JP2016519188A

JP2016519188A - 末端２，５−脱水タロース又はその誘導体を含んでなる低分子量グリコサミノグリカン誘導体

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Publication number: JP2016519188A
Application number: JP2016506758A
Authority: JP
Inventors: 趙金華; 呉明一; 高娜; 李姿; ▲らい▼森森; 趙龍岩
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2016-06-30
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: EP2985298A4; WO2014166282A1; US20160060364A1; CN103214591A; US10494452B2; EP2985298A1; CA2908959C; JP6248179B2; EP2985298B1; CN103214591B; CA2908959A1

Abstract

【課題】血栓性疾患の予防及び／又は治療における前記薬物組成物に使用可能な低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の提供を目的とする。【解決手段】この目的を達成するため、低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩であって、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の構成単糖として、ヘキスロン酸、ヘキソサミン、デオキシヘキソース、及び２，５−脱水タロース又はその還元誘導体を含むものを採用する。【選択図】図７

Description

本発明は、医薬品の技術分野に属し、具体的には、末端２，５−脱水タロース又はその誘導体を含む低分子量グリコサミノグリカン誘導体（２，５−ａｎｈｙｄｒａｔｅｄＴａｌｏｓｅｔｅｒｍｉｎａｌＬｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔＦｕｃｏｓｙｌａｔｅｄＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ａＴＦＧ）、該低分子量グリコサミノグリカン誘導体の製造方法、該低分子量グリコサミノグリカン誘導体を含んでなる薬物組成物、並びに、心臓・脳血管疾患の予防薬及び／又は治療薬の製造における前記薬物組成物の用途に関する。

心臓・脳血管疾患は、罹患率、障害発生率、死亡率及び再発症率が高く、合併症を誘発する場合も多く、人々の健康と生活の質を大いに脅かしている。心臓・脳血管疾患を誘発する主要病因として血栓形成が挙げられ、抗凝固薬物を含む抗血栓薬物は、心血管疾患の臨床治療において第一選択薬になっており、医薬品市場において極めて重要な位置を占める。抗凝血薬物として、主にクマリン系及びヘパリン系の抗凝固薬物を挙げられ、これらの薬物は、確実な薬効及び薬理学的特性を示すが、その反面、臨床応用において明らかな欠点を抱えている。例えば、クマリン系抗凝固薬物は、一連の凝固因子の合成を阻害するため、重篤の出血症を引き起こす虞があると共に、薬効の遅延や個体差が大きい等といった欠点がある。また、ヘパリン系薬物は、その主要標的である第ＩＩａ因子と第Ｘａ因子（ｆ．ＩＩａ，ｆ．Ｘａ）が血液凝固カスケードの共通経路に位置するため、これらの薬物を使用する際にその標的に関連して重度の出血危険性及び血小板減少症等を引き起こす虞がある。したがって、臨床現場から優れた薬効・薬理作用を示す新規抗凝固薬物への期待が高まっている。新規抗凝固薬物を開発する際の主要課題が出血リスクを確実に減らすことであるが、出血リスクが低い新薬の研究開発においては、未だに画期的な進展がみられていない。

棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカン（ＦｕｃｏｓｙｌａｔｅｄＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ＦＧＡＧ）は、フコースの側鎖置換を有するグリコサミノグリカン系誘導体であり、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とからなるコンドロイチン硫酸に類似した主鎖を有すると共に、α−１，３グリコシド結合を介して主鎖のグルクロン酸基に結合するフコース（Ｌ−Ｆｕｃ）側鎖を有し、主鎖及び側鎖の糖環におけるヒドロキシ基が何れも一定の程度で硫酸エステル化されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２３９７３〜２３９８４．Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ，２０１３，１１：３９９〜４１７）。また、天然由来のＦＧＡＧは、非常に高い抗凝固活性を示している（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２００８、１００：４２０〜４２８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２３９７３〜２３９８４）。

ところで、天然ＦＧＡＧは、血小板の凝集を誘発し、出血傾向を増やし、或いは第ＸＩＩ因子の活性化を促進する等といった広範囲でありながら一見矛盾した薬理作用を示している（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ，１９８８，５９：４３２〜４３４．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９７，６５（４）：３６９〜３７３．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２０１０，１０３：９９４〜１００４）。そこで、適宜に解重合した低重合度ＦＧＡＧが開発され、低重合度ＦＧＡＧは、天然ＦＧＡＧの抗凝固活性を保ち、一方で血小板活性化に対する促進活性を低減した（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９１，６５：３６９〜３７３）。例えば、中国特許第１０１７２４０８６Ｂ号及び第１０１７３５３３６Ｂ号に低重合度ＦＧＡＧの製造方法が開示され、過酸化水素で処理することによってＦＧＡＧを解重合して低重合度産物を得て、得られた産物の出血傾向が著しく低下した。

ＦＧＡＧは、分子量が比較的大きく、複雑な構造を有するグリコサミノグリカン誘導体であるため、副作用を減らしつつ薬理活性を保持する前提で効果的に制御することのできる解重合方法を確立し、よって、特徴的な末端構造を有する低分子量誘導体を得ることは、技術面から言って相当難度がある。過酸化水素処理による解重合法がグリコシド結合の選択性に欠け且つプロセスの制御が複雑であるため、本発明において新たなＦＧＡＧ解重合方法、すなわち、脱アセチル化・脱アミノ化による解重合法（以下、「脱アセチル化・脱アミノ化解重合法」とも称する）を開発した。本発明の方法によれば、まず、ヒドラジン分解による脱アセチル化反応を経てＦＧＡＧに含まれるＤ−２−（Ｎ−アセチル）−アミノ−２−デオキシガラクトース（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）を部分的に脱アセチル化し、Ｄ−２−アミノ−２−デオキシガラクトース基（Ｄ−ＧａｌＮＨ_２）を含むＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物を取得し、その後、亜硝酸で処理することにより脱アミノ化解重合反応を起こさせ、末端２，５−脱水タロース残基又はその還元誘導体を含むＦＧＡＧ解重合産物を得ることができる。従来の技術においては未だにＦＧＡＧの脱アセチルー脱アミノによる解重合法についての開示がなく、末端２，５−脱水タロース又はその還元誘導体を有する低分子量フコシル化グリコサミノグリカンについての開示も無い。

上述した従来技術に存在する問題に鑑み、本発明は、低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を提供することを目的とし、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、末端２，５−脱水タロース又はその還元誘導体を含む低分子量フコシル化グリコサミノグリカン（２，５−ａｎｈｙｄｒａｔｅｄＴａｌｏｓｅｏｒｉｔｓｒｅｄｕｃｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｔｅｒｍｉｎａｌＬｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔＦｕｃｏｓｙｌａｔｅｄＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ａＴＦＧ）である。ついでに、本発明は、更に前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の製造方法、前記分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を含んでなる薬物組成物、並びに、心臓・脳血管疾患の予防薬及び／又は治療薬の製造における前記薬物組成物の用途の提供を目的とする。

本発明において、上述の目的を達成するため、以下に列挙した発明を採用する。

低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩であって、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の構成単糖として、ヘキスロン酸、ヘキソサミン、デオキシヘキソース及び２，５−脱水タロース又はその還元誘導体を含むものである。そして、ヘキスロン酸としては、Ｄ−β−グルクロン酸を用いることが好ましい。ヘキソサミンとしては、２−Ｎ−アセチルアミノ−２−デオキシ−Ｄ−β−ガラクトース、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−β−ガラクトース、又は−β−Ｄ−２−硫酸アミノ−２−デオキシガラクトースを用いることが好ましい。デオキシヘキソースとしては、Ｌ−α−フコースを用いることが好ましい。２，５−脱水タロース還元誘導体としては、２，５−脱水タリトール、２，５−脱水タロサミン、Ν−置換の２，５−脱水タロサミンを用いることが好ましい。

