NO323598B1 - Monoklonale antistoffer som binder humant veksthormon (hGH), anvendelse av dette til maling av hGH 20K in vitro, fremgangsmate for immunanalytisk deteksjon og kvantifisering av hGH 20K, terapeutisk preparat som omfatter antistoffene og hybridomcellelinje som produserer antistoffene - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår monoklonale antistoffer som spesifikt har evnen til å binde varianten av humant veksthormon med molekylvekt 20 kDa, her betegnet hGH 2OK,

Dette monoklonale antistoff har ingen vesentlig binding til hGH med molekylvekt 22 kDa.

Den angår også anvendelsen av dette monoklonale antistoff for måling av hGH 2OK, spesielt i kroppsvæsker.

Antistoffet kan anvendes for deteksjon og kvantifisering av hGH 2OK, spesielt i serum.

En hybridomcellelinje som produserer antistoffet er blitt deponert under nummeret DSM ACC 2254 den 28. februar 1996.

INNLEDNING

Humant veksthormon (hGH) er et enkeltkjedet polypeptid med molekylvekt 22 kDa (hGH 22K), omfattende 191 aminosyrer med to intrakjedete disulfidbroer, fremstilt i hypofyse-forlappen (1,2). Imidlertid er sirkulerende hGH en kompleks blanding av ulike molekylære former der noen er derivert fra hypofysen, slik som hGH 22K og hGH 20K, et humant veksthormon med molekylvekt 2 0 kDa som er et enkeltkjedet polypeptid, mens andre sekreres fra placenta under graviditet (hGH-V). I tillegg viser andre tropiske hormoner, placenta laktogen (hPL) og prolaktin (PRL) betydelig sekvensidentitet med hGH. Andre molekylære varianter av hGH avledet fra posttranslasjonelle modifiseringer slik som deamidering, acylering, glykosylering og oligomerisering (3) er også blitt beskrevet.

Humant veksthormon kodes av to gener, hGH-N og hGH-V, som sitter sammen på kromosom 17, sammen med det svært homo-loge placenta laktogen (hPL)-genet (4,5). Hovedproduktet fra det hypofyseuttrykte hGH-N-genet er det 191-aminosyre 22K hGH.

Et annet produkt fra dette genet er 20K hGH, avledet ved alternativ mRNA-spleising, som mangler 15 residier i poly-peptidkjeden fra aminosyre 32 til 46 (6,7). Dette hGH 2OK representerer 5-10 % av hypofyse-hGH (3) og dets biologiske egen-skaper er ennå ikke definert. Mens det helt sikkert har noen av dé samme funksjoner som 22K isoformen, er det holdepunkter for spesifikke aktiviteter. Således binder ikke hGH 2OK til hGH-reseptoren i human lever (8) eller i det minste viser redusert binding (9) og har mindre fremmende insulinaktig aktivitet (10) . 2OK isoformen konkurrerer med hGH for binding til brystkjertelreseptorer i kanin, hvilket indikerer at dens effekt er mer lik laktogen enn somatogen selv om den fremmer vekst i hypofysektomiserte rotter (11), se også f.eks.

EP 587 427.

hGH 2OK elimineres langsommere enn hGH, og denne forlengede tilstedeværelse av hGH 2OK i sirkulasjon kan bidra til dens bioaktivitet som er høyerer enn forventet in vivo (Baumann et al, Endocrinology, vol 117, nr. 4, 1309-13, 1985).

I EP 587 427 beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av hGH 20K ved en rekombinant fremgangsmåte.

På tross av denne peptidhormonfamiliens kliniske relevans er det liten informasjon om konsentrasjonene til sirkulerende isoformer eller den relative deltakelse fra hver molekylære form i den komplekse blanding. Selektive analyser for å definere hGH 22K og hGH 2OK konsentrasjonen ville være verdi-fulle både innen diagnostikk og grunnforskning (12, 13, 14). Hjelpemidler slik som monoklonale antistoffer (mAb) som spesifikt blokkerer effekten av disse proteiner kan være av stor interesse for å forstå deres spesifikke biologiske virkninger.

Det er blitt antatt at mengden og forholdet mellom hGH 22K og hGH 2OK i sirkulasjon kan være av betydning for spesielle sykdommer og tilstander av sykdom som diabetes, akromegali, kronisk lever- og/eller nyresykdom, og det er derfor stort behov for en spesifikk og nøyaktig fremgangsmåte for å måle 20 kDa.

Det eksisterer i dag ingen fremgangsmåte basert på anvendelsen av et hGH 20K spesifikt mAb for spesifikk deteksjon og kvantifisering. Det er gjort forsøk på å frembringe hGH 2OK-spesifikke mAb i den hensikt å utvikle immunanalyser for hGH 20K, men uten suksess. Referanse kan gis til F. Gomez et al. Journal of Immunoassay, 5 (364), 145-57 (1984). På side 155 står det "siden den eksakte patofysiologiske relevans til 20K GH fortsatt i stor grad er ukjent, følte vi det passende å utvikle en immunanalyse for den, ved først å fremskaffe monoklonale anti-hGH-2OK-antistoffer med høy spesifisitet. Imidlertid ble ingen stabile hybridomer sekrerende spesifikke anti-20K-antistoffer frembragt på tross av selektiv immuni-ser ing av dyrene med et høyt renset preparat av varianten".

I Hormone Research, vol. 36, nr.l, 1991, diskuterer Bo Dinesen immunokj emiske aspekter av GH-analyser, men som en generell diskusjon omkring fortrinnene ved selektive analyser i forhold til å påvise individuelle konsentrasjoner av ulike GH-spieisende former som 22K og 20K. Ingen 20K-spesifikk mAb blir tilkjennegjort. Frankenne, F. et al., Clin. Endocrinol. Metab., 1988, Juni 66(6):1171-80 viser mAb som gjenkjenner ulike epitoper, men ingen 20K-spesifikk mAb blir tilkjennegjort. Aston et al., Mol. Immunol. 1985, Mars 22(3):271-5 tilkjennegir monoklonale antistoffer mot humant veksthormon som kan skille mellom hypofyseformer og genetisk endrede former. Slik ble antistoffer produsert for å bli i stand til å skille mellom rekombinant NH2-terminalt metionin-GH og hypofyseavledet GH, men ingen mAb blir tilkjennegjort som er spesifikk mot hGH20k.

