ES2886063T3

ES2886063T3 - Tratamiento de la artrosis

Info

Publication number: ES2886063T3
Application number: ES15194091T
Authority: ES
Inventors: John Allan Hamilton; Andrew David Cook
Original assignee: University of Melbourne
Current assignee: University of Melbourne
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2021-12-16
Anticipated expiration: 2029-12-21
Also published as: AU2009329814A1; PL2376121T3; KR101799264B1; HK1226938A1; EP2376121A1; US20160185868A1; JP6458086B2; KR20170128630A; SI2376121T1; EP2376121B2; US20200247895A1; KR20110128273A; US9243061B2; SI2376121T2; BRPI0918356B1; CY1117698T1; JP2012512815A; HRP20160577T4; US20180066062A1; ES2572368T5

Abstract

Un antagonista del GM-CSF para usar en el tratamiento de la artrosis, en donde el antagonista es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de la artrosis

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un antagonista del GM-CSF para usar en el tratamiento de la artrosis, en donde el antagonista es un anticuerpo que es específico del receptor del GM-CSF.

Antecedentes de la invención

La artrosis, también conocida como artritis degenerativa, es una enfermedad más prevalente entre los ancianos y los obesos. La artrosis es una enfermedad de las uniones articulares, pero, a diferencia de la artritis reumatoide (AR), la enfermedad no es sistémica, afectando habitualmente solo a unas pocas articulaciones. La enfermedad conduce a la destrucción total del cartílago articular, esclerosis de los huesos subyacentes y formación de osteofitos, lo que tiene como resultado pérdida de movimiento y dolor. El resultado final suele ser la necesidad de un reemplazo total de la articulación.

La artrosis afecta a aproximadamente ~21 millones de personas en los Estados Unidos, constituye el 25 % de todas las visitas al médico de atención primaria y representa el 50 % de todas las prescripciones de AINE (antiinflamatorios no esteroideos). Actualmente no hay ningún tratamiento disponible que ralentice o detenga la progresión de la enfermedad; los fármacos actuales simplemente tratan los síntomas. La incidencia y la gravedad de la enfermedad aumentan con la edad. A la edad de 65 años, el 80 % de los estadounidenses muestran evidencia radiográfica de artrosis, aunque solo el 60% de ellos será sintomático. El 65 % de todas las enfermedades articulares a la edad de 65 años son artrosis. En 2006, en los EE. UU. hubo 735.000 hospitalizaciones relacionadas con la artrosis.

Los fármacos para la artrosis actuales tratan los síntomas de la artrosis en lugar de la propia enfermedad. Los fármacos frecuentemente utilizados en el tratamiento de la artrosis incluyen los antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como Diacereína, Voltaren, Mobic y Arthrotec (nombres genéricos: diclofenaco, misoprostol, meloxicam). Los AINE son principalmente compuestos orales que actúan inhibiendo la síntesis de prostaglandinas en el sistema nervioso central (SNC). Otros fármacos frecuentemente utilizados incluyen analgésicos no narcóticos, tales como Ultram (tramadol), inhibidores de la COX-2, tales como Celebrax y Arcoxia (celecoxib, etoricoxib), analgésicos narcóticos, tales como Duragesic (dextropropoxifenofentanilo), ácidos hialurónicos, tales como Supartz, Hyalgan, Orthovisc y Synvisc (Hylan G-F20), y corticoesteroides, tales como prednisolona y metilprednisolona. Los tratamientos actuales para la artrosis pretenden obviar la necesidad de cirugía mediante ingeniería de tejidos, tal como el trasplante de condrocitos; sin embargo, estos tratamientos solo son aplicables para el tratamiento de la artrosis en última fase. Otros enfoques en el tratamiento de la artrosis que se consideran incluyen la proloterapia, en la que se inyecta un irritante, tal como dextrosa, en la articulación afectada, lo que provoca una reacción inflamatoria aguda, pero también fortalece y, con suerte, cura los tejidos, ligamentos, tendones y cartílago. Existe, por lo tanto, una gran necesidad médica no satisfecha para el tratamiento de la artrosis.

Se sabe que algunas citocinas están implicadas en la artrosis (Blomet al., CurrentDrug Targets (2008) 8:283). Unas pocas citocinas, tales como IL-1, una citocina "destructiva", y el factor de crecimiento anabólico, el factor de crecimiento transformante p (TGF-p), se consideran posibles dianas farmacológicas.

El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) es una citocina que funciona como factor de crecimiento de leucocitos. El GM-CSF estimula a las células madre para que produzcan granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y monocitos. Los monocitos salen de la circulación y migran al tejido, después de lo cual maduran y se convierten en macrófagos. Es, por lo tanto, parte de la cascada inmunitaria/ inflamatoria natural, mediante la cual la activación de un pequeño número de macrófagos puede conducir rápidamente a un aumento en su número, un proceso crucial para combatir las infecciones. La forma activa del GM-CSF se encuentra extracelularmente como un homodímero. En particular, el GM-CSF se ha identificado como un mediador inflamatorio en trastornos autoinmunitarios, como la artritis reumatoide (AR), que conduce a una mayor producción de citocinas, quimiocinas y proteasas proinflamatorias y, de este modo, en última instancia a la destrucción articular.

