CN117700334A - 一种3-羟基苯基丙酸衍生物、3-羟基苯基丙酸免疫检测试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种3‑羟基苯基丙酸衍生物、3‑羟基苯基丙酸免疫检测试剂及其制备方法。所述3‑羟基苯基丙酸衍生物的结构式如下述式(Ⅰ)所示：使用所述3‑羟基苯基丙酸衍生物获得了高免疫原性的3‑羟基苯基丙酸免疫原与相应抗体、3‑羟基苯基丙酸酶标偶联物，以及3‑羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂。所述3‑羟基苯基丙酸免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗3‑羟基苯基丙酸抗体特异性强、效价高，制成的均相酶免疫检测试剂可以快速、准确地确定生物样品中的3‑羟基苯基丙酸含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现3‑羟基苯基丙酸的高通量、快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高。

Description

一种3-羟基苯基丙酸衍生物、3-羟基苯基丙酸免疫检测试剂 及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种3-羟基苯基丙酸衍生物、3-羟基苯基丙酸免疫检测试剂及其制备方法。
背景技术
孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders，ASD)是一种起病于婴幼儿时期的神经发育障碍性疾病，患病率呈逐年上升趋势，该病以社会沟通与交往障碍，局限的、重复的刻板行为，狭窄的兴趣或活动为核心症状。3-羟基苯基丙酸(3-Hydroxyphenylpropionicacid，3HPP)是肠道中梭菌类代谢副产物与人体代谢产物结合产生的苯丙氨酸异常代谢产物—M-酪氨酸的代谢产物，分子式为C9H10O3，分子量为166.17。能产生3HPP的梭菌包括生孢梭菌、肉毒杆菌、耐热芽孢杆菌、芒氏梭菌、戈氏梭菌、双酶杆菌、艰难梭菌和索氏芽孢杆菌。临床上，尿液3-羟基苯基丙酸含量的检测具有重要的临床意义。3HPP能够消耗儿茶酚胺，可引起如刻板行为，极度活跃高度-反应性的孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorders，ASDs)样行为。高浓度的3HPP通过抑制多巴胺-β羟化酶，导致神经递质平衡紊乱，发生行为障碍和精神性问题，包括：抽搐、抑郁、孤独症、精神分裂症等。ASDs患者尿液中3HPP含量明显升高，检测尿液中3HPP的含量，有助于早期发现ASDs患者，及早进行行为干预和教育，改善ASDs患儿的不良预后情况。
检测3-羟基苯基丙酸的实验室方法有比色法、放射免疫分析法、高效液相色谱法、液相串联质谱法、酶联免疫吸附测定法等。比色法检测的是3-羟基苯基丙酸等类似物质的总量而非单一化合物的水平；放射免疫分析法稳定性较差，且存在放射线辐射与污染等问题；高效液相色谱法前处理复杂，要求目标分析物在色谱上被完全分离，因此分析时间较长；液相串联质谱法检测灵敏度高，快速快，但结构复杂，维护成本高，需经过专门培训的技术人员操作，不易在基层医疗机构普及；酶联免疫吸附测定法灵敏度高，特异性好，但检测时间长，准确度差，难以用于批量检测。因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高，检测时间短，样品处理简单，仪器自动化程度高，可多样本连续检测的3-羟基苯基丙酸检测产品。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种3-羟基苯基丙酸衍生物、3-羟基苯基丙酸免疫检测试剂及其制备方法，实现3-羟基苯基丙酸的高通量、快速化检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一、提供一种3-羟基苯基丙酸衍生物，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：
二、提供一种上述的3-羟基苯基丙酸衍生物的制备方法，所述制备方法的合成路线如下：
具体的制备步骤如下：
a.化合物2的合成
将化合物1(10g，0.09mol)与无水丙二酸(25g，0.24mmol)加入无水吡啶(200ml)中，同时加入几滴哌啶，制成反应混合物溶液，将所述反应混合物溶液在80℃下加热1小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液冷却，然后用HCl溶液(～20ml)进行酸化使产物沉淀；制备得到的固体产物，经过滤，然后从乙醇中重结晶，得到化合物2。
b.化合物3的合成
将化合物2(8.2g，0.05mol)溶解于100mL MeOH中，然后逐滴加入10％Pd/C(0.8g)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在通入H2并处于室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物3。
c.化合物4的合成
将化合物3(3.3g，0.02mol)溶解于100mL DCM中，然后逐滴加入HATU(7.6g，0.02mol)、TEA(2.0g，0.02mol)以及(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯(3.2g，0.02mol)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物4。
d.3-羟基苯基丙酸衍生物的合成
