NO161287B - Homogen immunologisk analysemetode, reagensmidler og proeveinnretning for bruk ved immunoanalysebestemmelse. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører immunologiske analysemetoder for bestemmelsen av jodtyroniner i biologiske væsker slik som serum eller plasma. Spesielt vedrører oppfinnel-

sen immunologiske analysemetoder basert på konkurrerende binding, reagensmidler og prøvesett for å bestemme jodtyroniner i ikke-ekstraherte prøver av serum eller plasma gjennom anvendelsen av blokkerende eller dissosierende midler for bindingen av jodtyroniner til tyroksin-bindende proteiner (TBP) som er tilstede i slike prøver.

Jodtyroninene har den generelle formel:

hvor 3 1 og 3 2 uavhengig av hverandre er hydrogen eller jod.

De viktigste jodtyroninene av klinisk interesse er 3,5,3',5'-1 2

tetrajodtyronin (tyroksin, T-4) hvor 3 og 3 begge er jod; 3,5,3'-trijodtyronin (T-3 eller forenklet "trijodtyronin") hvor 3 er jod og 3 er hydrogen; 3,35'-trijodtyronin ("omvendt T-3") hvor 3 1 er hydrogen og 3 2 er jod; og 3,3'-dijodtyronin hvor 3 1 og 3 2 begge er hydrogen. Den kvanti-tative bestemmelse av konsentrasjonen av de forskjellige jodtyroninene, særlig hormene T-4 og T-3, i blodet er av viktig betydning ved diagnosen sykdommer i skjoldbruskkjertelen.

Nesten alle jodtyroninene som er i omløp i blodet, er bundet i kompleks til forskjellige bærerprotein-

er omfattende albumin, tyroksin-bindende prealbumin og tyroksin-bindende globulin (TBG), idet slike bærerproteiner her refereres til med det felles navn tyroksin-bindende protein (TBP). For å måle konsentrasjonen av den totale mengde av et jodtyronin i en blodprøve, slik som serum eller plasma,

må de TBP-bundne formene dissosieres i en analytisk signifikant grad og den resulterende totale mengde fritt jodtyronin bestemmes. Dissosiasjonen av jodtyroniner fra TBP, særlig TBG, ble opprinnelig utført ved en ekstraksjonsfremgangsmåte (U.S. patent nr. 3.414.383). Etter den nåværende teknikkens

stand kan jodtyroniner bestemmes ved immunologisk analyse i ikke-ekstraherte prøver ved anvendelsen av forbindelser som empirisk er funnet å blokkere og forårsake dissosiasjon av TBP-binding. I alminnelig immunologiske analysemetoder for jodtyronin basert på konkurrerende binding, kombineres en prøve med reagenser omfattende et antistoff til jodtyroninet som skal bestemmes, en merket form (f.eks. radioaktivt merket) av jodtyroninet og ett eller flere TBP-blokkerende midler. Jodtyroninet i prøven som er bundet i kompleks med TBP, dissosieres og konkurrerer med merket jodtyronin om binding til antistoffet. Forholdet mellom merket jodtyronin som blir antistoff-bundet sammenlignet med det som forblir ubundet til antistoff, er avhengig av den totale konsentrasjonen av jodtyroninet i prøven og er målbart på en lang rekke måter avhengig av den bestemte immunologiske analyseteknikken som anvendes.

Forskjellige forbindelser er funnet å være nyttige TBP-blokkerende midler, deriblant tetraklortyronin (Mitsuma et al, J. Clin. Enocrinol. Metab. 33:365 (1971)), difenylhydantoin (Lieblich og Utiger, J. Clin. Invest. 50: 60a (1971)), salicylat (Larson, Metab. 20:976 (1971)) og de forskjellige materialene åbenbart av Hollander (U.S. patent nr. 3.928.553) og Chopra (U.S. patent nr. 3.911.096, særlig 8-anilino-l-naftalensulfonsyre (ANS)). Strukturene og de generelle egenskapene til de kjente TBP-blokkerende midlene varierer over et svært stort område. Egenskapene som er kri-tiske for opererbarheten som et TBP-blokkerende middel i immunologiske analysemetoder, dvs. evnen til i tilstrekkelig grad å dissosiere jodtyroniner fra TBP ved konsentra-sjonsnivåer som ikke er tilstrekkelige til å forårsake betydningsfull inhibering av bindingsreaksjonen til antistoffet, anses vanligvis som uforutsigbart ut fra rent strukturelle sammenligninger selv om enkelte teorier vedrørende TBG-blokkering er fremsatt (Brown og Metheany, J. Pharm. Sei. 63:1214 (1974)).

Fenclofenac [2-(2,4-diklorfenoksy)fenyleddik-syre] er en difenyleter med antirevmatisk virkning som er angitt å gripe inn i prøver på skjoldbruskkjertelfunksjon (Lancet 1:267 (2.2.1980), Lancet 1:432 (23.2.1980), Lancet 1:487 (1. mars 1980), Capper et al, Clin. Chim. Acta 112:77

(1981) og Kurtz et al, Clin. Endocrinol. 15:117 (1981)). Senere forfattere har reist spørsmålet hvorvidt fenclofenac vil være egnet som et TBG-blokkerende middel ved radioaktive immunologiske analysemetoder for skjoldbruskkjertelfunksjon-en (Ratcliff et al, Clin. Endocrinol. 13:569 (1980)). Capper et al, som det er henvist til ovenfor, undersøkte også virkningen av diclofenac [2-(2,6-diklorfenylamino)fenyl-eddiksyre].

Det er nå funnet at visse fenyleddiksyrer og salter er spesielt fordelaktige TBP-blokkerende midler for anvendelse ved immunologiske analysemetoder for jodtyronin. Blokkeringsmiddelforbindelsen er inkludert i reaksjonsblandingen for den immunologiske analysemetoden i en konsentrasjon tilstrekkelig til å frigjøre og blokkere bindingen av en analytisk signifikant prosentdel av TBP-kompleksbundet jodtyronin, fortrinnsvis mer enn 50% og vanligvis mer enn 70%, mens den er utilstrekkelig til signifikant å gripe inn i bindingen av antistoff til jodtyronin. Mens de nøyaktige konsentrasjonene av blokkeringsmidlet som ønskes til en bestemt immunologisk analysemetode for jodtyronin, vil vari-ere i overensstemmelse med jodtyroninet som skal analyseres, og den immunologiske analyseteknikken som følges, samt andre faktorer, brukes forbindelsen vanligvis i konsentrasjoner i reaksjonsblandingen på mellom1 0,1 millimolar (mil) og 5 mil, især når det involverte jodtyronin er tyroksin. De blokkerende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse til-settes til analysereaksjonsblandingen i form av syren eller et analytisk akseptabelt salt derav, f.eks. natrium-, kali-um-, litium- eller ammoniumsalter.

