EP0495958A1 - Monoklonale antikörper, die mit human- und ratteninsulin bindefähig sind - Google Patents

Monoklonale antikörper, die mit human- und ratteninsulin bindefähig sind

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Publication number
EP0495958A1
EP0495958A1 EP19910914569 EP91914569A EP0495958A1 EP 0495958 A1 EP0495958 A1 EP 0495958A1 EP 19910914569 EP19910914569 EP 19910914569 EP 91914569 A EP91914569 A EP 91914569A EP 0495958 A1 EP0495958 A1 EP 0495958A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
insulin
human
antibody
ecacc
rat
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19910914569
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kurt Naujoks
Ulrich Essig
Anne-Christine Kessler
Winfried Albert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0495958A1 publication Critical patent/EP0495958A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors

Definitions

  • the invention relates to monoclonal mouse antibodies which react with both human and rat insulin, a method for the determination of human or rat insulin, a reagent for the determination of human and rat insulin and hybridoma cell clones which contain such Produce antibodies.
  • Monoclonal antibodies which react with human insulin are already known from EP-A 0 331 126. Such antibodies are e.g. used for the determination of human insulin in various standardized enzyme tests suitable for automatic analysis.
  • rats are now essentially used as an experimental animal model. Up to now, self-developed test systems without an international standard have been used to determine the insulin in such rat experiments. It has therefore not been possible until now to compare the test values found in different laboratories with one another.
  • the aim of the invention is therefore to provide a method for the determination of human or rat insulin and in particular to provide antibodies which react with both human and rat insulin, so that both insulin species have one single standard can be measured and the values obtained can be compared.
  • mice that react with human and teninsulin Rat ⁇ is surprising because of theoretical G r ünden c'ie existence of such :. kr'uz ⁇ eagi2rfc ⁇ der antibody was not to be expected.
  • From Klaus Keck in Nature, Vol. 254 (1975), 78-79 it is known that the insulin molecules of humans, mice, rats and pigs have the same sequence in the so-called A chain loop. From Diabetologia (Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York), Vol. 13 (1977), 407, Abstract 164, it is also known that this A-chain loop acts as an immunogenic determinant. For this reason, it was generally assumed that mice can only develop antibodies against sheep insulin, but not against pig insulin, since pig insulin has only immunogenic determinants, such as its own mouse insulin.
  • mouse antibodies are also surprising because the A-chain loop recognized by the antibody is an epitope which is located at the binding site to the insulin receptor. An antibody directed against such a binding site therefore removes the binding ability of one's own insulin.
  • mice have only a very limited ability to produce insulin-specific antibodies, which is why only very high antibodies are used with mice of limited heterogeneity, that is to say of little difference.
  • a preferred subject of the invention are the monoclonal antibodies which are obtainable from the hybridoma cell clones ECACC 90052212, ECACC 90052213 and / or ECACC 90052214 or which are capable of being bound in an equivalent manner to both rat and human insulin.
  • antibody capable of binding in an equivalent manner is understood to mean an antibody in which an epitope overlap with the defined, known antibody is detectable. This epitope overlap can be done with the help of a competitive test system can be easily detected.
  • an enzyme immunoassay is used to check the extent to which an antibody competes with the known antibody for binding to a defined antigen or a special epitope. For this purpose, a solution containing the corresponding antigen is incubated with the known monoclonal antibody in labeled form and an excess of the antibody under consideration.
  • the invention also relates to the hybridoma cell clones ECACC 90052212, ECACC 90052213 and ECACC 90052214.
  • Another object of the invention is a method for producing murine, monoclonal antibodies which react with both human and rat insulin by immunizing Balb / c mice with human insulin, immortalizing the spleen cells of the immunized animals and cloning those hybridoma cells that produce antibodies that react with both human and rat insulin, and isolating the antibodies produced by these clones by known methods.
  • the spleen cells of the immunized animals are preferably immortalized by fusion with myeloma cells, particularly preferably with the myeloma cell line P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580).
