CN110575547A

CN110575547A - 靶向于tf的抗体-药物偶联物及其制法和用途

Info

Publication number: CN110575547A
Application number: CN201810582697.6A
Authority: CN
Inventors: 沈竞康; 余科; 孟韬; 马兰萍; 张永良; 王昕�; 张学赛; 陈驎; 于霆
Original assignee: Fudan University; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Fudan University; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2038-06-07
Also published as: CN110575547B

Abstract

本发明描述了抗组织因子(TF)的抗体药物偶联体，所采用的通过一类新型双取代马来酰亚胺连接子将强细胞毒活性物质和生物大分子进行偶联。该类连接子可选择性与二硫链同时作用，从而大大提高偶联物的物质均一性。本发明的连接子所制备的偶联物对于表达TF抗原的细胞株具有高抑制活性。此外，本发明还提供了上述偶联物的制备方法和用途。

Description

靶向于TF的抗体-药物偶联物及其制法和用途

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地，涉及靶向于组织因子(TF)的抗体-药物偶联物的及其制备方法和用途。

背景技术

组织因子(Tissue factor，TF)是一个47kDa的跨膜糖蛋白。正常生理状态下TF表达主要屏蔽于血管内皮下细胞层，一旦机体血管受到创伤，TF暴露于血流，通过结合并激活VII因子从而启动外源性凝血反应。研究发现，TF在众多肿瘤组织中异常激活表达，在肿瘤的发生和发展过程中起着重要作用。特别是在癌症晚期，病人大多伴随自发性血栓，如深度静脉血栓(Deep-vein thrombosis，DVT)、弥漫性血管内凝血(Disseminatedintravascular coagulation，DIC)和肺栓塞(Pulmonary embolism，PE)等。TF在肿瘤细胞中的异常表达则是这些症状发生的主要诱因。对众多肿瘤临床样本分析表明，TF的表达水平直接影响肿瘤的转移、病人血栓的发生等恶化指标，如在乳腺癌中TF异常表达率为85.8％，在胰腺癌中为88.5％，在肺癌中为83.6％，食道癌中为91.3％等。研究表明，首先，TF与FVII形成TF-FVIIa复合物,能直接结合并诱导跨膜G蛋白偶联受体Protease-activated receptor 2(PAR2)的活化。PAR2是调控炎症反应的重要信号通路，虽然对PAR2在肿瘤领域的研究目前还比较少，但可以想象，TF通过PAR2能影响细胞内一系列肿瘤功能信号。如TF-FVIIa-PAR2通过MAPK/ERK磷酸化，诱导关键生长因子、免疫调节因子和趋化因子的基因表达(如VEGF、CSF1/2、IL8、CXCL1等)，促进新生血管的形成，为肿瘤的生长提供了充足的养分、能量和适宜的微环境。其次，TF还可以通过与Rac1、β1家族相关整合素的相互作用，以提高肿瘤细胞的迁移性和粘附性，从而在整体上增强肿瘤细胞的血行转移能力。再次，TF起始的凝血作用也是肿瘤性血栓发生的重要诱因，导致多种癌症恶化。同时，TF-诱导的高凝状态又直接有助于肿瘤细胞逃离机体免疫系统的攻击，并增加了肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用，导致肿瘤细胞的血行转移能力的提高，这也正是当前癌症难治疗的重要原因。

如上所述，TF在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。而本发明人前期研究也发现与正常组织相比，TF在肿瘤组织中异常激活表达，尤其是在高侵袭、高转移的基底样和/或三阴性乳腺癌和胰腺癌，并且与其他靶点相比，靶向TF的抗体可被快速大量的内化，可见TF可能是一个更为优选的抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)开发靶点。然而，目前尚缺乏高特异性的针对人TF的抗体药物偶联物。

抗体药物偶联物一般由三部分组成：抗体或抗体类配体，小分子药物，和将配体与药物偶联起来的连接子。目前进入临床试验的抗体药物偶联物结构中，高活性的细胞毒性药物通常是通过连接子连接在配体表面的赖氨酸残基，或者抗体铰链区域的半胱氨酸残基(由链间二硫键部分还原得到)上，最佳的药物/配体比值(DAR)为2-4。抗体表面大量的赖氨酸残基(超过80个)以及偶联反应的非选择性，导致偶联数目和位点的不确定性，进而导致生成的抗体药物偶联物的不均一性。例如，T-DM1(平均DAR值为3.5)的DAR值分布为0-8。同样，尽管抗体铰链区的链间二硫键只有四对，但为达到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分还原链间二硫键。由于现有的还原剂(DTT，TCEP等)无法选择性地还原链间二硫键，因此生成的偶联物也不是均一的产物，由多种组分组成，其主要组分的DAR值为0,2,4,6,8，而且对应每一种特定DAR值的组分都存在由于连接位点不同而形成的异构体。抗体药物偶联物产品的不均一性可以导致各成员组分间药物动力学性质，效价以及毒性的不均一性。例如，具有较高DAR值的组分在体内被清除得更快，并导致更高的毒性。

针对以上偶联技术存在的问题，通过简单的化学方法对现有抗体实现定点偶联目的，会节省大量的人力物力财力，因此更加富有吸引力。其中已有相关的研究包括：波利泰里克斯有限公司报道的一种偶联技术CN200480019814.4；Igenica Biotherapeutics公司申请的WO2014197871A2；索伦托医疗有限公司申请的CN201380025774.3；上海新理念生物医药科技有限公司申请的CN201310025021.4等专利文献。然而上述技术存在偶联试剂合成路线较长、偶联试剂化学稳定性不佳、抗体偶联物电泳图较为杂乱，提示偶联过程中可能存在副反应、现有方案并未解决体内循环过程中的巯基交换(逆迈克尔加成反应)等问题。根马布公司报导了一类靶向TF抗体偶联物(CN201180039935)，也是基于传统偶联技术的抗体药物偶联物。

针对以上偶联技术存在的问题，通过简单的化学方法对现有抗体实现定点偶联目的，会节省大量的人力物力财力，因此更加富有吸引力。因此，本领域迫切需要提供高效、简单、实用的化学偶联方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向组织因子(TF)的抗体-药物偶联物。

本发明还提供了所述靶向组织因子(TF)的抗体-药物偶联物的制药用途，及其在抑制或预防肿瘤中作用。

本发明还提供了使用所述靶向组织因子(TF)的抗体-药物偶联物治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。

