JP2005507915A - 変形性関節症の処置方法およびその組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の背景
関節炎は、身体の関節構造(関節)の一般的炎症として定義される。慢性関節リウマチは関節炎疾患のサブセットであり、自己免疫機構および/またはウイルス感染症により誘発され得る慢性全身疾患であり、滑膜および関節構造の炎症を伴う。通常それは事実上多関節性である。一般的関節炎および慢性関節リウマチとは対照的に、変形性関節症(OA)の病状は、事実上非炎症性であり、関節における関節軟骨の一般的加齢分解を特徴とする、複雑な多因性進行性疾患である。OAはまた、細胞増殖およびアポトーシスに至る軟骨細胞活性化、プロテアーゼ発現および異常なマトリックス生産を特徴とし、軟骨を修復し得ないことから、細胞外マトリックスの喪失、マトリックスカルシウム沈着および骨増殖体形成を誘発する。軟骨および細胞外マトリックス構造の分解により、冒された関節の骨および神経間の摩擦が増加する。OAは、この病気に冒された関節において様々なレベルの疼痛および進行性衰弱を誘発する。OAについての現行療法は緩和的または外科的なものである。
【0002】
OAで見られる分解プロセスの開始に関与する特異的分子経路は解明されていないが、軟骨喪失に至る中心的機序は、関節軟骨細胞により製造されるコラーゲン分解性酵素アグリカナーゼ−1(AGG−1)、アグリカナーゼ−II(AGG−2)およびコラゲナーゼ−3(COL−3)によるII型コラーゲンおよびアグリカンの酵素分解であると仮定されている。COL−3は、II型コラーゲンおよびアグリカンについて最も有効なコラゲナーゼであると思われ、開裂は、主にAGG−1およびAGG−2開裂部位で行なわれ、OAにおける特異的アグリカナーゼの役割およびこれらの酵素の誘導に至る機序はまだ決定されていない。
【0003】
軟骨細胞におけるマトリックス分解性金属プロテイナーゼ、COL−3の発現および生成は、血小板由来増殖因子(PDGF)により促進され得る。プロテインキナーゼB(PKB)は、増殖因子、サイトカイン類および細胞ストレス条件により活性化されるプロト‐オンコジーンである。PDGFは、PKBおよび同じくPKBの上流アクチベーターであるホスホ‐イノシチド3キナーゼ(PI3K)の強力なアクチベーターである。しかしながら、PDGFがマトリックスメタロプロテイナーゼを活性化する機序およびPI3K、PKBおよびOA間の関係は解明されていない。
【0004】
我々は、驚くべきことに、サイトカイン類、例えばインターロイキン−1(IL−1)およびオンコスタチンM(OSM)に加えて、PI3KおよびPKBが、OAに伴う軟骨喪失においてある一定の役割を演じることを発見した。IL−1、OSMおよびPDGFは、PI3KおよびPKB経路を介してメタロプロテイナーゼ遺伝子発現を顕著にアップレギュレーションすることが示されている。すなわち、本発明は、IL−1、OSM、PI3Kおよび/またはPKBのモジュレーターおよび阻害剤を用いることにより、PI3K/PKBシグナリング経路の活性化を低減化し、次いでAGG−1およびCOL−3遺伝子発現の誘導を低減化することを意図するものである。OAの病因におけるAGG−1およびCOL−3の破壊的役割を仮定すれば、PI3K、PKB、IL−1およびOSMおよびそれらのイソ型は、OAまたはAGG−1またはCOL−3のレベルの変化に伴う疾患についての新規薬剤標的として使用され得る。本発明はまた、PI3K、PKB、IL−1およびOSM誘導AGG−1およびCOL−3活性のモジュレーターおよび阻害剤の同定およびまたPI3K、PKB、IL−1およびOSM遺伝子発現のモジュレーターの同定方法および対象におけるOAの処置および/または予防についての上記モジュレーターの使用法を提供する。本発明はまた、モジュレーターの医薬組成物および上記医薬組成物についての使用法を提供する。
【0005】
発明の要約
本発明は、インビトロおよびインビボでPI3K、PKB、IL−1およびOSMがAGG−1およびCOL−3 mRNAの誘導の増加をまねくという本発明者らの新規発見に基いている。本発明者らは、初めてPI3K、PKB、IL−1およびOSMに起因するAGG−1およびCOL−3 mRNA誘導の増加についての証拠をもたらした。この発見は、PI3KおよびPKB阻害剤、LY294002、およびPKBの阻害性優位突然変異形態の使用により示されている。PI3KおよびPKBアクチベーターPDGFによる、ヒト関節軟骨細胞におけるAGG−1およびCOL−3 mRNA活性化のレベルは、LY294002およびPKBの優位阻害性突然変異体の存在下で低減化された。さらに、IL−1およびOSMは両方とも、PDGFの場合よりも高いレベルのAGG−1およびCOL−3 mRNA誘導をもたらした。このIL−1およびOSM「超誘導」により、非IL−1およびOSM誘導軟骨細胞の場合と比べAGG−1およびCOL−3 mRNAのレベルが増加する結果となった。さらに、LY294001および優位阻害性突然変異体の存在下でさえ、弱いレベルにではあるが、超誘導が維持される。すなわち、本発明者らは、PI3K、PKB、IL−1およびOSMのモジュレーターまたは阻害剤が、AGG−1およびCOL−3発現および生成の低減化によるOAの処置に有用であり得ることを示している。OAの病因におけるAGG−1およびCOL−3の破壊的役割を仮定すれば、PI3K、PKB、IL−1およびOSMおよびそれらのイソ型は、OAに関する新規薬剤標的として使用され得る。すなわち、本発明では、PI3K、PKB、IL−1およびOSMおよびそれらのイソ型が、PI3KおよびPKB活性化およびIL−1およびOSM誘導PI3KおよびPKB活性化によるAGG−1およびCOL−3の誘導を伴うことが以前には知られていなかった病的状態であるOAを処置、予防または改善するための治療薬の開発についての有用な薬剤標的であると考えられる。
【0006】
すなわち、一態様において本発明は、変形性関節症の処置、予防または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補化合物が、PI3Kおよび/またはPKBの酵素活性を改変または阻害するかまたはインビトロまたはインビボでPI3K、PKB、IL−1および/またはOSM遺伝子発現を改変または阻害し、それによって軟骨細胞におけるAGG−1またはCOL−3製造の遺伝子発現をダウンレギュレーションし得るか否かを試験することを含む方法を提供するもので、AGG−1またはCOL−3タンパク質発現の改変は、化合物が潜在的治療価値を有し得ることを示している。
【0007】
一実施態様において、本発明は、AGG−1またはCOL−3レベルの変化に伴うかまたはそれにより誘発される疾患の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【0008】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法に関するものである。
【0009】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが対象においてPI3KおよびPKBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する方法に関するものである。
【0010】
別の実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが対象においてPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する方法に関するものである。
【0011】
既知PI3Kおよび/またはPKB阻害剤は、本明細書でLY−290042(2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オンとしても知られている)(Vlahos,CJ et al. J.Biol.Chem.(1994)269:7 5241−5248)と称する、シグマ‐アルドリッチ(セントルイス、ミズーリ)から市販されている化合物を含む。AGG−1およびCOL−3のレベルの低下として観察される驚くべき良好な結果に基づくと、この化合物を含む医薬組成物が、PI3Kおよび/またはPKBを阻害し、この阻害を通じて軟骨細胞でAGG−1およびCOL−3 mRNAおよびタンパク質レベルを低下させるのに使用され得ることから、処置等を必要とする対象におけるOAの処置、予防または改善に有用であり得ると本発明では考えられる。
【0012】