Visse uventede egensakper hos de foreliggende blokkerende midler, særlig fenclofenac, gjør dem særlig fordelaktige for bruk som TBP-blokkerende midler i homogene immunologiske analysemetoder basert på konkurrerende binding hvor en spektrofotometrisk response, slik som en fluorescensutstråling eller lysabsorbsjon, genereres i reaksjonsblandingen for analysen ved en bølgelengde som er større enn ca. 300 nanometer (nm) og vanligvis mindre enn 700 nm, hvilken respons er en funksjon av konsentrasjonen av jodtyroninet i prøven. De foreliggende blokkeringsmidler er funnet i det vesentlige ikke å ha noen absorbsjon ved bølgelengder større enn 300 nm. I de tilfeller hvor den spektrofotometriske respons er en fluorescensutstråling, eller den initieres, selv om den til slutt ikke uttrykkes, som en fluorescensutstråling, observeres det følgelig ikke noen avstengning av slik utstråling når man bruker de foreliggende forbindelser som TBP-blokkerende middel, mens det med midler ifølge teknikkens stand, særlig ANS, kan oppstå betydelig avstengning som gir uønskede eller uakseptable analyseut-førelseskarakteristika, f.eks. minsket sensitivitet, repro-duserbarhet, presisjon, etc.

Dertil vil særlig fenclofenac ikke oppvise noen vesentlig inhiberende virkning på den katalytiske aktivitet til mange enzymer ved konsentrasjoner hvor den er et effektivt TBP-blokkerende middel. Følgelig er denne forbindelse ytterligere fordelaktig som et TBP-blokkerende middel i homogene immunologiske analysemetoder basert på konkurrerende binding hvor den anvendte markøren er en deltaker i den enzymatiske reaksjon, f.eks. et enzymsubstrat, en enzyminhibitor, en prostetisk gruppe i et enzym, et koenzym, eller et enzym, eller en del derav. TBP-blokkerende midler ifølge teknikkens stand, særlig ANS, kan forårsake betydelig inhibering av enzymreaksjoner som igjen resulterer i redusert analyseutførelse.

Derfor finner de foreliggende fenyleddiksyrene og -saltene ny anvendelse som TBP-blokkerende midler i immunologiske analysemetoder generelt, og er spesielt fordelaktige når de anvendes ved spektrofotometrisk homogene immunologiske analysemetoder, i tilfellet med fenclofenac, særlig de hvor markøren som anvendes er en deltaker i en enzym-katalysert reaksjon. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også reagensmidler for utførelse av de nye immunologiske analysemetoder, spesielt i form av prøvesett som vanligvis brukes i kliniske laboratorier.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en homogen immunologisk analysemetode basert på konkurrerende binding for bestemmelse av et jodtyronin i en prøve av uekstrahert serum eller plasma, hvor det dannes en reaksjonsblanding ved å kombinere prøven med reagenser som omfatter et antistoff til jodtyroninet, et markert jodtyroninkonjugat og et TBP-blokkerende stoff, og hvor et spektrofotometrisk svar, fortrinnsvis en fluoresensemmisjon, eller en absorbsjonsendring bevirket av analysereaksjonen, utvikles i reaksjonsblandingen ved en bølgelengde større enn 300 nm, og denne metoden er kjennetegnet ved at det som TBP-blokkerende stoff benyttes en forbindelse med formel

hvori Y betyr 0, R-*- betyr klor og R<2> betyr hydrogen, eller Y betyr NH, R<1> betyr hydrogen, og R<2> betyr klor, eller et salt herav.

Når Y=0 og R<1>=C1 betegnes forbindelsen fenclofenac, og når Y=NH og R<2>=C1 betegnes forbindelsen diclofenac.

Videre er ifølge oppfinnelsen tilveiebragt reagensmidler for den homogene immunoanalysebestemmelse av et jodtyronin i en prøve av uekstrahert serum eller plasma, omfattende et antistoff til jodtyroninet, et TBP-blokkerende stoff, og et merket jodtyroninkonjugat med evnen til å utvikle et spektrofotometrisk svar, fortrinnsvis en fluorescensemisjon eller en absorpsjonsendring bevirket av analysereaksjonen ved en bølgelengde større enn ca. 3 00 nm, kjennetegnet ved at det TBP-blokkerende stoff er en forbindelse som definert ovenfor.

Det er også ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en prøveinnretning for homogen immunoanalysebestemmelse av et jodtyronin i en prøve av uekstrahert serum eller plasma,

idet innretningen omfatter en fast bæredel inkorporert med et antistoff til jodtyroninet, et TBP-blokkerende stoff og et merket jodtyroninkonjugat som med evnen til å utvikle et spektrofotometrisk svar, fortrinnsvis en fluorescensemisjon eller en absorpsjonsendring bevirket av analysereaksjonen ved en bølgelengde større enn ca. 300 nm, og denne innretning er kjennetegnet ved at det TBP-blokkerende stoff er en forbindelse som definert ovenfor.

Det blokkerende stoff 2(2,4-diklorfenoksy)fenyl-eddiksyre eller et salt derav er spesielt foretrukket for bruk i foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse er anvendbar ved immunologiske analysemetoder for jodtyronin i sin alminnelig-het. For disse formål menes det med en immunologisk analysemetode en hvilken som helst analysemetode basert på gjen-sidig påvirkning mellom antigen og antistoff, og med antistoff menes det et helt, vanlig eller monoklonalt antistoff (f.eks. av IgG-, IgM-, IgA-, etc. -typene) eller en effektiv del derav (f.eks. Fab-, F(ab')-, etc. -fragmenter av IgG). Den mest vanlige type immunologisk analysemetode som foreliggende oppfinnelse med fordel kan anvendes til, er den immunologiske analysemetoden som er basert på konkurrerende binding. I en slik immunologisk analysemetode for bestemmelse av et jodtyronin, kombineres en prøve av en kroppsvæske, vanligvis serum eller plasma, med et antistoff mot jodtyroninet som skal analyseres, en merket form av jodtyroninet og et blokkerende middel for TBT-binding. Forholdet mellom merket jodtyronin som bindes til antistoffet i konkurranse med ethvert jodtyronin i prøven sammenlignet med det som forblir ubundet er forbundet med konsentrasjonen av jodtyroninet i prøven.

Både homogene og heterogene immunologiske analyseteknikker kan følges, de førstnevnte er imidlertid særlig foretrukket. Ved heterogene immunologiske analyser separeres den antistoffbundne form av det merkede jodtyronin fysisk ifølge kjent teknikk fra den ubundne form og markøren måles i den ene eller den andre av de adskilte fasene. Mange forskjellige markører er kjent for anvendelse i heterogene immunologiske analyser, deriblant radioaktive isotoper (f.eks. U.S. patent nr. 4.111.656 og 3.911.096), fluorescerende stoffer (f.eks. U.S. patentskrift nr. 4.201.763, 4.171.311, 4.133.639 og 3.992.631), enzymer (f.eks. U.S. Patent nr. 3.654.090) osv. Ved radioaktive immunologiske analysemetoder for jodtyroniner er det særlig fordelaktig å bruke radioaktivt jod som markør idet man erstatter ett av de naturlige jod-atomene i jodtyroninet med dette.