Det har i lang tid vært behov for et hGH 20K-antistoff med høy spesifisitet som kan anvendes i en spesifikk og nøyaktig fremgangsmåte for måling av hGH 2OK.

Et slikt antistoff kan muligens også brukes ved terapeutiske anvendelser når den biologiske aktivitet av hGH 2OK blokkeres.

Behovet for deteksjon og kvantifisering av hGH 2OK er nå løst siden man har -fremskaffet et mAb spesifikt for hGH 20K.

Dette mAb er blitt anvendt med stor suksess til spesifikk deteksjon av dette hormon i ulike typer analyser og er også blitt funnet å kunne blokkere spesifikt den biologiske aktivitet. Av den grunn er det også nyttig å undersøke den biologiske aktivitet til dette hormon og analysere dens biologiske betydning.

I særskilte eksempler beskrives dannelsen og karakteriseringen av dette mAb. Monoklonale antistoffer spesifikke for hGH 22K og et som gjenkjenner både hGH 2OK og hGH 22K beskrives som sammenlignbare antistoffer.

FIGURTEKST

Figur 1 (A-C) . Inhibisjori av mAb-12SI-hGH(20K eller.22K) - binding til umerket rhGH-22K, hGH-2OK, hGH-V, hPL og hPRL. Figurene tilsvarer mAb hGH-33 (figur 1 A), hGH-12 (figur 1 B) og hGH-25 (figur 1 C). Figur 2 Sandwich bindingsanalyse for spesifikk deteksjon av hGH isoformer. hGH-22K (figur 2 A) og hGH-2OK (figur 2 B) . Figur 3 Vekststimulering av kimære (hGHR/G-CSF-transfektert

Ba/F3-celler på respons fra hGH 22K og 20K. Figur 4 Monoklonal antistoffblokkering av hGH 22K- og 20K- aktivitet på Ba/F3-transfekterte celler. Figur 5 Doserespons av 2OK og 22K hGH tilsatt en sammen-blanding av humant normalt serum.

OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen angår monoklonale antistoffer som er spesifikke for humant veksthormon (hGH) med molekylvekt 20kDa (hGH 20K) som har en affinitet for hGH 20K på 1 x 10'M"<1> eller større, fortrinnsvis minst 1 x 10'M<*1> og helst mer enn 2 x 10'M"<1 >som bestemt og beskrevet i den eksperimentéile del. Antistof-fet i følge oppfinnelsen har evnen til å binde humant veksthormon (hGH) med molekylvekt 20kDa (hGH 20K) med mindre kryssreaktivitet til hGH med molekylvekt 22kDa enn 5 %, helst mindre enn l %. Kryssreaktiviteten med hGH-V, placenta laktogen og prolaktin bør være liten og fortrinnsvis mindre enn 5 %, helst mindre enn 1 %, som beskrevet i den eksperimentelle del. ;De følgende hormoner er også blitt testet for kryssreaktivitet og viser mindre enn 5 % og også mindre enn 1 % kryssreaktivitet: luteiniserende hormon (LH), humant chorion gonadotropin (HCG), follikkelstimulerende hormon (FSH) og tyroidstimulerende (TSH). Dette monoklonale antistoff kan anvendes for måling av hGH 2OK f.eks. i kroppsvæsker som serum, plasma, blod, spytt, urin, lymfevæske etc.. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved immunanalytisk bestemmelse av hGH 2OK i prøver inneholdende dette hormon. De ulike utforminger av immunanalyser er vel kjente innen teknikken og omfatter trinnene: 1) kontakt mellom en prøve inneholdende hGH 20K og antistoffet ifølge oppfinnelsen for å danne et kompleks mellom antistoffet og hGH 2OK i en mengde som står i forhold til mengden hGH 2OK i prøven, og 2) bestemmelse av mengden dannet kompleks på en måte kjent per se og den funnede mengde settes i forhold til mengden hGH 2OK i prøven. ;Immunanalyser kan være heterogene eller homogene og kompetitive eller ikke-kompetitive (sandwich). Ulike utforminger anvender i flere tilfeller merkede immunreagenser, i dette tilfelle hGH 2OK eller antistoffbinding til hGH 2OK eller anti-antistoffbinding til hGH 2OK merket med enzymer, isotoper, biotin, fluoroforer, kromoforer etc. (f.eks. anti-mus lg) for å fremme bestemmelsen av mengden dannet kompleks. ;Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan kobles direkte til en fast fase eller indirekte via et annet antistoff bundet til antistoffet ifølge oppfinnelsen. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i en oppløst form. Noen utforminger kan gjøre bruk av presipiterende midler som anti-antisera og fast fasebundne anti-antistoffer. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes i en multianalytisk analyse, f.eks. for bestemmelse av ulike isoformer av hGH. ;Deteksjon av hGH 2OK i vev fra ulike arter (f.eks. aper, kaniner, hunder, rotter) ved immunhistokjemisk farging er en antatt anvendelse. Det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen kan også anvendes for rensing av prøver inneholdende hGH 2OK. Siden hGH 20K antas å ha en egen terapeutisk effekt, er et terapeutisk preparat omfattende en terapeutisk effektiv mengde av det monoklonale antistoff i farmasøytisk akseptabel bærersubstans beskrevet i kravene. ;Oppfinnelsen gjelder dermed et monoklonalt antistoff, kjennetegnet ved at det er spesifikt for humant veksthormon (hGH) med molekylvekt 20kDa (hGH 2OK), der det monoklonale antistoffet har en affinitet for hGH 2OK på 1 x IO<8> M"<1> eller større, og en kryssreaktivitet på mindre enn 5 % med hGH med molekylvekt 22kDa (hGH 22K), der det monoklonale antistoffet gjenkjenner den konformasjonsmessige epitopen som blir gjenkjent av mAb-33 som blir produsert av hybridomcellelinjen som er deponert som DSM ACC 2254. Den gjelder også anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen for måling av hGH 20K in vitro. I tillegg gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for immunanalytisk deteksjon og kvantifisering av hGH 20K, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: 1) en prøve inneholdende hGH 20K og antistoffet ifølge oppfinnelsen bringes i kontakt for å danne et kompleks mellom antistoffet og hGH 2OK i en mengde som står i forhold til mengden hGH 2OK og prøven, og 2) mengden kompleks dannet på en måte kjent per se bestemmes og mengden funnet relateres til mengden hGH 20K i prøven, et terapeutisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen i en farmasøytisk akseptabel bærersubstans og en hybridomcellelinje, kjennetegnet ved at den fremstiller et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen. ;DEFINISJONER ;Med kroppsvæsker menes f.eks, serum, plasma, lymfevæske, fullblod, urin, spytt, spinalvæsker, vevskulturmedium, celleekstrakter. ;hGH betyr humant veksthormon, hGH 2OK betyr varianten av hGH med en molekylvekt på 20kDa og hGH 22K betyr varianten av hGH med en molekylvekt 22kDa. ;mAb hGH-33 er det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen som er et monoklonalt antistoff med evne til å binde humant veksthormon (hGH) med molekylvekt 22kDa med liten kryssreaksjon med hGH molekylvekt 22kDa og som dekkes av kravene. ;mAb hGH-12 er et monoklonalt antistoff som har evne til å binde humant veksthormon (hGH) med molekylvekt 20kDa og med hGH med molekylvekt 22kDa like godt. ;mAb hGH-25 og mAb hGH-26 er monoklonale antistoffer som har evnen til å binde humant veksthormon (hGH) med molekylvekt 22kDa uten å kryssreagere med hGH med molekylvekt 20kDa. ;Ved betegnelsen antistoff (ab) menes antigenbindende antistoff-fragment (Fv, Fab, Fab2, enkeltkjedet Pv etc), kimære {som klasse-klasse og art-art), fusjonerte antistoffer og rekombinante antistoffer. ;BSA Bovint serumalbumin ;cpm tellinger per minutt ;EIA enzymbundet immunanalyse ;FCS føtalt kalveserum ;hGHR human veksthormonreseptor ;G-CSFR granulocytt-kolonistimulerende resepter ;PBS fosfatbufret saltvann ;PEG polyetylenglykol ;EKSPERIMENT, MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER ;MATERIALER ;Rekombinant human GH 22K (rhGH-22K, genotropin) og rekombinant human GH-variant (rhGH-V) ble levert fra Pharmacia Peptide Hormones (Sverige). Renset humant GH 20K ble gitt av professor Paul Roos (Uppsala, Sverige). Renset hPL, hPRL og hGH-22K var fra Dr. A.F. Parlow (Pituitary Hormones and Antisera Center, Maryland, USA). ;IMMUNISERING ;BALB/c, C57/BL10 og C3H/He-mus ble immunisert subkutant med 10-40 ug protein i 0,1 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) emulgert med Freunds fullstendige adjuvans (Difco Laboratories, USA) . Mus ble tilleggsimmunisert på dag 30 og 60 med 20 ug protein i Freunds ufullstendige adjuvans, og intraperitonealt i PBS på dag 90. Før cellefusjon ble musene tilleggsimmunisert intravenøst på dagene -3 og -2 med 40 ug hormon i sterilt PBS. ;Serum fra immuniserte mus ble samlet 7-10 dager etter hver tilleggsimmunisering og tilstedeværelsen av spesifikke antistoffer ble bestemt i enzymbundet- (EIA) eller radioimmun-analyser (RIA). ;CELLEFUSJON OG FREMSTILLING AV MONOKLONALE ANTISTOFFER ;Celler fra milt og/eller lymfeknuter fra mus ble fusjonert med P3X63Ag8.653 myelomcellelinje (CRL 1580, ATCC), ved anvendelse av polyetylenglykol 4000 (Merck, Tyskland) som fusjoneringsmiddel og utført etter følgende standard proto-koller (15, 16) . ;Supernatantene ble testet for tilstedeværelse av antistoffer ved EIA eller RIA og positive hybridomer ble stabilisert ved begrensende fortynning ved hjelp av et thymocytt fåringslag inntil en stabil antistoffproduksjon ble oppnådd. Hybridomer ble dyrket i RPMI-1640, 10 FCS uten antibiotika ved 37 °C og 5 % C02. ;Monoklonale antistoffer ble fremstilt både i vevs-kultursupernatanter og i ascitesvæsker fra "Pristane" (Sigma Chemical Co.) -injiserte mus (17); de ble renset ved ammonium-sulfatpresipitering (16) og/eller affinitetskromatografi på immobilisert