PI3Kおよび/またはPKB阻害剤、LY249002 2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オンが、AGG−1またはコラゲナーゼ−3の発現を改変させるという発見は、新規であり、本発明の重要な態様を構成する。したがって、一実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3KまたはPKBを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含み、上記PI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターがLY249002 2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である方法に関するものである。
【0013】
本発明の別の態様は、PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項2記載の方法に関するものである。
【0014】
本発明のさらに別の態様は、アグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気を処置するための医薬の製造を目的とするホスホ‐イノシチド3キナーゼまたはプロテインキナーゼBを調節し得る化合物の使用に関するものである。好ましい実施態様では、化合物は、ホスホ‐イノシチド3キナーゼまたはプロテインキナーゼBを阻害し得る。別の好ましい実施態様では、病気は変形性関節症である。特に好ましい実施態様では、ホスホ‐イノシチド3キナーゼまたはプロテインキナーゼBを阻害し得る化合物は、2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)である。
【0015】
本発明の興味深い実施態様は、ヒトPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3ポリペプチドまたはヒトPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3ポリペプチドの一部分について高度選択的である抗体を含む医薬組成物に関するものである。これらのタンパク質に対する抗体は、対象においてこれらのタンパク質の凝集を誘発することから、酵素の活性を低減化させ得る。上記抗体はまた、例えば活性部位と直接相互作用することにより、または活性部位への基質の接近を遮断することにより酵素活性を減少させ得る。PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3抗体はまた、これらのタンパク質の調節またはPI3K/PKB経路に関与し、酵素活性に必要であり得るタンパク質‐タンパク質相互作用を阻止することにより、これらのタンパク質の酵素活性を阻害するのに使用され得る。阻害活性を伴う抗体、例えば本明細書記載の抗体は、当業者によく知られた標準的検定法にしたがって製造および同定され得る。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3KまたはPKBを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法で、上記PI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターが、PI3KまたはPKBに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含むものであり、上記抗体またはそのフラグメントがPI3KまたはPKBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【0016】
本発明はまた、医薬組成物を用いてPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、すなわち対象において発現されるAGG−1またはCOL−3のレベルを修飾することにより対象において変形性関節症を予防または処置する方法を提供する。したがって、本発明の一態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関するものである。
【0017】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、対象においてPI3KおよびPKBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する方法に関するものである。
【0018】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、対象においてPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する方法に関するものである。
【0019】
別の実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3KまたはPKBを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記PI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターが、LY249002 2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である方法に関するものである。
【0020】
本発明の追加的実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にPI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、PI3KまたはPKBに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがPI3KおよびPKBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【0021】
本発明はまた、PI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変するモジュレーターをスクリーニングまたは同定する方法を提供する。すなわち、上記モジュレーターは、変形性関節症の予防、処置または改善に有用である。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変するその能力について検定することを含む方法に関するものである。
【0022】
慣用的スクリーニング検定法(インビトロおよびインビボの両方)は、PI3K、PKB、IL−1またはOSMタンパク質活性および/またはmRNA発現を阻害する化合物の同定に使用され得る。タンパク質活性レベルは、慣用的酵素活性検定方法を用いて対象から採取した生物学的試料、例えば軟骨細胞ライゼートを用いて対象で検定され得る。遺伝子発現はまた、当業者によく知られた方法、例えば慣用的ノーザン分析または市販のガラスチップマイクロアレイを用いて測定され得る。タンパク質レベルは、本明細書記載の方法により、または公知方法、例えばイムノアッセイおよび電気泳動検定法により生物学的試料から測定され得る。
【0023】
本明細書に開示された方法による分析用の候補化合物には、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSM阻害活性を有することが知られている化学的化合物並びにいかなるレベルにせよこれらのタンパク質に対する効果がまた特性確認されていない化合物が含まれる。本発明では、必ずしも特異的阻害活性をもつ化合物だけではなく、PI3K、PKB、IL−1またはOSM阻害活性をもつ化合物であれば有用な治療薬であることが証明され得ると考えられる。
【0024】
当業者であれば、PI3K、PKB、IL−1またはOSMに対する効果をもつ化合物の場所をつきとめるスクリーニング検定法が、当業者によく知られた技術を含み得ること、例えばインビトロ酵素活性検定法が慣用的方法を用いて使用され得ることを容易に理解できるはずである。さらに、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSMの試験化合物の阻害効果およびそれによるAGG−1および/またはCOL−3レベルの改変は、AGG−1および/またはCOL−3を検出するためのELISA抗体ベース検定法または蛍光標識反応検定法により検出され得る。これらの技術は、高スループットスクリーニングに容易に利用され得、当業者にも熟知されている。
【0025】
スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターは、インビトロまたはインビボでの変形性関節症の動物モデルにおいてそれらの効果についてさらに確認され得、また同定されたモジュレーターがOAの動物モデルおよび/またはOA罹患対象による臨床試験において観察される病理学的影響を除去するその能力についてもさらに検定され得る。したがって、本発明の一態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、さらに同定されたPI3K、PKB、IL−1またはOSM阻害性モジュレーターが変形性関節症の動物モデルで観察される病理学的影響を除去するその能力について検定することを含む方法に関するものである。