前記ａＴＦＧの構成単糖の含有量比は、モル比でヘキスロン酸：ヘキソサミン：デオキシヘキソース＝１：（１±０．３５）：（１±０．３）の範囲であり、２，５−脱水タロース及び／又はその還元誘導体は、モル比で構成単糖総量において３．０％以上を占めることが好ましい。

本発明に係るａＴＦＧの重量平均分子量Ｍｗは、２．５ｋＤ〜２０ｋＤの範囲であることが好ましい。

本発明に係るａＴＦＧの多分散指数（Ｍｎ／Ｍｗ）は、１．０〜１．８の範囲にあることが好ましい。

本発明に係るａＴＦＧは、下記式（Ｉ）に示す構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物であることが好ましい。

［式（Ｉ）中、ｎは、平均値が３〜２１の整数であり、
−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−β１−は、−β−Ｄ−グルクロン酸−１−イルであり、
−Ｄ−ＧａｌＮ−β１−は、−β−Ｄ−２−アセチルアミノ−２−デオキシガラクトース−１−イル、−β−Ｄ−２−アミノ−２−デオキシガラクトース、又は−β−Ｄ−２−硫酸アミノ−２−デオキシガラクトースであり、
Ｌ−Ｆｕｃ−α１−は、α−Ｌ−フコース−１−イルであり、
Ｒ’は、各々独立して−ＯＨ、又は−ＯＳＯ_３ ⁻であり、
Ｒ_３は、−Ｈ、−ＯＳ_３ ⁻、又はアセチルであり、
Ｒ_１は、−Ｈ、又はβ−Ｄ−２−アセチルアミノ−２−デオキシガラクトース硫酸エステル−１−イルであり、
Ｒ_２は、−Ｈ、又は−β−Ｄ−グルクロン酸−１−イル、又は下記式（ＩＩ）で表される官能基である。

式（ＩＩ）中、−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−β１−、Ｌ−Ｆｕｃ−α１−、Ｒ’は、上記と同じであり、
ａｎＴａｌは、２，５−脱水タロース、その糖アルコール、糖アミン又はＮ−置換の糖アミンであり、
ｍは、１又は２であり、
Ｒ_４は、＝Ｏ、−Ｏ、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ_５から随意に選ばれ、そのうち、Ｒ_５は、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状又は分岐状アルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アリールである。
また、前記式（Ｉ）の構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物において、Ｒ_２が式（ＩＩ）で表される官能基である化合物とＲ_２が−Ｈ又は−β−Ｄ−グルクロン酸−１−イルである化合物との比がモル比で２：１以上である。］

本発明に係るａＴＦＧの分子量は、高速ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を利用して測定することができる。本発明において、好ましくは、ａＴＦＧの分子量が重量平均分子量で約２，５００〜２０，００００の範囲であり、すなわち、式（Ｉ）に示す同族体のｎの平均値が約３〜２１であり、分子量が約５，０００〜１２，０００Ｄａであることがより好ましく、すなわち、式（Ｉ）に示す同族体のｎの平均値が約５〜１５であることがより好ましい。

本発明に係るａＴＦＧの多分散指数（ＰＤＩ、重量平均分子量と数平均分子量との比、Ｍｗ／Ｍｎ）は、通常、１．０〜１．８の範囲にある。好ましくは、ａＴＦＧのＰＤＩは、１．１〜１．５の範囲にある。

本発明に係るａＴＦＧとして、その薬学的に許容可能なアルカリ金属、アルカリ土類金属等の塩であってもよく、同様に、前記ａＴＦＧとして、それ自体とアルカリ性の有機官能基によって形成されるエステルであってもよい。

本発明に係るａＴＦＧの薬学的に許容可能な塩は、ａＴＦＧのナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩であることが好ましい。

本発明に係るａＴＦＧは、棘皮動物門ナマコ綱動物の体壁及び／又は内臓から抽出したフコシル化グリコサミノグリカン（ＦｕｃｏｓｙｌａｔｅｄＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ＦＧＡＧ）の脱アミノ化解重合産物であり、若しくは、前記解重合産物の還元性末端を還元することにより誘導体化した産物である。したがって、本発明のもう１つの目的は、ＦＧＡＧを原料して本発明のａＴＦＧを製造する方法を提供し、前記ａＴＦＧの製造方法は、以下のステップを含んでなる。

ステップ１：棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカン（ＦＧＡＧ）をヒドラジンで処理し、そこに含まれるヘキソサミン（ＧａｌＮＡｃ）を部分的に脱アセチル化してＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物を取得し、得られた脱アセチル化産物は、スルホン化反応を経て遊離アミノ基をスルホン化して硫酸化アミノ誘導体を得る。

ステップ２：ステップ１で得られたＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物を亜硝酸で処理し、脱アミノ化反応を起こさせて解重合し、還元性末端が２，５−脱水タロース残基である低分子量フコシル化グリコサミノグリカンを取得し、得られた低分子量フコシル化グリコサミノグリカンについては、任意に２，５−脱水タロース末端基を糖アルコール、糖アミン又はＮ−置換の糖アミンに還元する還元性末端の還元処理を施すことができ、前記末端２，５−脱水タロース残基又はその糖アルコール、糖アミン、Ｎ−置換の糖アミンを有する低分子量フコシル化グリコサミノグリカンは、つまり、本発明に係るａＴＦＧである。

本発明に係るａＴＦＧの製造方法において、ステップ１でのヒドラジン処理による脱アセチル化反応は、棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンを無水ヒドラジン又はヒドラジン水和物の溶液に投入し、触媒の存在下又は非存在下において、攪拌しながら７５℃〜１２５℃の温度範囲で２〜１４時間反応することにより行われる。

ステップ１における脱アセチル化反応は、触媒存在下で行われるのが好ましく、前記触媒として硫酸ヒドラジン、塩酸ヒドラジン等を選ぶことができ、若しくは反応溶媒に少量で硫酸及び／又は塩酸等の強酸を加えて触媒としてもよく、加えた硫酸及び／又は塩酸は、溶媒であるヒドラジン又はヒドラジン水和物と反応して硫酸ヒドラジン及び／又は塩酸ヒドラジンを生成し、反応を促進する効果を奏することができる。本発明の好適な実施形態において、前記反応溶液における触媒の濃度は、０．５％〜２．５％の範囲である。

ステップ１の脱アセチル化反応が終了した後、反応溶液を減圧下で留去してもよく、若しくは等体積の８０％エタノールを加えて産物を沈降させるアルコール沈降法を採用してもよい。アルコール沈降時に適量の飽和塩化ナトリウム溶液を加え、更に完全に沈降させることもできる。上記処理により得られたＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物は、そのまま乾燥した後にステップ２の脱アミノ化解重合反応に用いることができ、若しくはヨウ素酸を用いて酸化することにより過量のヒドラジン及びアシルヒドラジン誘導体を除去した後、適宜な方法で精製、乾燥してステップ２の脱アミノ化解重合反応に用いてもよい。

ステップ１で得られたＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物については、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を用いて脱アセチル化度を測定することができる。具体的には、脱アセチル化度の測定として、原料化合物と産物におけるＤ−ＧａｌＮＡｃとＬ−Ｆｕｃに含まれるメチル基のプロトンピークの面積比を比較し、該メチルピークの積分比から反応産物の脱アセチル化度を算出する。