Ved homogene immunologiske analysemetoder, som

er særlig foretrukket i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, oppviser den antistoffbundne form av det merkede jodtyronin en egenskap som er forskjellig fra den ubundne form, følgelig kan separasjonstrinnet som kreves i heterogene analyser, unngås. Det er kjent en lang rekke homogene immunologiske analyseteknikker. Særlig foretrukket er de hvor markøren som er kjemisk konjugert med jodtyroninet, er et enzym eller et enzymfragment, f.eks. en prostetisk gruppe, eller en deltaker i en enzym-katalysert reaksjon, f.eks. et substrat, et koenzym, en inhibitor, en aktivator eller lig-nende .

Den foreliggende oppfinnelse er særlig anvendbar ved homogene immunologiske analyser basert på konkurrer rende binding hvor en spektrofotometrisk respons genereres i analysereaksjonsblandingen ved en bølgelengde større enn ca. 300 nm og vanligvis mindre enn 700 nm, hvilken respons gir en indikasjon på jodtyroninkonsentrasjon i prøven. De foreliggende blokkerende midler er funnet å ha ikke noen vesentlig absorbsjon ved slike bølgelengder. Med spektrofotometrisk respons menes det et optisk påvisbart signal, vanligvis målt ved en utvalgt bølgelengde eller bølgelengder. Eksempler på slike signaler er utstrålinger av lys, f.eks.kjemiluminescens (inkludert bioluminescens) og fluorescens, og lysabsorbsjoner eller refleksjoner, f.eks. fargeendringer eller -dannelser,

og målbare absorbans- eller reflektansendringer i det synlige spektrum. Det følgende er eksmpler på slike analysetyper:

1. Reduksjon eller økning av fluorescens

Det merkede konjugat i dette system er i sin merkede del sammensatt av et fluorescerende middel hvis fluorescens reduseres eller økes i en eller annen målbar grad når det merkede jodtyroninkonjugatet bindes av antistoff. Den fluorescerende markør måles vanligvis direkte idet dens fluorescens er det påvisbare signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i U.S. patenter nr. 4.160.016 og 3.940.475, i GB-patent nr. 1.583.869 og i J. Clin. Path. 30:526 (1977).

2. Fluorescenspolarisering

Markøren i dette system er også et fluorescerende middel, det påvirkede kjennetegn er imidlertid polari-sering av fluorescens på grunn av binding av det merkede konjugatet til antistoff. Analysesystemer av denne type er beskrevet i J. Exp. Med. 122:1029 (1975).

3. Enzymsubstrat- merkede teknikker

I dette system er markøren valgt slik at det merkede konjugatet er et substrat for et enzym og mulighet-en for enzymet til å virke på det substrat-merkede konjugat påvirkes enten på en positiv eller negativ måte ved å binde det merkede konjugatet med antistoff. Virkning av enzymet på det substrat-merkede konjugatet gir et produkt som kan skjelnes ved en eller annen egenskap, vanligvis en kjemisk eller fysisk egenskap slik som kjemisk reaktivitet i en in-dikatorreaksjon eller slik som en fotometrisk egenskap, f.eks. fluorescens eller lysabsorbsjon (farge). Analysesystemer av denne type er beskrevet i generelle vendinger i GB-

patent nr. 1.552.607 og i Anal. Chem. 48:1933 (1976), Anal. Biochem. 77:55 (1977) og Clin. Chem. 23:1402 (1977). I slike enzymsubstrat-merkede teknikker vil det merkede konjugatet, f.eks. et substrat-analytt-konjugat, ha den egenskap at det kan påvirkes av et enzym ved spalting eller modifikasjon til å produsere et produkt med en påvisbar egenskap som adskiller det fra konjugatet. F.eks. kan konjugatet være ikke-fluorescerende under analysebetingelser, men etter omsetning med et enzym produseres det et fluorescerende produkt.

Forskjellige fluorogene substrat-merkede konjugater er iøynefallende for bruk i slike teknikker. F.eks. kan det merkede konjugatet ha formelen: hvori G er en avspaltbar gruppe slik som fosfat, karboksylat eller glykon, D er en fluorogen fargestoffrest som etter fjerning av G gir et fluorescerende produkt, f.eks. kan D være umbelliferon, fluorescein, rhodamin og derivater derav, R er en sammenbindende gruppe og L er bindingskomponenten, vanligvis analytten (f.eks. et jodtyronin) eller et derivat derav. Enzymatisk spalting (f.eks. ved fosfatase, karbok-sylase, glykosidase etc.) av det merkede konjugat påvirkes av binding, slik som med antistoff, til L-delen i konjugat-tet. Se U.S. patent nr. 4.279.992. Et særlig foretrukket substrat-merket arialysesystem utnytter et merket konjugat av typen:

hvor R er en sammenbindende gruppe og L er bindingsbestanddelen, f.eks. analytten eller en analog derav, hvorved enzymet 3-galaktosidases evne til spalte konjugatet og gi et produkt som kan skjelnes ved hjelp av dets fluorescens, in-hiberes ved binding av konjugatet med antistoff.

Andre nyttige substrat-merkede konjugater er de med formelen:

hvor R er en enzym-spaltbar gruppe, f.eks. fosfat, karboksylat o.l., L er bindingsbestanddelen angitt ovenfor og U <©>r

en fluorogen fargerest som angitt ovenfor, som etter spalting av R frigir en fluorescerende indikator. En særlig foretrukket teknikk utnytter et merket konjugat av typen:

hvor R<1> er en binding eller en kjede som binder den merkede bestanddel L til den spaltbare fosfatgruppen og R<2> er hydrogen eller en substituentgruppe slik som lavere alkyl, f.eks. metyl og etyl, N-alkylamido eller N-(hydroksy-substituert lavere alkyl) amido, f. eks. -CONH—fCH^-^OH hvor n = 2 - 6

(se U.S. patent nr. 4.273.715). Umbelliferonresten kan være andre eller ytterligere substituenter (se Anal. Chem. 40: 803 (1968)). Spalting med fosfodiesterase påvirkes ved binding av antistoff til L-delen i konjugatet.

4. Energioverføring

I dette systemet er markøren et medlem i et energioverførings-donor-akseptorpar og antistoffet er konjugert med det andre medlemmet av paret. Når det merkede konjugatet er bundet av antistoff, påvirkes således energi-avgivelsen fra donorbestanddelen i paret ved overføring til akseptorbestanddelen. Vanligvis er donor et fluorescerende stoff og akseptor er et stoff som demper fluorescensen,

idet det sistnevnte stoffet eventuelt selv kan være et fluorescerende' stoff. I en slik utførelsesform er det påvisbare signal fluorescens, men andre påvisningssystemer er også mulige. Slike analysesystemer er beskrevet i U.S. patenter nr. 3.996.345, 4.174.384 og 4.199.559, og i GB-patent nr. 2.018.424.

5. Kjemisk eksitert fluorescens

I dette systemet er markøren igjen et fluorescerende stoff, den fluorescerende markørens evne til å eksisteres kjemisk til et energinivå hvor den fluorescerer påvirkes imidlertid ved binding av det merkede konjugatet til antistoff. Kjemisk eksitering av markøren fullføres vanligvis ved eksponering av den fluorescerende markør mot en høyenergiforbindelse dannet in situ. Analysesystemer av denne type er beskrevet i U.S. patent nr. 4.238.19 5.