  • the spleen cells of the immunized animals are fused using the method according to J.of Imm. Meth. 39 (1980) 285-308. However, others, the specialist, can also be used. ge -. " f ⁇ - .. Methods for Imr.orta -. Isifc.iung of IIIii: ⁇ cells (eg EBV transformation) can be used.
  • the cells are separated, for example using a fluorescence-activated cell sorter.
  • To detect immortalized cells that produce the desired antibody a sample of the culture supernatant is tested in an ELISA test for reactivity with human and rat insulin.
  • Another object of the invention is a method for the immunological determination of human and / or rat insulin by measuring the immunological binding reaction of insulin to a monoclonal antibody according to the invention.
  • the determination of the binding of insulin to the antibody according to the invention is carried out according to methods known to the person skilled in the art, preferably according to the RIA or ELISA principle.
  • the extent of the binding reaction of radioactively labeled insulin to the antibody is determined before and after the addition of the sample to be analyzed and the amount of the insulin contained in the sample is determined from these measured values.
  • the sample is first incubated with an immobilized antibody according to the invention and bound insulin from the sample is detected by incubation with a further, usually labeled antibody.
  • An enzyme, a fluorescent or chemiluminescent dye is preferably used for labeling.
  • the hybridoma cell clones ECACC 90052212, ECACC 90052213 and ECACC 90052214 were deposited on May 22, 1990 with the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK).
  • ECACC European Collection of Animal Cell Cultures
  • UK Porton Down
  • Balb / c mice 8 to 12 weeks old, are immunized intraperitoneally with 100 ⁇ g human insulin (adsorbed on aluminum hydroxide and Bordetella pertussis). After 6 weeks, three further immunizations are carried out every four weeks. In each case 50 ⁇ g of insulin (adsorbed on aluminum hydroxide and Bordetella pertussis) are administered intraperitoneally.
  • Each 2xl0 5 spleen cells:, on 24-wt.il- £ ellkuli; urp.l ⁇ -tten (company t.unc / sown ;. 1 x 10 5 spleen cells or 5 x 10 4 peritoneal exudate cells are added to each culture as feed cells.
  • hypoxanthine-azaserine selection medium 100 mM hypoxanthine, 1 ⁇ g / ml azaserine is added.
  • hybridoma cell clones ECACC 90052212, 90052213 and 90052214 could be isolated.
  • mice 5 ⁇ 10 6 hybrid cells are injected intraperitoneally into mice which have been pretreated once or twice with 0.5 ml pristane. One to three weeks later, ascites fluid can be obtained from the mice.
  • the antibodies can be isolated from this in a conventional manner.
  • an ELISA method is used as the test principle: microtiter plates are coated with 1 ⁇ g porcine insulin / ml coating buffer (0.2 M Sodium carbonate / bicarbonate, pH 9.3 to 9.5) coated at 37 ° C overnight. It is aftertreated for 10 minutes with 0.9% sodium chloride solution and 1% albumin solution. After that washed with 0.9% sodium chloride solution. The mixture is then incubated with 100 ⁇ l sample at 37 ° C. and washed again with 0.9% sodium chloride solution.
  • the ELISA test can also be carried out as follows: The microtiter plates are first coated with a Schafanti mouse IgG (20 to 30 ⁇ g / l coating buffer, one hour to overnight, 37 ° C.). Thereafter, as described above, treatment is continued, the sample solution is added and the mixture is washed again. Finally, incubation is carried out with 250 mU / ml of a porcine insulin-peroxidase conjugate (1 hour, 37 ° C.). It is washed again and the peroxidase activity is determined, for example, with ABTS®.
  • a competitive enzyme immunoassay was carried out to detect the epitope overlap of an antibody with the monoclonal antibodies ECACC 90052212, ECACC 90052213 or ECACC 90052214.