ステップ２の脱アミノ化解重合が迅速であり且つ化学量論的性質を示す反応であるため、脱アミノ化解重合して得られる最終産物ａＴＦＧの分子量は、ステップ１で得られるＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物の脱アセチル化度によって決められる。本発明者らの研究から、ステップ１で得られたＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物の脱アセチル化度が約５％〜３５％である場合、脱アミノ化解重合により得られる最終産物ａＴＦＧの分子量は、約４０００Ｄａ〜２００００Ｄａの範囲であることが確認できた。

本発明に係るａＴＦＧ製造方法のステップ２において、前記亜硝酸処理による脱アミノ化解重合法は、具体的に言うと、氷浴又は室温の条件下において、ステップ１で得られたＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物をｐＨ１．５〜４．５の亜硝酸溶液（４〜６ｍｏｌ／Ｌ）で５分間〜６０分間処理した後、ＮａＯＨ等のアルカリ性溶液でｐＨ８又はそれ以上に調整して反応を中止させ、その後、随意に以下の処理を施すことを含んでなる。

（１）反応溶液に３〜５倍体積のエタノールを加え、静置、遠心して沈降物を得た後、産物を限外濾過又はクロマトグラフィーで精製する。

（２）水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて、反応産物の還元性末端２，５−脱水タロース（ａｎＴａｌ）を糖アルコール（ａｎＴａｌＯＨ）に還元し、その後、上記（１）に記載のステップに従って産物を精製する。

（３）還元的アミノ化反応により反応産物の還元性末端２，５−脱水タロースを糖アミン又はＮ−置換の糖アミンに還元し、その後、上記（１）に記載のステップに従って産物を精製する。

ステップ２の処理（２）で述べた末端基の還元反応は、通常、水酸化ナトリウムでｐＨ８〜９に調整して脱アミノ化解重合反応を中止させた後、水素化ホウ素ナトリウム及び／又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えて濃度が０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌとなるようにし、５０℃で２０分間〜６０分間攪拌してａｎＴａｌを完全にａｎＴａｌＯＨに変換することにより行われる。その後、反応液を室温に冷却し、酸でｐＨ３〜４に調整して過量の水素化ホウ素ナトリウム及び／又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムを除去し、更にＮａＯＨ等のアルカリ性溶液で中和した後、上記（１）に記載のステップに従って産物を精製することができる。

ステップ２の処理（３）は、炭酸水素アンモニウム又は有機アミン、及び還元剤の存在下で末端ａｎＴａｌを還元アミノ化し、すなわち、アンモニウム塩又は有機アミンとａｎＴａｌのアルデヒド基とを反応させてシッフ塩基とした後、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下で第２級アミンに還元することにより行われる。

本発明により得られたａＴＦＧ産物は、ＮＭＲ法を利用して検出することができる。通常、産物のＮＭＲスペクトルに基づいて検出することができ、本発明に係るａＴＦＧ産物において、末端２，５−脱水タロース又はその還元誘導体を有する化合物は、モル比で解重合産物全体の６０％〜９７％を占める。

本発明において、Ｄ−ＧａｌＮＡｃの脱アセチル化、Ｄ−ＧａｌＮＡｃの脱アミノ化、及びａｎＴａｌカルボニル基の還元と還元的アミノ化は、下記化３に示す「反応路線図」のとおりに行われる。該反応路線において、各化合物（１）〜（５）におけるＲ’、Ｒ_５は何れも上記と同じである。当業者からすれば、還元的アミノ化反応を利用することにより、Ｒ_５がＨ、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状又は分岐状アルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アリールである場合、該路線図における化合物（５）で表される最終産物を得ることは容易である。

プロトタイプの天然産物ＦＧＡＧは、主鎖及び側鎖の構造が複雑であり、選択的な脱アセチル化を効果的に実現することが技術面から言って困難である。また、側鎖のＬ−Ｆｕｃが酸によって加水分解し易いため、ＨＮＯ_２処理により脱アミノ化解重合反応を行う際、反応条件の制御が特に重要である。しかし、本発明に係る技術路線及びパラメーターを用いることで、これらの反応がスムーズに行われる。

本発明に係る方法おいて、前記ａＴＦＧ反応最終産物は、当分野で周知の方法を利用して精製することができ（例えば、中国特許公開第１０１７３５３３６Ａ号に記載の方法）、例えば、透析法又は限外濾過法を用いて低分子塩等の不純物を除去し、ゲルクロマトグラフィー又はＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー等を利用して更に精製することができる。

本発明に係る方法おいて、前記透析により不純物を除去する際、標的分子量に合わせて適宜な分画分子量を有する透析膜又は限外濾過膜カセットを選ぶことができ、分画分子量が１０００Ｄａの透析膜又は限外濾過膜カセットを用いて透析することで低分子物質を除去するのが好ましく、また、透析時間については特定の処理条件に合わせて定めるものであり、６時間以上にするのが一般的である。透析する際、他の分子量の大きい不純物、及び未解重合のＦＧＡＧや所定分子量範囲を超えたａＴＦＧを除去する手法を採用してもよい。

本発明に係る方法により得られたａＴＦＧ最終産物は、更にカチオン交換により、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩等の単塩形態にすることができる。本発明に係るａＴＦＧ産物を塩に変換する際、イオン交換法を利用して前記ａＴＦＧを水素型に変え、その後、相応の塩基で中和してａＴＦＧ塩にすることができる。また、動的イオン交換を介してカラム上で直接に塩へ変換することもできる。樹脂カラムの前処理、サンプルの注入及び溶出は、何れも慣用の方法を利用することができる。

本発明に係るａＴＦＧの製造方法において、ステップ１で言う出発原料が棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカン（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ＦＧＡＧ）である。前記ＦＧＡＧは、コンドロイチン硫酸に類似した主鎖を有し、該主鎖は、通常、グルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＵＡ）と２−（Ｎ−アセチル）−アミノ−２−デオキシガラクトース（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）とからなり、２種類の構成単糖が「−４）−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−（β−１−」と「−３）−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−（β−１−」のグリコシド結合を介して順に連結されて構成される。ＦＧＡＧは、更にフコース（Ｌ−Ｆｕｃ）側鎖を有し、Ｌ−Ｆｕｃ側鎖がα−１，３グリコシド結合を介して主鎖のＤ−ＧｌｃＵＡに結合する。なお、ＦＧＡＧ主鎖のＤ−ＧａｌＮＡｃと側鎖のＬ−Ｆｕｃ糖残基におけるヒドロキシ基は、度合いが異なるものの、硫酸によってエステル化される（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２３９７３〜２３９８４．Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ，２０１３，１１：３９９〜４１７）。

本発明に係るａＴＦＧ又はその薬学的に許容可能な塩を製造する際、出発原料であるＦＧＡＧの由来については特に限定がなく、以下のナマコ品種、すなわち、タマナマコ（ＳｔｉｃｈｏｐｕｓｖａｒｉｅｇａｔｅｓＳｅｍｐｅｒ）、ハネジナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｓｃａｂｒａＪａｅｇｅｒ）、ニセクロナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａＢｒａｎｄｔ）、アカミシキリ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｅｄｕｌｉｓＬｅｓｓｏｎ）、ジャノメナマコ（ＢｏｈａｄｓｃｈｉａａｒｇｕｓＪａｅｇｅｒ）、シカクナマコ（ＳｔｉｃｈｏｐｕｓｃｈｌｏｒｏｎｏｔｕｓＢｒａｎｄｔ）、チュウカナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｓｉｎｉｃａＬｉａｏ）、バイカナマコ（ＴｈｅｌｅｎｏｔａａｎａｎａｓＪａｅｇｅｒ）、イモナマコモドキ（ＡｃａｕｄｉｎａｍｏｌｐａｄｉｏｉｄｅｓＳｅｍｐｅｒ）、クロエリナマコ（ＰｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａｇｒａｅｆｆｅｉＳｅｍｐｅｒ）及びイシナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｎｏｂｉｌｉｓＳｅｌｅｎｋａ）から選ぶことができる。本発明において、上述の構造特性を有するＦＧＡＧを得ることができる限り、世界各地産のナマコ品種を使用することができ、本発明の方法に従って脱アミノ化し、解重合して必要とされる最終産物を得ることができる。したがって、本発明の方法は、特定のナマコ品種に制限されない。