El documento WO 06/0234412 divulga numerosos biomarcadores de la artrosis, que se identificaron mediante micromatrices de proteínas. Uno de los biomarcadores identificados es el GM-CSF, para el cual se ha descrito una regulación al alza de cuatro veces en el tejido artrósico. Sin embargo, no se proporciona ninguna indicación o sugerencia de que el GM-CSF también pueda ser un punto para la intervención terapéutica, y una mera regulación al alza cuatro veces superior en el tejido artrósico, identificado con la tecnología divulgada en el documento WO 06/0234412, tampoco sugiere lo mismo. En una línea relacionada, Devalaraja et al (US20020141994A1) mencionan brevemente la artrosis entre una larga lista de indicaciones potencialmente adecuadas para el tratamiento con antagonistas de factores estimulantes de colonias. La lista de indicaciones incluye ateroesclerosis, septicemia, asma, enfermedad autoinmunitaria, osteoporosis y artritis reumatoide. Además de otros factores estimulantes de colonias, tales como M-CSF y G-CSF, el GM-CSF es uno de los factores estimulantes de colonias mencionados en Devalarajaet al. De hecho, Devalarajaet al. no incluyen datos u otras ideas sobre por qué antagonizar el GM-CSF sería apropiado para tratar a un sujeto que padece artrosis.

Thomas, A. et al., Arthritis&Rheumatism, September 2006, 54(9):S357 divulga la inhibición de la artritis inducida por colágeno, un modelo comúnmente utilizado para la artritis reumatoide, en ratones Dba/1 mediante tratamiento con un anticuerpo anti-cadena alfa del receptor del GM-CSF. El documento WO 2007/110631A1 divulga miembros de unión para la cadena alfa del receptor del GM-CSF y su uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios. Berenbaum, F. et al., EuropeanCytokine Network, 1 January 1994, 5(1):43-46, divulga que el receptor del GM-CSF se expresa en el tejido sinovial de pacientes tanto con artrosis como con artritis reumatoide. Bendele, A., Journal of Musculoskeletal& Neuronal Interactions, 1 June 2001, 1(4):363-376 y Little, C. et al., CurrentRheumatologyReviews, 1 August 2008, 4(3):175-182 describe modelos de artrosis.

Sumario de la invención

La presente invención, por primera vez, demuestra que el GM-CSF es una diana válida para el tratamiento de la artrosis. Este hallazgo es nuevo y la técnica anterior no enseña, sugiere ni proporciona ninguna razón para tal punto de intervención en el tratamiento de la artrosis. En consecuencia, la invención proporciona, un antagonista del GM-CSF para usar en el tratamiento de la artrosis, en donde el antagonista es un anticuerpo que es específico del receptor del GM-CSF.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un antagonista del GM-CSF para su uso en el tratamiento de la artrosis, en donde el antagonista es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF y que además comprende uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, las palabras "comprender", "tener" e "incluir" y sus respectivas variaciones tales como "comprende", "que comprende", "tiene", "que tiene", "incluye" e "incluyendo" se entenderá que implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros citados pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra datos cuantitativos del daño articular en diferentes regiones evaluadas por puntuación histológica.La configuración experimental y el sistema de puntuación se describen en el Ejemplo 2. "Lat." significa lateral, "Med." significa medial. El análisis estadístico se realizó a mediante la prueba de Mann-Whitney. Los datos son estadísticamente significativos para Fémur Lat. (p = 0,02), Tibia Lat. (p = 0,003), Tibia Med. (p = 0,001) y en todas las regiones (Media; p = 0,002).

La Figura 2 muestra cortes de histología de ejemplo de rodillas de control sanas. El aumento es 100x. No se observa daño en el cartílago, formación de osteofitos, sinovitis o deformaciones. S = revestimiento sinovial, C = capa de cartílago.

La Figura 3 muestra cortes de histología de ejemplo de las rodillas izquierdas de ratones C57/BL6 en un modelo de artrosis inducida por colagenasa. El aumento es de los cortes individuales y está indicado en las Figuras. La fila superior de las imágenes muestra que el daño del cartílago, la formación de osteofitos y la sinovitis son evidentes. O = osteofito. S = revestimiento sinovial. La fila inferior de imágenes muestra que también existe deformación de la articulación.

La Figura 4 muestra cortes de histología de ejemplo de las rodillas izquierdas de ratones GM-CSF-/- en un modelo de artrosis inducida por colagenasa. El aumento es de los cortes individuales y está indicado en las Figuras. Como puede verse, las anomalías y/o daños son mucho menos graves en comparación con los ratones C57/BL6 (véase Figura 3) y son comparables a los ratones de control sanos (véase Figura 2). O = osteofito. S = revestimiento sinovial.

La Figura 5 muestra la puntuación de la histología de la articulación de la rodilla del tratamiento terapéutico con un anticuerpo anti-GM-CSF en un modelo de artrosis en ratón. Lat.=Lateral. Med.=Medial. Los resultados se expresan como media ± EEM. Como puede observarse, los ratones tratados con un anticuerpo anti-GM-CSF muestran menos enfermedad.

La Figura 6 muestra el resultado de un experimento que evalúa la distribución del peso de las patas traseras en un medidor de incapacidad. Los datos son significativos (ensayo t no pareado) desde el día 27 después de la inducción de la artrosis en adelante, como se indica en el gráfico.

Descripción detallada de la invención

La presente invención demuestra que el GM-CSF es una diana válida para el tratamiento de la artrosis. En este sentido, la invención proporciona, en un aspecto, un antagonista del GM-CSF para usar en el tratamiento de la artrosis, en donde el antagonista es un anticuerpo que es específico del receptor del GM-CSF.

Se divulgan métodos terapéuticos que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del GM-CSF a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad de un antagonista del GM-CSF necesaria para provocar la respuesta biológica deseada. De acuerdo con la presente invención, la cantidad terapéutica eficaz es la cantidad de un antagonista del GM-CSF necesaria para tratar y/o prevenir la artrosis.