将化合物4(1.6g，0.005mol)溶解于50mL MeOH中，然后逐滴加入HCl/MeOH(20mL，2M)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物通过制备级高效液相色谱(pre-HPLC)纯化，得到3-羟基苯基丙酸衍生物(3-(3-Hydroxyphenyl)propanoic acid derivative)。
三、提供一种3-羟基苯基丙酸免疫原，由上述的3-羟基苯基丙酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：
四、提供一种上述的3-羟基苯基丙酸免疫原的制备方法，包括以下步骤：
a.称取5.0～25.0mg上述式(Ⅰ)所示的3-羟基苯基丙酸衍生物，溶解于5.0～25.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L、pH＝8.5)中，得到3-羟基苯基丙酸衍生物溶液；
b.称取10.0～50.0mg甲基化的牛血清白蛋白、1.0～10.0mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、50.0～100.0mg Sulfo-NHS,溶解于1.0～5.0ml磷酸钾缓冲液(浓度为10.0mmol/L、pH＝4.5～5.0)中，然后在室温条件下搅拌反应5～25分钟，得到甲基化的牛血清白蛋白活性溶液；
c.将步骤b中得到的甲基化的牛血清白蛋白活性溶液直接倒入步骤a中得到的3-羟基苯基丙酸衍生物溶液中混匀，得到偶联反应混合溶液，然后将所述偶联反应混合溶液在室温条件下搅拌反应10～60分钟，搅拌结束后在2～8℃条件下静置12小时，得到3-羟基苯基丙酸免疫原溶液。
d.将步骤c中得到的3-羟基苯基丙酸免疫原溶液通过G-25葡聚糖凝胶层析柱纯化，纯化后得到3-羟基苯基丙酸免疫原，置于-20℃下储存。
五、提供一种抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体，所述抗体是由上述的3-羟基苯基丙酸免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
六、提供一种上述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
a.将上述式(Ⅱ)所示的3-羟基苯基丙酸免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0～5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0～5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
b.1～4周后，再用2.0～5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1～4周注射一次，共计注射3～8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体。
七、提供一种3-羟基苯基丙酸酶标偶联物，由上述的3-羟基苯基丙酸衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式(Ⅲ)所示：
八、提供一种上述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
a.称取1.0～10.0mg上述式(Ⅰ)所示的3-羟基苯基丙酸衍生物，溶解于0.1～1.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/L、pH＝8.5)中，然后加入0.1～1.0ml无水DMF、1.0～20.0mg葡萄糖-6-磷酸搅拌均匀，得到3-羟基苯基丙酸衍生物溶液；
b.称取1.0～5.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶解于0.1～1.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为10.0mmol/L、pH＝5.0～5.5)中，将溶液温度降至2～8℃，然后同时加入2.5～15.0mg Sulfo-NHS与1.0～20.0mg EDAC，并在室温条件下缓慢搅拌反应1～5分钟，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液；
c.将步骤a制备的3-羟基苯基丙酸衍生物溶液与步骤b制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液温度都降至2～8℃，然后将3-羟基苯基丙酸衍生物溶液逐滴添加到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液中，整个滴加过程持续5分钟，随后将混合溶液在2～8℃下搅拌2小时，得到3-羟基苯基丙酸酶标偶联物溶液。
d.将步骤c制备的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物溶液通过G-25葡聚糖凝胶层析柱(用50mM、pH＝9.0的Tris缓冲液预平衡)纯化，纯化后添加质量分数0.5％的BSA及质量分数0.1％的NaN3，得到3-羟基苯基丙酸酶标偶联物。