本发明提供了一种偶联方法，将毒素小分子通过特定连接物偶联到靶向TF抗体上，在不改变抗体亲和性的基础上大幅提高抗体对肿瘤细胞的杀伤力。

在本发明的第一方面，提供了一种基于闭环或开环马来酰亚胺的抗体-药物偶联物，所述的偶联物具有式Ia和/或Ib所示的结构；

其中，

Ar'选自下组：取代或未取代的C6-C10芳基，取代或未取代的5-12元杂芳基，取代或未取代的C6-C10亚芳基，取代或未取代的5-12元亚杂芳基；

L₁为连接于Ar'基团上的-O(CH₂CH₂O)_n-，其中n选自1-20中任一整数，优选为1-10中任一整数；

L₂为化学键或AA-PAB结构；其中，AA为二肽或三肽或四肽片断(即2-4个氨基酸通过肽键连接形成的片段)，PAB为对-氨基苄基氨甲酰基；

CTD为通过酰胺键键合于L₂的细胞毒类小分子药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物；

m为1.0～5.0，优选为3.0-4.2；更优选为3.5-4.5；又更优选为3.8-4.2，又更优选为3.9-4.1，最优选为4.0；

抗体(Ab)为靶向组织因子(TF)的抗体或抗体片段。

在另一优选例中，所述的式Ib为式Ia中N-苯基马来酰亚胺开环后产物。

在另一优选例中，所述的偶联物共价连接有一个或多个药物组分。

在另一优选例中，所述的偶联物中，抗体和药物是通过共价方式(如通过分别共价连接于连接子上)进行偶联。

在另一优选例中，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于抗体铰链区的二硫链还原后的巯基上。

在另一优选例中，所述的抗体-药物偶联物是通过所述抗体或抗体片断铰链区的二硫链还原生成一对半胱氨酸残基，并通过所述半胱氨酸残基中巯基与式Ic表示的取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物中的芳基硫醚发生取代反应，从而获得抗体-药物偶联物Ia和/或Ib。

在另一优选例中，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于完全还原后的抗体上，即铰链区的4对二硫链完全打开，优选m为3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。

在另一优选例中，所述靶向组织因子(TF)的抗体选自下组：单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段(优选为抗体Fab片段)。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.:2所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.:3所示的VH-CDR3，

其中，上述重链可变区氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留组织因子(TF)结合亲和力的衍生序列；和/或

所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.:5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.:6所示的VL-CDR3，

其中，上述轻链可变区氨基酸序列中任意一种氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有组织因子(TF)结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述靶向组织因子(TF)的抗体选自下组：TF-mAb-SC1、TF-mAb-Ch、TF-mAb-H29、TF-mAb-H30、TF-mAb-H31、TF-mAb-H32、TF-mAb-H33、TF-mAb-H34、TF-mAb-H35、TF-mAb-H36、TF-mAb-H37、TF-mAb-H38、TF-mAb-H39、TF-mAb-H40、TF-mAb-H41、TF-mAb-H42、TF-mAb-H43、TF-mAb-H44、TF-mAb-H45、TF-mAb-H46、TF-mAb-H47、TF-mAb-H48、或其组合。

在另一优选例中，所述靶向组织因子(TF)的抗体选自下组：TF-mAb-H39、TF-mAb-H44、或其组合。

在另一优选例中，所述Ar'选自下组：苯基、卤代苯、C1-C4烷基苯基、C1-C4烷氧基苯基、2-吡啶基、2-嘧啶基、1-甲基咪唑-2-基、其中W为与羰基连接的胺基R¹，R¹选自-NH₂、其中：C1-C4烷基苯基进一步优选为4-甲基苯基；C1-C4烷氧基苯基进一步优选为4-甲氧基苯基。

在另一优选例中，Ar'选自取代或未取代的亚苯基或吡啶基，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基所取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲基、腈基、酰胺基。

在另一优选例中，所述的AA选自下组：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)、Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、Ala-Ala-Asn(丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺)、D-Ala-Phe-Lys(D型丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)。

在另一优选例中，所述的CTD为细胞毒类小分子药物，选自下组：微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合剂。

在另一优选例中，所述的微管蛋白抑制剂选自下组：美登素(maytansine)衍生物、单甲基阿里他汀-E(MMAE)、单甲基阿里他汀-F(MMAF)、Monomethyl Dolastatin 10(MMAD)、Tubulysin类衍生物、Cryptophycin类衍生物、Taltobulin。

在另一优选例中，所述的拓扑异构酶抑制剂选自下组：阿霉素(Doxorubicin)代谢产物PNU-159682衍生物、依沙替康(Exatecan、DX8951)、伊立替康(irinotecan,CPT-11)代谢产物SN38衍生物。

在另一优选例中，所述的DNA结合剂选自下组：PBD类衍生物、duocarmycin类衍生物。

在另一优选例中，所述的CTD具有选自D1-D14的分子结构：

在另一优选例中，所述抗体-药物偶联物(ADC)选自下组：偶联物ADC1结构如下：

偶联物ADC2结构如下：

偶联物ADC3结构如下：

偶联物ADC4结构如下：

偶联物ADC5结构如下：

偶联物ADC6结构如下：

m为3.5-4.5；优选3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。

在另一优选例中，所述抗体-药物偶联物(ADC)选自下组：TF-mAb-H39-BL9-MMAE、TF-mAb-H44-BL9-MMAE、TF-mAb-H39-BL20-MMAE、TF-mAb-H44-BL20-MMAE。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(i)活性成分，所述活性成分为如本发明的第一方面中任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物或其组合；以及

(ii)药学上可接受的稀释剂，载体(载剂)和/或赋形剂。

在本发明的第三方面，提供了本发明的第一方面中任一项所述的抗体-药物偶联物的用途，所述偶联物用于制备治疗肿瘤的药物，其中，所述肿瘤为TF介导的肿瘤。

在另一优选例中，所述TF介导的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、乳腺癌(三阴乳腺癌)、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，急性淋巴细胞性白血病，间变性大细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、间皮瘤。

在本发明的第四方面，提供了本发明的第一方面中任一项所述的抗体-药物偶联物的制备方法，包括步骤：

(1)用抗体与还原试剂在缓冲液中反应，得到经还原后的抗体；

(2)用式Ic连接子-药物缀合物与步骤(1)中得到的经还原后的抗体在缓冲液与有机溶剂混合液中进行交联(偶联)，得到抗体-药物偶联物Ia和/或Ib。

在另一优选例中，所述制备方法的反应式如式A所示：

在另一优选例中，所述步骤(1)中所述抗体经还原试剂还原，从而使抗体链间二硫键被还原，产生巯基基团。

在另一优选例中，所述步骤(1)中还原试剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、beta-巯基乙醇、beta-巯基乙胺盐酸盐、或二硫苏糖醇(DTT)。

在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH₂PO₄-NaOH)/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)、硼酸-硼砂/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)、组氨酸-氢氧化钠/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)，和PBS/二乙基三胺五乙酸(DTPA)。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，有机溶剂在反应液中的体积占比不超过15％。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中的有机溶剂选自下组：乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亚砜(DMSO)。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的偶联反应在0-37℃下进行。

