JP2000508889A - ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合性モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト成長ホルモンの分子量２０ｋＤａ変異種に特異的に結合することのできるモノクローナル抗体に関する。このモノクローナル抗体は、分子量２２ｋＤａのｈＧＨには実質的に結合しない。本発明は、特に体液におけるｈＧＨ２０Ｋの測定のためのこのモノクローナル抗体の使用にも関する。この抗体は、特に血清におけるｈＧＨ ２０Ｋの検出および定量に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合性モノクローナル抗体 本発明は、ここでｈＧＨ ２０Ｋと呼ばれる人成長ホルモンの分子量２０ｋＤ ａ変異種に特異的に結合することができるモノクローナル抗体に関する。 このモノクローナル抗体は、分子量２２ｋＤａのｈＧＨに実質的に結合しない 。 本発明は、特に体液中におけるｈＧＨ ２０Ｋの測定のためのこのモノクロー ナル抗体の使用にも関する。 この抗体は、特に血清中におけるｈＧＨ ２０Ｋの検出および定量に用いるこ とができる。 抗体を生成するハイブリドーマ細胞系が、１９９６年２月２８日にＤＳＭ Ａ ＣＣ２２５４の名で寄託されている。 緒言 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、下垂体前葉腺により産生される（１、２）、 二つの鎖内ジスルフィド結合を有する１９１アミノ酸からなる、分子量２２ｋＤ ａの一本鎖ポリペプチド（ｈＧＨ ２２Ｋ）である。しかしながら、循環ｈＧＨ は、異 なる分子形態の複合混合物であり、それらのあるものは、分子量２０ｋＤａの一 本鎖ポリペプチドのヒト成長ホルモンであるｈＧＨ ２２ＫおよびｈＧＨ ２０ Ｋのような下垂体誘導のものであり、他のものは妊娠中の胎盤により分泌される （ｈＧＨ−Ｖ）ものである。さらに、他の刺激ホルモンである胎盤ラクトゲン（ ｈＰＬ）およびプロラクチン（ＰＲＬ）は、ｈＧＨとかなりの配列同一性を示す 。脱アミド化、アシル化、グリコシル化およびオリゴマー化（３）のような翻訳 後修飾から誘導された他のｈＧＨ分子変異種も記載されている。 ヒト成長ホルモンは、高度に相同性の胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）遺伝子と一緒 に染色体１７上にクラスターを形成している（４、５）、ｈＧＨ−ＮおよびｈＧ Ｈ−Ｖの二つの遺伝子によりコードされている。下垂体発現ｈＧＨ−Ｎ遺伝子の 主な生成物は、１９１−アミノ酸２２ＫのｈＧＨである この遺伝子の２次産物は、ポリペプチド鎖中アミノ酸３２〜４６の１５残基を 欠く、選択的ｍＲＮＡスプライシングにより誘導される２０ＫｈＧＨである（６ 、７）。このｈＧＨ ２０Ｋは、下垂体ｈＧＨの５〜１０％に相当するが（３） 、その生物学的特性はまだ明らかにされていない。これは、確かに２２ Ｋのイソホームの機能を共有しているが、特異的活性の証拠も示されている。す なわち、ｈＧＨ ２０Ｋは、ヒトの肝臓においてｈＧＨレセプターに結合しない （８）、または少なくとも低下した結合を示し（９）、インスリン様促進活性は 少ない（１０）。２０Ｋのイソホームは、ウサギ乳腺レセプターへの結合におい てｈＧＨと競合し、そのことは、下垂体切除ラットにおける成長を促進しさえす るが（１１）（例えばＥＰ５８７４２７も参照）、その効果がソマトゲンよりも ラクトゲン的であることを示している。 ｈＧＨ ２０Ｋは、ｈＧＨよりも遅い速度で排除され、循環系におけるｈＧＨ ２０Ｋのこの長期間滞留は、生体内における生物活性に予想されるよりも高度 に貢献していよう（Ｂａｕｍａｎｎら著、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１１ ７巻、Ｎｏ．４、１３０９〜１３頁、１９８５年）。 ＥＰ５８７ ４２７において、組み換え法によるｈＧＨ ２０Ｋを産生させる 方法が開示されている。 このペプチドホルモンファミリーの臨床的関連性に拘わらず、循環しているイ ソホームの濃度、または複合混合物の各分子形態の相対的貢献についての情報は ほとんどない。ｈＧＨ ２２ ＫおよびｈＧＨ ２０Ｋ濃度を定めるための選択的アッセイは、診断および基礎 研究の両方に価値がある（１２、１３、１４）。これらのタンパク質の効果を特 異的に阻害するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のようなツールは、その特異的生 物学的作用の理解を助けるのに大きく寄与し得る。循環系におけるｈＧＨ２２Ｋ およびｈＧＨ ２０Ｋ間の関係および量は、特定の病気および、糖尿、末端肥大 症、慢性肝炎及び／又は腎臓病のような病気の状態に重要であることが示され、 ２０ｋＤａを測定するための特異的および正確な方法がこのようにおおいに必要 とされている。 ｈＧＨ ２０Ｋ特異的ｍＡｂの使用に基づく特異的検出および定量のための方 法は今日存在しない。ｈＧＨ ２０Ｋのための免疫アッセイを開発する目的でｈ ＧＨ ２０Ｋ特異的ｍＡｂを生成させる試みがなされたが、成功していない。