KR20240101987A - 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 CLDN18.2에 대한 높은 결합력 및 우수한 세포내재화(internalization)능을 가지고 있으므로, 단클론항체 또는 변형된 형태(항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체, 또는 다중특이적 항체)로 암 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도{Monoclonal antibody specifically binding to claudin-18.2 and uses thereof}
본 발명은 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
클라우딘-18은 대략 27 kDa의 분자량을 가지며 상피와 내피의 접합부에 존재하는 내인성 막 단백질 패밀리에 속한다. 구조는 2개의 세포 외 루프(Loop)와 4개의 막투과성(transmembrane, TM) 도메인으로 이루어져 있고, 8개의 아미노산만이 상이한 2가지의 스플라이스 변이체(splice variant)인, 클라우딘-18.1(Genebank accession number, NM_016369) 및 클라우딘-18.2(Genebank accession number, NM_001002026)가 존재한다. 클라우딘-18.1은 정상적인 폐와 위 상피에서 발현되지만, 클라우딘-18.2는 위 점막을 제외한 정상 세포에서는 발현이 매우 제한되어 있고, 위암, 간암, 담도암, 유방암, 신장암, 췌장암, 비소세포폐암, 중피종(mesothelioma) 등 다양한 암 및 그들의 전이성 암에서 과별현 된다(Okugawa T, et al. Dig Sci (2012) 57:1562-7; Rohde C, et al. Jpn J Clin Oncol (2019) 49:870-6). 클라우딘 단백질은 종양 발생과 전이 및 염증에 중요한 역할을 할 수 있다. 클라우딘 단백질의 발현 변화는 밀착연접(tight junction)의 기능 저하를 초래하고, 신호 전달 경로에 영향을 미쳐 종양을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
따라서 우수한 항암 치료제 개발을 위해 클라우딘-18.1과 달리 종양 특이적 발현을 보이는 클라우딘-18.2에만 특이적으로 결합하는 항체 개발이 요구된다.
최근 종양세포 표면에서 클라우딘-18.2에 결합하는 강력한 키메라 IgG1 mAb(IgG1 단클론항체)인 졸베툭시맙(zolbetuximab)이 개발되어 임상시험이 진행되고 있다. 특히, 3상 시험(SPOTLIGHT trial, NCT03504397)에서 1차 치료제로 사용한 졸베툭시맙은 표준 화학요법에 비해 클라우딘-18.2-발현 위암 환자의 무진행 질병생존기간(progression-free survival; PFS)과 전체생존기간(overall survival; OS)을 향상시켰다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 인간 클라우딘-18.2 단백질을 항원으로 사용하여, 인간 클라우딘-18.2에만 특이적으로 결합하는 단클론항체를 완전인간항체 서열로 구성된 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 스크리닝 하였고, 스크리닝된 항체 클론의 중쇄와 경쇄의 가변부위를 바탕으로 제조된 인간항체 형태(IgG; immunoglobulin)의 단클론항체가 세포 표면에 발현된 인간 CLDN18.2 단백질에 선택적으로 결합할 수 있으며, 세포내재화(internalization) 능력이 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
한편, 한국공개특허 제2022-0136267호에는 '인간 CLDN18.2에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2022-0121873호에는 '항-클라우딘 18.2 항체 및 그 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명의 목적은 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 대한 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR (complementarity-determining region) 1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 DVS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 AAS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 13으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 GAF로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 암 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 결합된 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)를 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 상기 단클론항체; ⅱ) 막투과성 도메인(transmembrane domain); 및 ⅲ) 상기 i)의 항체가 항원에 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multi-specific antibody)를 제공한다.
본 발명에 따른 클라우딘-18.2(CLDN18.2)에 결합하는 신규한 단클론항체는 세포내재화 완전인간항체서열로 구성되어 있고, 특이적 항원 결합력과 다양한 세포내재화(internalization)능을 나타내며, 열 안정성(thermal stability)이 확인되므로, 단클론항체 또는 변형된 형태(항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체, 또는 다중특이적 항체 등)로 클라우딘-18.2를 발현하는 암 질환 및 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 인간 클라우딘-18.2(CLDN18.2)가 발현되어 있지 않은 HEK293E 세포주를 이용한 유세포 분석 결과이다.
도 2는 CLDN18.2가 과발현된 HEK293E 세포주(HEK293E/18.2)를 이용한 유세포 분석 결과이다.
도 3은 CLDN18.2가 과발현된 CHO-K1 세포주(CHO-K1/18.2)를 이용한 유세포 분석 결과이다.
도 4는 인간 CLDN18.2를 코팅 항원으로 한 ELISA 분석 결과이다.
도 5는 인간 CLDN18.1을 코팅 항원으로 한 ELISA 분석 결과이다.
도 6 은 BxPC3 세포주(내생적으로 인간 CLDN18.1를 발현하는 세포주)를 이용한 유세포 분석 결과이다.
도 7은 도 6에 사용된 BxPC3 세포주의 CLDN18.1 발현 수준을 유세포 분석으로 확인한 결과이다.
도 8은 HEK293E 세포주(CLDN18.2 음성)에서 단클론항체의 세포내재화(internalization)능을 라이브 세포 분석기기(Incucyte)로 분석한 것이다.
도 9는 HEK293E/18.2 세포주(CLDN18.2 과발현)에서 단클론항체의 세포내재화능을 분석한 것이다.
도 10 및 도 11은 세포면역형광법(cell immunofluorescence staining)을 통해 CHO-K1/18.2 세포주(CLDN18.2 과발현)에서 단클론항체의 세포내재화능을 분석한 것이다.