在另一优选例中，所述的步骤(1)采用beta-巯基乙醇、beta-巯基乙胺盐酸盐或DTT还原，在所述的步骤(1)和步骤(2)之间还包括步骤(1a)：在还原反应完成后，对产物进行过脱盐柱或超滤以去除还原剂。

在另一优选例中，在pH 6-8缓冲液中，抗体-药物偶联物1a内转化为抗体-药物偶联物1b。

在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：将所述肿瘤细胞与本发明的第一方面中任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物接触。

在另一优选例中，所述的接触是在体外培养体系中进行。

在本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用治疗有效量的本发明的第一方面中任一项所述的抗体-药物偶联物或本发明的第二方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物，优选为人。

在另一优选例中，所述的治疗为抑制TF介导的肿瘤的发生、生长和/或转移。

在本发明的第七方面，提供了一种减缓治疗对象中肿瘤生长的方法，包括步骤：联用有效量的本发明的第一方面中任一项所述的抗体药物偶联物与一种或多种选自下组的治疗：辐射治疗、化疗剂治疗、生物治疗、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了抗体偶联物TF-mAb-H39-BL9-MMAE的质谱图。

图2显示了抗体偶联物TF-mAb-H44-BL9-MMAE的质谱图。

图3显示了抗体偶联物TF-mAb-H39-BL20-MMAE的质谱图。

图4显示了TF-mAb-H39-BL9-MMAE对肿瘤细胞的体外增殖抑制实验结果。

图5显示了TF-mAb-H39-BL9-MMAE抑制HCC1806裸小鼠原位瘤增殖，并且在3mg/kg剂量下即可完全抑制HCC1806肿瘤的生长。

图6显示了TF-mAb-H39-BL9-MMAE抑制BxPC-3裸小鼠皮下移植瘤增殖，并且在1mg/kg剂量下即可完全抑制BxPC-3肿瘤的生长。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，针对现有技术中抗体-药物偶联技术存在的问题，使用一类新型的连接子结构(该连接子可以全部/部分交叉偶联抗体的轻链-重链及重链-重链二硫键还原的半胱氨酸巯基上)与药物形成的缀合物(式Ic)(例如取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物)，通过简单的化学方法对靶向TF的抗体实现定点偶联药物，获得一种靶向TF的抗体-药物偶联物。应用此种偶联方法得到的抗体药物偶联物，与传统抗体药物偶联物相比，具有更窄的药物/抗体比值(DAR)分布(m为3.5-4.5；优选3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0)。本发明方法可提高药物的均一性，对于工艺与质量控制研究节省大量的资源，同时还可能提高偶联物的稳定性、药效与安全性等成药性质。实验结果表明，所述抗体-药物偶联物(例如TF-mAb-H39-BL9-MMAE、TF-mAb-H44-BL9-MMA E、TF-mAb-H39-BL20-MMAE)具有显著的抗肿瘤效果。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“抗体药物偶联体”、“抗体偶联物”、“抗体药物偶联物”、“抗体-药物偶联物”“免疫偶联物”可互换使用，指抗体(Ab)或其活性片段与式Ic所示的连接子-药物缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物形成的偶联物。

如本文所用，术语“本发明的抗体药物偶联体”、“本发明的抗体与药物偶联物”、或“本发明的抗体药物偶联物”、“本发明的ADC”可互换使用，指具有针对组织因子(TF)的本发明抗体或其活性片段与式Ic所示的连接子-药物缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物形成的偶联物。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

在本文中，除特别说明之处，术语“C1-C4烷基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。

术语“C1-C4烷氧基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。

术语“卤素”指F、Cl、Br和I。

术语“C6-C10芳基”指具有6-10个碳原子的芳基，例如苯基、萘基等，所述的芳基可以是取代或未取代的。

术语“C6-C10亚芳基”指具有6-10个碳原子的亚芳基，例如亚苯基、亚萘基等，所述的亚芳基可以是取代或未取代的。

术语“5-12元杂芳基”、“5-12元亚杂芳基”指具有5-12个碳原子和一个或多个(优选1-3个)选自O、S和/或N的杂原子的杂芳基或亚杂芳基，优选5-8元杂芳基或亚杂芳基。所述的杂芳基或亚杂芳基可以是取代或未取代的。

本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。

如本文所用，术语“本发明化合物”指式Ic所示的化合物。该术语还包括及式Ic化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

除非特别说明，本文中所使用的“氨基酸”意在包括任何常规氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸。

当本文中使用商品名时，该商品名意在包括商品名产品制剂、其相应的仿制药，以及商品名产品的活性药物组分。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段(如抗原结合片段)或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller等(2003)Journal of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统产生的蛋白质(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd.,Garland Publ ishing,NewYork)。靶抗原一般具有由多种抗体的CDRs识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全-长免疫球蛋白分子或全-长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合所关注靶标的抗原或其部分的分子，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种。然而，优选地，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(Olafsen等(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)；Fab表达文库制备的片段；抗-独特型(抗-Id)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-结合片段；单-链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够，最好专一性地，与抗原结合。

典型地，本发明所述抗体是能够与TF结合的抗体。

抗体的制备

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。

本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

药物

如本文所用，“药物”泛指任何具有期望的生物活性，并具有反应性官能团以便制备本发明所述偶联物的化合物。期望的生物活性包括，诊断，治愈，缓解，治疗，预防人或其它动物的疾病。因此，只要具有必需的反应性官能团，术语“药物”涉及的化合物包括正式国家药典，以及例如美国正式同种疗法药典，正式全国处方集，或者其任何增补本等确认的药物。典型的药物列于医师案头用药参考(PDR)和美国食品药品监督管理局(FDA)的橙皮书。应理解，随着新型药物不断被发现和发展，这些药物也应纳入本发明所述偶联药物的中的“药物”。

可用于构成本发明ADC的药物包括但并不限于：细胞毒剂(例如细胞毒类小分子药物)。

术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞表达活性、细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素、化学治疗剂以及毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒剂的例子包括但不限于：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂以及糖皮质激素和其它化学治疗剂，以及放射性同位素，如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和包括Lu177在内的Lu的放射性同位素。抗体也可与能够将前药转化成其活性形式的抗癌前药活化酶偶联。

优选的小分子药物为具有高细胞毒性的化合物，优选单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)、加利车霉素、美登素类、或其组合；更佳地选自：单甲基阿里他汀-E(MMAE)、单甲基阿里他汀-D(MMAD)、单甲基阿里他汀-F(MMAF)、或其组合。

较佳地，所述的药物是指：用于癌症治疗的细胞毒性药物，或具有期望生物活性的蛋白或多肽，例如一种毒素，如相思子毒素，蓖麻毒素A，假单胞菌外毒素，和白喉毒素；其他合适的蛋白包括肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经原生长因子，血小板衍生生长因子，组织型纤酶溶原生长因子，以及生物反应调节制剂，例如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-6(IL-6),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子，或其它生长因子。