Ｆ Ｇｏｍｅｚら著、Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、第５（３６４）巻、１ ４５〜１５７頁（１９８４年版）を参照することができ、１５５頁には、「２０ Ｋ ＧＨの正確な病態生理学的関連性はいまだあまり知られていないが、高度の 特異性を有するモノクローナル抗ｈＧＨ ２０Ｋ抗体を先ず得て、そのための免 疫ア ッセイを開発することが適切であると思った。それにもかかわらず、高度に精製 された変異種の調製を伴う動物の選択的免疫化にもよらず、特異的抗２０Ｋ抗体 を分泌する安定なハイブリドーマは得られなかった。」と記載されている。 長期間、ｈＧＨ ２０Ｋを測定するための特異的かつ正確な方法において用い ることのできる特異性の高いｈＧＨ ２０Ｋ抗体が求められてきた。 そのような抗体は、ｈＧＨ ２０Ｋの生物学的活性を阻害する際の治療的用途 に用いることもできよう。 我々は、ｈＧＨ ２０Ｋに特異的なｍＡｂを生成させて、ｈＧＨ ２０Ｋの検 出および定量に用いられる溶液を見い出した。 このｍＡｂは、アッセイにおける異なる種類のこのホルモンの特異的検出にう まく用いられ、その生物学的活性を特異的に阻害することも発見された。その理 由から、このｍＡｂは、このホルモンの生物学的活性を研究し、その生物学的意 義を分析することにも有用である。 特定の実施例において、我々はこのｍＡｂの生成および特性付けを記載してい る。比較抗体として、ｈＧＨ ２２Ｋに特異的であるモノクローナル抗体および ｈＧＨ ２０ＫおよびｈＧ Ｈ ２２Ｋの両方を認識するモノクローナル抗体も記載している。 図面の説明 図１ （Ａ−Ｃ）：非標識ｒｈＧＨ−２２Ｋ、ｈＧＨ−２０Ｋ、ｈＧＨ−Ｖ、 ｈＰＬおよびｈＰＲＬとのｍＡｂ−¹²⁵Ｉ−ｈＧＨ（２０Ｋまたは２２Ｋ）の結 合の阻害。図は、ｍＡｂ ｈＧＨ−３３（図１Ａ）、ｈＧＨ−１２（図１Ｂ）お よびｈＧＨ２５（図１Ｃ）に対応する。 図２ ｈＧＨイソホームの特異的検出のためのサンドイッチ捕獲アッセイ。ｈ ＧＨ ２２Ｋ（図２Ａ）およびｈＧＨ ２０Ｋ（図２Ｂ）。 図３ キメラｈＧＨＲ／Ｇ−ＣＳＦ形質転換Ｂａ／Ｆ３細胞のｈＧＨ ２２Ｋ および２０Ｋによる成長刺激。 図４ Ｂａ／Ｆ３形質転換細胞へのｈＧＨ ２２Ｋおよび２０Ｋの活性のモノ クローナル抗体阻害 図５ ヒト正常血清プールに添加されたｈＧＨ ２０Ｋおよび２２Ｋの用量応 答。 本発明 本発明は、我々によって測定され実験部に記載されているよ うに、１×１０⁸Ｍ^-1またはそれ以上、好ましくは少なくとも１×１０⁹Ｍ^-1、よ り好ましくは２×１０⁹Ｍ^-1以上のｈＧＨ２０Ｋへの親和性を有する、分子量２ ０ｋＤａ（ｈＧＨ ２０Ｋ）のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に特異的なモノクロ ーナル抗体に関する。 本発明の抗体は、分子量２０ｋＤａ（ｈＧＨ ２０Ｋ）のヒト成長ホルモン（ ｈＧＨ）に結合することができ、５％未満、好ましくは１％未満の分子量２２ｋ ＤａのｈＧＨとの交差反応がある。ｈＧＨ−Ｖ、胎盤ラクトゲンおよびプロラク チンとの交差反応性は小さく、実験部に測定されているように、好ましくは５％ 未満、より好ましくは１％未満である。 また、以下のホルモンを交差反応性について試験し、５％未満、さらには１％ 未満の交差反応性が示された：黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロ ピン（ＨＣＧ）、小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ Ｈ）。 このモノクローナル抗体を、例えば、血清、血漿、血液、唾液、尿、リンパ液 などのような体液中におけるｈＧＨ ２０Ｋの測定に用いることができる。本発 明の抗体は、このホルモンを含むサンプル中におけるｈＧＨ ２０Ｋの免疫アッ セイ測定 に用いることができる。免疫アッセイの種々の形式は当分野において良く知られ ており、以下の工程を含む： １） ｈＧＨ ２０Ｋを含むサンプルを本発明の抗体に接触させて、サンプル中 のｈＧＨ ２０Ｋの量に相応する量のｈＧＨ２０Ｋと抗体との間の複合体を形成 させ、 ２） それ自体知られている方法で形成された複合体の量を測定し、見い出され た量をサンプル中のｈＧＨ ２０Ｋの量に対応させる。 免疫アッセイは不均質または均質、競合的または非競合的（サンドイッチ）で あり得る。多くの場合の種々の形式において、標識された免疫試薬を用いる。こ の場合、形成された複合体の量の測定を容易にするために、酵素、放射性同位体 、ビオチン、蛍光団、発色団などで標識化したｈＧＨ ２０ＫまたはｈＧＨ２０ Ｋに結合する抗体またはｈＧＨ ２０Ｋに結合する抗抗体（例えば抗マウスＩｇ ）を用いる。 本発明の抗体は、固相に、直接にまたは本発明の抗体に結合した別の抗体を介 して間接的に、結合することができる。本発明の抗体は溶液状で用いることもで きる。 幾つかの形式において、抗抗血清および固相結合抗抗体のよ うな沈降剤を用いることができる。 本発明の抗体は、複数分析アッセイ、例えば、ｈＧＨの異なるイソホームの測 定のために用いることができる。 免疫組織化学染色により異なる種（例えば、サル、ウサギ、イヌ、ラット）か らの組織中のｈＧＨ ２０Ｋの検出への使用が示唆される。 