九、提供一种3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含上述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体和均相酶底物溶液，所述均相酶底物溶液由葡萄糖-6-磷酸和Tris缓冲液配制而成；所述R2试剂包含上述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物和辅酶溶液，所述辅酶溶液由氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Tris缓冲液配制而成；使用时将所述R1试剂与R2试剂按1:1～4:1的体积比混合，优选按1:1的体积比使用。
十、提供一种上述的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
a.R1试剂的制备：将2.5～7.5g的葡萄糖-6-磷酸用1.0～2.5L、55mmol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将上述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中，搅拌均匀得到R1试剂，所述抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:1000；
b.R2试剂的制备：将5.0～15.0g的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸用2.0～5.0L、120mmol/L、pH＝8.2的Tris缓冲液溶解制成辅酶溶液；再将上述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物加入所述辅酶溶液中，搅拌均匀得到R2试剂，所述3-羟基苯基丙酸酶标偶联物与辅酶溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述3-羟基苯基丙酸酶标偶联物与辅酶溶液的体积比为1:1500。
本发明的有益效果是：获得了一种全新的3-羟基苯基丙酸衍生物，所述3-羟基苯基丙酸衍生物可以通过末端-NH2基团与载体蛋白中的游离-COOH偶联，使用所述3-羟基苯基丙酸衍生物制备出免疫原性强的3-羟基苯基丙酸免疫原，从而免疫实验动物得到效价高、特异性强的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体；同时，所述3-羟基苯基丙酸衍生物可以通过末端-NH2基团与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中的游离-COOH偶联，使用所述3-羟基苯基丙酸衍生物制备得到3-羟基苯基丙酸酶标偶联物。利用所述抗体与所述酶标偶联物制备的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对3-羟基苯基丙酸高通量、快速化的检测。
本发明另外一个有益效果在于：均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了防止葡萄糖-6-磷酸脱氢-半抗原酶标偶联物与酶的底物(葡萄糖-6-磷酸)及辅酶(氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应，必须将酶标偶联物与底物分开放置，不能混合。所以传统的均相酶免疫检测试剂是将底物、辅酶与半抗原特异性抗体混合在一起制成R1试剂，而将葡萄糖-6-磷酸脱氢-半抗原酶标偶联物单独加入R2试剂中的。也就是说，传统的均相酶免疫检测试剂在使用前底物与辅酶是混合在一起的。然而，如果在使用前操作者不慎将少量R2试剂混入R1试剂中，或者全自动生化分析仪运行过程中存在携带污染情况，就会使酶和底物提前发生反应，而且在底物和辅酶充足的情况下，反应会持续进行，导致底物被大量消耗，同时氧化态的辅酶会被大量还原成还原态的辅酶，从而导致检测试剂本底信号持续升高，严重影响检测结果的准确度，甚至导致试剂完全报废。本发明改进了传统均相酶免疫试剂的配方，将辅酶添加到R2试剂中，而R1试剂中只添加抗体与底物，不再添加辅酶，这样即使使用前有少量R2试剂混入R1试剂中，反应也会在辅酶消耗完后立刻终止。因此本发明可以有效避免试剂使用前R1试剂与R2试剂发生交叉污染导致的本底反应信号升高，避免了试剂浪费，提高了检测准确度。
本发明的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低3-羟基苯基丙酸检测成本，有利于临床推广使用。
附图说明
图1是本发明的3-羟基苯基丙酸ELISA检测反应标准曲线；
图2是本发明的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测反应标准曲线；
图3是本发明的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫法与高效液相色谱法相关性分析图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1.3-羟基苯基丙酸衍生物的合成
3-羟基苯基丙酸衍生物的化学结构如式(Ⅰ)所示：
上述3-羟基苯基丙酸衍生物的制备方法，其合成路线如下：
具体的制备步骤如下：
a.化合物2的合成
将化合物1(10g，0.09mol)与无水丙二酸(25g，0.24mmol)加入无水吡啶(200ml)中，同时加入几滴哌啶，制成反应混合物溶液，将所述反应混合物溶液在80℃下加热1小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液冷却，然后用HCl溶液(～20ml)进行酸化使产物沉淀；制备得到的固体产物，经过滤，然后从乙醇中重结晶，得到化合物2(13g，产率87％)。
b.化合物3的合成
将化合物2(8.2g，0.05mol)溶解于100mL MeOH中，然后逐滴加入10％Pd/C(0.8g)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在通入H2并处于室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物3(7.6g，产率92％)。