protein-A sepharose (Pharmacia, Sverige). ;Isotypen av hvert mAb ble bestemt ved "Ouchterlony" dobbeldiffusjonsanalyse (18) ved hjelp av klasse- og subklasse-spesifikke antisera (ICN). ;JODINERING OG BIOTINYLERING AV PROTEINER ;Hormoner (2,5 ug i 20 ml 50 ul natriumfosfatbuffer, pH 7,6) ble jodinert ved hjelp av "Iodogeh"-belagte reagensrør (Pierce Chemical Co.) (19) eller kloramin-T (20) som oksi-da sjonsmiddel . Jodinerte hormoner ble separert fra uinkorpo-rert merking ved gelfiltrering på en PD-10 Sephadex G-25M-kolonne (Pharmacia). Spesifikk aktivitet av merkede hormoner varierte fra 10-50 uCi/ug. Biotinylering ble utført som beskrevet i (21). Hormoner og mAb (0,5 mg i 0,5 ml 150 mM NaCl, 0,1 M karbonatbuffer, pH 9) ble inkubert med 50 ul 1 mg/ml N-hydroksysuccinimidbiotin i dimetylsulfoksid (Sigma Chemical Co.) i 120 minutter ved romtemperatur. Ukoblet biotin ble fjernet ved dialyse mot PBS. Biotinmerket protein ble fortynnet 1/2 med glyserol og lagret ved -20 "C. ;ENZYMBUNDET IMMUNANALYSE ;Tre ulike enzymbundne immunanalyser (EIA) ble utført, (antistoff, antigen og sandwichbinding), som er ulike i sin måte å presentere antigenet for antistoffet. ;1. ENZYMBUNDET IMMUNANALYSE - ANTISTOFFBINDING ;Hormoner (0,5 ug/ml i PBS, 100 pl/brønn) ble adsorbert på mikrotiterplater (Maxi-sorb, Nunc) over natten ved 4 °C. Gjenværende proteinbindingsseter ble blokkert med 0,5 % BSA i PBS. Etter vasking av platene med destillert vann ble mAb inkubert i 60 minutter ved 37 °C etterfulgt av et peroksidasemerket geit-antimiis-antistdff (GAM-PO) (Tago, Inc.) og o-fenylendiamindihydroklorid (OPD, 4 mg/ml i 0,15 M natrium-sitratbuffer, pH 5,0,.Sigma Chemical Co.). Reaksjonen ble terminert med 3N svovelsyre og optisk tetthet bestemt ved 492 nm. ;2. ENZYMBUNDET IMMUNANALYSE - ANTIGENBINDING ;Monoklonale antistoffer ble adsorbert til den faste fase, enten direkte (3 pg/ml i PBS), eller via et affinitetsrenset GAM-antistoff. Etter blokkering ble biotinmerkede hormoner fortynnet 1/500 - 1/1000 i PBS inneholdende 0,5 % BSA og inkubert i 60 minutter ved 37 °C etterfulgt av peroksidasemerket streptavidin (Sigma Chemical Co.) i 30 minutter ved 37 °C og OPD. Reaksjonen ble terminert som ovenfor. ;3. ENZYMBUNDET IMMUNANALYSE - SANDWICHBINDING ;Renset mAb (3 ug/ml i PBS) ble adsorbert på mikrotiterplater. Etter inkubering over natten ved 4 °C og blokkering med 0,5 % BSA, ble hormoner fortynnet i PBS-0,5 % BSA tilsatt og inkubert i 60 minutter ved 37 °C. Etter vasking ble et annet biotinmerket mAb (mAb hGH-12) på forhånd titrert for å gi optimal binding tilsatt. mAb hGH-12 ble tilsatt som et andre antistoff fordi det gjenkjenner begge molekylære former. Etter dette ble peroksidasemerket streptavidin og OPD tilsatt. Reaksjonen ble terminert som tidligere. ;RADIOIMMUNANALYSE - FAST FASE ;Antistoffer ble adsorbert på RIA-brønnstriper (Costar) via et affinitetsrenset GAM-antistoff (2,5 pg/ml i PBS). Etter blokkering med 0,5% BSA i PBS, ble jodmerkede hormoner tilsatt (20.000 cpm/brønn) og inkubert i 120 minutter ved 37 °C. Etter vasking med destillert vann ble bundet radioaktivitet telt. ;RADI0IMMUNANALYSE - VÆSKEFASE ;Antistoffer (100 ul/rør) fortynnet i 10 raM natriumfosfat, 150 mM NaCl, 10 raM EDTA, 0,25 % BSA, pH 7,6 (RIA-buffer) for å gi halvparten av maksimal binding, ble inkubert med 30.000 cpm jodmerkede hormoner i 100 ul RIA-buffer i nærvær eller fravær av umerkede hormoner som konkurrenter. Normalt museserum ble tilsatt for å gi 0,25 % i et sluttreaksjonsvolum. Etter inkubering over natten ved romtemperatur ble bundet og ubundet hormon i 400 ul separert ved inkubering i 60 minutter ved romtemperatur med 200 pl 5 % GAM-antiserum og 200 pl 15 % PEG 6000 (Merck) etterfulgt av sentrifugering ved 1520 x g i 20 minutter. Gjenværende radioaktivitet i pelleten ble telt i en gammateller. ;BESTEMMELSE AV AFFINITETSKONSTANT OG KRYSSREAKTIVITET ;Den tilsynelatende affinitetskonstant (Ka) til mAb ble beregnet ved Scatchard plot analyser av kompetitive RIA-data (22) . Kryssreaktivitet ble definert som mengden konkur-rent nødvendig for identisk fortrengning av tracerbinding til mAb. ;SDS-PAGE ANALYSE OG WESTERN BLOT ;Elektroforese ble utført på hormoner (15 pg av hver) på 15 % (vekt/volum) SDS-polyakrylamidgeler ifølge fremgangs-måten til Laemmli (23). Geler ble farget med Coomassie-blått og overført til nitrocellulose på en semitørr blotter (Bio Rad) i 60 minutter ved 250 mA i en 48 mM tris base, 39 mM gly-sin, 20 % metanolbuffer inneholdende 0,037 % SDS. Etter blokkering med 10 % fettfri tørrmelk i PBS ble mAb inkubert med agitering i 120 minutter ved romtemperatur etterfulgt av GAM-PO-antistoff (Tago Inc.) fortynnet 1/2500. Blottet ble frem-kalt ved hjelp av 4-klor-l-naftolsubstrat (Sigma Chemical Co). ;CELLEPROLIFERASJONSANALYSE ;Ba/F3-celler transfektert med det kimære hGHR/G-CSFR ble dyrket i RPMI-1640 medium tilsatt IL-3 (10 U/ml) og 10 % FCS ved 37 °C i 5 % C02. Cellene (20 x 10s celler/ml) ble vasket i det samme medium uten IL-3, og 25 pl cellesuspensjon ble tilsatt 96-brønns plater. Cellene ble behandlet med ulike konsentrasjoner av hormoner (0,001 nM-10 nM) i et sluttvolum på 100 ul i 18 timer ved 37 °C. I kompetitive analyser ble ulike konsentrasjoner av renset mAb (1-450 nM) og hormoner (0,001 nM-10 nM) reinkubert i 18 timer ved 4 °C før behandling av celler. For måling av DNA-syntese ble 1 uCi/brønn <J>H-tymidin tilsatt (5 Ci/mmol). Etter 4 timers inkubering ved 37 °C i 5 % C02 ble cellene oppsamlet og vasket på glassfiltere. Radioaktiviteten ble tellet i en (3-teller. ;RESULTATER ;Eksempel 1. Analyse av sera i antistoffbindings- EIA ;Når sera fra hGH 20K- eller 22K-immuniserte mus ble analysert i et antistoffbindings-EIA ble det funnet at alle mus responderte på det tilsvarende immunogen, med titere ;(antiserumfortynning som gir halvparten av maksimal binding) ;på 1/500 - 1/100,000 avhengig av den anvendte screenings-analysen og det anvendte immunogen. ;Sera fra hGH 2OK-immuniserte mus ble analysert i antistoffbindings-EIA ved anvendelse av fastfasebundet hGH .2OK og hGH 22K. Titere varierte fra 1/500-1/10.000 for begge hormoner, ingen fremvisning av spesifisitet for hGH 22 eller 20K. ;Eksempel 2. Radioimmunanalyse - fastfase ;Etter fusjon ble hybridomklonene screenet ved fast fase-RIA ved anvendelse av 12SI-hGH 20K og åtte hybridomer viste bindingsaktivitet (åtte ganger eller mer enn bak-grunnen) . Kun et antistoff gjenkjente ikke <ia5>I-hGH 22K i fastfase-RIA, og det ble utvalgt for stabilisering og videre karakterisering (hGH-33). De andre syv antistoffer gjenkjente både hGH 20K og 22K. ;Eksempel 3. Radioimmunanalyse - væskefase ;Sera fra mus immunisert med hGH 22K ble analysert i væskefase-RIA overfor 22K-proteinet. Alle sera viste høye titere for immunogenet (>1/10.000) og mus ble deretter anvendt for cellefusjonering. Etter fusjon ble hybrider produserende antistoffer som bandt "<5>I-hGH 22K utvalgt og stabilisert. To var hGH 22K-spesifikke (mAb hGH-25 og mAb hGH-26) mens et annet (mAb hGH-12) gjenkjente de to molekylære former like godt. ;Eksempel 4. Antigenbindende EIA og kompetitiv væskefase- RIA ;De utvalgte hybrider fra eksempel 2 ble testet i antigenbindende-EIA ved anvendelse av biotinmerkede og umerkede hormoner som konkurrenter, eller i en kompetitiv væskefase-RIA. Bindingskarakteristika til mAb hGH-33 og de tre mAb kontrollene hGH-25, hGH-26 og hGH-12 summeres i tabell I. ;Kompetitiv RIA ved anvendelse av jodmerkede hormoner og spesifikke mAb ble anvendt for kvantifisering av hormonene. I figur 1 vises inhibisjonen av mAb<*>"<5>I-hGH{20K eller 22K)-binding med umerket hGH-22K, hGH 2OK, hGH-V, hPL og hPRL.