"Antagonistas del GM-CSF", como se utiliza en el presente documento, incluye antagonistas del GM-CSF en su sentido más amplio; se incluye cualquier molécula que inhiba la actividad o función del GM-CSF, o que de cualquier otra forma ejerza un efecto terapéutico sobre el g M-CSF. La expresión antagonistas del GM-CSF incluye, pero sin limitación, anticuerpos que se unen específicamente al GM-CSF, inhibidores específicos de los ácidos nucleicos del GM-CSF o moléculas orgánicas pequeñas específicas del GM-CSF. Asimismo, dentro del significado de la expresión antagonista del GM-CSF están los anticuerpos que se unen específicamente al receptor del GM-CSF, ácidos nucleicos inhibidores específicos del receptor del GM-CSF o pequeñas moléculas orgánicas específicas del receptor del GM-CSF.

Para revisiones véase Ghose et al, J CombinChem: 1:55-68, 1999 y Lipinski et al, AdvDrug Del Rev 23:3-25, 1997. Un antagonista del GM-CSF para usar en la presente invención es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF. Dicho anticuerpo puede ser de cualquier tipo, tal como un anticuerpo murino, de rata, quimérico, humanizado o humano. Un anticuerpo "humano" o un fragmento de anticuerpo humano funcional se define aquí como uno que no es quimérico (por ejemplo, no "humanizado") y no procede (en su totalidad o en parte) de una especie no humana. Un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo funcional puede derivarse de un ser humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. Un "anticuerpo humano sintético" se define en el presente documento como un anticuerpo que tiene una secuencia derivada, en su totalidad o en parte, in silico de secuencias sintéticas que se basan en el análisis de secuencias conocidas de anticuerpos humanos. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo humano o fragmento del mismo se puede lograr, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias de un anticuerpo humano o fragmentos de anticuerpo y concibiendo una secuencia de polipéptidos utilizando los datos obtenidos de la misma. Otro ejemplo de un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo funcional es uno que está codificado por un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de origen humano (es decir, estando basada dicha biblioteca en anticuerpos tomados de una fuente natural humana).

Un "anticuerpo humanizado" o fragmento de anticuerpo humanizado funcional se define en el presente documento como uno que (i) se deriva de una fuente no humana (por ejemplo, un ratón transgénico que lleva un sistema inmunológico heterólogo), anticuerpo que está basado en una secuencia de una línea germinal humana; o (ii) quimérico, en donde el dominio variable se deriva de un origen no humano y el dominio constante se deriva de un origen humano o (iii) CDR injertado, en donde las CDR del dominio variable son de origen no humano, mientras que una o más regiones marco del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (si lo hay) es de origen humano.

La expresión "anticuerpo quimérico" o fragmento de anticuerpo quimérico funcional se define en el presente documento como una molécula de anticuerpo que tiene regiones de anticuerpo constantes derivadas de, o que corresponde a, secuencias encontradas en una especie y regiones variables de anticuerpos derivadas de otra especie. Preferentemente, las regiones de anticuerpos constantes proceden de o corresponden a, secuencias encontradas en seres humanos, por ejemplo, en la línea germinal humana o células somáticas, y las regiones variables de anticuerpos (por ejemplo, regiones VH, VL, CDR o FR) se derivan de secuencias que se encuentran en un animal no humano, por ejemplo, un ratón, rata, conejo o hámster.

Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo "se une específicamente a", "une específicamente", es "específico de" o "reconoce específicamente" un antígeno (aquí, GM-CSF o, como alternativa, el receptor del GM-CSF) si dicho anticuerpo es capaz de discriminar entre dicho antígeno y uno o más antígenos de referencia, ya que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta, sino relativa. El antígeno o antígenos de referencia pueden ser uno o más antígenos estrechamente relacionados, que se utilizan como puntos de referencia, por ejemplo, IL3, IL5, IL-4, IL13 o M-CSF. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, según se determina, por ejemplo, de acuerdo con los siguientes métodos. Dichos métodos comprenden, pero sin limitación transferencia Western, ensayos ELISA, RIA, ECL, IRMA y exploraciones de péptidos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo ELISA estándar. La puntuación puede llevarse a cabo mediante revelado de color estándar (por ejemplo, anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano picante y tetrametilbencidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en determinados pocillos se puntúa por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (=reacción negativa) puede ser de 0.1 DO; la reacción positiva típica puede ser de 1 DO. Esto significa que la diferencia positiva/negativa puede ser de más de 10 veces. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza utilizando no solo un único antígeno de referencia, sino un conjunto de entre tres y cinco antígenos no relacionados, tales como leche en polvo, ASB, transferrina o similares. Adicionalmente, "unión específica" se puede referir a la capacidad de un anticuerpo para discriminar entre diferentes partes de su antígeno diana, por ejemplo, diferentes dominios o regiones del g M-CSF o el receptor del GM-CSF, o entre uno o más restos de aminoácidos clave o tramos de restos de aminoácidos del GM-CSF o del receptor del GM-CSF.