一种优选的本发明药物是美登素或类美登素。美登素化合物通过抑制微管蛋白的微管形成来抑制细胞增殖。类美登素是美登素的衍生物。美登素和类美登素都具有高效的细胞毒性，但是它们在癌症治疗的临床应用上具有很大的局限性，这主要是源于此类分子对肿瘤的低选择性。但是，这种高细胞毒性促使它们成为抗体药物偶联物的首选药物部分。以下列出了去乙酰基美登素的结构。

另一种优选的本发明药物是耳抑素肽类药物。耳抑素肽类药物是海兔毒素10(Dolastatin10)的类似物，而后者是从海洋软体动物海兔体内分离出来的具有生物活性的多肽。海兔毒素10通过结合微管蛋白(与长春新碱同样的结合区域)而抑制微管蛋白聚合。海兔毒素10，耳抑素肽PE，耳抑素肽E都是线性多肽，含有四个氨基酸(其中三个氨基酸是海兔毒素类化合物所独有的)和C-端酰胺基团。两个代表性的耳抑素肽类化合物，单甲基耳抑素肽E(MMAE)和单甲基耳抑素肽F(MMAF)，都是抗体药物偶联物的首选药物。

Monomethyl Auristatin E(MMAE)

Monomethyl Auri statin F(MMAF)

Monomethyl Dolastatin 10(MMAD)

另一种优选的本发明药物是微管溶素(Tubulysin)。微管溶素首先由研究小组从粘细菌培养物中分离，是非常有效的细胞生长抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合并从而诱导细胞凋亡而起作用。微管溶素中的微管溶素D是最有效的，具有超过大多数其他微管蛋白调节剂(包括埃博霉素、长春碱和紫杉醇)10至100倍的活性。紫杉醇和长春碱目前用于多种癌症的治疗，而埃博霉素衍生物正在临床试验中进行活性评价。微管溶素D的合成衍生物将提供与抑制和关键结合相互作用有关的必要信息，并且作为抗癌剂可以具有优越的性质，所述抗癌剂作为分离的实体或作为靶向抗体或配体上的化学弹头。微管溶素D是复杂的四肽，其可以分为四个区域，Mep(D-N-甲基哌啶甲酸)、Ile(异亮氨酸)、Tuv(管式缬氨酸，tubuvaline)和Tup(管式苯丙氨酸，tubuphenylalanine)，如下式所示：

另一种优选的本发明药物是可抑制微管聚合的微生物来源的cryptophycin衍生物。Cryptophycin是从蓝藻的培养物中分离得到的一种能抑制微管生成的新型抗肿瘤活性物质，对多种肿瘤有活性。Cryptophycin是一个脂溶性化合物，含有2个肽键及2个酯键，有5个光学活性中心及1个环氧基团。双肽双酯键都在一个大环结构中。Cryptophycin衍生物CP1和CP2结构如下式所示：

另一种优选的本发明药物是新型抗微管剂Taltobulin(HTI-286、SPA-110)。Taltobulin抑制纯化微管的多聚化，干扰细胞内微管组织、诱导有丝分裂阻断以及诱导细胞凋亡。Taltobulin是细胞增殖强效抑制剂，对18种人肿瘤细胞系的平均IC50为2.5nM。和目前应用的抗微管剂相比，Taltobulin并不是p-糖蛋白的合适的底物，其中Taltobul in结构如下式所示：

一种药物是喜树碱类药物衍生物SN-38。SN-38是伊立替康盐酸盐(CPT-11)的生物活性代谢物，为一类拓扑异构酶抑制剂。SN-38引起DNA拓扑异构酶I的抑制最强，剂量依赖性和时间依赖性地抑制DNA的合成，并造成频繁的DNA单链断裂。其中SN-38结构如下式所示：

另一种优选的本发明药物是鹅膏覃碱类药物(alpha-Amanitin)，结构如下式所示。alpha-Amanitin是一种来自毒蘑菇鬼笔鹅蕈(Amanita phalloides)的真菌毒素，二环八肽，能抑制真核RNA聚合酶Ⅱ与RNA聚合酶Ⅲ转录。

另一种优选的本发明药物是苯并二吡咯类抗生素(duocarmycins,CC-1065等)和其它的环丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one,CPI)衍生物。这类化合物是有效的DNA小沟结合-烷基化试剂。环丙苯并吲哚-4-酮(cyclopropabenzindol-4-one，CBI)类似物的化学结构更稳定，生物活性更高，而且与它们含有天然CPI烷基化亚基的父系化合物相比更容易合成。一个代表性的CBI衍生物是酚羟基保护衍生物CBI，具有弱化的前药毒性和增强的水溶性(其中CBI-seco类结构通式如下式所示)：

另一种优选的本发明药物是吡咯并苯二氮卓类(pyrrolo[2,1-c][1,4]ben zodi-azepines，PBDs)或者PBD二聚体类(PBD dimers)。PBD是一类由链霉菌产生的天然产物，其独特特性在于能够在DNA小沟，确切是在嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列处，形成非扭曲的共价加和物。应用PBD作为部分小分子策略靶向锁定DNA序列以及作为新型的抗癌和抗菌药物引起了越来越多的兴趣。应用一个柔性碳链连接两个PBD单元的C8/C8'的羟基基团，所得的二聚体具有增强的生物活性。PBD二聚体被认为是可以产成序列选择性的DNA损伤，例如倒序的5'-Pu-GATC-Py-3'链间交联，从而导致其生物活性。这些化合物已被证明是高效的细胞毒性药物，可作为抗体药物偶联物的备选药物。

另一种优选的本发明药物是PNU-159682衍生物，PNU-159682是Nemorubicin在人肝微粒体中的主要活性代谢产物，与MMDX和阿霉素相比，活性提高3000倍。

另一方面，药物并不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物。并且尤其是那些能够通过与接头的酰胺键来配位，如通过具有碱性胺基(一级胺或二级胺)来配位的细胞毒素，例如上文中所示的细胞毒素D1-D14的结构。

连接子

按照在细胞内药物释放的机制，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子和可断裂连接子。

对于含有不可断裂连接子的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应,bystandereffect)。

可断裂连接子，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值，谷胱甘肽浓度等。对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。

对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。

酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)，有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子包括Val-Cit(VC),Phe-Lys等。

自释放连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自释放连接子的作用机制是：当可断裂连接子在适宜的条件下断裂后，自释放连接子能够自发地进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的自杀式连接子包括对氨基苄醇类(PAB)和β-葡萄糖醛酸苷类(β-Glucuronide)等。