c.化合物4的合成
将化合物3(3.3g，0.02mol)溶解于100mL DCM中，然后逐滴加入HATU(7.6g，0.02mol)、TEA(2.0g，0.02mol)以及(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯(3.2g，0.02mol)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物4(2.8g，产率45％)。
d.3-羟基苯基丙酸衍生物的合成
将化合物4(1.6g，0.005mol)溶解于50mL MeOH中，然后逐滴加入HCl/MeOH(20mL，2M)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物通过制备级高效液相色谱(pre-HPLC)纯化，得到3-羟基苯基丙酸衍生物(3-(3-Hydroxyphenyl)propanoic acid derivative)(0.9g，产率86％)。
实施例2.3-羟基苯基丙酸免疫原的合成
本实施例中的3-羟基苯基丙酸免疫原由式(Ⅰ)所示的3-羟基苯基丙酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：
该3-羟基苯基丙酸免疫原的合成方法具体步骤如下：
a.称取15.0mg上述式(Ⅰ)所示的3-羟基苯基丙酸衍生物，溶解于15.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L、pH＝8.5)中，得到3-羟基苯基丙酸衍生物溶液；
b.称取30.0mg甲基化的牛血清白蛋白、5.0mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、75.0mg Sulfo-NHS，溶解于3.0ml磷酸钾缓冲液(浓度为10.0mmol/L、pH＝4.5)中，然后在室温条件下搅拌反应15分钟，得到甲基化的牛血清白蛋白活性溶液；
c.将步骤b中得到的甲基化的牛血清白蛋白活性溶液直接倒入步骤a中得到的3-羟基苯基丙酸衍生物溶液中混匀，得到偶联反应混合溶液，然后将所述偶联反应混合溶液在室温条件下搅拌反应30分钟，搅拌结束后在4℃条件下静置12小时，得到3-羟基苯基丙酸免疫原溶液。
d.将步骤c中得到的3-羟基苯基丙酸免疫原溶液通过G-25葡聚糖凝胶层析柱纯化，纯化后得到3-羟基苯基丙酸免疫原，置于-20℃下储存。
实施例3.抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的制备
将实施例2制备得到的3-羟基苯基丙酸免疫原采用弗氏佐剂免疫法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
a.将上述式(Ⅱ)所示的3-羟基苯基丙酸免疫原用PBS缓冲液稀释至4.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将4.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射；
b.3周后，再用4.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物兔注射一次，之后每隔3周注射一次，共计注射5次；
c.对免疫后的实验动物兔取血，分离纯化抗血清，得到抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体。
实施例4.使用3-羟基苯基丙酸ELISA检测方法检验抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的灵敏度
1.3-羟基苯基丙酸ELISA检测标准曲线的建立
(1)校准品的制备
将3-羟基苯基丙酸粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为120.00μg/mL、60.00μg/mL、30.00μg/mL、15.00μg/mL、7.50μg/mL、0.00μg/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mmol/L Tris，145mmol/L NaCl和0.25％的BSA。
(2)利用3-羟基苯基丙酸的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例3中所制备的抗3-羟基苯基丙酸抗体稀释成1:5000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12～24小时；用PBS将上述包被有抗3-羟基苯基丙酸抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8～16小时。然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的校准品。再加入100μL/孔工作浓度的辣根过氧化物酶(HRP)-3-羟基苯基丙酸偶联物；室温下孵育30分钟后PBS洗板5次；然后每孔加入100μLTMB底物，室温孵育30分钟。再每孔加入100μL终止液(2mol/L硫酸)。测定450nm的吸光度值。根据各校准品所对应的450nm的吸光度值定标，制作标准曲线，结果如附图1所示。
所述辣根过氧化物酶-3-羟基苯基丙酸偶联物的制备方法，包含以下步骤：
(a)称取3.5mg辣根过氧化物酶，在室温条件下溶解于1ml、pH为8.0的磷酸缓冲液中，然后再加入5.0mg的N，N′-二环己基碳二亚胺进行活化，制成辣根过氧化物酶溶液；