本発明のモノクローナル抗体の使用は、ｈＧＨ ２０Ｋを含むサンプルの精製 に用いることもできる。 ｈＧＨ ２０Ｋはそれ自体治療効果を有することが示唆されているので、薬学 的に許容できるキャリア物質中に治療有効量のモノクローナル抗体を含む治療組 成物も、この組成物を投与することにより２０Ｋの量を減少させる必要のある患 者を治療する方法と共に、本発明である。 定義 体液は、例えば、血清、血漿、リンパ液、全血、尿、唾液、脊髄液、組織培養 培地、細胞抽出物を意味する。 ｈＧＨはヒト成長ホルモンを意味し、ｈＧＨ ２０Ｋは分子量２０ｋＤａのｈ ＧＨの変異種を意味し、ｈＧＨ ２２Ｋは分子量２２ｋＤａのｈＧＨの変異種を 意味する。 ｍＡｂ ｈＧＨ−３３は、分子量２２ｋＤａのｈＧＨとは殆ど交差反応せず分 子量２０ｋＤａのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に結合することのできる、我々が 発見したモノクローナル抗体であり、本発明により包含される。 ｍＡｂ ｈＧＨ−１２は、分子量２０ｋＤａのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と 分子量２２ｋＤａのｈＧＨの両方に等しく良好に結合することのできるモノクロ ーナル抗体である。 ｍＡｂ ｈＧＨ−２５およびｍＡｂ ｈＧＨ−２６は、分子量２２ｋＤａのヒ ト成長ホルモン（ｈＧＨ）と結合することができ、分子量２０ｋＤａのｈＧＨと 交差反応しないモノクローナル抗体である。 抗体（ａｂ）という用語は、抗原結合抗体フラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａ ｂ２、一本鎖Ｆｖなど）、キメラ（クラス−クラスおよび種−種）抗体、溶融抗 体および組み換え抗体を意味する。 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ｃｐｍ １分間のカウント数 ＥＩＡ 酵素関連免疫アッセイ ＦＣＳ ウシ胎児血清 ｈＧＨＲ ヒト成長ホルモンレセプター Ｇ−ＣＳＦＲ 顆粒球コロニー刺激レセプター ＰＢＳ 燐酸塩緩衝塩水 ＰＥＧ ポリエチレングリコール 実験、材料および方法 材料 組み換えヒトＧＨ２２Ｋ（ｒｈＧＨ ２２Ｋ、Ｇｅｎｏｔｒ ｏｐｉｎ）およ び組み換えヒトＧＨ変異種（ｒｈＧＨ−Ｖ）は、ファーマシア・ペプチド・ホル モンズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＰｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ：スエーデン） から得た。精製ホルモンＧＨ２０Ｋは、ポール・ルーズ（Ｐａｕｌ Ｒｏｏｓ） 教授（Ｕｐｐｓａｌａ、スエーデン）から得た。精製ｈＰＬ、ｈＰＲＬおよびｈ ＧＨ−２２Ｋは、パーロウ博士（Ｄｒ．Ａ．Ｆ．Ｐａｒｌｏｗ）（Ｐｉｔｕｉｔ ａｒｙ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｓｅｒａ Ｃｅｎｔｅｒ、米国メ リーランド）から得た。 免疫処理 ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７／ＢＬ１０およびＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを、フロイント完 全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ製、米国）で乳化した滅菌燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）０．１ｍｌ中 のタンパク質１０〜４０μｇで皮下的に免疫処理した。マウスに３０日および６ ０日目に、フロイント不完全アジュバント中のタンパク質２０μｇを投与し、９ ０日目にＰＢＳ中で腹腔内に投与した。細胞融合の前に、マウスに３日前および ２日前に、滅菌ＰＢＳ中のホルモン４０μｇを静脈内投与した。 免疫処理したマウスからの血清を、各投与後７〜１０日に収集し、特異的抗体 の存在を酵素関連（ＥＩＡ）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）において決めた 。 細胞融合およびモノクローナル抗体の製造 融合剤としてポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ製、独国）を用い 標準的プロトコール（１５、１６）に従って、マウスの脾臓および／またはリン パ節からの細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞系（ＣＲＬ１５８０、Ａ ＴＣＣ）と融合させた。 上澄みを、安定な抗体生成が達成されるまで、胸腺細胞供給層を用いる制限希 釈により、安定化された陽性ハイブリドーマおよびＥＩＡまたはＲＩＡにより抗 体の存在について試験した。 ハイブリドーマは、１０％ＦＣＳのＰＲＭＩ−１６４０中で、抗生物質の不存在 下において５％ＣＯ₂、３７℃で成長させた。 