  • rat insulin is first biotinylated with D-biotinyl-amidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (Boehringer Mannheim GmbH, catalog no. 1008960) according to the manufacturer's instructions. 300 ng of this biotinylated antigen in a volume of 100 ⁇ l PBS are bound by incubation at room temperature for one hour to a streptavidin-coated microtiter plate (preparation according to EP-A 0 344 578).
  • Example 2 The positive antibodies found in Example 2 were checked by RIA for the detection of human / rat insulin.
  • the RIA system was structured as follows:
  • RIA buffer 0.05 mol / 1 phosphate buffer, 0.150 mol / 1 NaCl,
  • 100 ⁇ l of this antibody dilution were then incubated for 24 hours at 4 ° with 100 ⁇ l tracer and 100 ⁇ l insulin standard (either human insulin or rat insulin).
  • the bound from free tracer was separated by adding 400 ⁇ l of “dextran coated charcoal”, vortexing, centrifuging at 6 ° for 1/2 hour, and decanting the supernatant.
  • coal-bound tracer activity was then determined in a gamma counter.
  • % bound x 100 total count - counts bound
  • Non-specific binding was determined in the same system by replacing antibody with RIA buffer and was less than 1% in all experiments.
  • the specific capture antibody (eg the monoclonal antibody produced by the cell line ECACC 90052213) is first biotinylated with D-biotinyl-amidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (Boehringer Mannheim GmbH, catalog no. 1008 960) according to the manufacturer's instructions .

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Description

Monoklonale Antikörper, die mit Human- und Ratteninsulin bindefahig sind B E S C H R E I B U N G
Die Erfindung betrifft monoklonale Maus-Antikörper, die so¬ wohl mit Human- als auch mit Ratten-Insulin reagieren, ein Verfahren zur Bestimmung von Human- bzw. Ratteninsulin, ein Reagenz zur Bestimmung von Human- und Ratteninsulin sowie Hybridom-Zellklone, welche solche Antikörper produzieren.
Aus der EP-A 0 331 126 sind bereits monoklonale Antikörper bekannt, die mit Human-Insulin reagieren. Solche Antikörper werden z.B. zur Bestimmung von Human-Insulin in verschiedenen zur automatischen Analyse geeigneten standardisierten Enzym¬ tests verwendet. In der Erforschung der Ursachen und Behand¬ lung von Diabetes werden nun im wesentlichen als experimen¬ telles Tiermodell Ratten verwendet. Zur Bestimmung des Insu¬ lins bei solchen Ratten-Experimenten wurden dabei bislang üblicherweise selbstentwickelte Testsysteme ohne internatio¬ nalen Standard verwendet. Daher war es bislang nicht möglich, die in verschiedenen Labors aufgefundenen Versuchswerte mit¬ einander zu vergleichen.
Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein Verfahren zur Bestim¬ mung von Human- bzw. Ratteninsulin zur Verfügung zu stellen und im besonderen Antikörper bereitzustellen, die sowohl mit Human- als auch mit Ratten-Insulin reagieren, so daß beide Insulin-Spezies mit einem einzigen Standard gemessen und die erhaltenen Werte miteinander verglichen werden können.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die erfindungsgemäßen murinen monoklonalen Antikörper, welche sowohl mit Human- als auch mit Ratten-Insulin reagieren.
Das Auffinden von Maus-Antikörpern, die mit Human- und Rat¬ teninsulin reagieren, ist überraschend, da aus theoretischen Gründen c'ie Existenz solche:. kr'uzιeagi2rfcΛder Antikörper nicht zu erwarten war. Aus Klaus Keck in Nature, Vol. 254 (1975), 78-79 ist es nämlich bekannt, daß die Insulin-Molekü¬ le von Mensch, Maus, Ratte und Schwein dieselbe Sequenz im sogenannten A-Kettenloop aufweisen. Aus Diabetologia (Sprin¬ ger-Verlag Berlin-Heidelberg-New York) , Vol. 13 (1977), 407, Abstract 164 ist es außerdem bekannt, daß dieser A-Kettenloop als immunogene Determinante wirkt. Aus diesem Grunde wurde allgemein angenommen, daß Mäuse lediglich Antikörper gegen Schaf-, jedoch nicht gegen Schweine-Insulin entwickeln kön¬ nen, da Schweine-Insulin nur immunogene Determinanten wie das eigene Maus-Insulin aufweist.