도 12는 HEK293E/18.2 세포주(CLDN18.2 과발현)에서 단클론항체의 세포내재화 및 세포용해(cytolytic) 활성을 FabZAP 어세이를 통해 분석한 것이다.
도 13은 HEK293E 세포주(CLDN18.2 음성)에서 단클론항체의 세포내재화 및 세포용해(cytolytic) 활성을 FabZAP 어세이를 통해 분석한 것이다.
도 14는 CLDN18.2에 특이적인 단클론항체의 열 안정성을 시차 주사 형광측정법(Differential scanning fluorimetry)을 통해 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR (complementarity-determining region) 1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 DVS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 AAS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 13으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 GAF로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 DVS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체는 보다 구체적으로는, 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있고,
서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 AAS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체는 보다 구체적으로는, 서열번호 9의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있으며,
서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 13으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 GAF로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체는 보다 구체적으로는, 서열번호 14의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "단클론항체"란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 상기 단클론항체는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 항체(antibody)는 전체(whole) 항체 형태를 의미하며, 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 디설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA (immunoglobulin A), IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지며, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 발명의 단클론 항체는 인간항체(fully human antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 키메릭 항체(chimeric antibody), 마우스 항체(mouse antibody) 및 재조합 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 인간항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 인간항체는 모든 구조가 인간으로부터 유래되었기 때문에, 기존의 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비해서 면역화 반응이 일어날 확률이 적어서 인간에게 투여하였을 경우 원하지 않는 면역반응이 일어나지 않는 장점이 있다. 따라서 치료용 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원 결합 단편"이란, 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649 등에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고, 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어 "가변영역(variable region)"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 부위를 의미하고, 가변영역에는 상보성결정영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 상보성결정영역 사이에는 프레임워크 영역(FR, framework region) 부분이 존재하여 상보성결정영역 고리를 지지해주는 역할을 한다.
본 발명에서 용어 "상보성결정영역(CDR, complementarity determining region)"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 천연 인간 단쇄 Fv 라이브러리(native human single chain Fv library)로부터 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 scFv를 스크리닝한 다음, 이를 IgG 형태로 전환(conversion)함으로써 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 인간항체를 제조하였다.
본 발명에서 용어 "바이오 패닝(biopanning)"은 파지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)과 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 특별히 이에 제한되지 않으나, 투여된 생체 내에서의 체류시간을 증진시키기 위하여, 당화(glycosylation) 및/또는 페길화(PEGylation)될 수 있다.
본 발명의 용어 "당화(glycosylation)"는 글리코실기를 단백질에 전위시키는 가공방법을 의미한다. 상기 당화는 글리코실 전달효소에 의해 글리코실기가 표적 단백질의 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 히드록실리신 잔기에 결합되어 수행되는데, 상기 당화된 단백질은 생체조직의 구성물질로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 세포표면에서 세포인식에도 중요한 역할을 수행한다. 따라서, 본 발명에서는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 당화 또는 상기 당화의 패턴을 변화시켜서 항체의 효과를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "페길화(PEGlation)"는 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 폴리에틸렌글리콜을 도입함으로써, 항체의 혈중 체류시간을 향상시키는 가공방법을 의미한다. 구체적으로, 폴리에틸렌글리콜로 고분자 나노 입자를 페길화하는 것에 의해, 나노 입자의 표면의 친수성이 증가되며 병원균, 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시키는 인체 내의 대식세포(macrophage) 등을 포함하는 면역 기능으로부터의 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과(stealth effect)를 통한 신체 내에서의 빠른 분해가 방지될 수 있다. 따라서, 상기 페길화에 의하여 항체의 혈중 체류 시간이 향상될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 페길화는 히알루론산의 카르복실 그룹과 폴리에틸렌글리콜의 아민 그룹의 결합에 의해 아미드 그룹을 형성하는 방법으로 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다양한 방법으로 페길화를 수행할 수 있다. 이때, 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 100 내지 1,000 사이의 분자량을 갖고, 선형 또는 가지형의 구조를 가지는 것을 사용함이 바람직하다.
상기 당화 및/또는 페길화는 본 발명의 항체의 기능을 유지하는 한 당업계의 공지된 방법에 의해 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형될 수 있고, 본 발명의 항체는 다양한 당화 및/또는 페길화 패턴이 변형된 변이 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 모두 포함한다.
용어 "친화도"는 항원의 특정 부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로, 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 항원에 대한 친화도 측정 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있고, 표면 플라즈몬 공명 기술(surface plasmon resonance technology)이 그의 예이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 인간항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "발현 벡터"란 숙주세포에서 목적유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코스미드(cosmid) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터(promoter), 개시코돈(initiation codon), 종결코돈(termination codon), 폴리아데닐화 시그널(polyadenylation signal) 및 인핸서(enhancer) 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 Lac, Tac, T3 또는 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(Simian virus 40, SV40) 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(Mouse mammary tumor virus, MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니(moloney) 바이러스 프로모터, 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV) 프로모터 뿐만 아니라, β액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나, 이로 제한되지 않는다.
발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다.
또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 폴리뉴클레오티드인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레트로바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 게놈내로 삽입될 수 있는 벡터도 사용 가능하다. 전체 항체 또는 항체 단편을 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(cotransformation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입하고, 경쇄(또는 중쇄)를 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별한다.
Fab 형태의 항체를 제작하기 위해서, 인간 경쇄의 가변영역(VL)과 불변영역(CL) 및 인간 중쇄의 가변영역(VH)과 첫 번째 불변 영역 도메인(CH1)의 아미노산을 코딩하는 유전자를 삽입한 벡터를 이용한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 발현 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.