モノクローナル抗体は、組織培養物上澄み中、およびプリスタン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）注射マウス（１７）で誘発した腹水中の両方にお いて産生され、それらを硫酸アンモニウム沈殿（１６）及び／又は固定化タンパ ク質−Ａのセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、スエー デン）上の親和クロマトグラフィーにより精製した。 各ｍＡｂの放射性同位体を、クラスおよびサブクラス特異的抗血清（ＩＣＮ） を用いてＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ二重拡散アッセイ（１８）において測定した。 タンパク質のヨウ素化およびビオチン化 ホルモン（５０μＭ燐酸ナトリウム緩衝液２０ｍｌ中に２．５μｇ、ｐＨ７． ６）を、酸化剤としてヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）被覆管（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（１９）またはクロラミン−Ｔ（２０）を用いてヨウ 素化した。ヨウ素化ホルモンを、ＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のゲル濾過により導入されなかった標識から分離 した。標識化ホルモンの比活性は、１０〜５０ μＣｉ／μｇであった。ビオチン化を、（２１）に記載されているように行った 。ホルモンおよびｍＡｂ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ０．５ｍｌ中に０．５ｍｇ、０ ．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９）を、ジメチルスルホキシド中のＮ−ヒドロキシス クシンイミドビオチン１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１ Ｃｏ．） ５０μｌと、室温で１２０分間インキュベートした。非結合ビオチンを、ＰＢＳ で透析することにより除去した。ビオチン標識タンパク質をグリセロールで１／ ２に希釈し、−２０℃で貯蔵した。 酵素関連免疫アッセイ 抗体への抗原提示の機構が異なる三つの異なる酵素関連免疫アッセイ（ＥＩＡ ）（抗体、抗原およびサンドイッチ捕獲）を行った。 １．酵素関連免疫アッセイ−抗体捕獲 ホルモン（ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウエル）を、微量プレー ト（Ｍａｘｉ−ｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）に４℃で一晩吸着させた。残りのタンパク 質結合部位を、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡでブロックした。蒸留水でプレートを洗 浄後、ｍＡｂを３７℃で６０分間インキュベートし、続いてペルオキシダーゼ 標識化ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（ＧＡＭ−ＰＯ）（Ｔａｇｏ，Ｉｎｃ． ）およびｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ、０．１５Ｍクエン酸ナトリ ウム緩衝液中４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ．）とインキュベートした。反応を３Ｎ硫酸で終了させ、光学密度を４９２ｎｍ で測定した。 ２．酵素関連免疫アッセイ−抗原捕獲 モノクローナル抗体を、固相に、直接（ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌ）または親和性 精製ＧＡＭ抗体を介して吸着させた。ブロック後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ 中で１／５００〜１／１０００に希釈したビオチン標識化ホルモンを３７℃で６ ０分間インキュベートし、続いてペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン（ Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を３７℃で３０分間およびＯＰＤとイ ンキュベートした。反応を前述のように終了させた。 ３．酵素関連免疫アッセイ−サンドイッチ捕獲 精製ｍＡｂ（ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌ）を、微量プレート上に吸着させた。４℃ で一晩インキュベートし、０．５％ＢＳＡで阻害した後、ＰＢＳ−０．５％ＢＳ Ａ中のホルモン希釈物を添 加し、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、最良の結合を与えるよう に予め力価測定した第２のビオチン標識化ｍＡｂ（ｍＡｂ ｈＧＨ−１２）を添 加した。ｍＡｂ ｈＧＨ−１２を第２の抗体として用い、両方の分子形態が認め られた。その後、ペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンおよびＯＰＤを添 加した。反応を前述のように終了させた。 