6. To antistoffer og sterisk hindring

Et annet analysesystem er det immunologiske analysesystemet med to antistoffer beskrevet i U.S. patentene nr. 3.935.074 og 3.998.943. Det merkede konjugatet omfatter to epitoper, hvorav den ene deltar i den immunologiske reaksjonen med liganden og anti-ligandantistoffet og den andre lar seg binde av et annet antistoff, med den begrensning at de to antistoffene er forhindret fra å bindes til det merkede konjugatet samtidig. Den andre epitopen kan være en fluorescerende substans hvis fluorescens dempes av den andre antistoffbindingen, eller kan delta i en underordnet konkurrerende bindingsreaksjon med en merket form av den andre epitopen for binding til det andre antistoffet. Forskjellige påvisningssystemer er mulige i et slikt system som beskrevet i de ovenfor nevnte patenter. Beselektede analysesystemer er beskrevet i U.S. patentene nr. 4.130.462 og 4.161.515, og i GB-patent nr. 1.560.852.

7. Prostetisk gruppemerkede teknikker

I dette systemet er markøren en prostetisk gruppe hos et enzym og evnen til et katalytisk inaktivt apoenzym til å kombinere seg med den prostetiske gruppe-markøren og danne et aktivt enzym (holoenzym) påvirkes ved binding at det merkede konjugatet til antistoff. Resulterende holoenzymaktivitet er målbar ved hjelp av vanlige påvisningssystemer som gir et endelig målbart signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i U.S. patent nr. 4.238.565. Et særlig foretrukket prostetisk gruppemerket analysesystem utnytter flavinadenindinukleotid (FAD) som markøren og apoglukoseoksidase som apoenzymet. Resulterende glukoseoksidaseaktivitet er målbar ved hjelp av et kolori-metrisk påvisningssystem som omfatter glukose, peroksidase og et indikatorsystem som gir en fargeendring som respons på hydrogenperoksyd. Fluorometrisk påvisning av hydrogenperoksyd er også mulig ved å bruke et passende fluorogent

substrat.

8. Koenzym- merkede teknikker

Det merkede konjugat i dette system er i sin markørdel sammensatt av en koenzym-virkende funksjonalitet og en slik koenzymmarkørs evne til å delta i en enzymatisk reaksjon påvirkes, ved binding av det merkede konjugatet til antistoff. Hastigheten til den resulterende enzymatiske reaksjon er målbar ved hjelp av vanlige påvisningssystemer som til slutt gir et påvisbart signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i GB-patent nr. 1.552.607 og i Anal. Biochem., 72:271 (1976), Anal. Biochem. 72:283 (1976) og Anal. Biochem. 76:95 (1976).

9. Enzymmodulator- merkede teknikker

Det merkede konjugatet i dette system er i

sin markørdel sammensatt av en enzym-modulerende funksjonalitet slik som en enzyminhibitor eller -stimulator, og en slik modulatormarkørs evne til å modulere aktiviteten av et enzym påvirkes ved binding av det merkede konjugatet til antistoff. Hastigheten til den resulterende enzymatiske reaksjon er målbar ved hjelp av vanlig brukte påvisningssystemer som til slutt gir et påvisbart signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i U.S. patentene nr. 4.134.792 og 4.273.866. Særlig foretrukket er anvendelsen av metotreksat som markør med dihydrofolatreduktase som det modulerte enzym.

10. Enzym- merkede teknikker

I dette eystem er markøren et enzym og aktiviteten til enzymmarkøren påvirkes ved binding av det merkede konjugatet til antistoff. Resulterende enzymaktivitet er målbar ved hjelp av vanlig brukte påvisningssystemer som til slutt gir et påvisbart signal, f.eks. absorbsjon eller fluorescens. Analysesystemer av denne type er beskrevet i U.S. patentene nr. 3.817.837 og 4.043.872.

Andre homogene immunologiske analyseteknikker basert på konkurrerende binding kan følges uten å avvike fra det foreliggende oppfinneriske konsept.

Ettersom særlig fenclofenac også vil ha en ubetydelig inhiberende virkning på den katalytiske aktivitet til mange enzymer ved de konsentrasjoner hvor det er effektivt som et TBP-blokkerende middel, er den foreliggende oppfinnelse ytterligere fordelaktig i homogene immunologiske analyser som omfatter enzymatiske reaksjoner. Slike, analyser omfatter de enzymsubstrat-merkede, prostetisk gruppe-merkede, koenzym-merkede, enzymmodulator-merkede og enzym-merkede tek-nikkene beskrevet ovenfor. Ved ubetydelig inhiberende virkning på enzymatisk aktivitet menes det at katalysehastigheten ikke avtar mer enn ca. 70%, vanligvis mindre enn 50% og foretrukket mindre enn 30%.

Den biologiske væske som skal analyseres, kan være en hvilken som helst hvori jodtyroninet(ene) som er av interesse, kan være uønsket forbundet med bindende proteiner. Vanligvis er den biologiske væske en blodprøve slik som helt blod, serum eller plasma.

Reagensmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter alle de viktige kjemiske elementene som kreves for å utføre en ønsket jodtyronin-immunologisk analysemetode om-fattet av den foreliggende oppfinnelse. Reagensmidlene fore-ligger i en kommersiell pakningsform som en blanding eller et tilsetningsstoff når foreneligheten av reagensene til-later det, i en prøveinnretningsform eller som et prøvesett, dvs. en pakket kombinasjon av én eller flere beholdere som inneholder de nødvendige reagensene. Inkludert i reagensmidlene er reagensene som passer for det ønskede bindings-reaksjonssystemet, og har en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. fenclofenac, som et TBP-blokkerende middel. Slike reagenser for bindingsreaksjonen omfatter vanligvis i tillegg til det blokkerende middel, et merket jodtyroninkonjugat, antistoff til jodtyroninet som skal analyseres og mulige andre TBP-blokkerende midler som kan være ønsket. Selvfølgelig kan reagensmidlene omfatte andre mater-ialer som er kjente innen teknikken, og som kan være ønske-lige ut fra et kommersielt og et brukersynspunkt, slik som buffere, fortynnere, standarder osv. Særlig foretrukket er et prøvesett for den homogene immunologiske analysen ifølge foreliggende oppfinnelse basert på konkurrerende binding som omfatter (a) et antistoff til jodtyroninet som skal bestemmes, (b) et merket jodltyroninkonjugat som har en påvisbar egenskap som endres når det bindes til antistoffet og (c) en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som et TBP-blokkerende middel. Den bestemte markøren som brukes vil være avhengig av teknikken som følges, som beskrevet ovenfor. Også foretrukket er en prøveinnretning omfattende en reagensbland-ing som inkluderer et jodtyroninantistoff, et merket jodtyroninkonjugat som har en påvisbar egenskap som endres når det bindes til antistoffet, og en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som et TBP-blokkerende middel, og en fast bærer inkorporert i reagensblandingen. De forskjellige formene av slike testinnretninger er beskrevet i EP patent-søknad nr. 51213, som innlemmes heri ved henvisning.