상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포, 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵 세포, 및 곤충 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 식물 세포일 수 있다. 또한 포유동물로부터 유래된 COS-7, BHK, CHO, CHO-K1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S 또는 HT1080 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "숙주세포로의 형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG (Polyethylene glycol), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민(lipofectamine) 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
(a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 본 발명의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는, 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서 형질전환체의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주 또는 세포의 종류에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
또한, 형질전환체를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 원심분리 또는 한외여과(ultrafiltration)에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있으며, 이들을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 그 중에서 친화 크로마토그래피가 가장 많이 사용되며, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 있다. 상기 방법으로 제작된 항체는 항원에 대한 친화도(affinity)가 증가된 항체이다.
본 발명은 또한, 상기 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물은 대상체에 본 발명의 항체를 투여하면 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 한다.
본 발명의 용어, "암의 치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 암은 췌장암, 식도암, 난소암, 폐암, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 유방암, 신장암, 중피종(mesothelioma) 및 두경부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(nonnaturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 단클론항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 항암효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 상기 항암효과를 갖는 공지의 유효성분은 바람직하게는 화학요법제 또는 면역관문억제제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화학요법제는 카보플라틴(Carboplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel) 등의 알킬화 계열 항암제; 젬시타빈(Gemcitabin) 등의 대사 길항제 계열 항암제; 독소루비신(Doxorubicin) 등의 안트라사이클린 계열 항암제; 및 보테조밉(Bortezomib) 등의 프로테아좀 억제제 계열항암제;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 면역관문억제제는 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 암 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내(intradermal) 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 암 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 개체는 클라우딘-18.2의 과도한 활성으로 인하여 종양 발달과 신생혈관생성 등의 질병이 발생할 수 있는 임의의 동물을 의미하는 것으로, 상기 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함할 수 있고, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 그리고 암에 대해서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 클라우딘-18.2에 특이적인 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 클라우딘-18.2의 발현 여부와 발현 정도와 관련된 질환, 예컨대 암을 진단할 수 있다.
상기 암을 진단하는 방법은 본 발명의 클라우딘-18.2에 특이적인 단클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 분석함으로써 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 클라우딘-18.2의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 클라우딘-18.2 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 클라우딘-18.2에 대한 항체를 이용한 방사선 면역측정법(radioimmunoassay), 방사선 면역침전법(radioimmunoprecipitation), 면역침전, 면역조직화학염색(immunohistochemistry), ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry) 및 형광면역분석(fluorescenceimmunoassay)을 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 의심되는 개체로부터 분리한 생물학적 시료에서 본 발명의 클라우딘-18.2 단백질이 과발현되어 시그널이 정상 개체로부터 분리한 생물학적 시료보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 클라우딘-18.2에 대한 항체를 포함하고, 시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널을 분석하여, 암을 진단할 수 있다. 이 때, 상기 시그널은 항체에 결합된 효소 (예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 사이토크롬 P450 등)에 의해 나타날 수 있고, 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 효소로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(o-Phenylenediamine, OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제, t-NBT 또는 m-PMS (phenzaine methosulfate) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있으며, 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (예컨대, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질 (예컨대, 14C, 125I, 32P 및 35S), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이를 통해 클라우딘-18.2의 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 결합된 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)를 제공한다.
본 발명에서 용어 "약물"이란, 본 발명의 클라우딘-18.2에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합될 수 있고, 산성조건에 의하여 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 분리될 수 있으며, 표적 세포에 대한 치료효과를 나타내는 화합물을 의미한다.
본 발명에 따른 항체-약물 접합체에 사용될 수 있는 약물은 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 부분 또는 기를 포함하며, (i) 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제; (ⅱ) 효소적으로 기능할 수 있는 단백질 독소; 및 (ⅲ) 방사선동위원소(방사선 핵종) 등이 포함되며, 상기 화합물에서 1종 이상이 사용될 수 있다.
이러한 약물의 비제한적인 예로는 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065 (Rachelmycin), 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈데신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 다우노마이신, 에토포시드, 테니포시드, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 기타 질소 머스타드 및 그의 입체 이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 기타 삽입제인 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산분해 효소, 항생제, 독소(세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소), 시스플라틴, CPT-11, 독소루비신, 파클리탁셀 및 도세탁셀 등의 각종 항종양 또는 항암제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사선 동위원소(방사선 핵종)에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며, 이에 제한되지 않으며, 특정 암유전자(oncogene)의 발현을 억제시킬 수 있는 마이크로 RNA (miRNA), siRNA 및 shRNA 등도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, ⅰ) 상기 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체; ⅱ) 막투과성 도메인(transmembrane domain); 및 ⅲ) 상기 i)의 항체가 항원에 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 단백질을 제공한다.
본 발명에서, 상기 CAR 단백질은 본 발명의 단클론항체와, 공지의 막통과 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인으로 구성됨으로써 특정될 수 있다.
