

_n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖构建部件，n表示在₁[A-B]的相反末端的构建部件；和

n是从大约2至大约10，其表示重复A-B单位的链的长度；

或GAG样寡糖、GAG样复合物或其化学类似物、同源物或直向同源物；

条件是₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]不是全长HLGAG分子；

P是肽、多肽或蛋白、化学部分、饱和或不饱和脂肪酸、脂、树状分子、糖、多元醇、葡聚糖、聚乙二醇或分枝或不分枝的、饱和的或不饱和的烃链或柔性接头；

l和m是整数，如l，m=1…q；

q是整数，1≤q≤9；

其中所述GAG寡糖、GAG样寡糖、GAG样复合物或类似物、同源物或直向同源物结合配体，该配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体。

11.权利要求10的GAG样复合分子，其中复合分子附加单个_mX或_lP部分以产生选自(_lP-_mX)_q+1或(_lX-_mP)_q+1的复合分子，其中l和m是整数，例如l，m＝1…q+1。

12.权利要求10的GAG样复合分子，其中X中的B具有一个或多个附着至羟基的单糖、二糖或三糖单位，从而产生分枝的结构；其中所述糖单位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

13.权利要求10的GAG样复合分子，其中X中的A是葡糖胺，A具有一个或多个附着至羟基的单糖、二糖或三糖单位，从而产生分枝结构；其中所述糖单位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

14.权利要求10的GAG样复合分子，其中X中的_i[A-B]具有这样的末端糖，该末端糖是4-脱氧-L-苏型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸或通过用亚硝酸处理产生的葡糖胺的衍生物。

15.权利要求14的GAG样复合分子，其中所述末端糖选自2，5-脱水-D-甘露醇、2，5-脱水-D-甘露糖和其衍生物。

16.权利要求10的GAG样复合分子，其中配体是IL-4、IL-5、βc、亲环蛋白A或PECAM-1。

17.用于产生和鉴定与配体相互作用的GAG寡糖的方法，该配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体，所述方法包括对GAG多糖或者GAG多糖或具有非GAG主链的GAG多糖的群体的水解作用以及下列步骤中至少一个步骤：

(i)    去乙酰化；

(ii)   硫酸化；

(iii)  去硫酸化；

(iv)   磷酸化；

(v)    侧链的附着；

然后就其与所述配体相互作用的能力对产生的各GAG寡糖进行筛选。

18.权利要求17的方法，其中多糖是大肠杆菌K5多糖。

19.权利要求17的方法，其中多糖是壳多糖。

20.权利要求17的方法，其中多糖是壳聚糖。

21.用于产生和鉴定与配体相互作用的GAG复合分子的方法，所述配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体，所述方法包括合成或构建包含由接头结构或接头连接的两个或更多个高度带电荷的二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖或八糖或其组合的复合结构，然后就其与所述配体相互作用的能力筛选所产生的各GAG复合分子。

22.权利要求21的方法，其中一个或多个所述高度带电荷的二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖或八糖是硫酸化的。

23.权利要求22的方法，其中一个或多个所述高度带电荷的二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖或八糖是磷酸化的。

24.权利要求21的方法，其中所述接头结构是烷基链。

25.权利要求21的方法，其中所述接头结构是多元醇。

26.权利要求21的方法，其中所述接头结构是葡聚糖链。

27.权利要求21的方法，其中所述接头结构是肽。

28.权利要求21的方法，其中所述接头结构是聚乙二醇。

29.权利要求21的方法，其中配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体。

30.产生和鉴定与配体相互作用的GAG寡糖的方法，所述配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体，所述方法包括对HLGAG或HLGAG的群体的大小分级分离，然后就与所述配体相互作用的能力对各级分进行筛选。

31.一种HLGAG级分，其包含下式：

₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]-....-_n[A-B]    (I)

或GAG样寡糖、GAG样复合物或式(I)的化学类似物、同源物或直向同源物；

其中：

A是寡糖、二糖或单糖单体单位，包含糖，例如但不限于，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、庚酮糖、戊糖或其硫酸化形式；

B可以与A相同或是包含葡糖胺残基、葡糖胺衍生物和/或其硫酸化和/或磷酸化的形式和/或其乙酰化的形式或包含甲基、乙基、丙基或丁基的烷基醚衍生物的单体单位；

其中单体单位A和B通过糖苷键连接；

_i[A-B]是相同或不同的A-B二糖构建部件，i表示从一端开始测量的沿着链排列的二糖的位置，其中i是整数，1≤i≤n；

_n[A-B]是相同的或不同的A-B二糖构建部件，n表示在₁[A-B]的相反末端的构建部件；和

n是从大约2至大约10，其表示重复A-B单位的链的长度；

条件是₁[A-B]-₂[A-B]-....-_i[A-B]....-_n[A-B]不是全长HLGAG分子。

32.权利要求31的方法，其中B包含附着至羟基的单糖、二糖或三糖单位，从而产生分枝的结构；其中所述糖单位是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

33.权利要求31的方法，其中A是葡糖胺，A包含附着至羟基的单糖、二糖或三糖单位，从而产生分枝的结构；其中所述糖单位可以是硫酸化的、非硫酸化的、磷酸化的或非磷酸化的。