Figur IA til 1C tilsvarer mAb hGH-33 (A), hGH-12(B) og hGH-25(C). Bundet GH er radioaktiviteten til stede i pelleten og uttrykkes som prosent av totalt "<5>I-hGH anvendt. hGH-25 mAb ble anvendt for hGH 22K med en deteksjonsgrense for denne isoform på 0,25 nM, mens de gjenværende testede hormoner (hGH 20K, hGH-V, hPL og hPRL) ikke konkurrerte selv ved 1000 gangers høyere konsentrasjoner (fig. 1C). hGH-33-mAb ble anvendt ved hGH 2OK med en påvisningsgrense på 0,5 nM, mens neglisjerbar konkurranse ble observert for resten av de testede hormoner (fig. IA).

Resultater fra kompetitiv RIA ved anvendelse av <1>2SI-hGH 20K viste at (mAb) hGH-33 hadde en tilsynelatende Ka for hGH 20K på 2,2 x IO<9> M"l og mindre enn 1 % kryssreaktivitet med hGH 22K, hGH-V, hPL og hPRL (fig. IA).

mAb hGH-12 gjenkjente hGH-V, hGH 2OK og hGH 22K like godt og hadde 40 % kryssreaktivitet med hPL og >1 % med hPRL (fig. IB). De andre to mAb (hGH-25 og hGH-26) er hGH 22K-spesifikke, viser neglisjerbar kryssreaktivitet med beslektede hormoner og har en tilsynelatende 1^ på 10<8->10<10> M"<1> (fig. 1C) .

Eksempel 5. Antistoffbindings EIA

I antistoffbindings-EIA varierer bindingskarakteristika til mAb. mAb hGH-33 gjenkjenner ikke fastfaseadsorberte hormoner, mens dette er ikke tilfelle for de monoklonale antistoffer hGH-12, hGH-25 og hGH-26 (data ikke vist).

Eksempel 6. Sandwich- analyse

For å teste gjennomførbarheten av anvendelsen av disse mAb for spesifikk påvisning av ulike molekylære former av hGH, er to ulike sandwich-analyser utviklet. For hver anvendes et isoform-spesifikt mAb som bindingsantistoff, hGH-33 i tilfelle hGH 2OK og hGH-26 for hGH 22K. I begge analyser ble biotinmerket mAb hGH-12 anvendt som det andre antistoff fordi det gjenkjenner begge molekylære former.

Sensitiviteten for hver spesifikke analyse er 0,2 nM for hGH 22K og 0,2 nM for hGH 20K, og ingen kryssreaktivitet med andre beslektede hormoner ble observert (fig. 2A og 2B).