ナマコ品種及び組織材料が異なるとか、抽出方法が異なるとかでＦＧＡＧの単糖組成比、側鎖の存在形態、及び多糖の硫酸化度合い等に一定の差異が見られるが、当業者であれば、これらの差異がＦＧＡＧに存在するアセチルアミノ基の構造特性に影響がなく、本発明に係る脱アセチル化・脱アミノ化解重合方法の実施と適用にも影響がないと理解できる。

本発明者が鋭意研究を重ねた結果、前記ａＴＦＧが高い抗凝固活性を示し、人コントロール血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を倍増するときの薬物濃度１２ｇ／ｍＬ以下であると共に、第Ｘ因子活性化複合体に対しても強い阻害活性を示し、ＥＣ_５０が約５〜５０ｎｇ／ｍＬであることを見いだした。第Ｘ因子活性化複合体が内因系凝固カスケードの最下流に位置する標的サイトであるため、様々な要因によって血液凝固が誘発される際に律速因子として機能し、よって、その阻害剤が顕著な抗血栓活性を示し、一方で生理的な止血については殆ど影響がない（Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６（２２），４３９０〜４３９１．Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，３０９２〜３１００）。

本発明に係るａＴＦＧ又はその薬学的に許容可能な塩は、確実な抗凝固活性を示し、明確な薬用価値があると考えられる。また、ａＴＦＧは、良好な水溶性を示すため、溶液製剤や凍結乾燥粉体にすることが容易である。多糖類成分を経口投与する場合の生体利用度に限界があるため、その薬物組成物を非経口投与製剤の形態にするのが好ましく、製剤化にあたって当分野で慣用の技術手段を利用することができる。

したがって、本発明は、更に抗凝固効果を示す有効量で上記低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩と、賦形剤とを含んでなる薬物組成物を提供し、前記薬物組成物の形態として、注射用水溶液であってもよく、注射用凍結乾燥粉体であってもよい。

本発明に係るａＴＦＧは、抗凝固活性が高く、例えば、血栓性心血管疾患、血栓性脳血管疾患、肺静脈血栓、末梢静脈血栓、深部静脈血栓症、末梢動脈血栓等、症状が異なる血栓症の予防と治療に適用可能である。したがって、本発明は、更に前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体（ａＴＦＧ）、その薬学的に許容可能な塩、及び該ａＴＦＧ又はその塩を含んでなる薬物組成物の、血栓性疾患を予防、治療するための薬物の製造における用途を提供する。ここで、前記血栓性疾患とは、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害を指す。

従来の技術に比べて、本発明は、以下の長所がある。

現在報告されているＦＧＡＧ解重合法は、主に過酸化水素を用いる解重合法である。しかし、該解重合法は、グリコシド結合の選択性に欠け且つ反応プロセスの制御が複雑である。本発明において、新たなＦＧＡＧ解重合法、つまり、脱アセチル化・脱アミノ化解重合法を確立し、該方法は、まず、ヒドラジン分解による脱アセチル化反応を介してＦＧＡＧに含まれるＤ−２−（Ｎ−アセチル）−アミノ−２−デオキシガラクトース（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）を部分的に脱アセチル化させ、Ｄ−２−アミノ−２−デオキシガラクトース残基（Ｄ−ＧａｌＮＨ_２）を含むＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物を取得し、その後、亜硝酸処理により脱アミノ化解重合反応を起こさせて末端２，５−脱水タロース残基又はその還元誘導体を含むＦＧＡＧ解重合産物を得る。当業者であれば、ＦＧＡＧの複雑な化学構造、特に、側鎖にフコース（Ｆｕｃ）置換基が大量に存在するため、ＦＧＡＧに含まれるＧａｌＮＡｃのアミノ基を選択的に取り除くことが技術に困難であり、また、Ｆｕｃ側鎖が酸性条件下で分解しやすいため、部分的に脱アセチル化したＦＧＡＧを酸性条件下で脱アミノ化することも技術面からして相当難度があると容易に理解できる。そこで、本発明において、複雑な構造を有するＦＧＡＧの脱アミノ化解重合法を確立することにより、初めて特徴的な末端構造を有する誘導体を得ることに成功し、並びに、初めて末端２，５−脱水タロース残基又はその還元誘導体を含むＦＧＡＧ解重合産物を得た。

本発明に係る方法及び該方法により得られる産物は、以下の長所がある。すなわち、１）ＦＧＡＧの脱アセチル化・脱アミノ化解重合反応は、グリコシド結合に対して選択性を示し、Ｌ−Ｆｕｃ（α１−）及びＤ−ＧｌｃＵＡ（β１−）グリコシド結合を分解することなく、選択的にＤ−ＧａｌＮＨ_２（β１−）グリコシド結合のみを分解し、得られた解重合産物がより優れた均質性を有する。２）ＦＧＡＧの脱アセチル化・脱アミノ化解重合産物は、特徴的な２，５−脱水タロース（２，５−ａｎｈｙｄｒａｔｅｄＴａｌｏｓｅ，ａｎＴａｌ）又はその還元誘導体の末端を有し、特徴的末端の存在により解重合産物の化学構造解析及び解重合産物の品質管理が便利となり、且つ末端を還元して誘導体化にすることで薬物動態学及び薬理作用機構の解析等が便利である。３）部分的に脱アセチル化したＦＧＡＧをＨＮＯ_２で処理する場合、化学量論的性質を示す脱アミノ化解重合反応を起こすため、脱アセチル化度を調整して解重合産物の分子量範囲を調整することが可能となり、ＦＧＡＧ解重合産物の製造プロセスを効果的に監視、制御することができる。

ＦＧＡＧ及びその脱アセチル化産物ｄＡＦＧ−１及びｄＡＦＧ−２の^１ＨＮＭＲスペクトルである。ＦＧＡＧ及びその脱アセチル化産物ｄＡＦＧ−１及びｄＡＦＧ−２の^１３ＣＮＭＲスペクトルである。ＦＧＡＧ及びその脱アセチル化・脱アミノ化解重合産物ａＴＦＧ−ａ、ａＴＦＧ−ｂ及びａＴＦＧ−ｃの^１ＨＮＭＲスペクトルである。ＦＧＡＧ及びその脱アセチル化・脱アミノ化解重合産物ａＴＦＧ−ａ、ａＴＦＧ−ｂ及びａＴＦＧ−ｃの^１３ＣＮＭＲスペクトルである。ＦＧＡＧ及びその脱アセチル化・脱アミノ化解重合産物ａＴＦＧ−ａ、ａＴＦＧ−ｂのＣＯＳＹ（Ａ）、ＮＯＥＳＹ（Ｂ）、ＴＯＣＳＹ（Ｃ）スペクトルの重ね合せ（局部）図である。ＦＧＡＧ（Ａ）及びその脱アセチル化・脱アミノ化解重合産物ａＴＦＧ−ｂ（Ｂ）の^１ＨＣＯＳＹスペクトルを比較する図である。第Ｘ因子活性化複合体に対するａＴＦＧの阻害活性を示す図である。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の権利範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。