Asimismo, como se utiliza en el presente documento, una "inmunoglobulina" (Ig) se define aquí como una proteína que pertenece a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas), e incluye todos los anticuerpos y fragmentos de los mismos conocidos convencionalmente. Un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define aquí como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que conserva la región de unión al antígeno. Una "región de unión al antígeno" de un anticuerpo se encuentra normalmente en una o más región o regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, CDR-2 y/o CDR-3; sin embargo, las regiones "marco" variables también pueden desempeñar un papel importante en la unión del antígeno, tal como proporcionando un armazón para las CDR. Preferentemente, la "región de unión al antígeno" comprende al menos los restos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena ligera variable (VL) y 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH), más preferentemente los restos de aminoácidos 3 a 107 de VL y 4 a 111 de VH, y se prefieren particularmente las cadenas VL y VH completas (posiciones de aminoácidos 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración de acuerdo con el documento WO 97/08320). Una clase preferida de inmunoglobulinas para usar en la presente invención es la IgG. "Fragmentos funcionales" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, scFv o construcciones que comprenden dominios variables de inmunoglobulina individuales o polipéptidos de anticuerpos de dominio único, por ejemplo, dominios variables de la cadena pesada única o dominios variables de la cadena ligera única. El F(ab')2 o Fab puede diseñarse para minimizar o eliminar por completo las interacciones intermoleculares de disulfuro que existen entre los dominios CH1 y CL.

Un anticuerpo de la invención puede derivarse de una biblioteca de anticuerpos recombinantes que se basa en secuencias de aminoácidos que se han diseñado in silico y codificado por ácidos nucleicos que se crean sintéticamente. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo se logra, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias humanas y concibiendo una secuencia de polipéptidos utilizando los datos obtenidos de la misma. Los métodos para diseñar y obtener las secuencias creadas in silico se describen, por ejemplo, en Knappik et al, J. Mol. Biol. 296:57, 2000; Krebs et al, J. Immunol. Methods. 254:67, 2001; Rothe et al, J. Mol. Biol. 376:1182, 2008 y patente de EE. UU. N.° 6.300.064 otorgadas a Knappik et al 2000 supra.

El receptor del GM-CSF es un miembro de la superfamilia del receptor de la hematopoyetina. Es heterodimérico, consistiendo en una subunidad alfa y una beta. La subunidad alfa es muy específica del GM-CSF, mientras que la subunidad beta se comparte con otros receptores de citocinas, incluyendo IL3 e IL5. Esto se refleja en una distribución tisular más amplia de la subunidad del receptor beta. La subunidad alfa, GM-CSFR a, se expresa principalmente en células mieloides y células no hematopoyéticas, tales como neutrófilos, macrófagos, eosinófilos, células dendríticas, células endoteliales y células epiteliales respiratorias. La GM-CSFR a de longitud completa es una glicoproteína de membrana de tipo I de 400 aminoácidos que pertenece a la familia de receptores de citocinas de tipo I y consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos (posiciones 1-22), un dominio extracelular de 298 aminoácidos (posiciones 23-320), un dominio transmembrana de las posiciones 321-345 y un dominio intracelular corto de 55 aminoácidos. El péptido señal se escinde para proporcionar la forma madura de la GM-CSFR a como una proteína de 378 aminoácidos. Se encuentran disponibles clones de ADNc de la GM-CSFR a humana y murina y, a nivel de proteína, las subunidades del receptor tienen una identidad del 36 %. El GM-CSF es capaz de unirse con una afinidad relativamente baja a la subunidad a sola (Kd 1-5 nM) pero no a la subunidad p sola. Sin embargo, la presencia de ambas subunidades a y p da como resultado un complejo ligando-receptor de alta afinidad (Kd » 100 pM). La señalización del GM-CSF se produce a través de su unión inicial a la cadleliea GM -CSFR y a continuación la reticulación con una subunidad más grande, la cadena p común, para generar la interacción de alta afinidad, que fosforila la vía JAK-STAT.

Con la presente invención se puede usar cualquier anticuerpo específico del receptor del GM-CSF. Los anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de una secuencia H-CDR3 representada en una cualquiera de las SEQ ID Nos: 28-46. Otros anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos que se derivan de anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de una secuencia H-CDR3 representada en una cualquiera de las SEQ ID Nos: 28-46. Otros anticuerpos de ejemplo más incluyen anticuerpos que tienen la misma especificidad y/o se unen al mismo epítopo que los anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de una secuencia H-CDR3 representada en una cualquiera de las SEQ ID Nos: 28-46. Otros anticuerpos de ejemplo más incluyen anticuerpos que comprenden una secuencia H-CDR3 que es al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % homologa a la secuencia H-CDR3 representada en una cualquiera de las SEQ ID Nos.: 28-46.

SEQ ID No:28:

Val Gly Ser Phe Ser Gly lie Ala Tyr Arg Pro

5 10

SEQ ID No:29:

Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu Arg Pro

5 10

SEQ ID No:30:

Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr

5 10

SEQ ID No:31:

Val Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Pro Tyr Arg Pro

5 10

SEQ ID No:32:

Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu

5 10

SEQ ID No:33:

Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Val Tyr Gly Leu

5 10

SEQ ID No:34:

Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Ala Tyr Arg Pro

5 10

SEQ ID No:35:

Val Gly Ser Phe Ser Pro Val Thr Tyr Gly Leu

5 10

SEQ ID No:36:

Val Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Arg Pro

5 10

SEQ ID No:37:

Val Gly Ser Phe Ser Pro lie Thr Tyr Gly Leu

5 10

SEQ ID No:38:

Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

5 10

SEQ ID No:39:

Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

5 10

SEQ ID No:40:

Leu Gly Ser Val Thr Ala Trp Ala Phe Asp Tyr

5 10

SEQ ID No:41:

Ala Gly Ser lie Pro Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

5 10

SEQ ID No:42:

Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu

5 10

SEQ ID No:43:

Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu

5 10

SEQ ID No:44:

Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu His Leu

5 10

SEQ ID No:45:

Val Gly Ser Val Ser Arg lie Thr Tyr Gly Phe

5 10

SEQ ID No:46:

Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu

5 10

También se divulgan métodos para el tratamiento de la artrosis en un sujeto, comprendiendo dicho método la etapa de administrar un antagonista del GM-CSF a dicho sujeto en donde el antagonista es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF. "Sujeto", como se utiliza en este contexto se refiere a cualquier mamífero, incluidos los roedores, tales como ratón o rata y primates, tales como el macaco cangrejero(Macaca fascicularis), macaco rhesus (Macaca mulatta) o humanos (Homo sapiens).Preferentemente el sujeto es un primate, lo más preferentemente un ser humano.