Eksempel 7 Western blot

Antistoffene hGH-25 og hGH-26 gjenkjenner særskilt det tilsvarende rensede hormon i western blot, under både reduserende og ikke-reduserende betingelser. hGH-33 mAb gjenkjenner ikke hGH 2OK i Western blot som forventet fra dets bindings-EIA.

Eksempel 8. Celleproliferasjon

Antistoffer spesifikke for hGH-isoformene ble funk-sjonelt karakterisert ved å teste deres evne til å blokkere hGH-avhengig cellevekst. Vekststimulering av kimære hGHR/G-CSF-transfekterte Ba/F3-celler på respons fra hGH 22K og hGH 2OK. Cellene ble behandlet med økende hormonkonsentrasjon i 18 timer. DNA-syntese ble målt ved <J>H-tymidininkorporering.

VilLtype Ba/F3-celler har behov for eksogent IL-3 for å vokse in vi tro (24). Ba/F3-celler ble transfektert med et

kimært gen inneholdende det ekstracytoplasmiske domene av hGH-reseptoren, og det transmembrane- og intracytoplasmiske domene av G-CSF (granulocyttkolonistimulerende faktor)-reseptor. Mens både villtype og transfekterte celler vokser i nærvær av eksogent IL-3, prolifererer bare transfekterte celler i nærvær av humant GH. Som vist i fig. 3 fremmer både hGH 20K og 22K tilsvarende proliferasjon i transfekterte celler. I begge tilfeller var hormonkonsentrasjonsområdet med maksimaleffekt 2-10 nM.

Monoklonal antistoffblokkering av hGH 22K og 20K-aktivitet på Ba/F3-transfekterte celler: Hormoner (1 nM) ble preinkubert med 74 nM hGH-33 og 222 nM hGH-12, -25 og -26 i 18 timer ved 4 °C før de ble tilsatt kulturen. Resultatene i fig. 4 representerer gjennomsnitt av triplikate bestemmelser med standard avvik.

hGH 22K-indusert proliferasjon ble spesielt inhibert av mAb hGH-25 og hGH-26, men ikke av hGH-33, mens hGH 20K-indusert proliferasjon ble bare inhibert av hGH-33 (fig. 4). hGH-12 mAb, som gjenkjenner begge hormoner like godt" i væskefase, viser en delvis inhibitorisk effekt av hGH 22K og 2OK, selv om dette mAb binder og immunpresipiterer hGH (22 og 2OK)-GHBP/GHR-komplekset med høy affinitet.

Eksempel 9. Deteksjon og kvantifisering av hGH 20K i serumprøver

Som et eksempel på kroppsvæske, ble normalt humant serum anvendt for å undersøke sandwich-analysen med hensyn på spesifisitet og anvendbarhet for kvantifisering av 20K.

I analysen ble det 20K-spesifikke antistoff hGH-33 anvendt som bindingsantistoff og som deteksjonsantistoff ble biotinmerket hGH-12 anvendt. For målinger av signalene ble "time-resolved" fluorimetri (TRF) anvendt.

En human normal serumsammenblanding ble anvendt for å teste dose-responsen til hGH 2OK og hGH 22K. Økende konsentrasjoner fra 0,5 til 50 ng/ml av 20K hGH resulterte i økende signalrespons. Tilsetting av 50 ng/ml 22K hGH kunne ikke påvi-ses i analysen. Økning av 22K hGH-konsentrasjonen til 500 ng/ml resulterte i et svakt signal og kryssreaktiviteten ble beregnet til mindre enn 0,5 % i 2QK sandwich-analysen (fig. 5).

Sensitivitetsnivået er under 0,5 ng/ml.

I fig. 5 vises dose-responsen til 20K og 22K hGH tilsatt en human normal serumsammenblanding.

Det bindende antistoff er hGH-33 bg det detekterte antistoff er hGH-12 (biotinylert).

Et testsystem TR-FIA, "Time resolved fluorescent immuno assay" ble anvendt. Dette viser klart at det spesifikke antistoff virker perfekt på humant normalt serum og kan dermed anvendes for immunanalytisk deteksjon og kvantifisering.

DISKUSJON

Veksthormon finnes i biologiske væsker som en blanding av ulike hGH-isoformer i ulike tilstander av aggregering eller i komplekser. Nettoeffekten av denne ekstraordinære komplekse blanding på reseptorbinding og biologisk aktivitet er vanskelig å undersøke nøyaktig. Det er sannsynlig at mange hGH-isoformer konkurrerer om reseptorbinding, virker som partielle antagonister og/eller antagonister og kryssmodulerer bioaktiviteten av andre isoformer (25). Denne heterogenitet sammen med forskjellene blant antistoffer (både poly- og monoklonale) anvendt i analysene kan forklare uoverens-stemmelsene observert ved hGH-bestemme1sene (26).

Iirtmunanalyser baseres på eksistensen av epitop-spesifikke antistoffer. Anvendelsen av monoklonale antistoffer frembrakte en økning i både spesifisitet og sensitivitet, så

vel som i håndtering av disse analyser. Det er blitt fremstilt og karakterisert mAb for anvendelse som effektive hjelpemidler til å måle hGH-isoformkonsentrasjonen nøyaktig og til å forstå den tilsvarende biologi. Sandwich-type EIA og kompetitive RIA er utviklet for å detektere hver av disse varianter særskilt i buffersystemer, med sensitiviteter tilsvarende de tidligere beskrevet (12).

hGH 20K-hormonet har samme aminosyresekvens som hGH 22K, med unntak av en intern utelatelse av 15 aminosyrerester (E32-Q46). hGH 20K er blitt hevdet å ha ulike aktiviteter sammenlignet med hGH 22K (25) slik som redusert fremming av insulinlignende aktivitet, mer laktogen enn somatogen poten-sial (11) og redusert affinitet for hGH-reseptorer så vel som for reseptorbeslektet bindingsprotein (8,25). Videre er et spesifikt hGH 20K-bindingsprotein, ikke-reseptorbeslektet beskrevet (27, 28, 29). De fleste av disse data er imidlertid langt fra konklusive.