＜ＦＧＡＧの脱アセチル化産物（ｄＡＦＧ）の製造＞
１．１材料
ＦＧＡＧは、バイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａａｎａｎａｓ）の体壁から抽出したフコシル化グリコサミノグリカンであり、ＭａｒｉｎｅＤｒｕｇｓ，２０１３，１１，３９９〜４１７）に記載の方法に従って抽出、精製し、分子量が６９，９３０Ｄａであった。ヒドラジン水和物、硫酸ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、塩酸、塩化ナトリウム、無水エタノール、ヨウ素酸、ヨウ化水素酸及び水酸化ナトリウム等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。

１．２方法
脱アセチル化反応：６０ｍｇのＦＧＡＧ原料を精確に秤量して反応チューブに入れ、触媒として硫酸ヒドラジン１４．５ｍｇ又は塩酸ヒドラジン１２．２ｍｇ又は２．３０４ｍｏｌ／Ｌの塩酸０．１ｍＬを添加し、或いは触媒無添加の条件下において、ヒドラジン水和物又は無水ヒドラジン１．４５ｍＬを加え、窒素雰囲気、２５０ｒｐｍの回転速度で攪拌しながら７５〜１０５℃で２〜１４時間加熱して反応させた。反応終了後、反応液に８０％エタノールを加えて沈降処理を行い、遠心して沈降物を得た。次に、減圧下で真空乾燥し、脱アセチル化した中間体サンプルを得た。該サンプルをそのまま亜硝酸で処理して解重合することができ、或いは更に精製して純度の比較的高い中間体を得ることができる。その際の処理方法として、溶液を完全に留去したサンプルを氷浴で冷却させた後、０．２５ｍｏｌ／Ｌのヨウ素酸溶液を滴下し、沈降物が溶解せずに黒い懸濁液となるまでに滴下を続けた。４５％のヨウ化水素酸約５ｍＬを滴下した後、更に３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを加えて沈降物を溶解させ、溶液が透明又は淡黄色の溶液となるまで滴下し続けた。該溶液のｐＨを中性に調整し、分画分子量が１，０００Ｄの透析バッグで透析し、凍結乾燥した。

脱アセチル化度の測定：約５ｍｇの上記脱アセチル化産物を精確に秤量して重水約６００ｍＬ（内部標準物としてＴＳＰを含む）に溶かし、ＢＵＣＫＥＲＤＲＸ−５００核磁気共鳴分光装置を用いてサンプルを測定した。脱アセチル化度（ｄｅｇｒｅｅｏｆｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ，ＤＤ）は、１ＨＮＭＲスペクトルにおける２種類メチル基のプロトンピーク（Ｎ−アセチルガラクトサミンのアセチルアミノ基におけるメチル基、及び硫酸フコース側鎖におけるメチル基）の積分比により算出した。

分子量の測定：高速ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を用いて産物の分子量を測定した。測定条件として、アジレント・テクノロジー社製の１２００シリーズ高速液体クロマトグラフ装置、ＳｈｏｄｅｘＯｈｐａｋＳＢ−８０４ＨＱ（７．８ｍｍｘ３００ｍｍ）カラムを用い、カラム温度が３５℃であり、検出装置としてＧ１３６２Ａ型の示差屈折計を用いた。適量のサンプルを精確に秤量し、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を加えて溶解した後、１０ｍＬ容量フラスコを用いて希釈し、均一に混ぜ合わせてから４０μｍの濾過膜で濾過し、濾液を測定用試料とした。

標準品溶液及びコントロール溶液の調製：コントロールとして、分子量既知のデキストランを精確に秤量し、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液でそれぞれ濃度が１０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、精確定量用標準液とした。更に、コントロールとして、分子量既知のＦＧＡＧを精確に秤量し、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液でそれぞれ濃度が１０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、プレ定量用標準液とした。サンプル、標準品、コントロール溶液をそれぞれ２５μＬ取って液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。データについては、ＧＰＣ専用のソフトを用いて処理した。

化学組成の測定：単糖構成としてＮ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸及びフコースは、それぞれＥｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇｏｎ法、ｍ−ヒドロキシジフェニル法及びシステインフェノール法（張惟傑，糖複合体の生化学研究技術（第２版），浙江大学出版社，１９９９を参照可能）を用いて測定し、硫酸とカルボン酸とのモル比は、電気伝導測定法（張惟傑，糖複合体の生化学研究技術（第２版），浙江大学出版社，１９９９，ｐ４０９〜４１０を参照可能）を用いて測定した。

１．３結果
反応条件の変化による脱アセチル化産物（ｄｅａｃｅｌｙｔｅｄＦＧＡＧ，ｄＡＦＧ）の脱アセチル化度への影響は、下記表１に示される通りである。表１の結果から、触媒を添加することにより反応が加速化し、産物の脱アセチル化度が更に向上することが確認でき、また、反応時間、反応温度及びヒドラジンの質量濃度を制御することにより、脱アセチル化度が異なる産物を得ることのできることが確認できた。

図１及び図２に、本実施例の方法により製造した脱アセチル化度が異なる２つのサンプルｄＡＦＧ−１及びｄＡＦＧ−２の^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。ＮＭＲスペクトルに基づいて脱アセチル化度を算出したところ、それぞれ４８％及び８８％であった。スペクトルのデータから、更に、脱アセチル化前後において、一部のＤ−ＧａｌＮＡｃに限ってアセチルアミノ基を失ってＤ−ＧａｌＮＨ_２を生成する以外、基本構造に明らかな変化がないのが確認できた。脱アセチル化前後のサンプルの単糖構成について解析を行ったところ、単糖構成としてＤ−ＧｌｃＵＡ：Ｄ−ＧａｌＮＡｃ＋Ｄ−ＧａｌＮＨ_２：Ｌ−Ｆｕｃのモル比が約１：１±０．３：１±０．３であるのが確認できた。この結果から、更に、一部のＤ−ＧａｌＮＡｃに脱アセチル化が起こり、それ以外、多糖の基本構造が保持されているのが確認できた。

＜ｄＡＦＧの脱アミノ化解重合によるａＴＦＧの製造＞
２．１材料
ＦＧＡＧの部分的脱アセチル化産物ｄＡＦＧは、実施例１と同様にして製造した。亜硝酸ナトリウム、濃硫酸、水素化ホウ素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム及び無水エタノール等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。

２．２方法
産物の製造：脱アセチル化済みの中間体約２０ｍｇを精確に秤量して反応容器に入れ、１ｍＬ水を加えて溶解し、氷浴又は室温条件において、５．５ｍｏｌ／Ｌの亜硝酸溶液（ｐＨ４）２ｍＬを加えて２〜３０分間解重合した。反応が十分に進行した後、１ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム溶液でｐＨ８〜９に調整して反応を中止させ、０．２５ｍｏｌ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液１ｍＬを用いて亜硝酸処理で得られた解重合産物のアルデヒド基を還元させた。その後、５０℃で４０分間保持してから室温に冷却し、０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸で余分の水素化ホウ素ナトリウムを取り除いた後、０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液で中和した。分画分子量が１，０００Ｄａの透析バッグで透析し、透析バッグ内の透析液を回収して凍結乾燥した。

産物の測定：ＢＵＣＫＥＲＤＲＸ−５００型核磁気共鳴分光装置を用いて解重合サンプルを測定した。解重合サンプルの分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて確定した。解重合サンプルの硫酸とカルボン酸のモル比については、電気伝導測定法を利用して測定した。

２．３結果
脱アミノ化解重合産物の収率は９０％を超え、サンプルの純度は９５％を超えた。

理論的に言うと、亜硝酸で処理する場合、遊離アミノ基のみが離脱し、それにつれてグリコシド結合が分解される。したがって、亜硝酸処理により解重合する前のサンプルの脱アセチル化度に基づいて遊離アミノ基の数を算出し、解重合産物の理論上可能な分子量を算出することができる。表２に示されるように、分子量が異なる原料を脱アセチル化させた後、亜硝酸処理により解重合した産物の分子量が理論値とほぼ一致した。このことから、異なる脱アセチル化度に基づいて理論分子量を有する解重合産物を得ることのできることが実証された。