放射免疫アッセイ−固相 抗体を、親和性精製ＧＡＭ抗体（ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌ）を介してＲＩＡ ウエルストリップ（Ｃｏｓｔａｒ）に吸着させた。ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡでブ ロック後、ヨウ素標識化ホルモンを添加（２００００ｃｐｍ／ウエル）し、３７ ℃で１２０分間インキュベートした。蒸留水で洗浄後、結合放射能を計測した。 放射免疫アッセイ−液相 1／2最大結合を与えるように１０ｍＭ燐酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、 １０ｍＭＥＤＴＡ、０．２５％ＢＳＡ、ｐＨ７．６（ＲＩＡ緩衝液）中に希釈し た抗体（１００μ１／管）を、競合剤としての非標識化ホルモンの存在または不 存在下に、ＲＩＡ緩衝液１００μｌ中のヨウ素標識化ホルモン３００００ ｃｐｍとインキュベートした。正常マウス血清を、最終反応液体積中０．２５％ となるように添加した。一晩室温でインキュベートした後、結合および非結合ホ ルモンの４００μｌを、５％ＧＡＭ抗血清２００μｌおよび１５％ＰＥＧ６００ ０（Ｍｅｒｃｋ）２００μｌと室温で６０分間インキュベートすることにより、 分離し、続いて１５２０×ｇで２０分間遠心分離した。ペレット中の残留放射能 を、ガンマ放射カウンターにおいて計測した。 親和定数および交差反応性決定 ｍＡｂの見掛け親和定数（Ｋ_a）を、競合ＲＩＡデータ（２２）のＳｃａｔｃ ｈａｒｄプロット分析により計算した。交差反応性を、ｍＡｂに結合するトレー サーの等量置換に必要な競合剤の量と定義した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロット ホルモン（各１５μｇ）を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（２３）に従って、１５％ （ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。ゲルをクマシ ーブルーで染色し、または、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、３９ｍＭグリシン、０． ０３７％ＳＤＳを含む２０％メタノール緩衝液中において２５０ｍＡにて ６０分間で、半乾燥ブロッター（Ｂｉｏ Ｒａｄ）上のニトロセルロースに移し た。ＰＢＳ中１０％脱脂乾燥乳でブロック後、ｍＡｂを室温で攪拌下に１２０分 間インキュベートし、続いて、１／２５００希釈ＧＡＭ−ＰＯ抗体（Ｔａｇｏ Ｉｎｃ．）とインキュベートした。ブロットを、４−クロロ−１−ナフトール基 質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）を用いて展開した。 細胞増殖アッセイ キメラ構築物ｈＧＨＲ／Ｇ−ＣＳＦＲで形質転換したＢａ／Ｆ３細胞を、ＩＬ −３（１０Ｕ／ｍｌ）および１０％ＦＣＳを補足したＰＲＭＩ−１６４０培地中 に３７℃、５％ＣＯ₂で成長させた。細胞（２０×１０⁵細胞／ｍｌ）を、ＩＬ− ３を含まない同じ培地中で洗い、細胞懸濁液２５μｌを９６ウエルプレートに添 加した。細胞を最終体積１００μｌとなる種々の濃度（０．００１〜１０ｎＭ） のホルモンにて３７℃で１８時間処理した。競合アッセイにおいて、異なる濃度 の精製ｍＡｂ（１〜４５０ｎＭ）およびホルモン（０．００１〜１０ｎＭ）を４ ℃で１８時間予備インキュベートしてから、細胞を処理した。ＤＮＡ合成を分析 するために、³Ｈ−チミジン１μＣｉ／ウエル を添加した（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。５％ＣＯ₂中３７℃で４時間インキュベート した後、細胞を収集し、ガラスフィルター上で洗った。放射能をβカウンターで 計測した。 結果実施例１． 抗体捕獲ＥＩＡ中の血清の分析 ｈＧＨ ２０Ｋまたは２２Ｋ免疫化マウスからの血清を、抗体捕獲ＥＩＡで分 析すると、用いるスクリーニングアッセイおよび使用するイムノゲンに依存して 、１／５００〜１／１０，００００の力価量（１／２最大結合を得る抗血清希釈 ）で、全てのマウスが対応するイムノゲンに反応した。 ｈＧＨ ２０Ｋ免疫化マウスからの血清を、固相結合ｈＧＨ２０ＫおよびｈＧ Ｈ ２２Ｋを用いて抗体捕獲ＥＩＡにおいて分析した。力価範囲は両方のホルモ ンについて１／５００〜１／１０，０００であり、これは２２ＫまたはｈＧＨ ２０Ｋへの特異性が無いことを示している。実施例２． 放射免疫アッセイ−固相 融合後、¹²⁵Ｉ−ｈＧＨ ２０Ｋを用いる固相ＲＩＡによりハイブリドーマク ローンをスクリーニングし、８つのハイブリドーマが結合活性を示した（背景の ８倍以上）。１つの抗体の みが固相ＲＩＡにおいて¹²⁵Ｉ−ｈＧＨ ２２Ｋを認識できず、それを安定化お よびさらなる特性付け（ｈＧＨ−３３）のために選択した。他の７つの抗体は、 ｈＧＨ ２０Ｋおよび２２Ｋの両方を認識した。実施例３． 放射免疫アッセイ−液相 ｈＧＨ ２２Ｋで免疫処理したマウスからの血清を、２２Ｋタンパク質につい て液相ＲＩＡで分析した。全ての血清がイムノゲンについて高い力価（＞１／１ ０，０００）を示し、次の細胞融合のためにマウスを用いた。