Monoklonale anti-hGH-antistoffer er blitt etablert av flere grupper (30, 31, 32) og mAb med økt respons mot hGH 22K sammenlignet med hGH 20K (33) er også blitt fremstilt. Det er her etablert to hybridomer som sekrerer mAb spesifikke for hGH 22K, ett for hGH 20K og ett som gjenkjenner begge isoformer like godt. I alle tilfeller har det dannede mAb høy affinitet (10B M"<1> til 10<10> M"<1>) og ubetydelig kryssreaktivitet med andre beslektede hormoner inkludert hGH-V, hPRL og hPL. Anti-hGH 2 0K-spesifikk antistoff ble dannet ved hjelp av nativt protein som immunogen. Det gjenkjenner trolig en konformasjonsepitop til stede bare i den korte hGH-form, siden dette mAb ikke gjenkjenner peptider inneholdende den nye E32-Q46-peptidbin-ding (data ikke vist) og det gjenkjenner ikke hGH 20K under betingelser som kan endre dets struktur (Western blot, adsorp-sjon til fast fase). I motsetning gjenkjenner de to hGH 22K-spesifikke mAb proteinet under denaturerende betingelser. Siden den eneste forskjell mellom 22K og 2OK er sletting av de 15 aminosyrer må hGH-25 og hGH-26 gjenkjenne en sekvens innenfor dette strekket på 15 aminosyrer.

Siden den biologiske aktivitet til hGH 20K og 22K ennå ikke er tydelig differensiert, ble effekten av disse mAb i en GH-aktivitetsanalyse undersøkt, ved hjelp av Ba/F3-celler som uttrykker hGHR/G-CSFR-kimærreseptor og utvalgt for vekst med hGH 22K. Disse celler prolifererer like godt i nærvær av både 22K og 20K. hGH-33 mAb blokkerer særskilt effekten av hGH 2OK, mens hGH-25 og 26 blokkerer særskilt 22K. Sekvensene som beskrives å være involvert i hGH 22K-reseptorbinding (34) er også til stede i hGH 20K. Dersom det antas at tilsvarende regioner på begge hormoner er innblandet i binding til reseptoren, burde isoformspesifikk blokkering av biologisk aktivitet ved hjelp av mAb ikke være mulig, dersom disse regioner fremviser konformasjonsforskjeller. Dette kunne muliggjøre spesifikk gjenkjenning av mAb og kunne forklare forskjellene i affinitet for hGH-reseptoren mellom disse to hormoner (8,25). Videre studier av de eksakte epitoper som gjenkjennes av disse mAb bør være av interesse for bestemmelse av strukturen til disse hormoner involvert i reseptorbinding.,

Oppsummert kan disse mAb anvendes til å kvantifisere hGH 22K og 20K i biologiske prøver, og på grunn av deres opp-førsel som spesifikke antagonister kan de anvendes ved bestemmelse av den fysiologiske rolle til disse isoformer.

Det er dermed blitt fremskaffet og karakterisert et sett av monoklonale antistoffer (mAb) spesifikke for de ulike humane veksthormon (hGH)-isoformer.

Disse antistoffer betegnes henholdsvis hGH-25, hGH-26, hGH-33 og hGH-12. Hvert antistoffs bindingsegenskaper til hGH-isoformene (22K og 20K) ble analysert i antistoff sandwich, direkte og kompetitive immunanalyser så vel som i Western blot.

hGH-33 er antistoffet som er spesifikt for hGH 2OK.

En hybridomcellelinje som uttrykker antistoffet

ifølge oppfinnelsen, mAb hGH-33, er blitt deponert under nummeret DSM ACC2254 den 28. februar 1996.

REFERANSER

(1) Li CH 1975 The chemistry of pituitary growth hormone: 1967-1973. ln: Li CH (ed) Hormonal proteins and peptides. Academic press. New York. vol. 3:1-40. (2) Lewis UD, Singh RNP,Tutwiler GF, Sigel MB, Vanderlaan EF, Vanderlaan WP 1980 Human growth hormone- a complex of proteins. Ree Prog Horm Res 36:477-504 (3) Baumann G 1990 Growth hormone binding proteins and various forms of growth hormone: implications for measurements. Acta Paediatr Scand (Supply 370:72-80 (4) Chen EY, Liao YC, Smith DH, Barrexa-Saldafia HA, Gelines RF, Seeburg PH 1989 The growth hormone locus: nucleotide sequence, biology and evolution. Genomks 4:479-497 (5) Barsh GS, Seeburg PH, Gelinas RE 1983 The human growth hormone gene famUy: structure and evolution of the chromosomal locus. Nuc Acid Res 11:3939-3058 (6) Lewis UJ, Dunn JT, Bonewald LF, Seavey BK Vanderlaan WP 1978 A naturally occuxring structural variant of human growth hormone. J Biol Chem 2533679-2687 (7) Lewis UJ, Bonewald LF, Lewis LJ1980 The 20,000-dalton variant of human growth hormone: location of the amino-acid deletions. Biochem Biophys Res Commun 92511-516 (8) Mc Carter J, Shaw MA, Winer LA, Baumann G1990 The 20,000 Da variant of human growth hormone does not bind to growth hormone receptors in human liver. Mol Cell Endocrinol 73:11-14 (9) Wohnlich L, Moore WV 1982 Binding of a variant of human growth hormone to liver plasma membranes. Horm Metab Res 14:138-141 (10) Frigeri LG, Peterson SM, Lewis UJ 1979,The 20,000-dalton structural variant of human growth hormone: Lack of some early insulin like effects. Bidchem Biophys Res Commun 91:778-782 (11) Lewis UJ 1992 Growth hormone. What is it and what does it do?. Trends Endocrin. Metabol. 3:117-121 (12) Chatelain P, Bouillat B, Cohen R, Sassolas G, Souberbielle JC, Ruitton A, Joly MO, Job JC11990 Assay of growth hormone levels in human plasma using commercial kits: analysis of some factors influencing the results. Acta Paediatr Scand (Suppl) 370:56-61 (13) Woodhead S, Turner G 1991 Accuracy of growth hormone measurements. Horm Res 36 (suppl):17-20 (14) Lewis UJ, Sinha YN, Haro LS 1994 Variant forms of human growth hormone in serum. Acta Paediatr (suppl) 399:29-31 (15) Galfre G, Howe SC, Milstein C, Butcher GW, Howard JC 1977

Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.