本実施例で製造した３つの産物ａＴＦＧ−ａ、ａＴＦＧ−ｂ及びａＴＦＧ−ｃのＮＭＲスペクトルを図３〜図６に示す。原料ＦＧＡＧと中間体ｄＡＦＧのＮＭＲスペクトルを比較し、^１ＨＮＭＲ、^１３ＣＮＭＲ及び１Ｈ同種核間相関ＮＭＲであるＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、並びに^１Ｈ−^１３Ｃ異種核間相関ＮＭＲであるＨＱＳＣ、ＨＭＢＣに基づき、脱アセチル化度が異なる（それぞれ１５％、４８％、８８％）場合の亜硝酸処理の解重合産物ａＴＦＧ−ａ、ａＴＦＧ−ｂ及びａＴＦＧ−ｃのスペクトル信号の帰属を確定した。ＮＭＲ信号のデータを下記表３に示す。

表３及び図３〜図６に示されるように、ＦＧＡＧの脱アミノ化解重合産物ａＴＦＧの^１ＨＮＭＲスペクトルがプロトタイプのＦＧＡＧのスペクトルとほぼ一致するが、脱アセチル化したＦＧＡＧのスペクトルにおいて約３．１〜３．２ｐｐｍに位置するＤ−β−ガラクトサミン（Ｄ−β−ＧａｌＮＨ_２）の２位水素の信号が消えたので、遊離アミノ基を含むヘキソサミンが全部反応しているのが確認できた。また、約５．０〜５．１ｐｐｍに現れる新たな信号ピークは、新たな還元性末端である２，５−脱水タロース（ａｎＴａｌ、末端基及び４位水素）によるものだと認められる。また、脱アセチル化産物に比べ、脱アミノ化解重合産物の^１ＨＮＭＲ信号がよりプロトタイプのＦＧＡＧに似ているのが確認できた。

＜異なるナマコ品種に由来のＦＧＡＧの、亜硝酸処理による解重合産物の製造＞
３．１材料
マナマコ（Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アカミシキリ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａｅｄｕｌｉｓ）、ブラジルナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａｇｒｉｓｅａ）、ニセクロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ）、及びイシナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａｎｏｂｉｌｉｓ）は何れも市販のものであり、体壁を取って乾燥した。

３．２方法
１）マナマコ、アカミシキリ、ブラジルナマコ、ニセクロナマコ及びイシナマコの乾燥体壁を細かに粉砕し、粉砕物をそれぞれ３００ｇ取って実施例１の方法（１）に従ってＦＧＡＧを抽出し、それぞれＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧと表記した。

２）ＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧをそれぞれ約１ｇ取って、実施例１及び２に記載の方法に従って脱アミノ化解重合産物ａＴＦＧを製造し、それぞれａＡＪＧ、ａＨＥＧ、ａＬＧＧ、ａＨＬＧ及びａＨＮＧと表記した。

３．３結果
マナマコ、アカミシキリ、ブラジルナマコ、ニセクロナマコ及びイシナマコの乾燥体壁からＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧを分離、精製する場合、収率がそれぞれ１．４％、０．９％、０．８％及び１．１％であり、重量平均分子量が何れも約５０ｋＤ〜８０ｋＤの範囲であった。ＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧの^１ＨＮＭＲスペクトルから、ＦＧＡＧ系化合物の基本特徴としてａ−Ｌ−Ｆｕｃ、β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ、及びβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡにおける末端基及び関連の特徴的プロトン信号が確認できた。

ＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧからａＡＪＧ（８．０ｋＤ）、ａＨＥＧ（１０．５ｋＤ）、ａＬＧＧ（７．３ｋＤ）、ＨＬＧ（１０．２ｋＤ）及びａＨＮＧ（８．７ｋＤ）を製造する場合、収率が約４０％〜７０％の範囲であった。^１ＨＮＭＲスペクトルから、解重合により形成されたａｎＴａｌに関連する特徴的信号が確認できた。

＜末端還元アミノ化産物の製造＞
４．１材料
ａＴＦＧは、実施例１及び２で製造したものであり、チラミン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。

４．２方法
１）末端の還元的アミノ化：実施例２で得られたａＴＦＧを０．１ｇ取って３．５ｍＬの０．２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かし、攪拌しながらそれぞれ過量の８０ｍｇチラミン及び３０ｍｇシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、３５℃の恒温水槽において約７２時間反応させた。反応が終了すると、９５％のエタノール１０ｍＬを加え、遠心して沈降物を得た。該沈降物を９５％のエタノール３０ｍＬで２回洗浄した後、３５ｍＬの０．１％ＮａＣｌで再び沈降物を溶解し、遠心して不溶物を除去した。上清を分画分子量が１ＫＤの透析バッグに入れ、脱イオン水で２４時間透析し、凍結乾燥してｄＬＦＧ−２Ａを８２ｍｇ得た。

２）理化学的特性及びＮＭＲスペクトルの測定：分子量及び分子量分布は、ＨＰＧＰＣを用いて測定した。−ＯＳＯ_３ ⁻／ＣＯＯ−モル比は、電気伝導測定法を利用して測定した。Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇｏｎ法によりアセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）の含有量を測定し、カルバゾール法によりグルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＵＡ）の含有量を測定した。Ｄ−ＧａｌＮＡｃ／Ｌ−Ｆｕｃモル比は、^１ＨＮＭＲスペクトルにおけるメチルピークの積分値により算出した（実施例１と同様である）。ＮＭＲスペクトルは、スイスブルカー社製のＡＶＡＮＣＥＡＶ５００超伝導式核磁気共鳴装置（５００ＭＨｚ）を用いて測定した。

４．３結果
原料投入量により算出した産物の収率が約７２％であった。産物の組成について測定を行った結果、Ｄ−ＧａｌＮＡｃ：Ｄ−ＧｌｃＵＡ：Ｌ−Ｆｕｃ：−ＯＳＯ_３ ⁻が約１．００：０．９８：１．１０：３．６０であり、Ｍｗが９，９６９、ＰＤＩが約１．３２であると確認できた。

１ＨＮＭＲ（Ｄ_２０，δ［ｐｐｍ］）：７．２５（２’，６’Ｈ）；６．８３（３’，５’Ｈ）；５．６５，５．３６，５．２８（Ｌ−Ｆｕｃα１Ｈ）；３．３８（８’Ｈ）；２．８２（７’Ｈ）；２．０２（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ，ＣＨ_３）；１．３０〜１．３２（Ｌ−Ｆｕｃ，ＣＨ_３）。また、ベンゼン環における水素とＬ−ＦｕｃのＨ１の積分値から、得られた産物の還元性末端が完全に還元チラミン化されたと確認できた。

＜アミノ基の硫酸化＞
５．１材料
クロロスルホン酸、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド、ジメチルホルムアミド、ピリジン及び炭酸ナトリウム等の試薬は、何れも市販の分析用試薬であった。脱アセチル化サンプルとしてタマナマコに由来のｄＡＦＧ−１は、実施例１と同様に製造され、脱アセチル化度が３５％であった。

５．２方法
０．１０ｇのｄＡＦＧ−１を精確に秤量して１０ｍＬ脱イオン水で溶解し、ｐＨ７．０に調整した。４０℃の水浴において保持しつつＮａ_２ＣＯ_３を０．１６ｇ加え、更に４時間かけて０．２０ｇのピリジン−クロロスルホン酸を加えた後、引続き１時間反応させた。反応終了後、静置して室温まで冷却させ、ｐＨ７．５〜８．０に調整した。その後、限外濾過により塩を除去し、凍結乾燥した。サンプルにおける硫酸とカルボン酸とのモル比については、電気伝導測定法を用いて測定した。