【0026】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記モジュレーターがPI3KおよびPKBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する方法に関するものである。
【0027】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記モジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する方法に関するものである。
【0028】
また本発明によると、上記スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターは、活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の臨床試験でそれらの効果についてさらに確認され得るものとする。したがって、本発明のさらなる態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、さらに同定された阻害性モジュレーターが変形性関節症に罹患した対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力について検定することを含む方法に関するものである。
【0029】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている方法に関するものである。
【0030】
別の実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害によってAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1またはOSMに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがPI3KおよびPKBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【0031】
本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。
【0032】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターがPI3KおよびPKBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する医薬組成物を提供する。
【0033】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻止する医薬組成物を提供する。
【0034】
本発明の一実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターが、LY249002 2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である医薬組成物に関するものである。
【0035】
本発明の別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含む医薬(組成物)であって、上記モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている医薬(組成物)に関するものである。
【0036】
本発明のさらに別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1またはOSMに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントが、PI3KおよびPKBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る医薬組成物に関するものである。
【0037】
本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体はまた、診断目的に使用され得る。例えば、慣用的方法にしたがって上記抗体を用いることにより、対象におけるPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のレベルが定量され得る。レベルの増加はOAの重さの度合を示す。すなわち、様々なタンパク質レベルは、OAの様々な臨床形態または重症度を示している。上記情報はまた、本発明モジュレーターによる処置に応答し得るかまたは応答し得ない関節炎を経験している患者のサブセットを同定するのに有用である。同様に、本発明では、対象におけるPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のメッセージレベルの定量は、診断および適切なOA治療の決定に有用であると考えられる。適切な対照個体と比べてPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のmRNAレベルが高い対象は、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSM阻害剤による処置についての適切な候補であるとみなされる。
【0038】
本発明によると、本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を診断目的に使用することが可能となる。したがって、一実施態様において、本発明は、PI3K、PKB、IL−1またはOSMモジュレーターによる処置についての適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてPI3K、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3のα、β、γおよびδイソ型の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAレベルを検定することを含む方法で、非変形性関節症対照レベルと比べてPI3K、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のレベルが変化、例えば増加または減少した対象が、PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーター処置に適切な候補である方法に関するものである。上記診断方法は、活動性または発生期変形性関節症対象を、上記PI3K、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のレベルが非変形性関節症対照生物学的試料で観察されるレベルと比べて変化した対象として同定するものと意図され得る。
【0039】
本発明の別の態様は、発生期または活動性OAについて診断される対象におけるPI3Kのα、β、γおよびδイソ型の割合の検出を意図し、それを実現させるものである。例えば、PI3Kイソ型α、β、γおよびδに対する抗体は、対象におけるα、β、γおよびδイソ型の割合の検出に使用され得る。これらのイソ型の相互割合は、表6〜10で示されている通り、正常な軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合と比べて変形性関節症軟骨細胞では特有な形で変化している。関節軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合と活動性または発生期OA罹患患者で見られるレベルの割合との比較は、臨床試験手順の一部としてPI3KおよびPI3Kイソ型、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3レベルをモニターするために、例えば所定の治療プログラムの効力を測定するかまたは変形性関節症疾患の診断を補助するのに使用され得る。興味深いことに、軟骨細胞は、本明細書に記載されている変形関節症の関節から得られ、PI3K発現の誘導物質であるPDGFの存在下で培養され得る。次いで、PI3Kのα、β、γおよびδイソ型の検出は、例えばウエスタン・ブロッティング検出法を用いるかまたはイソ型に対する蛍光標識抗体を用いて遂行され得る。
【0040】