Nature 266:550-552

(16) Harlow E, Lane D. 1988 Antibodies, a laboratory manual In: Harlow I

and Lane D (eds). Cold Spring Harbor Laboratory. New york.

(17) Hoogenraad NJ, Wraight CJ. 1986 The effect of pristane on ascites tumor formation and monoclonal antibody production. Methods Enzymol 121:375-

381 (18) Ouchferlony 6. 1949 Antigen-antibody reactions in gels. Ark Kemi Mineral Geol 26:1, last page. (19) Fraker PJ, Speck JC 1978 Protein and cell membrane iodinations with a aparingly soluble chloramide, l^,4^tetrachloro-3a,6a-diphenylglycoluril.

Biochem Biophys Res Commun 80:849-857

(20) Hunter WM, Greenwood FC 1962 Preparation of iodine-131 labeUed human growth hormone of high spedfic activity. Nature 194:495-496 (21) Goding JW 1987 Monoclonal antibodies: principles and practice. 2nd ed.

Academic Press. London

(22) Scatchard G1949 The attractions of proteins for small molecules and ions.

Ann NY Acad Sc? 51:660-772

(23) Laemmli EK 1970 Cleavage of structural protins during the assembly of

the head of bacteriophage T4. Nature (London) 277:680-685

(24) Palacios R, Steinmetz M 1985 IL-3-dependent'mouse clones that express B-220 surface antigen, contains lg genes in germ-line confjguration, and generate B-lymphocytes in vivo. Cell 41:727-734 (25) Baumann G 1991 Metabolism of growth hormone (GH) and different molecular forms of GH in biological fluids. Hor. Res. 36:5-10. (26) Granada M, SanMarti A, Lucas A, Salinas I, Carrascosa A, Foz M, Audi L 1990. Assay-dependent results of immunoassayable spontaneous 24-hour growth hormone secretion in short children. Acta Pedriatr. Scand. 370:63-70. (27) Baumann G and Shaw MA 1990 Plasma transport of the 20,000-dalton variant of human growth hormone (20K): evidence for a 20K-specinc binding site. J Clin Endocrinol Melab 71:1339-1343 (28) Baumann G, Amburn K and Shaw MA 1988 The rirculating growth hormone (GH)-binding protein complex: a major constituent of plasma GH in man. Endocrinol 122.-976-984 (29) Baumann G and Shaw M1990 A second, Iower affinity growth hormone-binding protein in human plasma. J Clin Endocrinol Metab 70:680-686 (30) Wallis M and Daniels M 1983 Binding spedficity of monoclonal antibodies towards fragments of human growth hormone produced by plasmin digesuon. FEBS Letters 159241-245 (31) Basuyaux B, Paolucci F, OLavies C, Hervaud E, Pau B and Peyrouset A

1987 Production and characterization of monoclonal antibodies to human growth hormone. Hybridoma 6:423-431

(32) Ivanyi J 1982 Study of antigenic structure and inhibition of activity of

human growth hormone and chorionic somatomammotropin by monoclonal antibodies. Mol Immunol 19:1611-1618

(33) Nakanishi T, Matstu H and Nogiiehi H 1989 Monoclonal antibodies which preferently bind to 22K human growth hormone rather than its 20K

variant Endocrinol Japon 36:481-490

(34) Cunningham BQ Jhurani P, Ng P, Wells JA 1989 Receptor and antibody epitopes in human growth hormone idenhfied by homolog-scanning mutagenesis. Science 243:1330-1336

Claims (10)

1. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det er spesifikt for humant veksthormon (hGH) med molekylvekt 20kDa (hGH 20K) , der det monoklonale antistoffet har en affinitet for hGH 2OK på 1 x 10<*> M"<1> eller større, og en kryssreaktivitet på mindre enn 5 % med hGH med molekylvekt 22kDa (hGH 22K) , der det monoklonale antistoffet gjenkjenner den konformasjonsmessige epitopen som blir gjenkjent av mAb-33 som blir produsert av hybridomcelle-1injen som er deponert som DSM ACC 2254.;

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en affinitet til hGH 2OK på minst 1 x IO9M"<1> og helst mer enn 2 x IO<9>M*<1>.

3. Anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2 for måling av hGH 2OK in vi tro.

4. Anvendelse ifølge krav 3 for in vitro målinger i kroppsvæsker.

5. Anvendelse ifølge krav 4 for in vitro måling i serum.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 4 til 5 i multianalytisk analyse.

7. Anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2 for rensing av preparater inneholdende hGH 2OK.

8. Fremgangsmåte for immunanalytisk deteksjon og kvantifisering av hGH 20K, karakterisert ved at den omfatter trinnene:

1) en prøve inneholdende hGH 2OK og antistoffet ifølge krav 1 eller 2 bringes i kontakt for å danne et kompleks mellom antistoffet og hGH 20K i en mengde som står i forhold til mengden hGH 2OK og prøven, og

2) mengden kompleks dannet på en måte kjent per se bestemmes og mengden funnet relateres til mengden hGH 2OK i prøven.

9. Terapeutisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av det monoklonale antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2 i en farmasøytisk akseptabel bærersubstans.

10. Hybridomcellelinje, karakterisert ved at den fremstiller et monoklonalt antistoff ifølge krav 1.