５．３結果
反応産物を秤量して収率を算出したところ、約８７％であった。電気伝導測定法を用いて測定した硫酸とカルボン酸とのモル比の結果から、産物中における硫酸とカルボン酸とのモル比が４．３であると確認できた。また、プロトタイプの天然産物と比較した場合、脱アセチル化後の遊離アミノ基がほぼ完全に硫酸化されているのが確認できた。

＜ＴＦＧの抗凝固活性の評価＞
６．１材料
ａＴＦＧサンプルとして、実施例２及び３に記載の方法に従って分子量が異なる一連のａＴＦＧサンプルを製造した。これらのサンプルの理化学的特性等を表４に示す。

試薬及び測定用キットとして、コントロール血漿、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定キット及びＣａＣｌ_２は、何れもドイツＴＥＣＯ社製であった。他の試薬は、市販の分析用試薬を使用した。測定装置として、ドイツＴＥＣＯ社製の血液凝固測定計ＭＣ−４０００を用いた。

６．２方法
コントロール血漿４５μＬに、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解した測定用サンプル５μＬを加え、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定キットを用いて凝固時間を測定した。

結果
測定結果を表５に示す。

表５に示されるように、ＦＧＡＧの脱アミノ化解重合産物であるａＴＦＧは、人血漿のＡＰＴＴを著しく延長させ、且つＡＰＴＴを倍増する際の薬物濃度が何れも１２μｇ／ｍＬ以下であり、これらの誘導体が内因系凝固機構に対して優れた阻害作用があることが実証された。これたの誘導体の分子量とＡＰＴＴを倍増する際の薬物濃度を比較する場合、分子量増加につれて抗凝固活性が高くなることから、分子量が抗凝固活性を影響する１つの要因であると確認できた。こうした結果に基づき、更にＦＧＡＧの血液学的特性を保持する観点から、本発明に係るａＴＦＧの分子量が重量平均分子量で５，０００Ｄａ以上であることが好ましいと認められる。

＜第Ｘ因子活性化複合体に対する阻害活性の評価＞
７．１材料
ａＴＦＧサンプルは、実施例２の方法に従って製造し、分子量が８７７７Ｄａであった。

試薬として、第ＶＩＩＩ因子（ｆ．ＶＩＩＩ、２００ＩＵ／バイアル）は、中国上海ＲＡＡＳ社製であり、第ＶＩＩＩ因子測定用キットは、フランスＨＹＰＨＥＮＢｉｏＭｅｄ社製であり、試薬構成として、Ｒ１がヒト第Ｘ因子、Ｒ２がヒト第ＩＸａ因子以外に、ヒトトロンビン、カルシウム及び合成リン脂質を含んでなる活性化剤、Ｒ３が第Ｘａ因子特異性の発色基質ＳＸａ−１１、Ｒ４がＴｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液であった。測定装置として、米国ＢｉｏＴｅｋ−ＥＬｘ社製の８０８型マイクロプレートリーダーを用いた。

７．２方法
第Ｘ因子活性化複合体（ｆ．Ｘａｓｅ）阻害活性については、第ＶＩＩＩ因子測定用キットと第ＶＩＩＩ因子を用いて測定方法を確立し、以下の通りにして測定した。すなわち、一連の濃度を有する測定用溶液又はコントロール溶液（Ｔｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液、試薬Ｒ４）３０μＬを、２．０ＩＵ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子（３０μＬ）と混ぜ合わせた後、順にキットの試薬Ｒ２（３０μＬ）、Ｒ１（３０μＬ）を加えて３７℃で２分間保持し、その後、Ｒ３（３０μＬ）を加えて３７℃で引続き２分間保持した後、２０％酢酸（３０μＬ）で反応を中止させてＯＤ_４０５を測定した。ＳｈｅｅｈａｎＪ．Ｐ．＆ＷａｌｋｅＥ．Ｋ．，Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７：３８７６〜３８８２に記載の方法に従い、第Ｘ因子活性化複合体に対する各サンプルのＥＣ_５０値を算出した。

７．３結果
測定結果を図７に示す。図７に示されるように、ａＴＦＧのＥＣ_５０が２２ｎｇ／ｍＬであり、第Ｘ因子活性化複合体に対して強い阻害活性を示すことが確認できた。第Ｘ因子活性化複合体が血液凝固系において内因系凝固カスケードの最下流に位置する標的であり、様々な要因が凝固反応を誘発する際において律速因子として機能するため、該標的サイトに特異的に作用する薬物は、生理的な凝固と止血に対して殆ど影響がないのが実証された（Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６（２２），４３９０〜４３９１．Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，３０９２〜３１００）。

＜凍結乾燥粉体の調製＞
８．１材料
ハネジナマコに由来のＦＧＡＧを用い、実施例１及び２と同様にしてａＴＦＧを製造し、ａＴＦＧの重量平均分子量が９４７６Ｄａであった。

８．２配合
ａＴＦＧの注射用水溶液を、下記表６に示す割合で配合した。

８．３配合方法
配合方法としては、次の通りである。すなわち、配合量に従ってａＴＦＧを秤量し、注射用水を全量で添加した後に攪拌しながら完全に溶解させ、バッチ式の加熱加圧法で滅菌処理を施した。０．６％の薬用活性炭を添加して２０分間攪拌した後、ブフナー漏斗及び３．０μｍ精密濾過膜を用いて濾過して活性炭を取り除き、熱源物質を除去した。中間体の含有量を測定し、合格となったもののみを０．２２μｍの精密濾過膜で濾過した。次に、バイアルごとに０.５ｍＬとなるように管状バイアルに分注し、バイアルに分注する際、注入量を監視しつつ開口にブチルゴム栓を半分程度に押し付けて密封した。凍結乾燥機に投入し、所定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥した後、ゴム栓を完全に押し付けて凍結乾燥機から取り出した。アルミ製キャップで堅固に密封し、目視で合格したか否かを判断し、合格となったものを包装して最終製品とした。

凍結乾燥は、以下の手順に従って行った。すなわち、凍結乾燥機にサンプルを投入し、内部温度を−４０℃に下げて３時間保持した。冷却トラップ内を−５０℃までに下げ、３００μｂａｒとなるまで真空を引いた。昇華が始まると、１時間かけて定速で−３０℃に昇温し、２時間保持した。その後、２時間かけて定速で−２０℃に昇温し、２００〜３００μｂａｒの真空度で８時間保持した。次に、２時間かけて−５℃に昇温し、１５０〜２００μｂａｒの真空度で２時間保持し、再び乾燥処理した。その後、０．５時間かけて１０℃にまで昇温し、８０〜１００μｂａｒの真空度を維持しながら２時間処理した後、０．５時間かけて４０℃に昇温し、最低真空度で４時間保持した。

Claims

低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩であって
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の構成単糖として、ヘキスロン酸、ヘキソサミン、デオキシヘキソース、及び２，５−脱水タロース又はその還元誘導体を含むものであり、
前記ヘキスロン酸は、Ｄ−β−グルクロン酸であり、
ヘキソサミンは、２−Ｎ−アセチルアミノ−２−デオキシ−Ｄ−β−ガラクトース、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−β−ガラクトース又は−β−Ｄ−２−硫酸アミノ−２−デオキシガラクトースであり、
デオキシヘキソースは、Ｌ−α−フコースであり、
２，５−脱水タロースの還元誘導体は、２，５−脱水タリトール、２，５−脱水タロサミン又はΝ−置換の２，５−脱水タロサミンであり、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の構成単糖の含有量比は、モル比でヘキスロン酸：ヘキソサミン：デオキシヘキソース＝１：１±０．３５：１±０．３の範囲であり、
２，５−脱水タロース及び／又はその還元誘導体は、モル比で構成単糖総量において３．０％以上を占め、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、重量平均分子量Ｍｗが２．５ｋＤ〜２０ｋＤの範囲で、且つ、多分散指数が１．０〜１．８の範囲にある、低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物である、請求項１に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。