También se divulga una composición que comprende tal antagonista del GM-CSF capaz de antagonizar la capacidad del GM-CSF de activación, proliferación, inducción del crecimiento y/o la supervivencia de células en un sujeto que padece artrosis, o que se sospecha que padece artrosis, comprendiendo además dicha composición uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los anticuerpos anti-GM-CSF de la presente invención pueden antagonizar cualquiera de las funciones del GM-CSF en la artrosis.

También se divulga un método para la profilaxis de la artrosis en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar un antagonista del GM-CSF a dicho sujeto, en donde el antagonista es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF. "Profilaxis", como se usa en este contexto, se refiere a métodos que tienen como objetivo prevenir la aparición de una enfermedad o que retrasan la aparición de una enfermedad.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un antagonista del GM-CSF para usar en el tratamiento de la artrosis, en donde dicho antagonista del g M-CSF es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF, comprendiendo además dicha composición uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

También se divulga el uso de tal antagonista del GM-CSF en la preparación de un medicamento en el tratamiento de la artrosis.

Las composiciones de la presente invención son preferentemente composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista del GM-CSF en donde el antagonista del GM-CSF es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, pare el tratamiento de la artrosis. Dichos vehículos, diluyentes y excipientes son bien conocidos en la técnica, y el experto en la materia encontrará la formulación y la vía de administración más adecuadas para tratar a un sujeto con los antagonistas del GM-CSF de la presente invención.

También se divulgan ratones genéticamente manipulados que tienen un genotipo GM-CSF -/-. Las expresiones ratón "con un gen inactivado", un ratón con un gen "alterado" y un ratón con un "genotipo -/-" se usan de forma intercambiable en la presente invención y son reconocidos en la técnica. Los animales respectivos son deficientes en un gen respectivo, aquí GM-CSF, en ambos alelos del cromosoma.

Ejemplo 1:

Generación de un ratón GM-CSF-/- La generación de ratones GM-CSF-/- se describe en Stanley et al (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5592. Brevemente, se generaron ratones quiméricos mediante microinyección de células ES derivadas de 129/OLA (H-2b) con un gen GM-CSF alterado en blastocistos del hospedador C57BL/6 (H-2b). Los transmisores de la línea germinal del alelo GM-CSF mutado se cruzaron con ratones C57BL/6 durante 11 generaciones, dando ratones GM-CSF+/-que se cruzaron entre sí para dar los ratones GM-CSF-/-, GM-CSF+/- y GM-CSF+/+ utilizados para los experimentos. El estado del genotipo del GM-CSF se determinó mediante análisis de PCR del ADN de la cola. Los animales se alimentaron con comida estándar para roedores y agua ad libitum y se alojaron con compañeros de camada del mismo sexo en jaulas forradas con serrín. Entre las 8 y 15 semanas de edad se destinaron ratones de ambos sexos a la realización de experimentos.

Ejemplo 2:

Validación del GM-CSF como una diana para la artrosis

Se compararon ratones GM-CSF -/- con ratones C57/BL6 (véase, por ejemplo, Mills et al., J Immunol 164:6166-6173, 2000) en un modelo experimental de artrosis.

Método: los ratones (n = 10 por grupo) recibieron una inyección intraarticular de colagenasa en la rodilla izquierda el día -2 y el día 0 (Blom et al, ArthritisRheum 56:147-157, 2007). El día 42 se sacrificó a los ratones, se recogieron las articulaciones de las rodillas, se fijaron, se descalcificaron, se incrustaron en parafina y se cortaron a 7 pm con un microtomo. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con safranina-O/Fast Green y hematoxilina y eosina para exhibir la patología articular. La patología investigada incluye: daño en el cartílago, sinovitis, formación de osteofitos y deformación articular.

El sistema de puntuación utilizado para la patología del cartílago fue el siguiente:

Grado

0 Normal

1 Irregular pero intacto

1.5 Irregular con superficie rugosa

2 Fibrilación superficial

2.5 Fibrilación superficial con un número reducido de células en la capa de cartílago

3 Fisuras verticales

3.5 Ramas y/o fisuras horizontales, roturas en la línea de calcificación

4 Pérdida de cartílago que no se extiende hasta la línea de calcificación

4.5 Pérdida de cartílago que se extiende hasta la línea de calcificación

5 Pérdida de cartílago más allá de la línea de calcificación pero que no se extiende hasta el hueso 5.5 Pérdida de cartílago que se extiende hasta el hueso

6 Pérdida/remodelación/deformación ósea

Estadio

1 <10 % de área dañada

2 10-25 % de área dañada

3 25-50 % de área dañada

4 50-75 % de área dañada

El grado se multiplicó por el estadio para dar la puntuación.