본 발명에서 용어, "CAR(chimeric antigen receptor)"은, 면역 효과기 세포에 특정 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있는, 자연적으로 존재하지 않는 수용체를 의미한다. 보통, 상기 CAR은 T 세포에 단클론항체의 특이성을 이식하기 위하여 사용되는 수용체를 말한다. CAR은 대개 세포 외 도메인, 막투과성 도메인(transmembrane domain) 및 세포 내 도메인으로 구성된다. 상기 세포 외 도메인은 항원 인식 부위(antigen recognition region)를 포함하며, 본 발명에서 상기 항원 인식 부위는 클라우딘-18.2에 특이적인 항체이다. 클라우딘-18.2에 특이적인 항체는 전술한 것과 같으며, CAR에 사용되는 항체는 항체 단편의 형태인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Fab 또는 scFv 형태이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, CAR의 막투과성 도메인은 세포 외 도메인과 연결된 형태로서, 자연적 또는 합성된 것에서 유래한 것일 수 있다. 자연적으로 존재하는 것에서 유래한 경우, 막 결합 또는 막투과성 단백질에서 유래한 것일 수 있으며, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 체인, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 CD8 등 다양한 단백질의 막투과성 영역에서 유래한 부분일 수 있다. 이러한 막투과성 도메인의 서열은 막투과성 단백질의 막투과성 영역 부분을 공지하고 있는 당업계에 공지된 문헌 등으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 막투과성 도메인이 합성된 것일 경우, 이는 류신 및 발린과 같은 소수성 아미노산 잔기를 주로 포함할 수 있으며, 그 예로 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛(triplet)이 합성된 막통과 도메인에 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 CAR에서 상기 세포 내 도메인은 세포 내에 존재하는 CAR의 도메인 일부로서, 막투과성 도메인과 연결된 형태이다. 본 발명의 상기 세포 내 도메인은 CAR의 항원 결합 부위에 항원이 결합하면 T 세포 활성화, 바람직하게는 T 세포 증식을 가져오는 것이 특징인, 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 세포 내 신호전달 도메인은 세포 외에 존재하는 항원 결합 부위에 항체가 결합하면, T 세포 활성화를 가져올 수 있는 신호를 전달하는 부분이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않으며, 다양한 종류의 세포 내 신호전달 도메인이 사용될 수 있으며, 그 예로 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)일 수 있으며, 상기 ITAM은 CD3 제타(ξ, zeta), FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 또는 FcεRIγ에서 유래한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 CAR의 세포 내 도메인은 세포 내 신호전달 도메인과 함께 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공동자극 도메인은, 본 발명의 CAR에 포함되어 세포 내 신호전달 도메인에 의한 신호에 더하여, T 세포에 신호를 전달하는 역할을 수행하는 부분으로서, 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는, CAR의 세포 내 부분을 의미한다. 상기 공동자극 분자는 세포 표면 분자로서, 항원에 대한 림프구의 충분한 반응을 가져오는데 필요한 분자를 의미하며, 그 예로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공동자극 도메인은 이러한 공동자극 분자 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포 내 부분일 수 있다.
또한, 선택적으로, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커가 CAR의 세포 내 도메인 및 막투과성 도메인을 연결할 수 있으며, 상기 링커는 본 발명의 CAR에 포함되어도, 세포 외에 위치한 항체에 항원이 결합하였을 때 세포 내 도메인을 통한 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 링커라면, 특별히 그 길이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multi-specific antibody)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 바람직하게는 이중특이적 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 다중특이적 항체는 본 발명에 따른 항-클라우딘-18.2 항체가 면역효능세포-특이적 표적분자에 대한 결합능을 가지는 항체 또는 그 단편과 결합된 형태가 바람직하다. 면역효능세포-특이적 표적분자는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, TIGIT, BTLA, KIR, A2aR, VISTA, B7-H3, TCR/CD3, CD16(FcγRⅢa) CD44, Cd56, CD69, CD64(FcγRI), CD89 및 CD11b/CD18(CR3)에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중특이적 항체는 동일한 항원 또는 두 개 이상의 다른 항원에 대하여 동시에 서로 다른 다중(이중 이상)의 에피토프를 인식하는 항체로, 다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 경쇄 가변영역(VL)과 중쇄 가변영역(VH)를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 이종이중체(heterodimeric) 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6444, 1993), 상이한 scFv를 서로 연결해서 tandem ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 heterodimeric 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고(Muller et al., FEBS lett., 432:45, 1998), 그리고 Fc의 homodimeric 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 heterodimeric 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 heterodimeric scFv 형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998).
Fab을 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 heterodimeric Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 homodimeric 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody), Fab의 경쇄말단과 중쇄말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시킴으로써 얻어진 간단한 형태의 삼중표적항체 F(ab')3의 제조방법이 당업계에 알려져 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 트리온파마(Trion Pharma)사에 의해 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써, 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 homodimeric 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 heterodimeric 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태의 이중특이적 항체의 제조방법(Merchant et al., 1998), heterodimeric 형태의 이중특이적 항체 이외에, 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 불변(constant) 도메인에 각각 융합 발현시켜 homodimeric 형태의 (scFv)4-IgG로 제조한 방법이 알려져 있다. 또한, 임클론(ImClone)사는 인간 VEGFR-2에 대한 키메릭 단클론항체인 IMC-1C11을 기반으로하여, 이 항체의 경쇄 아미노 말단에 마우스 혈소판유도성장인자수용체-알파(Platelet-derived Growth Factor Receptor-α)에 대한 single variable domain만을 융합시켜 이중특이적 항체를 제작하여 보고하였다. 또한, Rossi 등은 단백질 카이네이즈 A(protein kinase A, PKA) R 서브유닛의 dimerization and docking 도메인과 PKA의 anchoring 도메인을 이용한 이른 바 'dock and lock' 방법을 통해서 CD20에 대한 다수의 항원결합가를 지니는 항체를 선보인 바 있다(Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6841, 2006).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 클라우딘-18.2(CLDN18.2) 특이적 항체의 선별
CLDN18.2(R&D, #RDC2149)의 유전자를 HEK293E 동물세포주에 과발현하여 세포주를 확보하였다. CLDN18.2-VLPs 항원(Cusabio, #CSB-MP005498HU(A5))을 면역흡착튜브(Immunosorb tube)에 코팅한 후 블로킹(blocking)을 수행하였다. 인간 scFv 라이브러리 파지((주)와이바이오로직스)를 대장균에 감염시킨 후, 얻어진 대장균을 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상층액을 PEG (polyethylene glycol)로 농축한 다음, 이를 PBS (phosphate buffered saline) 완충용액에 녹여 인간 항체 라이브러리 파지를 준비하였다.