Die Ausbildung solcher Maus-Antikörper ist im übrigen auch deswegen überraschend, da es sich bei dem vom Antikörper erkannten A-Kettenloop um ein Epitop handelt, welches an der Bindungsstelle zum Insulin-Rezeptor sitzt. Ein gegen eine solche Bindungsstelle gerichteter Antikörper beseitigt daher die Bindefähigkeit des eigenen Insulins.
Schließlich ist es auch noch von J. Kapp (The Journal of Immunology, Vol. 123, July 1989, 109-114) bekannt, daß Mäuse nur eine ganz begrenzte Fähigkeit haben, Insulin-spezifische Antikörper auszubilden, weshalb mit Mäusen nur Antikörper von sehr begrenzter Heterogenität, also von nur geringer Unter¬ schiedlichkeit zu erhalten sind.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind die monoklona- len Antikörper, die aus den Hybridom-Zeilklonen ECACC 90052212, ECACC 90052213 und/oder ECACC 90052214 erhältlich sind oder in äquivalenter Weise sowohl an Ratten- als auch Humaninsulin bindefähig sind.
Unter dem Begriff "in äquivalenter Weise bindefähiger Anti¬ körper" wird ein Antikörper verstanden, bei dem eine Epitop- überlappung mit dem definierten, bekannten Antikörper nach¬ weisbar ist. Diese Epitopüberlappung kann mit Hilfe eines kompetitiven Testsystems leicht nachgewiesen werden. Dazu wird zum Beispiel mit Hilfe eines Enzym-Immunoassays über¬ prüft, inwieweit ein Antikörper mit dem bekannten Antikörper um die Bindung an ein definiertes Antigen bzw. ein spezielles Epitop konkurriert. Dazu inkubiert man eine das entsprechende Antigen enthaltende Lösung mit dem bekannten monoklonalen Antikörper in markierter Form und einem Überschuß des in Betracht gezogenen Antikörpers. Durch Immobilisierung der gebideten Komplexe, Trennung der festen von der flüssigen Phase und Nachweis der gebundenen Markierung in einer der beiden Phasen kann dann leicht festgestellt werden, inwieweit der in Betracht gezogene Antikörper den definierten Antikör¬ per aus der Bindung verdrängen kann. Ist eine Verdrängung von mindestens 50 % bei 105 -fächern Überschuß gegeben, so liegt eine Epitopüberlappung vor.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Hybridom-Zell- klone ECACC 90052212, ECACC 90052213 und ECACC 90052214.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von murinen, monoklonalen Antikörpern, die sowohl mit Human- als auch mit Ratteninsulin reagieren, durch Immu¬ nisierung von Balb/c-Mäusen mit humanem Insulin, Immortali-- sierung der Milzzellen der immunisierten Tiere und Klonierung derjenigen Hybridomzellen, die Antikörper produzieren, welche sowohl mit Human- als auch mit Ratteninsulin reagieren, und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.
Die Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere erfolgt vorzugsweise durch Fusionierung mit Myelomzellen, besonders bevorzugt mit der Myelomzellinie P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Die Fusionierung der Milzzellen der immuni¬ sierten Tiere erfolgt nach der Methode gemäß J.of Imm. Meth. 39 (1980) 285 - 308. Ebenso können aber auch andere, dem Fachiua . ge -."fι-.. Ver u.1 ren zur Imr.orta--.isifc.iung der Iiii-:~ zellen (z.B. EBV-Transformation) verwendet werden. Zur Klonierung werden die Zellen z.B. mittels eines Fluores- zenz-aktivierten Zellsorters vereinzelt. Zum Nachweis von immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper pro¬ duzieren, wird eine Probe des Kulturüberstandes in einem ELISA-Test auf Reaktivität mit Human- und Ratteninsulin gete¬ stet.