Den foreliggende oppfinnelse vil nå bli illu-strert, men er ikke ment å begrenses, ved hjelp av de føl-gende eksemplene.

EKSEMPLER

I. Dissosiasjon av tyroksin fra humanserum med fenclofenac og diclofenac

Man lot ca. 3 ml humanserum ekvilibrere med 125

radioaktivt jod-merket tyroksin ( I-tyroksin erholdt fra Amersham-Searle, Arlington Heights, Illinois, U.S.A.) i ca.

8 timer.

Deretter ble 100 yl aliquoter av dette serum kombinert med 300 yl aliquoter av 0,1-molar (M) natriumfosfatbuffer, pH 6,5, som inneholdt forskjellige konsentrasjoner av fenclofenac (GB-patent nr. 1.308.327, eksempel 6). Så ble 180 pl aliquoter av hver av disse blandinger tilført 2 ml kolonner med "Sephadex LH-20" (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J., U.S.A.) ekvilibrert med 0,1M natriumfosfatbuffer, pH 6,5. Radioaktiviteten på kolonnene ble målt og kolonnene ble vasket med 5 ml av bufferen. Radioaktiviteten av hver kolonne ble målt på nytt og resultatene (vist neden-under i tabell 1) brukt som beregninger av tyroksin dissosiert fra serumproteiner.

Et annet eksperiment ble utført for å sammen-ligne dissosiasjonens karakteristika for fenclofenac og di-125

clofenac. Tyroksin merket med radioaktivt jod ( I-tyroksin erholdt fra Amersham-Searle, Arlington Heights, IL, U.S.A.) ble ekvilibrert med 5 ml normalhumanserum i 48 timer ved 4°C. Aliquoter av dette serum (100 yl) ble tilsatt til 300 yl 0,1M natriumfosfat, pH 7,0, som inneholdt forskjellige konsentrasjoner av fenclofenac eller diclofenac (se eksempel XI) hvorved man fikk sluttkonsentrasjonene som er gjengitt i tabell IA. Etter 5 minutter med inkubering ved værelsestemperatur, ble en 16 5 yl aliquot tilsatt til en "Sephadex"-kolonne fra et "Seralute"-tyroksinanalysesett (Miles Laboratories, Inc., Ames Division, Elkhart, IN, U.S.A.), som var blitt ekvilibrert med 0,1M natriumfosfat, pH 7,0.

Den totale mengde radioaktivitet tilført til kolonnene ble målt og udissosiert materiale ble vasket gjennom kolonnen med 3 ml buffer. Kolonnene ble telt for å bestemme prosenten tyroksin dissosiert fra serumproteinene.

0,25 mM fenclofenac i en immunologisk analysereaksjonsblanding for jodtyronin kan derfor forventes å fri-gjøre og blokkere bindingen av ca. 40 - 50% av det protein-bundne jodtyronin, og 0,5 mM ca. 60 - 70%. Den andre under-søkelsen viste at begge de dissosierende midlene er like effektive til å dissosiere jodtyronin fra serumproteiner i en immunologisk analysereaksjon.

II. Virkning av fenclofenac på bindingen av tyroksin til antistoff

En serie antistoff-bindingsreaksjoner ble satt opp i 0,1M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, hvorved man fikk sluttvolumer på 0,6 ml som inneholdt forskjellige konsen-125 trasjoner av fenclofenac. Hver reaksjon inneholdt I-tyroksin, 20 yl normalt kanin-immunglobulin og 2 yl antistoff mot tyroksin. Blandingene ble inkubert ved værelsestemperatur i ca. 3 timer og deretter ble 400 yl 50% (vekt/ volum) polyetylenglykol tilsatt. De utfelte proteinene ble samlet opp ved sentrifugering og radioaktiviteten i hver utfelling ble målt. Resultatene er vist i tabell 2 som prosent av radioaktiviteten i utfellingen uten fenclofenac.

Dataene indikerer at konsentrasjoner av fenclofenac under ca. 5 mM inhiberer antistoffbindingsreaksjonen bare ca. 50% og under ca. 2,5 mM bare ca. 60%. Basert på disse data og de fra eksempel I, ville foretrukne fenclofenackonsentrasjoner i en immunologisk analysereaksjonsblanding for tyroksin være i området 0,25 - 1,0 mM.

III. Radioaktiv immunologisk analyse av tyroksin

En radioaktiv immunologisk analyse av tyroksin

i serum ble utført ved å bruke fenclofenac som det TBP-blokkerende middel. Serumstandarder i 100 yl aliquoter som inneholdt kjente konsentrasjoner av tyroksin ble kombinert med 290 yl 0,IM natriumfosfatbuffer, pH 6,5, en tilstrekkelig stor mengde av fenclofenac til å gi en konsentrasjon på 0,67 mM

i den enedelige analyseblandingen, 2 1 kaninantistoff mot tyroksin og en bestemt mengde <125>I-tyroksin (ca. 34.000 tellinger pr. minutt pr. 100 yl i sluttvolumet). Etter inkubering ved værelsestemperatur i 2 timer, ble 400 yl 50%

(vekt/volum) polyetylenglykol tilsatt og de resulterende utfellingene samlet opp ved sentrifugering. Radioaktiviteten i hver utfelling ble deretter målt. Resultatene er vist i tabell 3 (yg/dl er mikrogram pr. deciliter).

Dataene indikerer at etter hvert som tyroksinnivået i serumprøven øket, minket mengden merket tyroksin bundet til antistoff. Det ble følgelig demonstrert at fenclofenac kan brukes effektivt i immunologiske analyser basert på konkurrerende binding for jodtyronintyroksin i serum.

IV. Optiske absorbsjonsspektra for fenclofenac og diclofenac

En 50 mM oppløsning av fenclofenac i fortynnet natriumhydroksydoppløsning ble fremstilt og funnet ikke å

ha noen synlig farge. Det optiske absorbsjonsspekteret for en 0,5 mM oppløsning i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, ble målt og det ble ikke funnet noen absorbsjon av betydning over 300 nanometer (nm). Følgelig kan fenclofenac ikke ha noen virkning av betydning på spektrofotometriske signaler produ-sert over denne bølgelengde.

I motsetning til dette har det vanlig brukte blokkerende middel ANS'en betydningsfull absorbsjon over 300 nm. En 50 yM oppløsning av ANS i 0,1 M fosfatbuffer,

pH 7,0, oppviste et bredt absorbsjonsbånd fra 300 - 400 nm med en topp på 0,5 ved ca. 350 nm. ANS gir følgelig absorbsjon av betydning ved svært lave konsentrasjoner, konsentrasjoner langt under de som ANS vanligvis brukes ved som et blokkerende middel (ca. 1 mM).

I en annen undersøkelse ble oppløsninger av fenclofenac og diclofenac fremstilt ved å oppløse dem i 0,1 M natriumhydroksyd og spektra ble fremstilt ved hjelp av et Bausch & Lomb "Spectronic 2000" avsøkende spektro-fotometer med dobbelt stråle.