상기 면역흡착튜브에 상기 라이브러리 파지를 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 다음, 1x PBST와 1x PBS로 세척 후, 100 mM TAE와 Tris-HCl(pH 7.5) 용액을 차례로 처리하여 항원에 특이적으로 결합한 scFv-파지들만을 용출시켰다. 그리고 패닝 및 ELISA를 수행하여 최종적으로 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 3종의 양성 파지 클론을 선별하였다. 그리고 scFv 형태의 클론들을 IgG 형태로 전환하여 실험에 사용하였다.
선별된 단클론항체의 중쇄 및 경쇄 CDR 및 이를 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 서열은 하기 표 1 및 표 2와 같다.
단클론 0058-001, 0058-002 및 0058-003의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열
클론명 중쇄 경쇄
CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
0058-001 GFTFSSYA (서열번호 1) ISGSGGST (서열번호 2) AKEGVWWLRYFDH (서열번호 3) SNDVGGYTY (서열번호 5) DVS SSYAGSYTWV (서열번호 6)
0058-002 GFTFSSYA (서열번호 1) ISGSGGST (서열번호 2) ARGLGYYYYGMDV (서열번호 8) QTVSSW (서열번호 10) AAS QQYHSFPPT (서열번호 11)
0058-003 GFTFSSYA (서열번호 1) ISGSGGST (서열번호 2) ARGAASSYYFDY (서열번호 13) AGVRNY (서열번호 15) GAF QQYHSFPPT (서열번호 11)
단클론 0058-001, 0058-002 및 0058-003의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열
클론명 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
0058-001 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAAISGSGGSTYFADSVRGRFTISRDNPQSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGVWWLRYFDHWGQGTPITVSS (서열번호 4) QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSNDVGGYTYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSYTWVFGGGTKLTVL (서열번호 7)
0058-002 QMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 9) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVSSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFGTYYCQQYHSFPPTFGGGTKVGIK (서열번호 12)
0058-003 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAASSYYFDYWGLGTTVTVSS (서열번호 14) DIQMTQSPSSLAAYVGDTVTITCRASAGVRNYLAWVQQKPGKAPRSLIYGAFKLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFGTYYCQQYHSFPPTFGGGTKVDIK (서열번호 16)
밑줄: CDR
실시예 2. 선별된 CLDN18.2 특이 단클론항체의 특성
2-1. 유세포 분석을 통한 CLDN18.2 단클론항체의 비특이성
HEK293E 세포주에서 비특이적 결합력 실험을 실시하였다. 인간-CLDN18.2 발현은 anti-CLDN18.2(CUSABIO, #CSB-RA005498A1HU)를 사용하여 확인하였다.
인간 CLDN18.2를 발현하지 않는 HEK293E 세포를 시료당 0.5x106 세포가 되도록 준비하고, 선별 항체인 0058-001, 0058-002 및 0058-003을 7.5 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 준비된 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포를 2% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 PBS (Welgene, #LB001-02)로 3회 세척하고, FITC (fluorescein isothiocyanate) 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체(Vectorlabs, #FI-3000)를 사용하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 상기와 동일하게 세척하였다. 세포를 0.2 ㎖의 2% FBS(Thermo, #26140-079)가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 CytoFlex flow cytometer(Beckman coulter, 미국)를 사용하여 결합력을 분석하였다.
분석 결과, 선별 항체인 0058-001, 0058-002 및 0058-003 3종 모두 CLDN18.2가 발현되어 있지 않은 HEK293E 세포주에는 결합하지 않았다(도 1).
2-2. 유세포 분석을 통한 CLDN18.2 단클론항체의 특이성
인간 CLDN18.2를 과발현하는 HEK293E/18.2 세포와 CHO-K1/18.2 세포 각각을 시료당 0.5x106 세포가 되도록 준비하고, 항 CLDN18.2 항체를 각각 일정한 배수로 희석한 후 준비된 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포를 2% 소태아혈청이 포함된 PBS로 3회 세척하고, FITC 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 4℃에서 20분간 반응시킨 후, 상기와 동일하게 세척하였다. 세포를 0.5 ㎖의 2% FBS가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 CytoFlex flow cytometer를 사용하여 결합력을 분석하였다.
분석 결과, 항-CLDN18.2 선별 항체인 0058-001, 0058-002 및 0058-003 모두CLDN18.2가 높게 발현되어있는 HEK293E/18.2와 CHO-K1/18.2 세포주에 농도 의존적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3).
실시예 3. 선별된 CLDN18.2 특이 단클론항체의 CLDN18 이소폼(isoform)에 대한 결합력 분석
클라우딘-18.1은 정상적인 폐와 위 상피에서 발현되는 항원으로 클라우딘-18 유전자의 첫번째 엑손 내 어느 ATG를 개시코돈으로 사용하는지에 따라 CLDN18.1/18.2의 이소폼이 만들어지며 단백질 서열의 92%가 동일하기에, 클라우딘-18.1에는 결합하지 않고 클라우딘-18.2에만 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위해 이소폼에 대한 선택적 결합능을 분석하였다.