Este sistema de puntuación se basa en un método reconocido para evaluar la histopatología de la artrosis en la artrosis clínica y experimental. Véase Pritzker et al, OsteoarthritisCartilage 14:13-29, 2006. El grado se define como la progresión de la profundidad de la artrosis hacia el cartílago. El estadio se define como la extensión horizontal de la afectación del cartílago, es decir, la cantidad de cartílago afectada. El grado se multiplica por el estadio para dar la puntuación y obtener una puntuación global, a fin de representar una evaluación combinada de la gravedad y el alcance de la artrosis. Se puntúan hasta seis cortes por ratón.

Resultados: La inspección de estas articulaciones mostró que los ratones GM-CSF -/- muestran menos patología de la articulación de la rodilla que los ratones de control, lo que indica el papel del GM-CSF en la patología y progresión normal de la artrosis. La patología observada en los ratones C57/BI6 incluye daño intenso en la capa de cartílago, formación de osteofitos, deformación articular y sinovitis. Los ratones GM-CSF -/- no mostraron formación de osteofitos o deformación articular y mucho menos daño del cartílago y sinovitis.

Los datos cuantitativos sobre el daño articular en diferentes regiones se muestran en la Figura 1. La histología representativa se muestra en las Figuras 2 (rodillas de control sanas), 3 (C57/BL6 rodillas izquierdas) y 4 (GM-CSF-/- rodillas izquierdas). Los ratones deficientes en el gen GM-CSF desarrollaron menos patología de artrosis inducida por colagenasa, en comparación con los ratones C57BL/6.

En resumen, los ratones GM-CSF -/- mostraron una patología de la articulación de la rodilla fuertemente disminuida en comparación con los ratones C57/BL6 en un modelo experimental de artrosis y GM-CSF validado como una diana farmacológica para la intervención terapéutica para la artrosis.

Ejemplo de referencia 3:

Eficacia terapéutica de los antagonistas del GM-CSF en el tratamiento de la artrosis

En este experimento utilizamos un anticuerpo monoclonal específico del GM-CSF para demostrar que un antagonista del GM-CSF puede ser eficaz para tratar la artrosis.

Modelo de ratón con artrosis inducida por colágeno:

Se administró a ratones C57BL/61 unidad de colagenasa tipo VII por vía intraarticular en la rodilla derecha los días 0 y 2 para inducir inestabilidad articular (véase Blomef al. (2004) Osteoarthritis Cartilage.12; 627-35).

Tratamiento con anticuerpo anti-GM-CSF:

Se dividieron aleatoriamente 20 ratones en 2 grupos (10 ratones/grupo).

Grupo 1 (n = 10): anticuerpoanti-GM-CSF (22E9)

Grupo 2 (n = 10): anticuerpo de control de isotipo IgG2a.

Los ratones se trataron intraperitonealmente, tres veces por semana durante 6 semanas con 250 pg/ratón/tratamiento con anticuerpo anti-GM-CSF (22E9) o anticuerpo de control de isotipo IgG2a. El tratamiento comenzó 4 días antes de la inducción de la artrosis (profiláctico), es decir, los ratones se trataron el día -4, día -2, día 0 (el día de la primera inyección de colagenasa), a continuación 3 veces por semana hasta el final del experimento de 6 semanas). En las semanas 2, 4 y 6, se tomaron muestras de sangre de los ratones. Se comprobó el contenido de anticuerpos y la inmunogenicidad del suero contra 22E9. Ambos, tanto el anticuerpo de control como el anticuerpo anti-GM-CSF se purificaron para contener menos de 10 unidades de endotoxina/ml.

El anticuerpo 22E9 se usó como un ejemplo de anticuerpo anti-GM-CSF. 22E9, que es del isotipo IgG2a, es un anticuerpo anti-GM-CSF específico de ratón de rata. 22E9 se adquirió en AbDSerotec (Martinsried, Alemania; N.° de Cat. 1023501). Existen proveedores alternativos, por ejemplo, eBioscience (San Diego, CA, EE.UU., N.° de Cat. 14 7331).

Histología:

6 semanas después de las inyecciones finales, se realizó la histología de las articulaciones de las rodillas de los ratones. Se recogieron las articulaciones de las rodillas, se fijaron, se descalcificaron, se incrustaron en parafina y se cortaron a 7 pm con un microtomo. Los portaobjetos se tiñeron con safranina-O/Fast Green y hematoxilina y eosina para exhibir la patología articular. La patología investigada incluyó: daño en el cartílago, sinovitis, formación de osteofitos y deformación articular.

Se utilizó el mismo sistema de puntuación que en el Ejemplo 2 para la patología del cartílago.

El grado se multiplicó por el estadio para dar la puntuación.

Se utilizó el siguiente sistema de puntuación para la sinovitis (sistema de puntuación de la capa sinovial):

0 Sin cambios en comparación con las articulaciones normales

1 Engrosamiento del revestimiento sinovial y cierta afluencia de células inflamatorias

2 Engrosamiento del revestimiento sinovial y afluencia intermedia de células inflamatorias

3 Profundo engrosamiento del revestimiento sinovial y máxima afluencia observada de células inflamatorias Mediciones del dolor:

Un indicador del dolor utilizado para los modelos de artrosis es la distribución diferencial del peso medido con un medidor de incapacidad. Este instrumento mide los cambios en la distribución del peso entre la extremidad trasera operada y la contralateral no operada. Se permitió que los ratones se aclimataran al equipo en tres ocasiones antes del experimento. El peso colocado en cada miembro trasero se midió durante un período de 5 segundos. A continuación se promediaron tres mediciones separadas por ratón para cada punto temporal. Las mediciones se realizaron 2 veces por semana durante todo el experimento. Los resultados se expresan como extremidad inyectada con colagenasa/extremidad de control x 100.