別の態様において、本発明は、同定された阻害性物質が、一般的当業者によく知られている、OAの動物モデルおよび/またはOA罹患対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力を評価し得る検定法を提供する。例えば、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSMの阻害剤がOAにおける治療効力について試験され得る一動物モデルは、試験される動物が変形性関節症病変を自然発症することが知られている自然発症OAモデルである。変形性関節症の自然発症動物モデルの一例は、STR/ortマウスモデルに見出される。Mason,R.M.,et al.、“The STR/ort mouse and its Use as a Model of Osteoarthritis”(STR/ortマウスおよび変形性関節症モデルとしてのその使用)、Osteoarthritis and Cartilage(2001)9:85−91。変形性関節症の自然発症の追加的一例は、ダンキン・ハートレイモルモットに見出される。変形性関節症の自然発症動物モデルに関するダンキン・ハートレイモルモットの使用については、Jimenez,P.A. et al.、“Spontaneous Osteoarthritis in Dunkin Hartley guinea pigs:Histologic,Radiologic and Biochemical Changes”(ダンキン・ハートレイモルモットにおける自然発症変形性関節症:組織学的、放射線学的および生化学的変化)、Lab.Anim.Sci.(1997)27:134−142に記載されている。
【0041】
二重盲検プラセボまたは活性コンパレーター制御臨床試験はまた、本発明の阻害剤スクリーンにより発見された阻害剤の変形性関節症患者における効果を試験するように設計され得る。
【0042】
発明の詳細な説明
略語
PI3K、ホスホイノシチド3−キナーゼ;
PKB、プロテインキナーゼB;
IL−1、インターロイキン−1;
TNF、腫瘍壊死因子;
OA、変形性関節症;
RA、慢性関節リウマチ;
AGG−1、アグリカナーゼ−1;
COL−3、コラゲナーゼ−3;
PDGF、血小板由来増殖因子;
MMP、マトリックスメタロプロテイナーゼ;
OSM、オンコスタチンM;
GAPDH、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ;
ADAMTS、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ;
FKHR、横紋筋肉腫;
PCR、ポリメラーゼ連鎖反応;
RT−PCR、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応;
【0043】
定義
本明細書に記載されている本発明では、記載された方法、プロトコールおよび試薬は、変わり得るため、特定のものに限定されないものとする。また、本明細書で使用されている用語は、実施態様を説明することのみを目的としており、いかなる意味にせよ本発明の範囲を限定するものではないことは明らかである。
【0044】
特記しない場合、本明細書で使用されている技術および科学用語は全て、この発明が属する技術分野での当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載されているものと類似しているかまたはそれに匹敵する方法および材料でも本発明の実践または試験で使用され得るが、好ましい方法、装置および材料はここに記載されているものである。本明細書で挙げられている出版物は全て、本発明に関して使用され得る出版物に報告されている材料および方法を記載および開示する目的のために出典明示により援用する。
【0045】
本発明を実践する際には、分子生物学、微生物学および組換えDNAにおける多くの慣用的技術が使用される。これらの技術は公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、第1、2および3巻、1997(F.M.Ausubel編)、Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク;DNA Cloning:A Practical Approach、第1および2巻、1985(D.N.Glover編);Oligonucleotide Synthesis、1984(M.L.Gait編);Nucleic Acid Hybridization、1985(HamesおよびHiggins);Transription and Translation、1984(HamesおよびHiggins編);Animal Cell Culture、1986(R.I.Freshney編);Immobilized Cells and Enzymes、1986(IRLプレス);Perbal、1984、A Practical Guide to Molecular Cloning;シリーズ、Methods in Enzymology(アカデミック・プレス、インコーポレイテッド);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells、1987(J.H.MillerおよびM.P.Calos編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー);およびMethods in Enzymology 第154巻および第155巻(それぞれWuおよびGrossman、およびWu編)に説明されている。
【0046】
請求の範囲を含め、本明細書の英文テキストで使用されている単数形の冠詞「a」、「an」および「the」は、文脈上、他に明記されていない場合、複数形を包含する。すなわち、例えば「抗体(antibody)」といえば、1個またはそれ以上の抗体および当業者に公知のその均等内容物などを指すものとする。
【0047】
「ベクター」分子は、異種核酸が挿入され得る核酸分子であり、その後それは適切な宿主細胞へ導入され得る。ベクターは、好ましくは1個またはそれ以上の複製起点、および組換え体DNAが挿入され得る1個またはそれ以上の部位を有する。ベクターは、ベクターを伴う細胞が伴わない細胞から選択され得る好都合な手段を有することが多く、例えばそれらは薬剤耐性遺伝子をコード化する。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノムおよび(主に酵母および細菌で)「人工染色体」がある。
【0048】
物質がPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3を「調節する」能力には、限定されるわけではないが、物質がこれらのタンパク質の酵素活性を阻害および/またはこれらのタンパク質の遺伝子発現を阻害する能力が含まれる。また、上記調節によると、他のタンパク質がこれらのタンパク質、例えば関連調節タンパク質またはPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3により修飾されるタンパク質と相互作用する能力がもたらされ得る。PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3の「モジュレーター」は、特にこれらのタンパク質または例えば関連調節タンパク質に対するこれらの効果を有し得る物質をいう。
【0049】
同様に、本明細書で使用されている「アンタゴニスト」または「阻害剤」の語は、PI3K、PKB、IL−1またはOSMに結合したとき、これらのタンパク質の生物活性を遮断または調節することにより、軟骨または軟骨細胞においてAGG−1およびCOL−3をダウンレギュレーションする分子をいう。アンタゴニストおよび阻害剤は、タンパク質、核酸、炭水化物またはこれらのポリペプチドに結合する天然または合成的な他のあらゆる分子を含み得る。
【0050】
本明細書で使用されている「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは一部分、並びに一本または二本鎖であり、センスまたはアンチセンス鎖を表し得るゲノムまたは合成に基くDNAまたはRNAをいう。
【0051】
本明細書で使用されている「アンチセンス」の語は、特異的DNAまたはRNA配列と相補的であるヌクレオチド配列をいう。「アンチセンス鎖」の語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して使用される。アンチセンス分子は、興味の対象である遺伝子(複数も可)を逆配向で相補鎖を合成させ得るウイルスプロモーターにライゲーションすることによる合成を含む任意の方法により生成され得る。一旦細胞へ導入されると、この転写された鎖は、細胞により生成された天然配列を合わせてデュプレックスを形成する。次いで、これらのデュプレックスは、さらなる転写または翻訳を遮断する。「負(の)」という表現はアンチセンス鎖に関して使用されることがあり、「正(の)」はセンス鎖に関して使用されることもある。
【0052】