融合後、¹²⁵Ｉ− ｈＧＨ２２Ｋを結合する抗体を生産するハイブリッドを選択および安定化した。 二つはｈＧＨ ２２Ｋ特異的（ｍＡｂｈＧＨ ２５およびｍＡｂｈＧＨ ２６） であり、一方（ｍＡｂｈＧＨ−１２）は二つの分子形態を等しく良好に認識した 。実施例４． 抗原捕獲ＥＩＡおよび競合液相ＲＩＡ 実施例２の選択されたハイブリッドを、競合剤としてビオチン標識化および非 標識化ホルモンを用いる抗原捕獲ＥＩＡにおいて、または競合液相ＲＩＡにおい て試験した。ｍＡｂ ｈＧＨ−３３、および対照ｍＡｂである３つのｈＧＨ ２ ５、ｈＧＨ ２６およびｈＧＨ−１２のそれぞれの結合特性を表１に要約する。 ホルモンの定量のために、ヨウ素標識ホルモンおよび特異的ｍＡｂを用いる競 合的ＲＩＡを使用した。図１において、非標識化ｒｈＧＨ ２２Ｋ、ｈＧＨ ２ ０Ｋ−Ｖ、ｈＰＬおよびｈＰＲＬと結合するｍＡｂ−¹²⁵Ｉ−ｈＧＨ（２０Ｋま たは２２Ｋ）の阻害を示す。 図１Ａ〜１Ｃは、ｍＡｂｈＧＨ−３３（Ａ）、ｈＧＨ−１２（Ｂ）およびｈＧ Ｈ ２５（Ｃ）に対応する。結合ＧＨは、ペレット中に存在する放射能であり、 適用した全¹²⁵Ｉ−ｈＧＨの％として表す。 ｈＧＨ−２５ｍＡｂをｈＧＨ ２２Ｋについて使用し、このイソホームについ ての検出限界は０．２５ｎＭであり、残りの試験したホルモン（ｈＧＨ ２０Ｋ −Ｖ、ｈＧＨ−Ｖ、ｈＰＬおよびｈＰＲＬ）は、１００倍の高い濃度においても 競合しなかった（図１Ｃ）。ｈＧＨ ２０ＫについてｈＧＨ−３３ｍＡｂを用い 、この検出限界は０．５ｎＭであり、試験したホルモンの残りについて無視し得 る競合が観察された（図１Ａ）。 ¹²⁵Ｉ−ｈＧＨ ２０Ｋを用いる競合ＲＩＡからのデータは、（ｍＡｂ）ｈＧ Ｈ−３３が、ｈＧＨ ２０Ｋについて２．２×１０⁹Ｍ−１の見掛けＫ_aおよび、 ｈＧＨ ２２Ｋ、ｈＧＨ−Ｖ、 ｈＰＬおよびｈＰＲＬと１％未満の交差反応性を有することを示した（図１Ａ） 。 ｍＡｂｈＧＨ−１２は、ｈＧＨ−Ｖ、ｈＧＨ ２０ＫおよびｈＧＨ ２２Ｋを 等しく良好に認識し、ｈＰＬについて４０％の交差反応を示し、ｈＰＲＬと１％ 未満の交差反応性を示す（図１Ｂ）。他の２つのｍＡｂ（ｈＧＨ ２５およびｈ ＧＨ ２６）は、ｈＧＨ ２２Ｋ特異的で、関連ホルモンに対する無視し得る交 差反応性および１０⁸〜１０¹⁰Ｍ^-1の見掛けＫ_aを示す（図１Ｃ）。 表１：モノクローナル抗体の主要特性 ¹：見掛け親和定数は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析を用いて、ｈＧＨ２２ Ｋ（ｈＧＨ−２５、２６および１２）またはｈＧＨ２０Ｋ（ｈＧＨ−３３）によ り競合ＲＩＡから計算した。² ：交差反応性は、ｍＡｂからの標識化ホルモンの５０％置換に必要な非標識ホ ルモンの量の逆数％として表される。実施例５． 抗体捕獲ＥＩＡ 抗体捕獲ＥＩＡにおいて、ｍＡｂの結合特性は変化する。ｍＡｂｈＧＨ−３３ は、固相吸着ホルモンを認識しないが、ｍＡｂｈＧＨ−１２、ｈＧＨ ２５およ びｈＧＨ ２６（データは示さず）の場合はそうではない。実施例６． サンドイッチアッセイ 種々のｈＧＨ分子形態の特異的検出のためのこれらｍＡｂの使用可能性を試験 するために、２つの異なるサンドイッチアッセイを開発した。各々において、イ ソホーム特異的ｍＡｂを捕獲抗体として用い、ｈＧＨ ２０Ｋの場合はｈＧＨ− ３３、およびｈＧＨ ２２ＫについてはｈＧＨ ２６を用いる。両方のアッセイ において、ビオチン標識化ｍＡｂ ｈＧＨ−１２を第２の抗体として用いたが、 それは両方の分子形態物を認識する。 各特異的アッセイの感受性は、ｈＧＨ ２２Ｋについて０．２ｎＭ、およびｈ ＧＨ ２０Ｋについて０．２ｎＭであり、他の関連ホルモンについては交差反応 が観察されなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。実施例７． ウエスタンブロット 抗体ｈＧＨ ２５およびｈＧＨ ２６は、還元および非還元 の両方の条件下、ウエスタンブロッドにおいて対応する精製ホルモンを特異的に 認識した。ｈＧＨ−３３ｍＡｂは、抗体捕獲ＥＩＡにおけるその結合特性から予 想されるように、ウエスタンブロッドにおいてｈＧＨ ２０Ｋを認識しない。実施例８． 細胞増殖 ｈＧＨイソホームに特異的な抗体を、ｈＧＨ依存細胞増殖を阻害する性能を試 験することにより、機能的に特性付けた。ｈＧＨ ２２ＫおよびｈＧＨ ２０Ｋ に応答した、キメラｈＧＨＲ／Ｇ−ＣＳＦ形質転換Ｂａ／Ｆ３細胞の成長促進。 細胞を、ホルモン濃度を上昇させてホルモンで１８時間処理した。ＤＮＡ合成を 、³Ｈ−チミジン組み込みにより測定した。 野生型Ｂａ／Ｆ３細胞は、外因性ＩＬ−３をインビトロ培養において成長する ために要求する（２４）。Ｂａ／Ｆ３細胞を、ｈＧＨレセプターの細胞質外領域 およびＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）レセプターの膜透過および細胞質 内領域を含むキメラ遺伝子で形質転換した。野生型および形質転換した細胞の両 方が、外因性ＩＬ−３の存在下に成、長するが、形質転換した細胞のみがヒトＧ Ｈの存在下に増殖する。図３に示すように、ｈＧＨ ２０Ｋおよび２２Ｋの両方 が形質転換した細胞において 等しい増殖を促進する。