本发明提供了连接子或偶联试剂，包含二芳硫基马来酰亚胺单元和一个偶联基团。二芳硫基马来酰亚胺单元用于交联抗体链间的巯基基团(还原后)，而偶联基团用于与小分子药物或药物-连接子单元偶联。由于该二芳硫基马来酰亚胺单元与抗体中的开放半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的两个硫原子的二齿结合(bidentate binding)，因此这些ADC是均质的并比含有单齿接头的ADC具有更强的稳定性。因此它们将具有增长的体内半衰期，减少全身性释放的细胞毒素的量，并且比具有单齿接头的ADC更加安全的药物性质。

在另一个方面，所产生的药物-连接子单元通过该连接子与抗体偶联，生成部分链间交联的偶联物。与传统的抗体药物偶联物相比，应用本发明方法制备的抗体药物偶联物的药物/抗体比值(DAR)分布更窄，从而大幅提升了产品均一性及药理学特性均一性。该抗体药物偶联物可用于靶向输送药物到达目标细胞群体，例如肿瘤细胞。抗体药物偶联物可以特异性的与细胞表面蛋白结合，所产生的结合物随即被细胞内吞。在细胞内，药物以活性药物的方式释放出来产生功效。抗体包括嵌合抗体，人源化抗体，人抗体；可与抗原结合的抗体片段；或者抗体Fc融合蛋白；或者蛋白。“药物”是高活性药物(见定义部分)，在某种情况下，药物可以是聚乙二醇。

连接子-药物缀合物

在本发明中，连接子-药物缀合物包括式Ic所示的取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物；

其中，

R为X或ArS-，

X选自下组：卤素，优选为溴或碘；

CTD为通过酰胺键键合于L₂的细胞毒类小分子药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物。

典型地，本发明中，所述式Ic化合物选自下组：

抗TF的抗体

在本发明中，一类优选的ADC中，抗体部分为抗组织因子(TF)的抗体。所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

优选地，所述的抗体药物偶联中的抗体部分选自下组：TF-mAb-SC1、TF-mAb-Ch，或TF-mAb-H29～48；更佳地，所述的抗体部分选自下组：TF-mAb-H39、TF-mAb-H44。这些优异的抗TF的抗体的序列和活性等信息，可参见本申请人的在先申请CN201610704559.1。该文献通过引用方式全部并入本文。典型地，这些优选的抗体具有以下CDR区：

重链可变区的CDR氨基酸序列为：

SEQ ID No.:1：SYWMN；

SEQ ID No.:2：MIYPADSETRLNQKFKD；

SEQ ID No.:3：EDYGSSDY。

轻链可变区的CDR氨基酸序列为：

SEQ ID No.:4：SASSSVSYMN；

SEQ ID No.:5：GISNLAS；

SEQ ID No.:6：QQKSSFPWT。

抗体-药物偶联物

本发明提供的抗体药物偶联物由抗体、连接子、连接子和药物组成，所述连接子是可断裂连接子组合或不可断裂连接子。

抗体是球状蛋白，含有一系列氨基酸位点可用于偶联药物-连接子。由于其三级和四级结构，只有溶剂可及的氨基酸可供偶联。事实上，高收率的偶联通常发生在赖氨酸残基的ε-氨基基团或半胱氨酸残基的巯基基团上。

抗体蛋白表面的大量赖氨酸侧链导致大量的位点可供药物偶联，从而导致生成的抗体药物偶联物是混合物，含有不同的药物偶联数量(药物/抗体比值，DAR)和偶联位点。

本发明提供的偶联产品，尽管仍然是混合物，但与传统方式偶联得到的抗体药物偶联物相比，其DAR分布范围很窄。其平均DAR值接近4，接近最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围。此外，偶联产品不含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒杀不起作用。同时，偶联产品也不含有重度偶联产品(DAR＝8),这一组分在体内的清除速度很快，相对于低DAR的组分而言。因此，本发明提供的抗体药物偶联物产品非均一性得到很大的改善。

在本发明中，一类优选的ADC中，抗体部分为组织因子(TF)的抗体。所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

优选地，所述的TF抗体选自下组：TF-mAb-SC1、TF-mAb-Ch、TF-mAb-H29、TF-mAb-H30、TF-mAb-H31、TF-mAb-H32、TF-mAb-H33、TF-mAb-H34、TF-mAb-H35、TF-mAb-H36、TF-mAb-H37、TF-mAb-H38、TF-mAb-H39、TF-mAb-H40、TF-mAb-H41、TF-mAb-H42、TF-mAb-H43、TF-mAb-H44、TF-mAb-H45、TF-mAb-H46、TF-mAb-H47、TF-mAb-H48、或其组合；更佳地，所述的TF抗体为TF-mAb-H39或TF-mAb-H44，对应的抗体-药物偶联物为：TF-mAb-H39-BL9-MMAE、TF-mAb-H44-BL9-MMAE、TF-mAb-H39-BL20-MMAE、TF-mAb-H44-BL20-MMAE。

抗体-药物偶联物的制备方法

抗体药物偶联物制备路线如下所示。抗体链间二硫键被还原，产生2n个(如4个)巯基基团。本发明的取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物(式Ic化合物)与还原后的抗体巯基交联，生成相应的抗体药物偶联物，其中该抗体药物偶联物存在如下所示中的一种或二种形式：

式中，R、Ar'、L1、L2和CTD如上所述。

一种典型的制备方法包括：将抗体原液用反应缓冲液稀释至2-10mg/mL，加入140-200倍过量摩尔比的二硫苏糖醇(DTT)，或加入6.0-20倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于10-35℃搅动2-48小时；在此所述反应缓冲液可以是按以下比例制备的缓冲液：50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH₂PO₄-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM磷酸氢二钠-柠檬酸/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM硼酸-硼砂/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM组氨酸-氢氧化钠/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9和PBS//1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9。

将上述反应液冷至0-10℃，若采用DTT还原，需在还原反应完成后过脱盐柱或超滤除去过量的DTT，再加入取代马来酰亚胺类化合物(预先10mg/ml溶在乙腈(ACN)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或二乙基乙酰胺(DMA)中)，并保证反应液中有机溶剂的体积占比不超过15％，偶联反应于0-37℃搅动2-4小时。若采用TCEP还原，也可不需除去剩余TCEP，直接加入取代马来酰亚胺类化合物进行偶联。

采用脱盐柱将偶联反应混合物用琥珀酸钠/NaCl缓冲液或组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。或超滤数遍。然后过滤除菌，所得产物低温保存。优选温度为-100—60℃，过滤装置的孔径优选0.15-0.3微米。

所得抗体药物偶联物的药物抗体偶联比(DAR)较为均一。采用本发明不同取代马来酰亚胺连接头(连接子片断)时，ADC产物均一性非常高(通常DAR优势产物(如DAR约为4)占所有ADC的至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或更高)。对于DAR有一定差别的ADC，如需要获得均一性更好的样品，可进一步利用但不限于以下方法进行分离纯化：疏水作用层析方法(HIC)、分子排阻色谱法(SEC)、离子交换层析(IEC)。