本明細書で意図されているところによると、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、RNAアプタマー、リボザイムおよび二本鎖RNAは、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3の核酸配列に指向されており、それによって選択されたこれらのタンパク質のヌクレオチド配列は、これらのタンパク質の遺伝子発現の遺伝子特異的阻害をもたらす。例えば、PI3Kヌクレオチド配列の知識は、mRNAとの非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすアンチセンス分子を設計するのに使用され得る。同様に、リボザイムは、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それらを開裂するように合成され得る(Cech.J.Amer.Med Assn.260:3030(1988))。遺伝子発現のターゲッティングされた阻害で使用される上記分子の設計技術は、当業者にはよく知られている。
【0053】
「PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3」の語は、限定されるわけではないが、ヒトまたは他のいずれかの種に由来する、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3配列または上記のいずれかのフラグメントを含む変異型、部分形態、イソ型、前駆体形態、完全長ポリペプチド、融合タンパク質を含む、これらのポリペプチドのあらゆる形態全てをいう。PI3Kのイソ型には、PI3Kα、PI3Kβ、PI3KγおよびPI3Kδがある。ヒトPI3Kαの配列は、GenBank受入番号Z29090で見出され得る。ヒトPI3Kβの配列は、GenBank受入番号S67334で見出され得る。ヒトPI3Kγの配列は、GenBank受入番号X83368で見出され得る。ヒトPI3Kδの配列は、GenBank受入番号U86453で見出され得る。ネズミPKBの配列は、GenBank受入番号NM−009652で見出される。ヒトインターロイキン−1ベータの配列は、NCBI Genbank受入番号NP000567で見出され得る。ヒトオンコスタチンMの配列は、NCBI Genbank受入番号NP065391で見出され得る。ヒトAGG−1の配列は、GenBank受入番号Af148213で見出され得る。ヒトCOL−3の配列は、GenBank受入番号XM−006274で見出され得る。当業者にとっては明白なものである、これらのタンパク質のホモログ(相同体)およびヒトオルソログも、この定義に含まれるものとする。また、この語は、あらゆる種の天然に存する供給源、例えばゲノムDNAライブラリーおよび発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から単離されるか、または例えば自動ペプチド合成装置を用いた化学合成、または上記方法の組合せにより製造されるこれらのタンパク質を包含するものと考えられる。上記ポリペプチドの単離および調製手段は、当業界では十分に理解されている。
【0054】
本明細書で使用されている「試料」の語は、その最も広い意味で使用されている。対象からの生物学的試料は、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3酵素活性または遺伝子発現が検定され得る軟骨、血液、尿または他の生物学的材料を包含し得る。生物学的試料は、慣用的ガラスチップマイクロアレイ技術、例えばアフィメトリックスチップ、RT−PCRまたは他の慣用的方法を用いて遺伝子発現プロファイリング用に全RNAが精製され得る関節軟骨を含み得る。
【0055】
本明細書で使用されている「抗体」の語は、エピトープ決定基と結合し得る無傷の分子並びにそのフラグメント、例えばFa、F(ab')2、およびFvをいう。PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3ポリペプチドと結合する抗体は、免疫化抗原として興味の対象である小ペプチドを含む無傷のポリペプチドまたはフラグメントを用いて製造され得る。動物の免疫化に使用されるポリペプチドまたはペプチドは、RNAの翻訳から誘導されるかまたは化学的に合成され得、所望の場合担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。ペプチドに化学的にカップリングされる常用担体には、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンがある。次いで、カップリングされたペプチドを用いて、動物(例、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫化する。
【0056】
本明細書で使用されている「ヒト化抗体」の語は、もとの結合能を保持しながらも、ヒト抗体により緊密に類似させるためにアミノ酸が非抗原結合領域で置換された抗体分子をいう。
【0057】
「治療有効量」は、OAの病理学的影響、例えば、限定はされないが、関節痛、関節の可動性および可動域の減少、非可動性または凍結関節、関節軟骨の進行性分解、および関節強度の減少を処置および/または改善するのに十分な薬剤の量である。
【0058】
本明細書で使用されている「関連調節タンパク質」および「関連調節ポリペプチド」は、慣用的方法、例えば本明細書記載の方法を用いて当業者により同定され得るPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3の調節に関与するポリペプチドをいう。
【0059】
OAおよび「関連状態」は、限定はされないが、変形性関節症として医学的に定義可能または診断可能であるかまたは付随する合併症として医学的に同定可能な病状および状態または変形性関節症疾患の誘導形態であるかまたは随伴的続発症である状態を包含する。「発生期OA」は、変形性関節症の観察可能な軽い徴候、例えば関節痛および硬直故に診断可能であり得る変形性関節症の初期段階をいう。発生期OAはまた、無症候性であるが、例えば変性関節間隙狭小化の証拠を示すx線などの手段、PI3Kおよび/またはそのイソ型のレベルの改変および/または増加についての関節軟骨細胞の生化学的検定法、およびAGG−1および/またはCOL−3レベルの改変および/または増加についての関節軟骨細胞の生化学的検定法により診断可能であることを特徴とし得る。「活動性OA」は、症候性であり、医学的に診断可能または医師により変形性関節症として明確に診断される関節炎疾患をいう。変形性関節症疾患は、発生期または活動性変形性関節症により誘発される状態または病状をいう。
【0060】
「対象」および/または「患者」は、ヒトまたはヒト以外の生物体を全て包含する。
本明細書で使用されている「形質転換ベクター」は、転位因子技術を用いて生物体のゲノムにおける一片のDNAの組込みを仲介するものをいい、当業者にはよく知られている。
【0061】
本明細書で使用されている「候補化合物」および「化合物」の語は、PI3K、PKB、IL−1またはOSMに結合したときPI3KまたはPKBの生物活性を遮断または調節し、その結果AGG−1および/またはCOL−3をダウンレギュレーションする分子をいう。候補化合物および化合物は、上記ポリペプチドに結合する天然または合成のタンパク質、核酸、炭水化物、または他の分子を含み得る。
【0062】
発明の記載
マトリックス分解酵素AGG−1およびCOL−3のレベルは、正常軟骨に対し変形性関節症軟骨では高くなっている。これらのAGG−1およびCOL−3プロテアーゼのレベルの変化は、変形性関節症の発病および進行の誘因であり得る。
【0063】
本発明は、IL−1およびOSMが、新しい独特な作用機序を通してOAを処置、予防または改善するための新規治療薬の開発に適切な標的であるという発見に関するものである。特に、本出願者らは、驚くべきことに、インビトロまたはインビボでIL−1およびOSMの酵素活性または遺伝子発現を改変、阻害または調節することにより、PI3Kおよび/またはPKB活性化AGG−1および/またはCOL−3遺伝子および/またはタンパク質発現および/または分泌のダウンレギュレーションが誘導されるということを発見した。マトリックス分解酵素AGG−1およびCOL−3のレベル増加は、OAに関係している。したがって、IL−1およびOSMの阻害剤は、AGG−1およびCOL−3生産のIL−1およびOSM介在PI3Kおよび/またはPKB活性化の新たに解明された介在機構によるOAの処置に有用な化合物として機能する。
【0064】
本発明は、PI3K、PKB、IL−1およびOSM活性化により、AGG−1およびCOL−3の発現および/または生産が誘導されるという発見に基いている。OAの病因におけるAGG−1およびCOL−3の破壊的役割を考慮すれば、PI3KおよびPKBおよびそのイソ型は、OAに関する新規薬剤標的として使用され得る。すなわち、本発明では、PI3KおよびPKBは、PI3K、PKB、IL−1およびOSM活性化によるAGG−1およびCOL−3の活性化を伴うことが以前には知られていなかった病的状態である、OAを処置、予防または改善するための治療薬の開発に有用な薬剤標的であると考えられる。