両方の場合において、最大効果のホルモン濃度領域は２ 〜１０ｎＭであった。 Ｂａ／Ｆ３形質転換処理細胞へのｈＧＨ ２２Ｋおよび２０Ｋ活性のモノクロ ーナル抗体阻害：ホルモン（１ｎＭ）を、培地に添加する前に、７４ｎＭ ｈＧ Ｈ−３３および２２２ｎＭｈＧＨ−１２、２５および２６により４℃で１８時間 予備インキュベートした。図４のデータは、示される標準偏差を有する３回決定 の平均を表す。 ｈＧＨ ２２Ｋ誘発増殖は、ｍＡｂｈＧＨ ２５およびｈＧＨ ２６により特 異的に阻害されたが、ｈＧＨ−３３によっては阻害されず、またｈＧＨ ２０Ｋ 誘発増殖はｈＧＨ−３３によってのみ抑制された（図４）。両方のホルモンを液 相において等しく良好に認識するｈＧＨ−１２ｍＡｂは、高親和性のｈＧＨ（２ ２および２０Ｋ）−ＧＨＢＰ／ＧＨＰ複合体を結合および免疫沈殿させるがｈＧ Ｈ ２２Ｋおよび２０Ｋの部分的阻害効果を示す。実施例９． 血清サンプルにおけるｈＧＨ ２０Ｋの検出および定量 体液の例として、正常ヒト血清を用いて、２０Ｋの定量のた めの使用および特異性についてのサンドイッチアッセイを調べる。 このアッセイにおいて、２０Ｋ特異的抗体であるｈＧＨ−３３を捕獲抗体とし て用い、検出抗体としてビオチン標識化ｈＧＨ−１２を用いた。信号を測定する ために、時間分解蛍光光度法（ＴＲＦ）を用いた。 ヒト正常血清プールを、ｈＧＨ ２０ＫおよびｈＧＨ ２２Ｋの用量応答試験 に用いた。ｈＧＨ ２０Ｋの０．５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度増加により、応答信 号が増加した。ｈＧＨ ２２Ｋ５０ｎｇ／ｍｌの添加は、アッセイにおいて検出 することができなかった。ｈＧＨ ２２Ｋ濃度の５００ｎｇ／ｍｌへの増加によ り信号が弱くなり、２０Ｋサンドイッチアッセイにおいて交差反応性が０．５％ より低く計算された（図５）。 感受性のレベルは０．５ｎｇ／ｍｌより低い。 図５において、ヒト正常血清プールに添加したｈＧＨ ２０Ｋおよび２２Ｋの 用量応答を示す。 捕獲抗体はｈＧＨ−３３であり、検出抗体はｈＧＨ−１２である（ビオチン化 されている）。 試験システムとして、ＴＲ−ＦＩＡ、すなわち時間分解蛍光 イムノアッセイを用いた。これは、特異的抗体がヒト正常血清において完全に働 いており、免疫アッセイ検出および定量化に用い得ることを明らかに示している 。 考察 成長ホルモンは、生物体液中に、種々の状態の集合体または複合物中の幾つか のｈＧＨイソホームの混合物として存在する。この特別な複合体混合物のレセプ ター結合および生物学的活性への真の効果は、正確に評価することが困難である 。ｈＧＨ形態の多くがレセプター結合のために競合し、部分的作用薬及び／又は 拮抗薬として作用し、他のイソホームの生物活性を交差的に調節するようである （２５）。この異質性は、アッセイで用いられる抗体（ポリおよびモノクローナ ル）の相違とともに、ｈＧＨ測定で観察される不一致を説明し得る（２６）。 免疫アッセイは、エピトープ特異的抗体の存在に基づく。モノクローナル抗体 の使用は、特異性および感受性を増加し、およびこれらアッセイの取り扱いを増 加する。ｈＧＨイソホーム濃度を正確に測定し、対応する生物学を理解するため の効率的なツールとして用いるために、我々はｍＡｂを製造し特性付けた。 先に記載されたものに匹敵する感受性を有する緩衝液系において特異的にこれ らの変異種の各々を検出するためのサンドイッチ型ＥＩＡおよび競合ＲＩＡが開 発された（１２）。 ｈＧＨ ２０Ｋホルモンは、１５アミノ酸残基（Ｅ３２〜Ｑ４６）が内部で除 去されている以外はｈＧＨ ２２Ｋと同じアミノ酸配列を有する。ｈＧＨ ２２ Ｋと比較して異なる活性がｈＧＨ ２０Ｋについて記載され（２５）、それは、 インシュリン様活性の促進の低下、ソマトゲン的であるよりもよりラクトゲン的 であり（１１）、ｈＧＨレセプターおよびレセプター関連結合タンパク質への親 和性が低下している（８、２５）ことである。さらに、非レセプター関連の特異 的ｈＧＨ ２０Ｋ結合タンパク質が記載されている（２７、２８、２９）。しか しながら、これらのデータの大部分が結論につながらない。 モノクローナル抗−ｈＧＨ抗体が、幾つかの研究グループにより樹立され（３ ０、３１、３２）、ｈＧＨ ２０Ｋに比較してｈＧＨ ２２Ｋに対する反応が向 上しているｍＡｂも生成された（３３）。我々は、ｈＧＨ ２２Ｋに特異的なｍ Ａｂを分泌する２つのハイブリドーマであって、その一方はｈＧＨ ２０Ｋを、 他方は両方のイソホームを等しく良好に認識するものを 確立した。全ての場合において、高度の親和性（１０８Ｍ^-1〜１０¹⁰Ｍ^-1）、お よび生成したｍＡｂは、ｈＧＨ−Ｖ、ｈＰＲＬおよびｈＰＬを含む他の関連ホル モンへの無視し得る交差反応性を有する。抗−ｈＧＨ ２０Ｋ特異的抗体を、イ ムノゲンとして天然タンパク質を用いて生成させた。これは、おそらく、短いｈ ＧＨ形態としてのみ存在する立体配座エピトープを認識し、このｍＡｂは、新規 Ｅ３２〜Ｑ４６ペプチド結合（データは示さず）を含むペプチドを認識せず、そ の構造を変化させるような条件下においてｈＧＨ ２０Ｋを認識しない（ウエス タンブロット、固相への吸着）。対照的に、この２つのｈＧＨ ２２Ｋ特異的ｍ Ａｂは、変性条件下にタンパク質を認識する。