药物组合物和施用方法

由于本发明提供的抗体-药物偶联物，可以靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，从而通过结合物内吞或药物渗入使得药物以活性形式释放到细胞内，因此，本发明的抗体-药物偶联物可以用于治疗目标疾病，上面提到的抗体-药物偶联物可以以治疗有效量，通过合适的途径给予受试者(例如人)。需要治疗的受试者可以是有风险，或怀疑患有与特定抗原的活性或表达量有关病症的患者。这样的患者可以通过常规体检来鉴定。

常规方法，已知的医学领域的普通技术人员，可以用于施用药物组合物给受试者，这取决于疾病的要治疗的类型或疾病的部位。此组合物还可以通过其它常规途径，例如，口服，肠胃外给药，通过吸入喷雾，局部，直肠，经鼻，口腔，阴道或通过植入进行给药。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。此外，它可以施用到通过施用可注射的贮库途径，例如使用1-，3-，或6个月的贮库可注射或可生物降解的材料和方法的主题。

注射组合物可以含有各种载体如植物油，二甲基乙酰胺(dimethylactamide)，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，多元醇(甘油，丙二醇，液体聚乙二醇，等等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过点滴方法，由此含有抗体和生理上可接受的赋形剂的药物制剂输注给药。生理上可接受的赋形剂可以包括，例如，5％葡萄糖，0.9％盐水，林格溶液或其它合适的赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的一个合适的可溶盐形式的无菌制剂，可以溶解和施用的药用赋形剂诸如水换注射液，0.9％盐水，或5％葡萄糖溶液。

当用本发明的抗体-药物偶联物治疗时，可以通过本领域常规的方法进行递送。例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。其它方法包括通过使用缀合物和生物可降解的聚合物的各种运输和载体系统。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的抗体-药物偶联物以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成溶液剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。

本发明所述的抗体-药物偶联物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的抗体偶联物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的抗体-药物偶联物每天以约0.0001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明抗体偶联物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点

(1)本发明提供的新型连接子，可通过简单的化学方法与靶向TF抗体偶联，与传统的偶联方式相比，应用这种连接子得到的TF抗体药物偶联物DAR值分布非常窄，因此生成的产品均一性高，获得的交联物单一分布的组份(DAR为4)占比80％以上。

(2)本发明提供的TF抗体药物偶联物，裸抗和低交联度或高交联度的ADC占比几乎为零(质谱检测未观察到DAR为<2或>5的组份)。

(3)申请人通过大量的实验证明，本发明提供的TF抗体药物偶联物，在治疗肿瘤方面具有一定安全性和有效性。偶联后乙二醇所赋予的亲水性可以用来调节生物分子特性；交联物的体外肿瘤细胞增殖抑制活性较传统mcVC-PAB交联生物学活性、药物代谢稳定性、安全性等成药性质方面有所提高或保持。

(4)本发明基于马来酰亚胺的二硫链桥接具有更好的稳定性，Ar’部位引入取代基可以调解马来酰亚胺开环水解的反应速度与减缓马来酰亚胺开环后的环合二次水解反应，在体内不易发生巯醚交换和开环后的环合二次水解反应，进一步加强了抗体药物偶联物在体外和体内的稳定性。

下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应发理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

实施例1、式Ic所示的化合物的合成与制备

本发明第一方面中列出的式Ia所代表的取代马来酰胺类连接子片断分子可通过方案一中的方法合成，通过n甘醇与溴乙酸叔丁酯反应获得中间体A，后与取代的硝基氟苯进行芳香亲核取代得到中间体B。此外，中间体B也可通过对甲苯磺酸酯保护的中间体F与取代的硝基氟酚反应获得。中间体B中硝基基团还原为氨基得到中间体C，后与2,3-二溴马来酸酐环合反应得中间体D，后再与芳基硫酚进行取代反应后获得连接子片断分子E。通过与带有二肽/三肽-PAB细胞毒药物连接子进行缩合，可获得系列分子F。反应路线与具体实例举例如下：

1.1化合物Ic-1的合成

1.1.1中间体A-1(步骤a)

将三甘醇(92g,613mmol)溶于tBuOH(200ml)中。冰浴下加入KOtBu(22.91g,204mmol)搅拌半小时，氩气保护下，滴加溴乙酸叔丁酯(39.8g,204mmol)在tBuOH(40ml)的溶液，室温搅拌过夜。第二天，TLC检测反应结束。旋蒸除去叔丁醇后，剩余物加入400ml二氯甲烷，有机相用400ml水洗，该水相用300ml二氯甲烷萃取一次，合并有机相后用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干。粗产物经石油醚：乙酸乙酯＝3:1-->1:1柱层析，得中间体A-1(24g,44.5％yield)，为黄色油状物。

1.1.2中间体B-1(步骤b)

在250ml圆底瓶中将中间体A-1(4g,15.13mmol),三乙胺(2.53ml,18.16mmol)和二甲胺基吡啶(0.370g,3.03mmol)溶于100毫升分子筛干燥二氯甲烷中搅拌，冰浴下分批加入对甲基苯磺酰氯(3.17g,16.65mmol)，移至室温氩气保护搅拌过夜。

将反应体系加入100ml二氯甲烷萃取，用200ml 1N稀盐酸洗一次，200ml水洗两次，200ml饱和盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干有机相。用200-300目硅胶装柱，PE:EA＝5:1-2:1洗脱进行柱层析分离。旋蒸蒸干得中间体B-1(2.8g,收率44.2％)。

1.1.3中间体C-1(步骤c)

将中间体B-1(3g,7.19mmol)，4-硝基苯酚(1g,7.19mmol)，溶于20ml DMF中，加入K₂CO₃(1.9g,14.4mmol)，加热至100度搅拌5小时。旋蒸蒸干溶剂，加入200ml二氯甲烷溶解，萃取，分别用200ml 1N稀盐酸，200ml水和200ml饱和盐水洗各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干，用200-300目硅胶装柱，PE：EA＝5:1-3:1洗脱柱层析纯化，旋蒸蒸干得中间体C-1(2g,收率72％)。

1.1.4中间体D-1(步骤d)

将中间体B-1(6g,15.57mmol)溶于100毫升无水乙醇中并且将溶液，加入装有10％Pd-C 1.2g的反应瓶中。加氢反应6小时(1atm,38℃)，TLC检测反应完全。硅藻土过滤反应液，滤饼用乙醇淋洗，滤液旋蒸蒸干，得中间体D-1(4.8g,87％yield)为黄色油状物。

1.1.5化合物E-1(步骤e)