【0065】
一実施態様において、本発明は、AGG−1またはCOL−3のレベルの改変に伴うかまたはそれにより誘発される疾患の予防、処置または改善方法を提供する。この実施態様は、AGG−1および/またはCOL−3のレベルの増加に伴う疾患に罹患した可能性がある対象または患者に、PI3K、PKB、IL−1またはOSM遺伝子および/またはタンパク質を調節し、例えば限定されるわけではないがこれらの物質の関節レベルを増加または減少させ、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3の遺伝子および/またはタンパク質発現および/または分泌を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む。上記の投与されるPI3K、PKB、IL−1および/またはOSM調節性化合物については、AGG−1および/またはCOL−3遺伝子および/またはタンパク質のレベルを低減化し、対象または患者における関連した病的状態の改善を導くことを意図している。意図された病状の改善は、例えば、限定されるわけではないが、罹患身体組織におけるAGG−1および/またはCOL−3遺伝子および/またはタンパク質レベルを測定する検定法による生化学的検出を含む方法または病気の徴候の主観的改善により立証され得る。
【0066】
AGG−1および/またはCOL−3のレベル増加は、OAと相互に関連している。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSM遺伝子および/またはタンパク質を調節し、例えば限定されるわけではないが、これらの物質の関節レベルを増加または減少させ、そしてその調節を通じてAGG−1またはCOL−3の遺伝子および/またはタンパク質発現および/または分泌を改変させ得る化合物の有効量を投与することによる方法に関するものである。この実施態様は、活動性または発生期OAに罹患した可能性のある対象または患者に、PI3K、PKB、IL−1またはOSMを調節し、その調節を通じてAGG−1またはCOL−3のレベルを改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む。上記の投与されるPI3K、PKB、IL−1および/またはOSM調節性化合物については、AGG−1および/またはCOL−3遺伝子および/またはタンパク質のレベルを低減化し、対象または患者におけるOAの改善を導くことを意図している。OAの改善は、例えば、限定されるわけではないが、関節軟骨細胞におけるAGG−1および/またはCOL−3レベルを測定する検定法による生化学的検出を含む方法またはOAの徴候の主観的改善により立証され得る。
【0067】
OAの予防、処置または改善はまた、PI3Kおよび/またはPKBの酵素活性を低減化または阻害することを特異的に意図されたPI3K、PKB、IL−1および/またはOSMモジュレーターの投与を通じてAGG−1および/またはCOL−3レベルを低減化することにより達成され得るとも考えられる。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、発生期または活動性OAに罹患した対象に、PI3KまたはPKB酵素活性を阻害し得る化合物の有効量を投与する方法に関するものである。さらにPI3Kおよび/またはPKB酵素活性の阻害は、AGG−1またはCOL−3の遺伝子発現またはタンパク質レベルを低下させることにより、罹患個体においてOAの改善を導くことを目的とする。上記処置を施された対象における発生期または活動性OAの改善は、関節軟骨細胞におけるAGG−1および/またはCOL−3レベルを測定する検定法またはOAの徴候における主観的改善によりモニターされ得る。
【0068】
別の興味深い実施態様において、本発明は、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3の遺伝子および/またはタンパク質発現を阻害することによる変形性関節症の予防、処置または改善方法に関するものである。この方法は、発生期または活動性変形性関節症に罹患した対象に、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3の遺伝子またはタンパク質のいずれかの阻害を目的とするPI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターである化合物の有効量を投与することを含む。したがって、この実施態様におけるPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターおよび/またはOSMモジュレーターの効果は、本発明で確認された罹患経路と相関関係を示す4タンパク質、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3のいずれかまたは全ての遺伝子および/またはタンパク質発現を阻害し得ることであると考えられる。
【0069】
PI3Kおよび/またはPKB阻害剤がAGG−1またはCOL−3の発現を改変するという発見は新規であり、本発明の重要な態様を構成する。公知PI3Kおよび/またはPKB阻害剤は、本明細書でLY290042(2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オンとしても知られている)(Vlahos,CJ et al. J.Biol.Chem.(1994)269:7 5241−5248)と称され、シグマ‐アルドリッチ(セントルイス、ミズーリ)から市販されている化合物を含む。AGG−1およびCOL−3のレベルの低下として観察される、驚くべき良好な結果に基づくと、本発明では、この化合物の遊離または医薬上許容される塩類を含む医薬組成物を用いることにより、PI3Kおよび/またはPKBを阻害し、この阻害を通じて軟骨および/または軟骨細胞におけるAGG−1およびCOL−3 mRNA遺伝子および/またはタンパク質レベルを低減化させ得ると考えられる。したがって、LY294002塩基またはその塩類は、PI3Kおよび/またはPKBの阻害およびそれに応じた罹患身体組織におけるAGG−1および/またはCOL−3レベルの低減化により対象においてOAを処置、予防または改善するのに有用である。
【0070】
PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3の遺伝子発現の調節は、対象においてこれらの物質のレベルに相応じて影響を及ぼす。したがって、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSMの遺伝子発現の調節に指向されたある種の生物学的ツールはまた、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3の遺伝子発現を阻害し得ると考えられる。遺伝子発現を阻害する上記生物学的ツールは、OAの処置に有用である。したがって、本発明の別の興味深い態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAのいずれか1種またはそれ以上を含むPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーター、OSMモジュレーターを使用し、その場合これらの物質は、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害し、発生期または活動性OAに罹患した対象に有益なものとなるように設計されている。
【0071】
PI3K、PKB、IL−1および/またはOSMまたは関連調節タンパク質に対する適切な抗体は、1種またはそれ以上の差次的発現遺伝子エピトープを特異的に認識し得る。上記抗体には、限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより生成されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれ得る。
【0072】
本明細書で検討されているポリペプチドに対する抗体を製造するため、様々な宿主動物がポリペプチドまたはその一部分の注射により免疫化され得る。上記宿主動物には、限定されるわけではないが、少し例を挙げれば、ウサギ、マウスおよびラットが含まれ得る。宿主の種によって、免疫応答を高めるために様々なアジュバントが使用され得、例えば、限定されるわけではないが、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油性エマルジョン類、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG(カルメッテ‐グエリン(Calmette‐Guerin)菌)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)が挙げられ得る。