34.权利要求31的方法，其中A和B相同。

35.权利要求31的方法，其中_i[A-B]具有4-脱氧-L-苏型-己-4-烯并吡喃糖基糖醛酸作为末端糖。

36.权利要求31的方法，其中_n[A-B]具有选自2，5-脱水-D-甘露醇、2，5-脱水-D-甘露糖和其衍生物的末端糖。

37.权利要求31的方法，其中通过凝胶过滤柱进行大小分级分离。

38.权利要求31的方法，其中，通过将所述GAG寡糖与配体混合并就对该配体与固定化的HLGAG结合的抑制进行筛选来鉴定与该配体相互作用的GAG寡糖。

39.权利要求31的方法，其中通过滤膜结合试验鉴定与配体相互作用的GAG寡糖或GAG复合分子，该试验包括将用报告分子标记的GAG寡糖或GAG复合分子与配体混合，将混合物通过能够保留配体的滤膜，就保留在滤膜上的报告分子的存在进行筛选，报告分子存在表示配体和GAG寡糖或GAG复合分子之间形成复合物。

40.权利要求39的方法，其中所述报告分子是荧光染料。

41.权利要求30或31的方法，其还包括将经鉴定为与配体相互作用的GAG寡糖经阴离子交换柱通过，以确定该级分中不同结构实体的数目。

42.与配体相互作用的GAG寡糖，其通过权利要求31的方法产生。

43.在受治疗者中治疗疾病状况的方法，所述疾病状况由所述宿主中细胞表面上的HLGAG与配体之间的相互作用造成，所述配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体，所述方法包括给所述受治疗者施用有效量的药物，所述药物包含权利要求1的GAG寡糖或权利要求10的GAG复合物。

44.权利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG复合物分子具有抗炎活性。

45.权利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG复合物分子具有抗转移活性。

46.权利要求1至16中任一项的GAG寡糖或GAG复合物分子，所述GAG寡糖或GAG复合物分子具有抗病毒活性。

47.权利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG复合物分子具有抗哮喘活性。

48.权利要求43的方法，其中所述GAG寡糖或GAG复合物分子具有抗过敏性鼻炎活性。

49.鉴定配体上的GAG结合区域的方法，该配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体，所述方法包括获得一种或多种该配体的变体形式，以及将该配体的所述变体形式和GAG分子的结合与该配体的非变体形式和相同的GAG分子的结合进行比较，其中与非变体配体和GAG分子的结合相比，变体配体和相同的GAG分子之间的结合亲和力的降低表示配体的该变体形式包含该配体的GAG结合位点的改变。

50.权利要求48的方法，其中配体选自βc、亲环蛋白A、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、BDNF、CNTF、EGF、EPO、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、LIF、MCP1、MCP2、KC、MCP3、MCP4、MCP5、M-CSF、MIP1、MIP2、NGF、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、OSM、PBP、PBSF、PDGF、PECAM-1、PF4、RANTES、SCF、TGFα、TGFβ₁、TGFβ₂、TGFβ₃、TNFα、TNFβ、TPO、VEGF、GH、趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子-1，-2或-3)；或可溶性受体或细胞结合或病毒结合的受体，gp120。

51.权利要求48或49的方法，其中配体的所述变体形式包含一个或多个氨基酸插入、缺失或置换。

52.权利要求48至49中任一项的方法，其中使用表面等离子共振生物传感器测量GAG与配体的结合。

53.权利要求1的GAG寡糖或权利要求10的GAG样复合分子，其结合IL-5上的一个或多个残基，所述残基选自R32、R67、K70、K76、K77、K83、K84、K85、E88、E89、R90、R91和R92。

54.权利要求53的GAG寡糖或GAG样复合分子，其中所述GAG寡糖或GAG样复合分子包含糖结构ΔUA2SGlcNS6S-(UA2SGlcNS6S)5或和ΔUA2SGlcNS6S-(UA2SGlcNS6S)₅一样结合IL-5上的相同位点的其类似物、同源物或直向同源物。

55.权利要求1的GAG寡糖或权利要求10的GAG样复合分子，其中所述GAG寡糖或GAG样复合分子与IL-4上的一个或多个残基相互作用，所述残基选自E9、K12、R53、E60、K61、H74、R75、K77、Q78、R81、R84、R85、D87和/或R88。

56.权利要求54的GAG寡糖或GAG样复合分子，其中所述GAG寡糖或GAG样复合分子包含糖结构，所述糖结构选自：

ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)₄、ΔUA2SG1cNS6S-(UA2SG1cNS6S)3-UAG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS、ΔUA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、ΔUA2SG1cNS-UA2SG1cNS6S-UA2SG1cNS6S-UAG1cNAc6S-UA2SG1cNS6S、和与上述糖结构一样结合IL-4上的相同位点的其类似物、同源物或直向同源物。

57.组合物，其包含以下物质中的一种或多种：

(i)  权利要求1的GAG寡糖；

(ii) 权利要求10的GAG样复合分子，

和一种或多种药物可接受载体或稀释剂。

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