［式（Ｉ）中、ｎは、平均値が３〜２１の整数であり、
−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−β１−は、−β−Ｄ−グルクロン酸−１−イルであり、
−Ｄ−ＧａｌＮ−β１−は、−β−Ｄ−２−アセチルアミノ−２−デオキシガラクトース−１−イル、−β−Ｄ−２−アミノ−２−デオキシガラクトース、又は−β−Ｄ−２−硫酸アミノ−２−デオキシガラクトースであり、
Ｌ−Ｆｕｃ−α１−は、α−Ｌ−フコース−１−イルであり、
Ｒ_１は、−Ｈ、又はβ−Ｄ−２−アセチルアミノ−２−デオキシガラクトース硫酸エステル−１−イルであり、
Ｒ’は、各々独立して−ＯＨ、又は−ＯＳＯ_３−であり、
Ｒ_３は、−Ｈ、−ＯＳ_３−、又はアセチルであり、
Ｒ_２は、−Ｈ、又は−β−Ｄ−グルクロン酸−１−イル、又は下記式（ＩＩ）で表される官能基である。

式（ＩＩ）中、−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−β１−、Ｌ−Ｆｕｃ−α１−、Ｒ’は、上記と同じであり、
ａｎＴａｌは、２，５−脱水タロース、その糖アルコール、糖アミン又はＮ−置換の糖アミンであり、
ｍは、１又は２であり、
Ｒ_４は、＝Ｏ、−Ｏ、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ_５から随意に選ばれ、そのうち、Ｒ_５は、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状又は分岐状アルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アリールである。
また、前記式（Ｉ）の構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物において、Ｒ_２が式（ＩＩ）で表される官能基である化合物と、Ｒ_２が−Ｈ又は−β−Ｄ−グルクロン酸−１−イルである化合物との比がモル比で２：１以上である。］
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の重量平均分子量が、５ｋＤ〜１２ｋＤの範囲であり、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の多分散指数が、１．１〜１．５の範囲にある、請求項１に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩
前記薬学的に許容可能な塩は、低分子量グリコサミノグリカン誘導体のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、又は有机アンモニウム塩である、請求項１又は２に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩
前記薬学的に許容可能な塩は、低分子量グリコサミノグリカン誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩である、請求項４に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、棘皮動物門ナマコ綱動物の体壁及び／又は内臓から抽出したフコシル化グリコサミノグリカンの脱アミノ化解重合産物、或いは前記解重合産物の還元性末端を還元することにより誘導体化した産物である、請求項１、２又は４のいずれか１項に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
請求項１、２又は４のいずれか１項に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法であって、
棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンをヒドラジンで処理し、そこに含まれるヘキソサミンを部分的に脱アセチル化することにより、フコシル化グリコサミノグリカンの部分的脱アセチル化産物を得るステップ１と、
ステップ１で得られたフコシル化グリコサミノグリカンの部分的脱アセチル化産物を亜硝酸で処理し、脱アミノ化反応を起こさせて解重合し、還元性末端が２，５−脱水タロース残基である低分子量フコシル化グリコサミノグリカンを取得し、更に、得られた低分子量フコシル化グリコサミノグリカンについて、任意に２，５−脱水タロース末端基を糖アルコール、糖アミン又はＮ−置換の糖アミンに還元する還元性末端の還元処理を施すステップ２と、
を含んでなる、低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
前記ステップ１において、棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンは、棘皮動物門ナマコ綱動物の体壁及び／又は内臓から抽出、精製したフコシル化グリコサミノグリカンの天然産物であり、
前記フコシル化グリコサミノグリカンの単糖構成として、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−Ｎ−アセチルアミノ−２−デオキシガラクトース及びＬ−フコースを含み、
前記棘皮動物門ナマコ綱動物として、バイカナマコ（ＴｈｅｌｅｎｏｔａａｎａｎａｓＪａｅｇｅｒ）、タマナマコ（ＳｔｉｃｈｏｐｕｓｖａｒｉｅｇａｔｅｓＳｅｍｐｅｒ）、ハネジナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｓｃａｂｒａＪａｅｇｅｒ）、ニセクロナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａＢｒａｎｄｔ）、アカミシキリ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｅｄｕｌｉｓＬｅｓｓｏｎ）、ジャノメナマコ（ＢｏｈａｄｓｃｈｉａａｒｇｕｓＪａｅｇｅｒ）、シカクナマコ（ＳｔｉｃｈｏｐｕｓｃｈｌｏｒｏｎｏｔｕｓＢｒａｎｄｔ）、チュウカナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｓｉｎｉｃａＬｉａｏ）、イモナマコモドキ（ＡｃａｕｄｉｎａｍｏｌｐａｄｉｏｉｄｅｓＳｅｍｐｅｒ）、クロエリナマコ（ＰｅａｒｓｏｎｏｔｈｕｒｉａｇｒａｅｆｆｅｉＳｅｍｐｅｒ）、イシナマコ（ＨｏｌｏｔｈｕｒｉａｎｏｂｉｌｉｓＳｅｌｅｎｋａ）を用いる、請求項７に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
前記ステップ１において、前記ヒドラジン処理による脱アセチル化反応は、棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンを、無水ヒドラジン又はヒドラジン水和物溶液に入れ、触媒の存在下又は非存在下において、攪拌しながら７５℃〜１２５℃の温度範囲で２〜１４時間反応することにより行われる、請求項７に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
前記ステップ１において、前記ヒドラジン処理による脱アセチル化反応は、触媒存在下で行われ、前記触媒は、硫酸ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、塩酸及び硫酸から任意に選ばれ、且つ前記反応溶液における触媒の濃度は、０．５％〜２．５％の範囲である、請求項９に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
前記ステップ２において、前記亜硝酸処理による脱アミノ化解重合は、氷浴又は室温の条件下において、ステップ１で得られたフコシル化グリコサミノグリカンの部分的脱アセチル化産物を、４〜６ｍｏｌ／Ｌ且つｐＨ１〜５の亜硝酸溶液で５分間〜６０分間処理した後、アルカリ性溶液でｐＨ８又はそれ以上に調整して反応を中止させ、その後、随意に下記１〜３の何れか１種の処理を施すことにより行われる、請求項７に記載の低分子量グリコサミノグリカン又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
処理１：反応溶液に３〜５倍体積のエタノールを加え、静置、遠心して沈降物を得た後、産物を限外濾過又はクロマトグラフィーで精製する。
処理２：水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて、反応産物の還元性末端２，５−脱水タロースを糖アルコールに還元し、その後、上記処理１のステップに従って産物を精製する。
処理３：還元的アミノ化反応により反応産物の還元性末端２，５−脱水タロースを糖アミン又はＮ−置換の糖アミンに還元し、その後、上記処理１のステップに従って産物を精製する。
抗凝固効果を示す有効量で請求項１、２又は４のいずれか１項に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩と、賦形剤とを含んでなる、薬物組成物、
前記薬物組成物の形態は、注射用水溶液又は注射用凍結乾燥粉体である、請求項１２に記載の薬物組成物、
請求項１、２又は４のいずれか１項に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害を予防、治療するための薬物の製造における用途。
請求項１２に記載の薬物組成物の、静脈血栓塞栓、動脈血栓塞栓、虚血性心疾患又は虚血性脳血管障害を予防、治療するための薬物の製造における用途。