２２Ｋと２０Ｋとの唯一の相違が １５アミノ酸欠失であり、ｈＧＨ ２５およびｈＧＨ ２６はこの１５アミノ酸 列内中において配列を認識しなくてはならない。 ｈＧＨ ２０Ｋおよび２２Ｋの生物学的活性は明確に区別されていないので、 ｈＧＨＲ／Ｇ−ＣＳＦＲキメラレセプターを発現しｈＧＨ ２２Ｋによる成長に ついて選択されたＢａ／Ｆ３細胞を用いて、ＧＨ活性アッセイにおいて我々はこ れらｍＡｂの効果を試験した。これらの細胞は、２２Ｋおよび２０Ｋの 両方の存在下に等しく良好に増殖する。ｈＧＨ−３３ｍＡｂは、ｈＧＨ ２０Ｋ の効果を特異的に阻害し、ｈＧＨ ２５および２６は、２２Ｋの効果を特異的に 阻害する。ｈＧＨ ２２Ｋレセプター結合（３４）にかかわっていると記載され ている配列は、ｈＧＨ ２０Ｋ中にも存在する。両方のホルモン上の類似の領域 がレセプターへの結合にかかっているとすると、ｍＡｂを用いる生物学的活性の イソホーム特異的阻害は、これらの領域が立体配座的相違を示さなければ、可能 でないはずである。これにより、ｍＡｂによる特異的認識が可能になり、これら の２つのホルモン間のｈＧＨレセプターへの親和性の相違を説明することができ る（８、２５）。これらｍＡｂにより認識される正確なエピトープのさらなる研 究は、レセプター結合に含まれるこれらのホルモン構造の明確化に有意義である 。 要約すれば、これらのｍＡｂは、生物学的サンプルにおいてｈＧＨ ２２Ｋお よび２０Ｋを定性分析するために用いることができ、特異的拮抗薬としてのその 挙動故に、これらのイソホームの生理学的役割の決定に用いることができる。 我々は、異なるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）イソホームに特 異的な一組のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を誘導しおよび特性付けた。これら の抗体は、それぞれ、ｈＧＨ ２５、ｈＧＨ２６、ｈＧＨ−３３およびｈＧＨ− １２と名づけられる。ｈＧＨイソホーム（２２Ｋおよび２０Ｋ）への各抗体の結 合特性を、抗体サンドイッチ、直接および競合的免疫アッセイならびにウエスタ ンブロットにおいて分析した。 ｈＧＨ−３３は、ｈＧＨ ２０Ｋに対して特異的な抗体である。 本発明の抗体を発現する一つのハイブリドーマ細胞系であるｍＡｂｈＧＨ−３ ３は、１９９６年２月２８日にＤＳＭ ＡＣＣ２２５４の番号で寄託されている 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クレメル・バロン，レオノール スペイン国、エ―28791・マドリード、ソ ト・デル・レアル、フウエンテ・デ・ラ・ ピエドラ、12 (72)発明者 マルテイネス・アロンソ，カルロス スペイン国、エ―28035・マドリード、サ ン・マルテイン・デ・ポレス、14 (72)発明者 メラド・ガルシア，ホセ・マリオ スペイン国、エ―28008・マドリード、マ ルテイン・デ・ロス・エロス、23 (72)発明者 ロドリゲス・フラデ，ホセ・ミゲル スペイン国、エ―28016・マドリード、チ レ・32

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ｈＧＨ ２０Ｋに１×１０⁸Ｍ^-1以上の親和性を有する分子量２０ｋＤａ （ｈＧＨ ２０Ｋ）のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に特異的なモノクローナル抗 体。 ２． ｈＧＨ ２０Ｋに少なくとも１×１０⁹Ｍ^-1、より好ましくは２×１０⁹Ｍ^-1 を超える親和性を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。 ３． 分子量２２ｋＤａ（ｈＧＨ ２２Ｋ）のｈＧＨと５％未満が交差反応する 請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。 ４． ｈＧＨ ２０Ｋの測定のための請求項１ないし３のいずれかのモノクロー ナル抗体の使用。 ５． 体液中における測定のための請求項４に記載の使用 ６． 血清中における測定のための請求項５に記載の使用 ７． 複数分析アッセイにおける請求項５または６に記載の使用 ８． ｈＧＨ ２０Ｋを含む調製物の精製のための請求項１ないし３のいずれか のモノクローナル抗体の使用。 ９． ｈＧＨ ２０Ｋの免疫アッセイ検出および定量のための方法であって、 １） ｈＧＨ ２０Ｋを含むサンプルを本発明の抗体に接触させて、サンプル中 のｈＧＨ ２０Ｋの量に相応する量のｈＧＨ２０Ｋと抗体との間の複合体を形成 させる工程、 ２） それ自体知られている方法で形成された複合体の量を測定し、見い出され た量をサンプル中のｈＧＨ ２０Ｋの量に関連付ける工程 を含む方法。 １０． 薬学的に許容できるキャリア物質中に請求項１ないし３のいずれかのモ ノクローナル抗体の治療有効量を含む治療組成物。 １１． 請求項１０に記載の組成物を投与することによりｈＧＨ ２０Ｋの量を 減少させる必要のある患者を治療する方法。 １２． 請求項１に記載のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系 。