【0073】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を製造するため、宿主動物、例えば上記のものは、同じく上記のアジュバントを補ったポリペプチドまたはその一部の注射により免疫化され得る。
【0074】
特定抗原に対する抗体の均一集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインにより抗体分子を製造させる技術により得られる。これらの例としては、限定されるわけではないが、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技術(1975、Nature 256:495−497;および米国特許第4376110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.、1983、Immunology Today 4:72;Cole et al.、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026−2030)、およびEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al.、1985、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77−96頁)がある。上記抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサブクラスを含むいずれかの免疫グロブリンクラスに属し得る。この発明のmAbを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。インビボで高力価のmAbが生産されるため、これは現時点では好ましい製造方法である。
【0075】
さらに、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」を製造するために開発された技術(Morrison et al.、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、81:6851−6855;Neuberger et al.、1984、Nature、312:604−608;Takeda et al.、1985、Nature、314:452−454)が使用され得る。キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種から誘導された分子で、例えばネズミmAbから誘導された可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン定常域を有するものがある。
【0076】
別法として、1本鎖抗体の製造について報告された技術(米国特許第4946778号;Bird、1988、Science 242:423−426;Huston et al.、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;およびWard et al.、1989、Nature 334:544−546)は、差次的発現遺伝子−1本鎖抗体の製造に適合化され得る。1本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重および軽鎖フラグメントを結合して1本鎖ポリペプチドを生成することにより形成される。
【0077】
非常に好ましくは、「ヒト化抗体」の製造に有用な技術は、本明細書に開示されたポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的均等内容物に対する抗体の製造に適合化され得る。上記技術は、米国特許第5932448、5693762、5693761、5585089、5530101、5910771、5569825、5625126、5633425、5789650、5545580、5661016および5770429号に開示されており、これらは全て出典明示により援用する。
【0078】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、限定されるわけではないが、抗体分子のペプシン消化により生成され得るF(ab')2フラグメントおよびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成され得るFabフラグメントがある。別法として、Fab発現ライブラリーを構築することにより(Huse et al.、1989、Science、246:1275−1281)、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントが迅速かつ容易に同定され得る。
【0079】
本明細書記載の抗体の検出は、標準ELISA、FACS分析、およびインビトロまたはインビボで使用される標準イメージング技術を用いて達成され得る。検出は、抗体を検出可能物質にカップリング(すなわち、物理的結合)することにより簡易化され得る。検出可能物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、ルミネセンス物質、生物発光物質および放射性物質がある。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、(3−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがある。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンがある。適切な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンがある。ルミネセンス物質の一例にはルミノールがある。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンがあり、適切な放射性物質の例には、125I、131I、35Sまたは3Hがある。
【0080】
検出の容易さについて特に好ましいのは、サンドイッチ検定法であり、それには若干の変形が存在し、それらも全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的なフォワード検定法では、非標識抗体を固体基質に固定し、試験すべき試料を結合分子と接触させる。適切なインキュベーション期間後、十分な時間をおいて抗体−抗原二元複合体を形成させる。この時点で、検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した二次抗体を加え、インキュベーションし、十分な時間をもうけることにより、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成させる。未反応物質があれば洗い流し、シグナルの観察により抗原の存在を測定するか、または既知量の抗原を含有する対照試料と比較することにより定量し得る。フォワード検定法に関する変形には、試料および抗体の両方を同時に結合抗体に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき試料を最初に合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加えるリバース検定法がある。これらの技術は当業者にはよく知られており、小さな変形の可能性についても容易に理解されるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチ検定法」は、基本的2部位技術に関する変形も全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体がPI3K、PKB、IL−1またはOSMポリペプチドまたは関連調節タンパク質に特異的な抗体またはそのフラグメントであることである。
【0081】