Mens begge forbindelser har et absorbans-spektrum nær UV, har ingen av dem absorbans over 320 nm. Ingen av forbindelsene ville bidra med noen interferens med spektrofotometrisk fremstilte signaler over denne bølgelengde.

V. Virkning av fenclofenac på aktiveringen av apoglukoseoksidase med FAD- merkede konjugater

Det ble stilt opp en serie reaktiveringsmålinger av apoenzym med forskjellige konsentrasjoner fenclofenac. Analysene ble utført ved 37°C og sluttkonsentrasjonene av reagenser i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,0, var 1,0 nanomolar (nM) FAD-merket konjugat (et FAD-teofyllinkonju-gat som beskrevet i U.S. patent nr. 4.238.565), 50 nM apoglukoseoksidase (U.S. patent nr. 4.268.631), 2,5 yl/ml anti-(glukoseoksidase)-antiserum, 2 mM natriumdiklorhydroksybenzensulfonat (DHSA), 0,2 mM 4-aminoantipyrin, 0,1 M glukose,

20 yg/ml peroksidase og 0,1% (vekt/volum) serumalbumin fra okse. Apoenzymet og anti(glukoseoksidase)en ble på forhånd inkubert og reaksjonen deretter startet opp ved samtidig iblanding av de øvrige reagensene. Reaksjonsblandingene ble inkubert i 5 minutter og deretter ble absorbansen ved 520 nm avlest. Resultatene vist i tabell 4 relaterer fenclofenackonsentrasjon til produksjonen av aktivt glukoseoksidase.

Dataene indikerer at fenclofenackonsentrasjoner under 2,5 mM lar rekombinasjonen av apoglukoseoksidase og FAD-merkede konjugater fortsette i en hastighet tilstrekkelig stor for anvendelse av en prostetisk gruppe-merket immunologisk analyse (U.S. patent nr. 4.238.565).

For sammenligningsformål ble det stilt opp en serie reaktiveringsmålinger av apoenzym med forskjellige konsentrasjoner av det vanlig brukte blokkerende middel ANS.

De følgende reagensene ble fremstilt:

ANS ble oppløst direkte i adskilte aliquoter av reagens A i konsentrasjonene vist i tabell 5. Apoenzymaktivitet ble bestemt ved å plassere 50 pl reagens B i en kuvette og starte omsetningen ved å tilsette 1,90 ml reagens A. Reaksjonsblandingene for analysen ble inkubert i 10 minutter ved værelsestemperatur og asorbansene ved 520 nm avlest. Resultatene er vist i tabell 5.

Dataene viser at ANS-konsentrasjoner over ca. 1,0 mM inhiberer totalt rekombinasjonsreaksjonen. Ettersom ANS-konsentrasjoner rundt denne konsentrasjon kreves ved anvendelse som blokkerende middel, kan ANS ikke brukes i den immunologiske analysen.

I en annen studie ble virkningen av fenclofenac på aktiveringen av apoglukoseoksidase med et FAD-jodtyronin-(T-4) konjugat undersøkt. Aktiveringen av apoglukoseoksidase ble stilt opp med forskjellige konsentrasjoner av fenclofenac og utført ved 37°C. Til to sett analyseoppløsninger inneholdende 96 mM natriumfosfat, pH 7,0, 95 mM glukose, 1,0 mM natriumdiklorhydroksybenzensulfonat (DHSA), 19 ug/ml peroksidase og forskjellige konsentrasjoner med natriumfenclofenac, ble det tilsatt apoglukoseoksidae, 4-aminoantipyrin og anti(glukoseoksidase) til sluttkonsentrasjoner på hhv.

100 nM, 100 uM, 5 yl/ml eller 2,1 nM sluttkonsentrasjon av et FAD-tyroksinkonjugat. Etter forhåndinkubering av analyse-mediene i 5 minutter ved 37°C, ble FAD-tyroksinkonjugatet eller apoglukoseoksidasereagensen tilsatt til det passende analysesett. Absorbansen ved 520 nm ble målt etter en 330 sekunders inkubering. Dataene er fremlagt som en prosent av absorbansen målt når ikke noe fenclofenac er tilstede .

Den kolorimetriske respons ble minsket med bare 8 - 10% ved ca. 2 mM fenclofenac når det ble brukt et FAD-tyroksinkonjugat til å aktivere apoglukoseoksidasen under de anvendte be-tingelsene ved en aktuell immunologisk analyse for jodtyronin .

VI. Undersøkelserav f luo:rescensreduksjon med fenclofenac

Fluorescensmålinger ble utført i 50 mM "Bicine"-buffer (N,N-bis-(2-hydroksyetyl)glycin, Calbiochem-Behring, LaJolla, California, U.S.A.), pH 8,3, ved å bruke et "Aminco Bowman Fluorometer" (American Instruments, Silver Springs, Maryland, U.S.A.), eksitasjon satt til 400 nm og.emisjon ved 450 nm, som er fluorescensbetingelsene for den 3-galak-tosyl-umbelliferonenzymsubstrat-merkede immunologiske analysemetoden basert på fluorescens (SLFIA) beskreveti U.S. patent nr. 4.279.992. Under disse betingelser oppviste 10 mM fenclofenac ingen fluorescens.

Reduksjonsundersøkelser ble utført ved å måle fluorescensen til en 1,3 yM oppløsning av 2-[7-hydroksy-3-karboksamidokoumarin]etanol (U.S. patent nr. 4.273-715) i nærvær av forskjellige nivåer med fenclofenac. Forholdet mellom observert fluorescens (F) og fluorescens i fravær av fenclofenac (Fo) sammenlignet med fenclofenackonsentrasjon ble beregnet og er gjengitt i tabell 6.

Dataene indikerer at fenclofenac praktisk talt ikke oppviser noen reduserende virkning på det fluorescerende middel umbelliferon brukt i SLFIA-teknikken og er føl-gelig godt egnet for bruk som et TBP-blokkerende middel i slike homogene immunologiske analyseteknikker (U.S. patent nr. 4.279.992).

VII. Virkning av fenclofenac på aktiviteten til enzymet dihydrofolatreduktase

Analyseblandinger ble fremstilt slik at de inneholdt forskjellige konsentrasjoner av fenclofenac og,

i et 1 ml sluttvolum ved 37°C, 0,3 mM tiazoyIblått, 0,115 M dihydrofolat, 0,5 mM NADPH og 0,012 enheter/ml dihydrofolatreduktase. Absorbansen til hver reaksjonsblanding ved 560 nm ble avlest over en 10 minutters inkubasjonsperiode ved 37°C. Resultatene er gjengitt i tabell 7.

Datene indikerer at fenclofenac ikke ga noen vesentlig inhibering av enzymaktivitet ved konsentrasjoner under 1,0 mM som er effektive til å dissosiere tyroksin fra serumproteiner, og følgelig er fenclofenac godt egnet for bruk som et TBP-blokkerende middel i enzymmodulator-merkede homogene immunologiske analysemetoder (U.S. patent nr. 4.134.792).