(b)称取35mg实施例1中所述的3-羟基苯基丙酸衍生物，加入1ml的异丙醇中溶解，并与步骤(a)中制备的辣根过氧化物酶溶液进行偶联反应，反应结束后经透析纯化得到辣根过氧化物酶-3-羟基苯基丙酸偶联物。
2.待测样品中3-羟基苯基丙酸含量的检测
(1)制作待测样品
制备方法：将3-羟基苯基丙酸粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1mg/ml的3-羟基苯基丙酸储存液，并将此3-羟基苯基丙酸储存液稀释于不含3-羟基苯基丙酸的人造尿液中，至终浓度分别为0.00，2.00，20.00，60.00μg/mL，形成空白、低值、中值、高值浓度的尿液样本。
(2)测试方法
利用上述3-羟基苯基丙酸的ELISA检验方法，将上述空白、低值、中值、高值浓度的尿液样本代替校准品，测试上述空白、低值、中值、高值浓度的尿液样本在450nm的吸光度值。
(3)测试结果
对照图1中所示的3-羟基苯基丙酸ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中3-羟基苯基丙酸含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中3-羟基苯基丙酸的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表13-羟基苯基丙酸的ELISA检测回收实验
由表1中结果可知：采用本发明的3-羟基苯基丙酸ELISA检测试剂测定不同浓度尿液样本中的3-羟基苯基丙酸回收率都位于98.0％～102.0％的区间内，说明本发明所述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的反应灵敏度较高，可以用于临床样本中3-羟基苯基丙酸含量的检测。
实施例5.3-羟基苯基丙酸酶标偶联物的制备
本实施例中的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物由式(Ⅰ)所示的3-羟基苯基丙酸衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)连接而成，其结构式如下述式(Ⅲ)所示：
该3-羟基苯基丙酸酶标偶联物的合成方法具体步骤如下：
a.称取4.0mg上述式(Ⅰ)所示的3-羟基苯基丙酸衍生物，溶解于500μL磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/L、pH＝8.5)中，然后加入500μL无水DMF、10.0mg葡萄糖-6-磷酸搅拌均匀，得到3-羟基苯基丙酸衍生物溶液；
b.称取2.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶解于200μL磷酸盐缓冲液(浓度为10.0mmol/L、pH＝5.2)中，将溶液温度降至2～8℃，然后同时加入6.5mg Sulfo-NHS与10.0mg EDAC，并在室温条件下缓慢搅拌反应3分钟，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液；
c.将步骤a制备的3-羟基苯基丙酸衍生物溶液与步骤b制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液温度都降至2～8℃，然后将3-羟基苯基丙酸衍生物溶液逐滴添加到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液中，整个滴加过程持续5分钟，随后将混合溶液在2～8℃下搅拌2小时，得到3-羟基苯基丙酸酶标偶联物溶液。
d.将步骤c制备的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物溶液通过G-25葡聚糖凝胶层析柱(用50mM、pH＝9.0的Tris缓冲液预平衡)纯化，纯化后添加质量分数0.5％的BSA及质量分数0.1％的NaN3，得到3-羟基苯基丙酸酶标偶联物。
实施例6.3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的制备
该3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的制备方法具体步骤如下：
a.R1试剂的制备：将4.5g的葡萄糖-6-磷酸用1.8L、60mmol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将上述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中，搅拌均匀得到R1试剂，所述抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:1000。
b.R2试剂的制备：将9.2g的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸用1.8L、120mmol/L、pH＝8.2的Tris缓冲液溶解制成辅酶溶液；再将上述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物加入所述辅酶溶液中，搅拌均匀得到R2试剂，所述3-羟基苯基丙酸酶标偶联物与辅酶溶液的体积比为1:1500。
实施例7.3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测标准曲线制作
(1)设置日立7180全自动生化分析仪反应参数(表2)。