Resultados:

Para todas las áreas analizadas en histología (excepto el fémur medial), es decir, el fémur lateral, la tibia lateral y la tibia medial, hubo una clara tendencia hacia una menor enfermedad en los ratones tratados con anticuerpo anti-GM-CSF. Los resultados se muestran en la Figura 5.

La evaluación de la distribución del peso, como una medida del dolor asociado con la artritis, mostró un cambio significativo en el peso de la rodilla artrítica desde el día 27 en adelante en el grupo tratado con mAb anti-GM-CSF en comparación con el grupo tratado con mAb de control. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Los ratones tratados con un antagonista del GM-CSF mostraron menos enfermedad en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control. Los ratones tratados con el antagonista del GM-CSF también mostraron significativamente menos dolor en las últimas etapas de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control. Los ratones tratados con el anticuerpo de control de isotipo mostraron un aumento significativo de los signos de artrosis en comparación con los ratones que recibieron el anticuerpo específico del GM-CSF. Esto demuestra que los antagonistas del GM-CSF son eficaces en el tratamiento de la artrosis.

Ejemplo de referencia 4:

Eficacia terapéutica de un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende las SEQ ID Nos. 1 o 2

Se repite el Ejemplo 3, en el que como antagonista del GM-CSF, se usa un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada como se representa en la SEQ ID NO: 1 o que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera como se representa en la SEQ ID NO: 2. Se pueden usar otras especies que no sean el ratón, en particular una especie en la cual el anticuerpo usado en este experimento tiene reactividad cruzada. Preferentemente la especie animal usada en este experimento es la rata.

Los animales tratados con el anticuerpo de control de isotipo muestran un aumento significativo de los signos de artrosis en comparación con los animales que recibieron un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 1 o que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera como se representa en la SEQ ID NO: 2. Esto demuestra la eficacia de los anticuerpos en el tratamiento de la artrosis.

Ejemplo de referencia 5:

Eficacia terapéutica de un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende las SEQ ID Nos. 3 o 4

Se repite el Ejemplo 3. Como antagonista del GM-CSF, se usa un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada como se representa en la SEQ ID NO: 3 o que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera como se representa en la SEQ ID NO: 4. Se pueden usar otras especies que no sean el ratón, en particular una especie en la cual el anticuerpo usado en este experimento tiene reactividad cruzada. Preferentemente la especie animal usada en este experimento es la rata.

Los animales, por ejemplo la rata, tratados con el anticuerpo de control de isotipo muestran un aumento significativo de los signos de artrosis en comparación con los animales que recibieron un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 3 o que comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera como se representa en la SEQ ID NO: 4. Esto demuestra la eficacia de los anticuerpos en el tratamiento de la artrosis.

Ejemplo de referencia 6:

Eficacia terapéutica de un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende las SEQ ID Nos. 5-20

Se repite el Ejemplo 3. Como antagonista del GM-CSF, se usa un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende una secuencia H-CDR3 seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID Nos. 5-16. Preferentemente, dichos anticuerpos comprenden adicionalmente la secuencia H-CDR1 de SEQ ID NO: 16, y/o la secuencia H-CDR2 de SEQ ID NO: 17, y/o la secuencia L-CDR1 de SEQ ID NO: 18, y/o la secuencia L-CDR2 de SEQ ID NO: 19), y/o la secuencia L-CDR3 de SEQ ID NO: 20. Se pueden usar otras especies que no sean el ratón, en particular una especie en la cual el anticuerpo usado en este experimento tiene reactividad cruzada. Preferentemente la especie animal usada en este experimento es la rata.

Los animales, por ejemplo la rata, tratados con el anticuerpo de control de isotipo muestran un aumento significativo de los signos de artrosis en comparación con los animales que recibieron un anticuerpo específico del GM-CSF de acuerdo con el presente ejemplo. Esto demuestra la eficacia de los anticuerpos en el tratamiento de la artrosis. Ejemplo de referencia 7:

Eficacia terapéutica de un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende las SEQ ID Nos. 21-26

Se repite el Ejemplo 3. Como antagonista del GM-CSF, se usa un anticuerpo específico del GM-CSF que comprende la secuencia L-CDR1 de SEQ ID NO: 22, y/o la secuencia L-CDR2 de SEQ ID NO: 23, y/o la secuencia L-^cD^r3 de SEQ ID NO: 24, y/o la secuencia H-CDR1 de SEQ ID NO: 25, y/o la secuencia H-CDR2 de SEQ ID NO: 26, y/o la secuencia H-CDR3 de SEQ ID NO: 27. Preferentemente dicho anticuerpo comprende todas las CRD de las s Eq ID Nos. 22-27. Se pueden usar otras especies que no sean el ratón, en particular una especie en la cual el anticuerpo usado en este experimento tiene reactividad cruzada. Preferentemente la especie animal usada en este experimento es la rata.

Los animales, por ejemplo la rata, tratados con el anticuerpo de control de isotipo muestran un aumento significativo de los signos de artrosis en comparación con los animales que recibieron un anticuerpo específico del GM-CSF de acuerdo con el presente ejemplo. Esto demuestra la eficacia de los anticuerpos en el tratamiento de la artrosis. Ejemplo 8:

Eficacia terapéutica de anticuerpos específicos del receptor del GM-CSF

Se repite el ejemplo 3 con la diferencia de que se usa un anticuerpo monoclonal específico del receptor del GM-CSF en lugar de un anticuerpo monoclonal específico del GM-CSF.