VIII. Enzyminhibitor- merket immunologisk analyse av tyroksin

En enzyminhibitor-merket immunologisk analyse (U.S. patent nr. 4.134.792) av tyroksin i serum ble utført ved å bruke fenclofenac som det TBP-blokkerende middel. Serumstandarder i 40 yl aliquoter inneholdende kjente konsentrasjoner av tyroksin ble kombinert med 0,2 ml av et anti-stoffreagens inneholdende 21 yl kaninantiserum mot tyroksin i 1 ml av 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, inneholdende 0,3 M kaliumklorid, 0,0 5% natriumazid og 0,5 mM fenclofenac. Etter en 30 sekunders inkubering ble det til hver blanding tilsatt 0,2 ml av et konjugatreagens bestående av 0,6 3 mg/ml NADPH (0,65 mM), 0,0175 yM av et metotreksat-tyroksinkonjugat (fremstilt som beskrevet i EP-A1-79486) i 10 mM natrium-karbonatbuffer, pH 9,5. Etter inkubering i ytterligere 30 sekunder ble det tilhver blanding tilsatt 0,2 ml av et enzymreagens bestående av dihydrofolatreduktase i en konsentrasjon på 27,5 nM metotreksat-bindende steder i 0,1 M tris-HCl-buffer (tris-(hydroksymetyl)amino-metanhydrokloridsalt, Calbiochem-Behring, La Jolla, California, U.S.A.), pH 8,5, inneholdende 0,5% (vekt:volum) gelatin og 0,005% (vekt:volum) klorheksidin (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, U.S.A.). Etter ytterligere 5 minutter med inkubering ble det til hver blanding tilsatt 50 yl av 2,5 mM dihydrofolat i 0,1 M tris-HCl, pH 8,5. Førtifem (45) sekunder senere ble absorbansen i hver oppløsning ved 340 nm avlest i løpet av en periode på 1 minutt. Resultatene er gjengitt i tabell 8.

Etter hvert som tyroksinnivået i serumprøven øket, øket følgelig mengden enzyminhibering av inhibitor-tyroksinkonjugatet. Fenclofenac påvirket ikke i vesentlig grad hverken den spektrofotometriske respons ved 340 nm eller den enzymatiske reaksjonen.

IX. Enzymsubstrat- merket immunologisk analyse av tyroksin A. Syntese av merket konjugat av 5-(tyroksinamido)-pentyl, 4-metylumbelliferon, og hydrogenfosfat

En oppløsning av 8,73 g (10 mmol) N-trifluor-acetyl-L-tyroksin, 1,133 g (11 mmol) 5-amino-l-pentanol og

2,7 g (20 mmol) 1-hydroksybenzotriazol i 125 ml tørr dimetyl-formamid (DMF) ble avkjølt til -5°C med omrøring under argon. Til dette ble det tilsatt 2,28 g (11 mmol) dicykloheksylkar-bodiimid. Avkjølingsbadet ble fjernet og reaksjonsblandingen ble hensatt til den nådde værelsestemperatur og om-rørt i 3 timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum. Resten ble tatt opp i 250 ml etylacetat, filtrert og vasket med 150 ml mettet vandig natriumbikarbonatoppløsning og 5% vandig sitronsyreoppløsning. Denne resten ble renset ved preparativ væskekromatografi i en silikagelkolonne som ble eluert med 5:1 (volum/volum) metylenklorid:aceton. Dette ga 6,5 g (67% utbytte) av N-(5-hydroksypentyl)amidet av N-tri-

fluoracetyltyroksin som et hvitt fast stoff, smeltepunkt 202 - 203°C.

Analyse: Beregnet for <C>22H21F3I4<N>2°5<:>

N-(5-hydroksypentyl)amidet (5,75 g, 6 mmol)

og 2,01 g (6 mmol) av pyridinsaltet av 4-metylumbelliferon-monofosfat ble suspendert i 75 ml tørr DMF. Blandingen ble konsentrert til ca. 2 5 ml i volum på et roterende inndamper knyttet til en vakuumpumpe. Ytterligere 20 ml tørr DMF ble tilsatt etterfulgt av 30 ml tørr pyridin. Fast dicyklohek-sylkarbodiimid (2,48 g, 12 mmol) ble deretter tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt under argon ved værelsestemperatur i 24 timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og resten omrørt med 30 ml 0,1 M vandig trietylammoniumbikarbo-nat i 1 time. Det hvite bunnfallet ble frafiltrert og deretter omrørt i 30 minutter i 300 ml eter og frafiltrert. Dette ga 8 g av det ønskede produkt forurenset med dicyklo-heksylurea. Denne resten (1,6 g) ble tatt opp i metanol (noe uoppløselig materiale ble fjernet ved filtrering) og kromatografert på "Sephadex LH-20" (60 cm x 5 cm) idet det ble eluert med metanol. Gjennomstrømningshastigheten var 0,5 ml pr. minutt og 10 ml fraksjoner ble samlet opp.

Fraksjonene 69 - 76 ble helt sammen og inndam-pet hvorved man fikk i form av et hvitt glassaktig fast stoff 390 mg 5-[N-(trifluoracetamido)tyroksinamido]pentyl, 4-metyl-hydrogenfosfat, trietylammoniumsalt.

Analyse: Beregnet for C38<H>43<F>3<I>4PN3°io:

En 200 mg porsjon av den N-trifluoracetamido-beskyttede fosfodiester ble oppløst i 50% vandig metanol,

pH 12, i 13 timer. Reaksjonen ble stanset med 0,5 ml eddik-syre og deretter ble oppløsningen konsentrert til tørrhet under vakuum. Resten ble tatt opp i metanol som inneholdt litt ammoniumhydroksyd, 2,5 g silikagel tilsatt og oppløs-ningsmidlet fjernet. Den impregnerte adsorbanten ble pias-

sert på toppen av en kolonne av 25 g silikagel tilberedt med 10:5:1 (volum/volum/volum) kloroform:metanol:konsentrert ammoniumhydroksyd. Kolonnen ble eluert med dette oppløs-ningsmidlet og 9 ml fraksjoner ble samlet opp.

Fraksjonene 10 - 21 ble slått sammen og inn-dampet, hvorved man fikk 100 mg 5-(tyroksinamid)pentyl, 4-metylumbelliferon, hydrogenfosfat, i form av et hvitt mikro-krystallinsk fast stoff, smeltepunkt 191 - 192°C (mørkner fra 188°C).

Analyse: Beregnet for C3QH29I4PH209 .H"20:

B. Analysemetode

De følgende reagenser ble satt sammen:

Reagens A 50 mM "Bicine"-buffer med 0,1% natriumazid,

pH 8,5

Reagens B 60 mM fenclofenac i 0,5 N natriumhydroksyd Reagens C tyroksinstandarder med konsentrasjoner på 0, 2,

4, 6, 8, 10, 12, 16 og 20 ug/dl fremstilt ved å tilsette tyroksin (Sigma) til tyroksin fritt serum.

Reagens D antistoff/enzymreagens inneholdende 50 yl antiserum pr. ml og 0,12 enheter pr.

ml fosfodiesterase (Sigma, type VII) i

" B ic ine " -bu f f e r.