3-1. ELISA를 통한 CLDN18 이소폼에 대한 결합능 분석
CLDN18.1(EUPROTEIN, #EPY255141) 및 CLDN18.2(CUSABIO, #CSB-MP005498HU(A5)) 단백질을 각각 희석용액(4% skim milk/0.05% tween-20/PBS)을 사용하여 1 ㎍/㎖로 준비한 후, 100 ㎕씩 면역 플레이트(Thermo, #439454)의 각 웰에 넣고 16시간 이상 4℃에서 정치 배양시켰다. 300 ㎕ 세척액(0.05% tween-20/PBS)으로 3회 세척한 후, 200 ㎕ 차단용액(4% skim milk/0.05% tween-20/PBS)을 웰에 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 3회 세척 후, 각각 일정한 배수로 희석한 항-CLDN18.2 항체 100 ㎕를 웰에 넣고 상온에서 1시간 흔들어주었다(rocking). 3회 세척 후, 1:3,000의 희석 배율로 준비된 항-인간 카파-HRP(anti-human kappa-HRP; Sigma, #A7164) 100 ㎕를 각 웰에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 3회 세척 후, 100 ㎕ TMB 기질(Sigma, #T0440)을 각 웰에 넣고 차광 하에 상온에서 반응시키면서 발색이 확인되었을 때 50 ㎕ 반응정지용액(1N H2SO4)을 넣어 반응을 정지시켰다. 흡광광도계(Promega, GM3000)로 흡광도를 측정하였다.
분석 결과, 선별 항체인 0058-001, 0058-002 및 0058-003은 CLDN18.2 항원에는 결합하였지만(도 4), CLDN18.1 항원에는 모두 결합하지 않아(도 5), CLDN18.2 항원에 선택적임을 확인하였다.
3-2. 유세포 분석을 통한 CLDN18 이소폼에 대한 결합능 분석
내생적으로 인간 CLDN18.1를 발현하는 BxPC3(도 7)를 시료당 0.5x106 세포가 되도록 준비하고, 50 nM 농도의 항CLDN18.1 항체(Cusabio, #CSB- RA005498A2HU)와 본 발명에 따른 항CLDN18.2 항체를 각각 준비된 BxPC3 세포와 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 세포를 2% 소태아혈청이 포함된 PBS로 3회 세척하고, FITC 형광물질이 결합된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 상기와 동일하게 세척하였다. 세포를 0.2 ㎖의 2% FBS가 든 PBS로 현탁시킨 후, 유세포 분석기인 CytoFlex flow cytometer를 사용하여 결합력을 분석하였다.
그 결과, 항-CLDN18.1 항체는 BxPC3 세포주에 결합하였고, 항-CLDN18.2 선별 항체 모두는 BxPC3 세포주에 결합하지 않는 것으로 확인되었다(도 6). 이상의 결과를 통해 선별 항체인 0058-001, 0058-002 및 0058-003은 CLDN18.1 이소폼에는 결합하지 않고, CLDN18.2 항원에 선택적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 선별된 CLDN18.2 특이 단클론항체의 세포내재화능
4-1. INCUCYTE를 이용한 세포내재화능 분석
항-CLDN18.2 대조 항체 SC0080와 선별 항체인 0058-001, 0058-002 및 0058-003의 세포내재화능은 각각 항체를 Incucyte®FabFluor human red fluorescent reagent (Essen Bioscience, 미국)와 접합시킨 후, CLDN18.2가 과발현된 HEK293E/18.2 세포와, CLDN18.2을 발현하지않는 HEK293E 세포에 처리하고 시간에 따라 세포 내로 유입되는 항체의 양을 모니터링하였다. 96-웰 플레이트(Nunc, 미국)에 웰당 1x104 개의 세포를 분주하여 24시간 부착시키고, 각각 4 ㎍/㎖의 항체를 동량의 Incucyte®FabFluor red antibody labeling reagent와 혼합하여 37℃에서 15분 동안 암반응시킨 후, 세포에 처리하였다. 항체의 세포내 유입량은 시간에 따라 세포의 라이소좀에 축적되는 항체의 양을 IncuCyte ZOOM HD/2CLR System (Essen Biosciences, 미국)을 통해 15분 간격으로 총 24시간 동안 확인하고 정량화를 실시하였다.
그 결과, 세포 표면에 결합한 항-CLDN18.2 선별 항체 0058-001, 0058-002 및 0058-003은 CLDN18.2를 발현하지 않는 HEK293E 세포에서는 세포내 유입이 확인되지 않았으며(도 8), HEK293E/18.2 세포에서는 5시간 이내에 항체의 50%가 세포내로 유입되는 것을 확인하였다(도 9). 특히, 선별 항체 0058-001 및 0058-002의 경우 대조항체(Ybiologics, #SC0080; IgG mAb zolbetuximab in-house) 보다 우수한 세포내재화능을 보여주었다. 상기 결과는 항-CLDN18.2 선별 항체 모두 타겟 특이적으로 세포 내로 약물을 전달할 수 있는 항체로서 기능할 수 있는 것으로 평가되며, 항체-약물 접합체로서 개발이 가능하다는 것을 시사한다.
4-2. 세포면역형광법을 이용한 세포내재화능 분석
항-CLDN18.2 항체가 세포 표면에 존재하는 항원과 결합한 후, 세포 내로 들어갈 수 있는지 확인하기 위하여 CLDN18.2이 과발현된 CHO-K1/18.2 세포에서 엔도사이토시스(endocytosis) 시험법을 수행하였고, 항체의 세포 내 위치를 확인하기 위하여 면역세포화학적 염색(ICC; immunocytochemistry)을 실시하였다. 참고로, CHO-K1/18.2 세포는 클라우딘18.2가 CHO-K1 세포 대비 약 161배 수준으로 과발현된 세포로서 이는 실시예 2-2와 동일한 방법으로 수행하여 확인하였다(도 10의 하단 참조).