Diejenigen Klone, deren Kulturüberstand eine positive Reak¬ tion ergibt, werden expandiert und die von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren isoliert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Human- und/oder Ratteninsulin durch Messung der immunologischen Bindungsreaktion von Insu¬ lin an einen erfindungsgemäßen, monoklonalen Antikörper.
Die Bestimmung der Bindung von Insulin an den erfindungsge¬ mäßen Antikörper erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfah¬ ren, bevorzugt nach dem RIA- oder ELISA-Prinzip. Bei der Bestimmung nach dem RIA-Prinzip wird der Umfang der Bindungs¬ reaktion von radioaktiv markiertem Insulin an den Antikörper vor und nach der Zugabe der zu analysierenden Probe bestimmt und aus diesen Meßwerten die Menge an des in der Probe ent¬ haltenen Insulins ermittelt.
Bei der Bestimmung nach dem ELISA-Prinzip wird die Probe zunächst mit einem immobilisierten erfindungsgemäßen Antikör¬ per inkubiert und gebundenes Insulin aus der Probe durch Inkubation mit einem weiteren, üblicherweise markierten Anti¬ körper nachgewiesen. Zur Markierung wird vorzugsweise ein Enzym, ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzfarbstoff ver¬ wendet.
Die Hybridom-Zellklone ECACC 90052212, ECACC 90052213 und ECACC 90052214 wurden am 22. Mai 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK), hinterlegt. Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert:
B e i s p i e l 1
Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen Human-/Ratten¬ insulin
Balb/c-Mäuse, 8 bis 12 Wochen alt, werden mit 100 μg Human- Insulin (an Aluminiumhydroxid und Bordetella pertussis adsor¬ biert), intraperitoneal immunisiert. Nach 6 Wochen werden drei weitere Immunisierungen in vierwöchigem Abstand durchge¬ führt. Dabei werden jeweils 50 μg Insulin (an Aluminiumhy¬ droxid und Bordetella pertussis adsorbiert), intraperitoneal verabreicht.
Ungefähr 4 Monate nach der letzten Immunisierung wird fusio¬ niert. Vier Tage und drei Tage vor der Fusionierung wird jeweils noch einmal mit 100 μg Insulin/PBS (= phosphate buffered saline, Dulbecco und Vogt, J.Exp.Med 99 (1954) 167 - 182), intraperitoneal bzw. intravenös immunisiert.
Zur Fusion werden in Anlehnung an Galfre, Methods in Enzymo- logy, 7 . (1981), Seite 3, 108 Milzzellen einer immunisierten Maus mit 2xl07 Myelo zellen P3x63-Ag 8.653, ATCC-CRL 8375) gemischt und anschließend 10 Minuten zentrifugiert (300 g, 4°C). Die Zellen werden noch einmal mit BSS (= balanced .salt s_olution) gewaschen und bei 400 g zentrifugiert. Der Über¬ stand wird entfernt. Das Zellsediment wird mit 1 ml 60%iger PEG-Lösung (MG 4000, Merck) versetzt. Danach wird bei Raum¬ temperatur 5 ml RPMI 1640-Medium (RPMI = Rosewell Parker Memory Institut) ohne fötales Kälberserum (FKS), anschließend noch einmal 5 ml RPMI 1640-Medium, mit 10% FKS langsam zuge¬ tropft, mit Medium auf 50 ml aufgefüllt und 10 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen werden in RPMI 1640-Medium mit 10% FKS aufgenommen. Je 2xl05 Milzzellen werde:, auf 24-wt.il-£ellkuli;urp.lά-tten (Firma t.unc/ eingesät;. Zu jeder Kultur werden lxlO5 Milzzellen oder 5xl04 Perito- neal-Exsudat-Zellen als Futterzellen zugefügt. Am folgenden Tag wird Hypoxanthin-Azaserin-Selektionsmedium (100 mM Hypo- xanthin, 1 μg/ml Azaserin) zugegeben.