Como antagonista del GM-CSF, se usa un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF que comprende una secuencia de aminoácidos de una secuencia H-CDR3 representada en una cualquiera de las SEQ ID Nos.: 27-45. Se pueden usar otras especies que no sean el ratón, en particular una especie en la cual el anticuerpo usado en este experimento tiene reactividad cruzada. Preferentemente la especie animal usada en este experimento es la rata.

Los animales, por ejemplo la rata, tratados con el anticuerpo de control de isotipo muestran un aumento significativo de los signos de artrosis en comparación con los animales que recibieron un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF de acuerdo con el presente ejemplo. Esto demuestra la eficacia de los anticuerpos en el tratamiento de la artrosis.

Ejemplo 9:

Ensayo clínico

Se realiza un ensayo clínico en pacientes adultos que padecen artrosis de rodilla. El objetivo del ensayo clínico aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo es determinar las diferencias comparativas entre los antagonistas del GM-CSF de la presente invención y el placebo en el alivio general del dolor y la calidad de vida en una muestra total de 30 pacientes con diagnóstico de artrosis de rodilla. Otro objetivo es determinar la seguridad y tolerabilidad de los antagonistas del GM-CSF de la presente invención según lo determinado por los acontecimientos adversos, examen físico y las constantes vitales.

Métodos:

En el estudio se incluyeron treinta pacientes (aproximadamente 15 hombres adultos y 15 mujeres adultas), de 40 años en adelante, con un diagnóstico clínico de artrosis de la o las rodillas y se verificó el dolor de la rodilla durante al menos 15 días en el mes anterior a la prueba. Los pacientes reciben una cantidad terapéuticamente eficaz de antagonistas del GM-CSF o un placebo (por ejemplo, una vez cada dos semanas durante aproximadamente seis meses).

En el estudio se utilizan el índice de Western Ontario and McMasterUniversitiesOsteoarthritis (WOMAC; Bellamy et al, J Rheumatol 15(12):1833-40, 1988) y las escalas del Instrumento de Calidad de Vida SF-36v2 (QualityMetricHealthOutcomesSolutions, Lincoln, RI). El WOMAC es un instrumento autoadministrado de la medida del estado de salud, específico de la enfermedad. Examina síntomas clínicamente importantes en las áreas de dolor, rigidez y función física en pacientes con artrosis de cadera y/o rodilla. El índice consta de 24 preguntas (5-dolor, 2-rigidez y 17-función física) y se puede completar en menos de 5 minutos. El WOMAC es un instrumento válido, confiable y sensible para la detección de cambios clínicamente importantes en el estado de salud después de una variedad de intervenciones (farmacológicas, nutricionales, quirúrgicas, fisioterapia, etc.). El cuestionario WOMAC es válido para evaluar los efectos de la intervención en la artrosis de cadera o rodilla. El instrumento de Calidad de vida SF-36v2 es una encuesta de salud de formato corto y multipropósito con 36 preguntas. Proporciona un perfil de 8 escalas de puntuaciones de salud funcional y bienestar, así como medidas resumidas de salud física y mental con base psicométrica y un índice de utilidad de salud basado en preferencias. Es una medida genérica, a diferencia de una que se dirige a una edad, enfermedad o grupo de tratamiento específicos. En consecuencia, el SF-36v2 ha demostrado ser útil en encuestas de poblaciones generales y específicas, comparando la carga relativa de enfermedades y diferenciando los beneficios para la salud producidos por una amplia gama de tratamientos diferentes. El SF-36v2 proporciona información sobre los siguientes aspectos y subconjuntos de la salud; Salud Física (compuesta de funcionamiento físico, rol físico, dolor corporal y salud general) y Salud Mental (compuesta de vitalidad, funcionamiento social, rol emocional y salud mental).

Resultados:

Cambio en el dolor corporal: la mejora en el dolor corporal de la escala SF-36v2 es estadísticamente significativa en pacientes tratados con los antagonistas del GM-CSF de la presente invención en comparación con placebo. Una puntuación más alta es mejor porque significa que el paciente siente menos dolor después de tomar el producto. Existe una mejora estadísticamente significativa en la puntuación de dolor corporal en el grupo que recibió los antagonistas del GM-CSF de la presente invención frente al grupo de placebo.

Cambio en la puntuación del rol físico: el efecto superior de los antagonistas del GM-CSF de la presente invención en comparación con el placebo es estadísticamente significativo en la semana 8, semana 12 y semana 20 en términos de limitaciones de rol debido a la salud física (rol físico). Una puntuación más alta es mejor porque significa que el paciente notó una mejoría física y una reducción de las limitaciones sufridas en las actividades de la vida diaria. Existe una mejora estadísticamente significativa en la puntuación del rol físico en el grupo que recibió los antagonistas del GM-CSF de la presente invención frente al grupo de placebo.

Cambio en la puntuación total del WOMAC: La puntuación total del WOMAC del grupo tratado con los antagonistas del GM-CSF de la presente invención es estadísticamente significativamente mejor que la puntuación total del WOMAC del grupo placebo (una puntuación más baja es mejor).

Cambio en las AVD del WOMAC: La mejora en las actividades de la vida diaria (medida como una subpuntuación de las AVD del WOMAC) es mayor en el grupo tratado con los antagonistas del GM-CSF de la presente invención que

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un antagonista del GM-CSF para usar en el tratamiento de la artrosis, en donde el antagonista es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF.

2. Un antagonista para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

3. Un antagonista para usar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

4. Una composición que comprende un antagonista del GM-CSF como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para usar en el tratamiento de la artrosis, en donde el antagonista es un anticuerpo específico del receptor del GM-CSF y en donde además dicha composición comprende además uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.