称取中间体D-1(1.0g,2.81mmol)于平行反应管中，氮气保护下加入AcOH(3ml)，搅拌溶解。后慢慢加入3,4-二溴马来酸酐(0.72g,2.81mmol)。氮气保护下加热到110℃搅拌过夜。TLC检测反应。将反应液冷却到室温后，旋蒸蒸干溶剂，并加入甲苯旋蒸蒸干两次，得棕色油状化合物E-1。无需纯化直接用于下步反应。

1.1.6化合物F-1的合成(步骤f)

称取化合物E-1(2.0g,3.72mmol)于100毫升圆底瓶中,氮气保护下加入30ml无水二氯甲烷搅拌溶解。称取4-(N-吗啉甲酰胺)苯硫酚(1.66g,7.45mmol)氮气保护下加入反应液中,溶解后在冰浴下慢慢滴加DIPEA(1.3mL ml,7.45mmol)，完毕后搅拌5分钟，撤去冰浴。在氮气保护下室温搅拌2小时，TLC检测反应结束。

减压蒸干溶剂后，柱层析(200目～300目硅胶)分离纯化，二氯甲烷装柱和淋洗，然后慢慢加大极性从2％至10％甲醇淋洗，收集蒸干溶剂得橘黄色油状产物F-1(2.2g,72％yield)。LC-MS(M⁺)理论值:821.2，实测值:821.3(ESI,M+H⁺)。

1.1.7化合物G-1(Ic-1)的合成(步骤g)

向100毫升圆底瓶中称入化合物E-9(300mg,0.365mmol)，氮气保护下加入无水DMF(20mL)使其完全溶解后,依次称取HATU(166mg,0.438mmol)和DIEA(0.127ml,0.730mmol)加入瓶中。室温搅拌15分钟后加入化合物VC-PAB-MMAE(416mg,0.365mmol),氮气保护下室温搅拌过夜。TLC与HPLC跟踪反应过夜，原料F-1消失。减压蒸干溶剂，做定量分析，后经反相HPLC纯化，得产物为黄色无定形粉末G-1(0.420g,59.7％yield)。LC-MS(M+)理论值:1925.9，实测值:1926.7(ESI,M+H+)。

1.2化合物Ic-2的合成

化合物Ic-2的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c中的4-硝基苯酚换为2,6-二氟-4-硝基苯酚，得到产物Ic-2为黄色无定形粉末。LC-MS(M⁺)理论值:1961.9，实测值:1962.7(ESI,M+H⁺)。

1.3化合物Ic-3的合成

化合物Ic-3的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c和f中的4-硝基苯酚与4-(N-吗啉甲酰胺)苯硫酚分别换为2,6-二氟-4-硝基苯酚与4-(1,1-二氧化硫代吗啉甲酰胺)苯硫酚，得到产物Ic-3为黄色无定形粉末。LC-MS(M⁺)理论值:2057.8，实测值:2058.8(ESI,M+H⁺)。

1.4化合物Ic-4的合成

化合物Ic-4的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c中的4-硝基苯酚换为2-三氟甲基-4-硝基苯酚，得到产物Ic-4为黄色无定形粉末。

LC-MS(M⁺)理论值:1993.9，实测值:1994.9(ESI,M+H⁺)。

1.5化合物Ic-5的合成

化合物Ic-5的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的三甘醇换为六甘醇，得到产物Ic-5为黄色无定形粉末。LC-MS(M⁺)理论值:2093.9，实测值:2094.0(ESI,M+H⁺)。

1.6化合物Ic-6的合成

化合物Ic-6的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c中的4-硝基苯酚换为3-三氟甲基-4-硝基苯酚，得到产物Ic-6为黄色无定形粉末。LC-MS(M⁺)理论值:1993.9，实测值:1994.7(ESI,M+H⁺)。

1.7化合物Ic-7的合成

化合物Ic-7的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c与步骤g中的4-硝基苯酚和VC-PAB-MMAE换为2,6-二氟-4-硝基苯酚和VC-PAB-MMAF，得到产物Ic-7为黄色无定形粉末。LC-MS(M⁺)理论值:1975.8，实测值:1976.9(ESI,M+H⁺)。

实施例2、抗体偶联物制备

2.1TF-mAb-H39-BL9-MMAE的制备

将靶向TF的人源化抗体TF-mAb-H39原液用50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH₂PO₄-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH7.4反应缓冲液稀释至5mg/mL，加入10倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于10℃搅动4小时。

将上述反应液冷至5℃，未经纯化加入适量的二乙基乙酰胺(DMA)，再加入6倍过量摩尔比的实施例1中制备的化合物Ic-1(10mg/ml预先溶在DMA中)，保证反应体系中DMA的体积占比不超过10％，于25℃搅动2.5小时进行偶联。

采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存，所得抗体偶联物命名为TF-mAb-H39-BL9-MMAE。

结果如图1和图2所示。HIC图谱和质谱均表明，经偶联反应后，形成了抗体偶联物TF-mAb-H39-BL9-MMAE，偶联物的分子量与预期值相符，DAR为约4.0。

2.2TF-mAb-H44-BL9-MMAE的制备

将靶向TF的人源化抗体TF-mAb-H44原液用50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠(KH₂PO₄-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH7.4反应缓冲液稀释至5mg/mL，加入10倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于10℃搅动4小时。

将上述反应液冷至5℃，未经纯化加入适量的二乙基乙酰胺(DMA)，再加入6倍过量摩尔比的化合物Ic-1(10mg/ml预先溶在DMA中)，保证反应体系中DMA的体积占比不超过10％，于25℃搅动2.5小时进行偶联。

采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存，所得抗体偶联物命名为TF-mAb-H44-BL9-MMAE。

结果如图1和图3所示。SDS-PAGE和质谱均表明，经偶联反应后，形成了抗体偶联物TF-mAb-H44-BL9-MMAE，偶联物的分子量与预期值相符，DAR为约4.0。

2.3TF-mAb-H39-BL20-MMAE的制备

将上述反应液冷至5℃，未经纯化加入适量的二乙基乙酰胺(DMA)，再加入6倍过量摩尔比的化合物Ic-2(10mg/ml预先溶在DMA中)，保证反应体系中DMA的体积占比不超过10％，于25℃搅动2.5小时进行偶联。

采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存，所得抗体偶联物命名为TF-mAb-H39-BL20-MMAE。

结果如图1和图3所示。质谱均表明，经偶联反应后，形成了抗体偶联物TF-mAb-H39-BL20-MMAE，偶联物的分子量与预期值相符，DAR为约4.0。

实施例3、抗体偶联物生物学活性检测

3.1TF-mAb-H39-BL9-MMAE针对TF高表达的三阴性乳腺癌细胞、胰腺癌的体外抗肿瘤活性

本实例所使用细胞系购自于美国典型培养物保藏中心(ATCC)或中国科学院细胞库,并按照相应的说明进行培养，包括：T47D，MDA-MB-231，HCC1806，BxPC-3，HPAF-II，PANC1。