Nach ca. 7 bis 10 Tagen werden bereits viele Klone sichtbar. Der Überstand der Primärkulturen wird nach einem in Beispiel 2 beschriebenen ELISA-Verfahren getestet. Primärkulturen, die Antigen-spezifische Antikörper enthalten, werden mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters auf 96-well-Zellkul- turplatten (Firma Nunc) weiter kloniert. Als Futterzellen dienen lxlO4 Peritoneal-Exsudat-Zellen oder 2xl04 Milzzellen pro 96er-well der Kultur.
Auf diese Weise konnten beispielsweise die Hybridom-Zellklone ECACC 90052212, 90052213 und 90052214 isoliert werden.
Zur Erzeugung von Ascites werden 5xl06 Hybrid-Zellen intrape¬ ritoneal Mäusen gespritzt, die zuvor ein bis zweimal mit 0,5 ml Pristan vorbehandelt worden sind. Ein bis drei Wochen danach kann aus den Mäusen Ascites-Flüssigkeit gewonnen wer¬ den. Hieraus können in üblicher Weise die Antikörper isoliert werden.
B e i s p i e l 2
Screening-Test auf Antikörper gegen Insulin
Um die Anwesenheit und Spezifität von Antikörpern gegen Insu¬ lin im Serum immunisierter Mäuse oder in dem Kulturüberstand der Hybridzellen oder in Ascites zu erkennen, wird ein ELISA- Verfahren als Testprinzip verwendet: Mikrotiterplatten werden mit 1 μg Schweineinsulin/ml Beschichtungspuffer (0,2 M Na- triumcarbonat/-Bicarbonat, pH 9,3 bis 9,5) bei 37°C über Nacht beschichtet. Es wird 10 Minuten mit 0,9 % Natriumchlo¬ ridlösung und 1 % Albuminlösung nachbehandelt. Danach wird mit 0,9% Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wird bei 37°C eine Stunde mit lOOμl Probe inkubiert und erneut mit 0,9 % Natriumchloridlösung gewaschen. Es folgt eine weitere Inkubation (eine Stunde bei 37°C) mit 100 bis 150 mU/ml eines Schaf-anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugats. Nach einem erneuten Waschschritt mit 0,9% Natriumchlorid wird die Peroxidaseakti- vität in üblicher Weise bestimmt (beispielsweise mit ABTS®, 30 Minuten bei Raumtemperatur, abgelesen wird die-Extink¬ tionsdifferenz, ΔmE bei 405nm) .
Der ELISA-Test kann auch wie folgt durchgeführt werden: Die Mikrotiterplatten werden zunächst mit einem Schafanti- Maus-IgG beschichtet (20 bis 30 μg/ l Beschichtungspuffer, eine Stunde bis über Nacht, 37°C). Danach wird wie oben be¬ schrieben, weiter behandelt, die Probelösung zugesetzt und erneut gewaschen. Schließlich wird mit 250 mU/ml eines Schweineinsulin-Peroxidase-Konjugat inkubiert (1 Stunde, 37°C). Es wird erneut gewaschen und die Peroxidase-Aktivität beispielsweise mit ABTS® bestimmt.