Reagens E 1,24 uM av det merkede konjugatet (del A

ovenfor) i 5 mM formiat, 0,1% natrium-azidbuffer, pH 3,5.

Analyseoppskriften medførte å tilsette 75 yl av reagens B og 0,5 ml av reagens A til en kuvette, etterfulgt av 75 yl av en passende reagens C og nok en gang 0,5 ml av reagens A, og til slutt 75 yl av reagens D og for tredje gang 0,5 ml av reagens A. Etter inkubering ved værelsestemperatur i 1 time, ble analysereaksjonen startet ved å tilsette 75 yl av reagens E og 0,5 ml av reagens A

til kuvetten. Fluorescensen (eksitasjon = 360 nm, emisjon

= 450 nm) ble målt 20 minutter etter tilsetningen av reagens E.

C. Resultater

Analysen ble utført for hvert reagens C og resultatene ble som vist i tabell 9.

Etter hvert som tyroksinkonsentrasjonen økte, økte fluorescensemisjonen. Følgelig var det etablert en analyse for tyroksin.

X. Anvendelsen av fenclofenac eller diclofenac i et immunologisk analysesystem for serumtyroksin basert på reakti-vering av apoenzym

Standardkurver for serumtyroksin ble fremstilt ved å bruke en halvautomatisert analyseoppskrift på "Gilford Clinical Chemistry Analyzer System 203-S" (Gilford Instru-ment Laboratories, Oberlin, OH, U.S.A.), Bufferen bestående av 96 mM natriumfosfat, pH 7,0, 2,1 mM diklorhydroksybenzen-sulfonat (DHSA), 21 yg/ml peroksidase, 105 mM glukose og 2 mM natriumfenclofenac eller natriumdiklofenac ble på forhånd oppvarmet til 37°C før 0,8 ml ble tilsatt til reaksjonsbeholderen med o,05 ml av 200 yl/ml tyroksinstandarder i T^-, T^-fritt humanserum (AMF Biological and Diagnostic Products, Sequin, TX, U.S.A.), 100 yl/ml anti(glukoseoksidase )-antiserum, 15 yl/ml anti(tyroksin)antiserum, 0,03 M natriumfosfat, pH 7,0. FAD-tyroksinkonjugatet (40 nm i 0,1 M natriumfosfat, pH-7,0, 0,01% "Triton X-100") i form av en 0,05 ml aliquot ble tilsatt til reaksjonsbeholderen og hensatt for ekvilibrering i 30 sekunder. Reaksjonen ble startet ved å tilsette 0,10 ml 1,0 MM apoglukoseoksidase,

2 mM 4-aminoantipyrin, 12% glycerol, 80 mM natriumfosfat,

pH 7,0. Absorbansen ved 520 nm ble målt etter en inkubering på 8 minutter.

Med fenclofenac eller diclofenac som det jodtyronin-dissosierende middel kan man påvise en sammenheng mellom absorbansen som avleses, og konsentrasjonen av tyroksin i serum ved å bruke et homogent immunologisk analysesystem basert på apo-enzymreaktivering.

XI. Virning av pH på dissosieringen av jodtyronin fra serumproteiner

Ved å bruke kolonnefremgangsmåten beskrevet i den andre undersøkelsen i eksempel I, ble pH-en i 0,1 M natriumfosfatoppløsningen variert og konsentrasjonen av det dissosierende middel holdt konstant ved 2,0 mM. Kolonnene ble ekvilibrert med buffer inneholdende det dissosierende middel ved den gitte pH og 165 pl av serumet fortynnet i buffer ved den gitte pH (som beskrevet ovenfor) ble tilsatt til kolonnen. Det totale antall tellinger ble målt og deretter ble kolonnene vasket med buffer ved den gitte pH. Tellingene som ble igjen på kolonnen representerer prosenten av dissosiert jodtyronin.

Dissosiasjonen av jodtyronin fra serumproteiner med fenclofenac eller diclofenac er uavhengig av pH (over området 6,8 - 8,0) hvor inkuberingen av den immunologiske analysen utføres.

XII. Fremstilling av diclofenac

Ved å følge metoden ifølge JP Kokai patentskrift nr. 80-79.352 (Chem. Abs. 94:121132u), ble 2-jodben-zosyre behandlet med tionylklorid og dimetylamin, hvorved man fikk N,N-dimetyl-2-jodfenylacetamid. Omsetning etter oppvarming med 2,6-dikloranilin i nærvær av kaliumkarbonat ved å følge metoden ifølge JP Kokai patentskrift nr. 80-87.748 (Chem. Abs. 94:30378q) ga N,N-cimetyl-o-(2,6-diklor-fenylamino)fenylacetamid. Hydrolyse med 15% kaliumhydroksyd (GB-patentsøknad nr. 2.027.028) ga diclofenac [o-(2,6-di-klorfenylamino)fenyleddiksyre].

Claims (4)

1. Homogen immunologisk analysemetode basert på konkurrerende binding for bestemmelse av et jodtyronin i en prøve av uekstrahert serum eller plasma, hvor det dannes en reaksjonsblanding ved å kombinere prøven med reagenser som omfatter et antistoff til jodtyroninet, et markert jodtyroninkonjugat og et TBP-blokkerende stoff, og hvor et spektrofotometrisk svar, fortrinnsvis en fluoresensemmisjon, eller en absorbsjonsendring bevirket av analysereaksjonen, utvikles i reaksjonsblandingen ved en bølgelengde større enn 300 nm, karakterisert ved at det som TBP-blokkerende stoff benyttes en forbindelse med formel hvori Y betyr 0, R<1> betyr klor og R<2> betyr hydrogen, eller Y betyr NH, R<1> betyr hydrogen, og R<2> betyr klor, eller et salt herav.

2. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at det som blokkerende stoff benyttes 2(2,4-diklorfenoksy)fenyl-eddiksyre eller et salt herav.

3. Reagensmidler for den homogene immunoanalysebestemmelse av et jodtyronin i en prøve av uekstrahert serum eller plasma, omfattende et antistoff til jodtyroninet, et TBP-blokkerende stoff og et merket jodtyroninkonjugat med evnen til å utvikle et spektrofotometrisk svar, fortrinnsvis en fluorescensemisjon eller en absorpsjonsendring bevirket av analysereaksjonen ved en bølgelengde større enn ca. 300 nm, karakterisert ved at det TBP-blokkerende stoff er en forbindelse ifølge krav 1 eller 2.

4. Prøveinnretning for homogen immunoanalysebestemmelse av et jodtyronin i en prøve av uekstrahert serum eller plasma, idet innretningen omfatter en fast bæredel inkorporert med et antistoff til jodtyroninet, et TBP-blokkerende stoff og et merket jodtyroninkonjugat med evnen til å utvikle et spektrofotometrisk svar, fortrinnsvis en fluorescensemisjon eller en absorpsjonsendring bevirket av analysereaksjonen ved en bølgelengde større enn ca. 300 nm, karakterisert ved at det TBP-blokkerende stoff er en forbindelse ifølge krav 1 eller 2.