(2)操作步骤为：先加R1试剂，再加入校准品，混匀，37℃温育5分钟，最后加入R2试剂，混匀，37℃恒温1.5分钟后，340nm波长读取吸光度A1，恒温3.5分钟后读取吸光度A2，计算△A＝A2-A1，由全自动生化分析仪自动计算出不同校准品浓度时的反应速率，得到反应标准曲线，如附图2所示。
表2日立7180全自动生化分析仪反应参数
表3不同浓度校准品的定标吸光度数据
实施例8.3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的性能验证
对实施例6制备得到的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂进行性能验证，主要检测的性能指标为重复性(精密度)、回收率、线性及分析灵敏度，实验参数设置按照实施例7中所述的方法进行。性能指标根据GB/T 26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》、《中华人民共和国卫生行业标准：定量测定方法的线性评价》的有关要求，并参考CLSI相关标准。试剂性能验证结果如下：
(1)3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的重复性与回收率验证
使用实施例7制作的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测标准曲线，重复测定低值、中值、高值浓度质控样本10次，上述质控样本为：将3-羟基苯基丙酸储存液稀释于不含3-羟基苯基丙酸的人造尿液中，至浓度分别为5.00μg/mL、20.00μg/mL、80.00μg/mL，检测数据详见表4。
表4重复性与回收率验证检测数据
检测结果表明：本发明的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂测定尿液样本中3-羟基苯基丙酸含量的重复性好，精密度高，CV均低于5％，回收率均在95％～105％之间，符合标准要求。
(2)3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的线性验证
用接近线性范围上限的高值样本和接近线性范围下限的低值样本，按照EP6-A方法混合配制7个不同浓度(Xi)的样本，每个浓度(Xi)重复测定3次，得到检测结果的均值(Yi)，以稀释浓度(Xi)为自变量，以检测结果均值(Yi)为因变量，求出线性回归方程。根据公式计算线性相关系数r符合标准要求。
表5 3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的线性验证数据
(3)3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的分析灵敏度验证
以纯化水为检测样本，测定试剂空白吸光度变化值；同时以3-羟基苯基丙酸浓度为15.00μg/mL的定值样品为标本测定吸光度变化值。测定的定值样品吸光度变化值与试剂空白吸光度变化值差值的绝对值，换算为15.00μg/mL的3-羟基苯基丙酸的吸光度差值的绝对值结果。性能指标要求：测定浓度为15.00μg/mL的3-羟基苯基丙酸样本，吸光度差值(ΔA)的范围为0.01～0.40。
表7 3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的分析灵敏度验证数据
实施例9.3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂与高效液相色谱法的相关性分析
分别使用本发明的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂与高效液相色谱法对100例临床尿液样本进行检测，并对检测数据进行相关性分析，结果如附图3所示，得到的线性方程为：y＝1.0055x﹣0.1055，相关系数为：R2＝0.9974，表明本发明的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂测定临床尿液样本中3-羟基苯基丙酸含量的实验数据与高效液相色谱法具有较高的一致性，检测结果准确度高。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关技术人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种3-羟基苯基丙酸衍生物，其特征在于：其结构式如下述式(Ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物的制备方法，其特征在于：所述制备方法的合成路线如下：
3.一种3-羟基苯基丙酸免疫原，其特征在于：由权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：
4.一种如权利要求3所述的3-羟基苯基丙酸免疫原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A1.称取5.0～25.0mg权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物，溶解于5.0～25.0ml磷酸盐缓冲液中，得到3-羟基苯基丙酸衍生物溶液；
A2.称取10.0～50.0mg甲基化的牛血清白蛋白、1.0～10.0mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、50.0-100.0mg Sulfo-NHS,溶解于1.0～5.0ml磷酸钾缓冲液中，然后在室温条件下搅拌反应5～25分钟，得到甲基化的牛血清白蛋白活性溶液；
A3.将步骤A2中得到的甲基化的牛血清白蛋白活性溶液直接倒入步骤A1中得到的3-羟基苯基丙酸衍生物溶液中混匀，得到偶联反应混合溶液，然后将所述偶联反应混合溶液在室温条件下搅拌反应10～60分钟，搅拌结束后在2～8℃条件下静置12小时，得到3-羟基苯基丙酸免疫原溶液；