24-웰 플레이트에 PPL(SIGMA-ALDRICH, #P4707)로 코팅된 12mm 커버글라스를 넣어 세포를 웰 당 5x104로 시딩(seeding)하고, 10 ㎍/㎖의 항-CLDN18.2 항체 0058-001, 0058-002 및 0058-003을 각각 처리하여 4℃에서 1시간 동안 세포 표면에 존재하는 항원에 항체가 결합하도록 반응시켰다. 이후 세포를 차가운 PBS로 수세하고, 항체의 세포내재화를 유도하기 위해 37℃에 미리 데운 완전배지[RPMI-1640 (GIBCO, #A1049101), 1% ANTI-ANTI (Thermo Fisher, #15240062), 10% FBS (Thermo Fisher, #26140-079)]로 교체하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 3회 수세하여 배지를 제거하고, 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 고정된 세포는 PBS로 3회 수세한 후, 0.5% 사포닌(saponin, SIGMA, #47036)과 10% FBS가 포함된 PBS에 희석한 엔도좀(endosome) 표지 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 반응되었다. 엔도좀 표지는 후기 엔도좀(late endosome)/라이소좀(lysosome) 표지항체로 항-토끼 LAMP1(Abcam, 미국)을 사용하였다. 표지항체 결합 후 세포는 10% FBS가 포함된 PBS로 3분 간격으로 3회 수세한 후, 항-CLDN18.2 항체에 대한 2차 항체인 FITC가 결합된 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, #709-545-149), 항-LAMP1에 대한 2차 항체인 Cy3가 결합된 항-토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch, #711-165-152)를 0.5% 사포닌과 10% FBS가 포함된 PBS에 각각 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 암배양하였다. 형광염색된 세포는 PBS로 3분 간격으로 3회 수세한 후, DAPI가 포함된 마운팅 용액(Vector laboratories, #H1200)을 슬라이드에 떨어뜨리고, 기포가 생기지 않도록 커버글라스 덮어 봉쇄한 후, 공초점 레이저 현미경(Confocal laser scanning microscope; ZEISS, LSM9, 독일)을 사용하여 관찰하였다. 각각의 형광색에 대한 신호 정보는 다음의 표 3과 같다.
형광색에 대한 신호 정보
색 신호
초록 (green) FITC-항체
빨강 (red) Cy3-LAMP1
파랑 (blue) DAPI-nucleus
노랑 또는 주황 (yellow or orange) 융합된 항체(merged antibody) 및 LAMP1
그 결과, 대조항체(SC0080)와 3종의 CLDN18.2 단클론항체는 엔도사이토시스 유도 후 세포 내로 유입됨을 확인하였고, SC0117은 CLDN18.2에 결합하지 않는 Isotype 대조군으로 0시간과 24시간째에 세포 내에서 관찰되지 않았다(도 10 및 도 11). 한편 유입된 항-CLDN18.2 항체는 엔도좀/리소좀 표지항체인 항-LAMP1과 공-위치(colocalization)되는 빈도가 높아, 항-CLDN18.2 항체가 리소좀으로 전달됨을 알 수 있었다. 이를 통해 항-CLDN18.2 선별 항체 0058-001, 0058-002 및 0058-003 모두 세포 독성 물질을 세포 내로 전달하기 위한 항체-약물 접합체용으로 적합한 항체임을 재확인하였다.
실시예 5. 선별된 CLDN18.2 특이 단클론항체의 CLDN18.2 발현 암세포에서의 효능 시험
㈜와이바이오로직스에서 생산된 항-CLDN18.2 항체 3종에 대한 세포내재화(antibody internalization) 및 세포 독성(cell cytotoxicity) 여부를 Fab ZAP Human Antibody Internalization Kit (ATSbio, #KIT-51-Z4)를 이용하여 확인하였다.
무균실험대(Biosafety cabinet, #JSCB-1500SB, JSR)에서 HEK293E/CLDN 18.2 과발현 세포주 또는 HEK293E 모세포주를 배양 배지인 DMEM (HyClone, #SH30243.01) 100 ㎕에 1x103개의 세포가 되도록 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣어주고 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 16시간 동안 배양한다. 항체 처리 당일에 Fab-ZAP Kit의 리보솜 불활성화 단백질인 사포린(Saporin, ATSbio, #SAP-200)을 배양 배지인 DMEM에 처리 농도의 10배인 10,000 nM부터 10배씩 희석하여 0.001 nM까지 총 8개의 농도를 준비한다. 테스트 항체를 희석하기 위한 ZAP spike 배지는 DMEM에 Fab-ZAP Human (ATSbio, #IT-51-40)을 45 nM의 농도가 되도록 준비한 뒤 이를 이용하여 항체를 처리농도의 10배인 100 nM부터 10배씩 희석하여 0.00001 nM까지 총 8개의 농도를 준비한다. 인간 IgG (Human IgG, Invitrogen, #31154)를 테스트 항체의 대조물질(control)로 사용하였다. 사포린의 대조물질(Con-SAP)인 Fab IgG-SAP (ATSbio, #IT-67-40)은 세포배양 배지인 DMEM에 처리 농도의 10배인 100 nM이 되도록 준비한다. 이렇게 준비된 사포린, 테스트 항체 및 Fab IgG-SAP을 16시간 배양한 96-웰 플레이트의 각 웰에 멀티파이펫을 이용하여 10 ㎕씩 넣어준다. 이후 플레이트를 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다.