将上述处于对数生长期的细胞，分别以每孔1,000-3,000个细胞的密度(依不同细胞的生长速率而定)接种至96孔细胞培养板中，150μL/孔，37℃，5％CO2培养约16h后，分别加入不同浓度的TF-mAb-H39-BL9-MMAE，每个药物浓度设置3个复孔，及相应的溶媒对照和空白对照孔，作用4天后，倾去培养液，加入MTS反应液(购自Promega,cat#G3581)，100μL/孔，于37℃反应至预期颜色深浅，测定每组的细胞活力(OD490nm)，并按照以下公式计算细胞存活率：

存活率＝(OD给药-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％。

通过GraphPad Prism 5软件分析上述数据,并计算TF-mAb-H39-BL9-MMAE在不同细胞株上的IC₅₀值。

实验结果表明，在体外，TF-mAb-H39-BL9-MMAE均能较好抑制TF高表达的肿瘤细胞的生长，并且其抑制作用与细胞表面的TF分子数成正比。如图4，上图为TF-mAb-H39-BL9-MMAE抑制TF高表达的肿瘤细胞生长的曲线，下表为TF-mAb-H39-BL9-MMAE在不同细胞株上的IC₅₀值。

3.2TF-mAb-H39-BL9-MMAE针对TF高表达的三阴性乳腺癌、胰腺癌模型的体内抗肿瘤活性

将处于对数生长期的HCC1806和BxPC-3细胞分别按照每200μL无血清培养基含3×10⁶和10×10⁶的密度接种到6周龄Balb/c雌性裸鼠背部皮下或乳垫(Balb/c裸鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，待肿瘤生长至100-200mm³后，将动物随机分组，每组8个只动物。将TF-mAb-H39-BL9-MMAE按照1mg/kg，3mg/kg剂量治疗HCC1806肿瘤和0.3mg/kg，1mg/kg的剂量治疗BxPC-3肿瘤，每周一次通过尾静脉给药，正常小鼠IgG偶联物，IgG-MMAE作为阴性对照。每周测量2-3次肿瘤体积及裸鼠重量并记录以绘制肿瘤生长曲线。肿瘤体积(V)计算公式为：

V＝1/2×a×b²其中a、b分别表示肿瘤的长、宽。

如图5所示，TF-mAb-H39-BL9-MMAE可以显著抑制HCC1806原位移植瘤生长，并呈一定的剂量依赖性。最低有效剂量(MED)为1mg/kg。

如图6所示，TF-mAb-H39-BL9-MMAE可以显著抑制BxPC-3皮下移植瘤生长，并呈一定的剂量依赖性。最低有效剂量(MED)为0.3mg/kg。

另外，TF-mAb-H44-BL9-MMAE可显著抑制HCC1806原位移植瘤和BxPC-3皮下移植瘤的生长，并呈一定的剂量依赖性，最低有效剂量与TF-mAb-H39-BL9-MMAE相当。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海药物研究所

复旦大学

<120> 靶向于TF的抗体-药物偶联物及其制法和用途

<130> P2018-0619

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Met Ile Tyr Pro Ala Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Gln Gln Lys Ser Ser Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Pro Ala Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Ile Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ile Trp Ile Tyr

35 40 45

Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Phe Thr Ile Asn Ser Met Glu Thr Glu

65 70 75 80

Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Ser Phe Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Tyr Pro Ala Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Gln Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ile Trp Ile Tyr

35 40 45

Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Ser Phe Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Ile Trp Ile Tyr

35 40 45

Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Ser Phe Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种基于闭环或开环马来酰亚胺的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的偶联物具有式Ia和/或Ib所示的结构；

其中，

抗体(Ab)为靶向组织因子(TF)的抗体或抗体片段。

2.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于抗体铰链区的二硫链还原后的巯基上。

3.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于完全还原后的抗体上，即铰链区的4对二硫链完全打开，优选m为3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。

4.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述靶向组织因子(TF)的抗体选自下组：单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段(优选为抗体Fab片段)。

5.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:1所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO.:2所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO.:3所示的VH-CDR3，

所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:4所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO.:5所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO.:6所示的VL-CDR3，

6.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述靶向组织因子(TF)的抗体选自下组：TF-mAb-SC1、TF-mAb-Ch、TF-mAb-H29、TF-mAb-H30、TF-mAb-H31、TF-mAb-H32、TF-mAb-H33、TF-mAb-H34、TF-mAb-H35、TF-mAb-H36、TF-mAb-H37、TF-mAb-H38、TF-mAb-H39、TF-mAb-H40、TF-mAb-H41、TF-mAb-H42、TF-mAb-H43、TF-mAb-H44、TF-mAb-H45、TF-mAb-H46、TF-mAb-H47、TF-mAb-H48、或其组合。

7.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，Ar'选自取代或未取代的亚苯基或吡啶基，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基所取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲基、腈基、酰胺基。

8.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的AA选自下组：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)、Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、Ala-Ala-Asn(丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺)、D-Ala-Phe-Lys(D型丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)。

9.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的CTD为细胞毒类小分子药物，选自下组：微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合剂。

10.如权利要求9所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的微管蛋白抑制剂选自下组：美登素(maytansine)衍生物、单甲基阿里他汀-E(MMAE)、单甲基阿里他汀-F(MMAF)、Monomethyl Dolastatin 10(MMAD)、Tubulysin类衍生物、Cryptophycin类衍生物、Taltobulin。

11.如权利要求9所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的拓扑异构酶抑制剂选自下组：阿霉素(Doxorubicin)代谢产物PNU-159682衍生物、依沙替康(Exatecan、DX8951)、伊立替康(irinotecan,CPT-11)代谢产物SN38衍生物。

12.如权利要求9所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的DNA结合剂选自下组：PBD类衍生物、duocarmycin类衍生物。

13.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述抗体-药物偶联物(ADC)选自下组：

偶联物ADC1结构如下：

偶联物ADC2结构如下：

偶联物ADC3结构如下：

偶联物ADC4结构如下：

偶联物ADC5结构如下：

偶联物ADC6结构如下：

m为3.5-4.5；优选3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。

14.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(i)活性成分，所述活性成分为如权利要求1-13中任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物或其组合；以及

(ii)药学上可接受的稀释剂，载体(载剂)和/或赋形剂。

15.权利要求1-13中任一项所述的抗体-药物偶联物的用途，其特征在于，所述偶联物用于制备治疗肿瘤的药物，其中，所述肿瘤为TF介导的肿瘤。

16.如权利要求15所述的所述的用途，其特征在于，所述TF介导的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、乳腺癌(三阴乳腺癌)、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，急性淋巴细胞性白血病，间变性大细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、间皮瘤。

17.权利要求1-13中任一项所述的抗体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括步骤：