B e i s p i e l 3
Bestimmung der Epitopüberlappung von Antikörpern gegen Insu¬ lin
Zum Nachweis der Epitopüberlappung eines Antikörpers mit den monoklonalen Antikörpern ECACC 90052212, ECACC 90052213 oder ECACC 90052214 wurde ein kompetetiver Enzym-Immunoassay durchgeführt. Dazu wird Ratten-Insulin zunächst mit D-Bioti- nyl-€-amidocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 1008960) gemäß Angaben des Her¬ stellers biotinyliert. Von diesem biotinylierten Antigen werden 300 ng in einem Volumen von 100 μl PBS durch einstün¬ dige Inkubation bei Raumtemperatur an eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte (Herstellung nach EP-A 0 344 578) gebunden. Nach viermaligem Waschen mit PBS/0,05 % Tween 20 wird 90 Minuten bei Raumtemperatur simultan inkubiert mit dem mono¬ klonalen Antikörper ECACC 90052212, ECACC 90052213 oder ECACC 90052214, der mit Peroxidase markiert wurde (Endkonzen¬ tration 250 mU/ml) und dem zu beurteilenden Antikörper. Nach erneutem viermaligem Waschen mit PBS/0,05 % Tween 20 wird mit der Enzym-Substratlösung ABTS® in Natriumperborat enthalten¬ dem Puffer 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und an¬ schließend die Extinktion bei 405 um als Maß für die Menge des gebundenen, POD markierten, monoklonalen Antikörpers gemessen. Dieser Wert wurde verglichen mit der Extinktion, die erhalten wurde, bei Inkubation mit dem monoklonalen Anti¬ körper ECACC 90052212, ECACC 90052213 oder ECACC 90052214 allein. Wenn bis zu einem 105 -fachen Überschuß an zu beurtei¬ lendem Antikörper gegenüber dem monoklonalen Antikörper-En- zy konjugat (250 mU/ml) mindestens 50 % Kompetition zu erkennen sind, liegt eine Epitopüberlappung vor.
B e i s p i e l
RIA-Test auf Human-/Ratteninsulin
Die im Beispiel 2 gefundenen, positiven Antikörper wurden mittels RIA auf die Erkennung von Human-/Ratteninsulin über¬ prüft.
Das RIA-System war folgendermaßen aufgebaut:
RIA-Puffer: 0,05 mol/1 Phosphatpuffer, 0,150 mol/1 NaCl,
0,5% Rinderserumalbumin, pH 7,4,
Tracer: I125 markiertes Schweine-Insulin (Corning)
"dextran coated charcoal": 100 ml RIA-Puffer mit 2,5 g
Kohle (Norit A) und 0,25 g Dextran F" (Sig a) . Zunächst wurde die Bindung des Tracers an die unterschiedli¬ chen Antikörper in einer Antikörperverdünnungsreihe bestimmt und die Antikörperverdünnung gewählt, die ca. 50% des Tracers band.
Von dieser Antikörper-Verdünnung wurden dann 100 μl mit 100 μl Tracer und 100 μl Insulinstandard (entweder Human- Insulin oder Ratten-Insulin) für 24 Stunden bei 4° inku¬ biert.
Die Trennung von gebundenem von freiem Tracer erfolgte durch Zugabe von 400 μl "dextran coated charcoal", vortexen, zen- trifugieren bei 6° für 1/2 Stunde, und Dekantieren des Über¬ standes.
Anschließend wurde die kohlegebundene Traceraktivität in einem Gammacounter bestimmt.
Die Berechnung des gebundenen Anteils markierten Insulins erfolgte folgendermaßen:
counts bound
% bound = x 100 total count - counts bound
Die nicht spezifische Bindung wurde im gleichen System durch Ersatz von Antikörper durch RIA-Puffer bestimmt und lag in allen Versuchen unter 1%. B e i s p i e l
Bestimmung von Human-Ratteninsulin mit ELISA-Technik
a) Beschichten von Mikrotiterplatten oder Teströhrchen mit einem spezifischen Fangantikörper
Der spezifische Fangantikörper (z.B. der von der Zell¬ linie ECACC 90052213 produzierte monoklonale Antikörper) wird zunächst mit D-Biotinyl-€-amidocapronsäure-N-hydro- xysuccinimidester (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 1008 960) gemäß Angaben des Herstellers biotinyliert. Anschließend werden 150 μl des biotinylierten Fanganti¬ körpers (0,5 mg/ml PBS ohne Mg2+ und Ca2+ ) mit einer Streptavidin-beschichteten festen Phase (Mikrotiterplat¬ ten oder Teströhrchen, Herstellung nach EP-A 0 344 578) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit 0,15 mol/1 NaCl/0,05 % Tween 20 gewaschen.