무균실험대에서 DPBS(HyClone, #SH30028.02) 5.5 ㎖과 Fab ZAP Kit의 XTT (ATSbio, #XTT) 5.5 ㎖을 잘 섞어 DPBS/XTT(1:1) 시약 11 ㎖을 만든 뒤 키트 내의 PMS (ATSbio, #PMS-400) 92 ㎕를 넣어 XTT/PMS 시약을 만든다. 72 시간동안 배양한 플레이트를 꺼내 항체 및 사포린 등의 처리된 각 웰에 XTT/PMS 시약을 50 ㎕씩 분주한 뒤 플레이트를 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다.
2시간 배양이 끝난 플레이트를 꺼내어 GloMax®Discover Microplate Reader(Promega, #GM3000)를 이용하여 450 nm파장에서 흡광도를 측정한다. 세포 생존력(cell viability, %)은 테스트 항체가 처리되지 않은 웰의 값을 100%로 기준하고, GraphPad prism(9.4 version)의 4-파라미터 비선형함수곡선(log vs response-variable slope 4 parameters)을 사용하여 IC50(the half maximal inhibitory concentration; 세포사멸을 50% 유도하는데 필요한 항체 양)을 산출하였다.
그 결과, 표 4, 도 12 및 도 13에 도시된 바와 같이 항원발현이 없는 HEK293E 모세포주에서는 테스트 항체들의 세포독성은 관찰되지 않았고, CLDN18.2가 과발현된 HEK293E/18.2 세포주에서 테스트 항체 처리 최고농도인 10 nM에서 세포 독성 효과가 관찰되고 IC50값은 0.04~0.10 nM 구간으로 테스트 항체들은 항원-특이적으로 내재화된 후 세포독성을 유발할 수 있으며 그 효과는 테스트 항체간 차이가 있는 것으로 나타났다.
세포 내재화 후 세포 독성 효과
HEK293E HEK293E/18.2
Cell viability(%) at 10 nM Cell viability(%) at 10 nM IC50(nM)
Saporin 97 98 51.53
Human IgG 100 100 N/A
0058-001 125 76 0.10
0058-002 108 58 0.04
0058-003 91 56 0.04
N/A: not available
실시예 6. 선별된 CLDN18.2 특이 단클론항체의 열 안정성
시차 주사 형광측정법(Differential Scanning Fluorimetry)을 이용하여 항체의 열안정성을 테스트하였다. 항체 단백질을 DPBS에 희석하여 3 μM, 45 ㎕를 만들고, 200x Sypro orange dye(Thermo, #S6650) 5 ㎕와 섞어서 qPCR 튜브(Bio-Rad, #TLS0851-white)에 50 ㎕씩 분주하고 뚜껑(Bio-Rad, #TCS0803)을 닫는다. Biorad CFX96 실시간 PCR 기기를 사용하여 qPCR을 실시하였다. qPCR은 25℃에서 30초간 반응시킨 후, 99℃까지 0.5℃씩 증가시키되 각 온도에서 0.5분간 반응시키고, 마지막으로 25℃에서 10초간 반응시켜 마무리하였다. 항체 구조가 풀리는 속도 상수로는 Tm(용융 온도)을 사용하였다.
항체의 열역학적 안정성
항체 종류 Tm (℃)
SC0080 67.00
0058-001 64.50
0058-002 67.00, 81.50
0058-003 67.50, 79.50
분석 결과 상기 표 5와 같이, 대조항체와 선별 항체 0058-002 및 0058-003은 Tm값 65℃ 이상으로 열 안정성이 양호한 것으로 확인되었고 0058-001은 64.5℃ 로 약간 낮은 것으로 나타났다. 0058-002 및 0058-003 항체에서 2개의 Tm이 나타난 것은 항체를 구성하는 도메인들(CH2, CH3, Fab)간의 풀리는 속도가 달랐거나 첫 용융온도로부터 풀려서 생긴 불활성화된 단백질이 응집(aggregation)된 후 두번째 용융온도에서 2차로 풀렸기 때문인 것으로 사료되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (23)

  1. 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR (complementarity-determining region) 1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 DVS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR (complementarity-determining region) 1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 AAS로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR (complementarity-determining region) 1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 13으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄가변영역과, 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 GAF로 이루어진 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것인 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제2항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것인 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제3항에 있어서, 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14의 아미노산 서열로 기재된 중쇄가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 기재된 경쇄가변영역을 포함하는 것인 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론항체는 인간항체, 인간화항체, 키메릭항체 및 재조합항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 클라우딘-18.2와 결합하는 scFv (single chain variable fragment), dsFv, Fab, F(ab') 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  11. 제10항의 발현 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 형질전환체.
  12. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 형질전환체를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 상기 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는, 클라우딘-18.2에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 식도암, 난소암, 폐암, 위암, 대장암, 간암, 담도암, 유방암, 신장암, 중피종(mesothelioma) 및 두경부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항암제는 화학요법제 또는 면역관문억제제인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
  17. 제13항의 암 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
  19. 제18항의 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트.
  20. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 결합된 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate).
  21. 제20항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  22. ⅰ) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체;
    ⅱ) 막투과성 도메인(transmembrane domain); 및
    ⅲ) 상기 i)의 항체가 표적 항원에 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) 단백질.
  23. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 클라우딘-18.2(claudin-18 spliced variant 2, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 단클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체(multi-specific antibody).
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