A4.将步骤A3中得到的3-羟基苯基丙酸免疫原溶液通过G-25葡聚糖凝胶层析柱纯化，纯化后得到3-羟基苯基丙酸免疫原，置于-20℃下储存。
5.一种抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体，其特征在于：所述抗体是由权利要求3所述的3-羟基苯基丙酸免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
6.一种如权利要求5所述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
B1.将权利要求3所述的3-羟基苯基丙酸免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0～5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0～5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
B2.1～4周后，再用2.0～5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1～4周注射一次，共计注射3～8次；
B3.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体。
7.一种3-羟基苯基丙酸酶标偶联物，其特征在于：由权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式(Ⅲ)所示：
8.一种如权利要求7所述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
C1.称取1.0～10.0mg权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物，溶解于0.1～1.0ml磷酸盐缓冲液中，然后加入0.1～1.0ml无水DMF、1.0～20.0mg葡萄糖-6-磷酸搅拌均匀，得到3-羟基苯基丙酸衍生物溶液；
C2.称取1.0～5.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于0.1～1.0ml磷酸盐缓冲液中，将溶液温度降至2～8℃，然后同时加入2.5～15.0mg Sulfo-NHS与1.0～20.0mg EDAC，并在室温条件下缓慢搅拌反应1～5分钟，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液；
C3.将步骤C1制备的3-羟基苯基丙酸衍生物溶液与步骤C2制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液温度都降至2～8℃，然后将3-羟基苯基丙酸衍生物溶液逐滴添加到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液中，整个滴加过程持续5分钟，随后将混合溶液在2～8℃下搅拌2小时，得到3-羟基苯基丙酸酶标偶联物溶液；
C4.将步骤C3制备的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物溶液通过G-25葡聚糖凝胶层析柱纯化，纯化后添加质量分数0.5％的BSA及质量分数0.1％的NaN3，得到3-羟基苯基丙酸酶标偶联物。
9.一种3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于：包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含权利要求5所述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体和均相酶底物溶液，所述均相酶底物溶液由葡萄糖-6-磷酸和Tris缓冲液配制而成；所述R2试剂包含权利要求7所述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物和辅酶溶液，所述辅酶溶液由氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Tris缓冲液配制而成。
10.一种如权利要求9所述的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
D1.R1试剂的制备：将葡萄糖-6-磷酸用Tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将权利要求5所述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中，搅拌均匀得到R1试剂，所述抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:1000；
D2.R2试剂的制备：将氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸用Tris缓冲液溶解制成辅酶溶液；再将权利要求7所述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物加入所述辅酶溶液中，搅拌均匀得到R2试剂，所述3-羟基苯基丙酸酶标偶联物与辅酶溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述3-羟基苯基丙酸酶标偶联物与辅酶溶液的体积比为1:1500。
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