b) Inkubation mit dem Analysenmaterial
100 μl der Analysenlösung, die humanes- oder Ratteninsu¬ lin enthält, werden zu dem nach a) immobilisierten Fang¬ antikörper pipettiert. Anschließend wird 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und mit 3 x 350μl 0,15 mol/1 NaCl/0,05 % Tween 20 gewaschen.
c) Nachweisreaktion
Zum Nachweis von gebundenem Insulin wird zunächst mit einem polyklonalen Meerschweinchen-Antikörper gegen Schweine-Insulin inkubiert, 3 x mit 350 μl 0,15 mol/1 NaCl/0,05 % Tween 20 gewaschen, mit alkalischer Phospha- tase markierter Schaf-Anti-Meerschweinchen-Ig-Antikörper (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 1276 352) zugege¬ ben, und nochmals mit 3 x 350 μl 0,15 mol/1 NaCl/0,05 % Tween 20 gewaschen. Schließlich wird gebundener Antikör¬ per gegen Meerschweinchen-Ig über die Phosphatase-Reak- tion nachgewiesen.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Muriner monoklonaler Anti-Insulin-Antikörper, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß er sowohl an Ratten- als auch an Humaninsulin bin¬ det.
2. Antikörper nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß er von einem der Hybridom-Zellklone ECACC 90052212, ECACC 90052213 oder ECACC 90052214 gebildet ist oder mit diesen äquivalent bindefähig ist.
3. Hybridom-Zellklon mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90052212.
4. Hybridom-Zellklon mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90052213.
5. Hybridom-Zellklon mit der Hinterlegungsnummer ECACC 90052214.
6. Verfahren zur Herstellung von murinen, monoklonalen Antikörpern, die sowohl mit Human- als auch mit Ratten¬ insulin reagieren, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit humanem Insulin, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere und Klonierung derjenigen Hybridomzellen, die Antikörper produzieren, welche sowohl mit Human- als auch mit Rat¬ teninsulin reagieren, und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach an sich bekannten Verfahren.
7. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Human- und/oder Ratten-Insulin, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die immunologische Bindungsreaktion von Human¬ oder/und Ratteninsulin an monoklonale Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 mißt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man nach dem Radio-Immuno-Assay-Prinzip (RIA) die Größe der Bindung von radioaktiv markiertem Insulin an den Antikörper vor und nach der Zugabe der zu analysie¬ renden Probe mißt.
9. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man nach dem Prinzip des enzy e linked immuno- sorbent assay (ELISA) die Probelösung mit dem erfin¬ dungsgemäßen Antikörper in immobilisierter Form inku- bierinkubiert und dabei gebundenes Insulin mit einem weiteren markierten Antikörper nachweist.
10. Reagenz zur Bestimmung von Human- und/oder Ratten-Insu¬ lin, enthaltend zumindest einen der monoklonalen Anti¬ körper nach Anspruch 1 oder 2.
11. Reagenz nach Anspruch 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es a) einen erfindungsgemäßen Antikörper in immobilisier¬ ter Form und b) ein Konjugat aus Insulin von Mensch, Ratte, Maus oder Schwein mit einem bestimmbaren Rest, insbeson¬ dere einer radioaktiven Gruppe, einem Enzym, einem Fluoreszenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff enthält.
12. Reagenz nach Anspruch 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß es a) immobilisiertes Insulin von Mensch, Ratte, Maus oder Schwein und b) ein Konjugat aus einem erfindungsgemäßen Antikörper mit einem bestimmbaren Rest, insbesondere einer radioaktiven Gruppe, einem Enzym, einem Fluores¬ zenzfarbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff ent¬ hält.
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