このタイプの検定法で最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団または放射性核種含有分子である。酵素免疫検定法の場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により酵素を二次抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められる通り、広く多様な種々のライゲーション技術が存在し、それらは当業者に熟知されている。常用酵素としては、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。特異的酵素と共に使用される基質は、一般的に対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色の変化を生じるように選択される。例えば、p−ニトロフェニルリン酸は、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとの使用に適切である。ペルオキシダーゼコンジュゲートの場合、1,2−フェニレンジアミンまたはトルイジンが常用される。また、上記の色素原基質ではなく蛍光生成物を生じる蛍光性基質を使用することも可能である。次いで、適切な基質を含む溶液を三元複合体に加える。基質は、二次抗体に結合された酵素と反応することにより、定性的視覚的シグナルを生じ、これはさらに通常分光光度計により定量され、血清試料中に存在する興味の対象であるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量の評価を与え得る。
【0082】
別法として、蛍光性化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、結合能を変えることなく抗体に化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線で照明することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子において励起状態を誘導し、特徴的な長い波長の光線を放射する。この放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出され得る特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびEIA技術は、両方とも当業界では十分に確立されており、本発明方法には特に好ましい。しかしながら、他のリポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子もまた使用され得る。当業者にとって、要求される使用法に合わせるためにいかに手順を変えるべきかは一目瞭然のはずである。
【0083】
同様に、阻害は、「三重らせん」塩基対合方法を用いて達成され得る。三重らせん対合は、それがポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合にとって十分な程度に開裂する二重らせんの能力の阻害を誘発するために有用である。三重らせんDNAを用いた最近の治療技術の進歩については文献に記載されている(Gee,J.E.et al.(1994)Huber,B.E.およびB.I.Carr、Molecular and Immunologic Approaches、フツーラ・パブリッシング・カンパニー、マウントキスコ、ニューヨーク)。また、これらの分子は、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによりmRNAの翻訳を遮断するように設計され得る。
【0084】
リボザイム、すなわち酵素的RNA分子はまた、RNAの特異的開裂を触媒することにより遺伝子発現を阻害するのに使用され得る。リボザイム作用機序は、相補的標的RNAとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を含む。使用され得る例には、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1、COL−3またはそのアップレギュレーションに関与する様々な調節タンパク質についてのポリペプチドの遺伝子をコード化する配列のエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を特異的かつ有効に触媒するように設計され得る「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフリボザイム分子がある。
【0085】
以下の配列:GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム開裂部位について標的分子を走査することにより、潜在的RNA標的内にある特異的リボザイム開裂部位が最初に同定される。一旦同定されると、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15および20間のリボヌクレオチドの短いRNA配列が、オリゴヌクレオチドを作動不可能にし得る二次構造的特徴について評価され得る。また、候補標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護検定法を用いることにより相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性を試験することにより評価され得る。
【0086】
リボザイム方法は、リボザイムへの細胞の暴露または上記小RNAリボザイム分子の細胞における発現の誘導を含む(GrassiおよびMarini、1996、Annals of Medicine 28:499−510;Gibson、1996、Cancer and Metastasis Reviews 15:287−299)。本明細書で検討されている遺伝子の少なくとも1つに対応するmRNAにターゲッティングされたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現を用いることにより、遺伝子によりコード化されたタンパク質が阻害され得る。
【0087】
リボザイムは、リボザイム配列を組込んだRNAオリゴヌクレオチドの形態で直接細胞へ送達されるか、または所望のリボザイムRNAをコード化する発現ベクターとして細胞へ導入され得る。リボザイムは、mRNAを開裂し、それによって細胞においてmRNA存在量を修飾する上で触媒的に有効であるのに十分な量で常用手順によりインビボ発現され得る(Cotten et al.、1989、EMBO J. 8:3861−3866)。特に、慣用的公知規則に従って設計され、例えば標準ホスホルアミダイト化学作用により合成されるリボザイムコーディングDNA配列は、tRNAをコード化する遺伝子のアンチコドンステムおよびループにおける制限酵素部位へライゲーションされ得、次いでそれは当業界における常法により興味の対象である細胞へ形質転換され、そこで発現され得る。また、好ましくは誘導性プロモーター(例、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント)をこの構築物へ導入することにより、リボザイム発現は選択的に制御され得る。飽和的使用の場合、高度構成的活性プロモーターが使用され得る。tDNA遺伝子(すなわち、tRNAをコード化する遺伝子)は、サイズが小さく、転写速度が速く、異なる種類の組織で遍在的に発現されるため、この適用において有用である。
【0088】
したがって、リボザイムは、事実上いかなるmRNA配列でも開裂するように常用手順で設計され得、細胞は、制御可能で触媒的有効量のリボザイムが発現されるように上記リボザイム配列をコードするDNAにより常用手順で形質転換され得る。したがって、細胞における事実上あらゆるRNA種の存在量が修飾または摂動され得る。
【0089】
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドについて記載した方法と本質的に同じ方法で修飾され得、例えばリボザイム配列は修飾塩基部分を含み得る。
【0090】
RNAアプタマーはまた、細胞へ導入または細胞で発現されることにより、RNA存在量または活性を修飾し得る。RNAアプタマーは、タンパク質、例えばTaqおよびRev RNA(Good et al.、1997、Gene Therapy 4:45−54)に特異的なRNAリガンドであり、それらの翻訳を特異的に阻害し得る。
【0091】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた、慣用的二本鎖RNA技術を用いて達成され得る。上記技術の記載は、国際公開第99/32619号において見出され、それについては出典明示で援用する。
【0092】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんDNA、RNAアプタマーおよびリボザイムは、核酸分子の合成に関する当業界で公知の方法により製造され得る。これらの例には、オリゴヌクレオチドの化学合成、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成技術がある。別法として、RNA分子は、本明細書で検討されているポリペプチドの遺伝子をコード化するDNA配列のインビトロおよびインビボ転写により生成され得る。上記DNA配列は、適切なRNAポリメラーゼプロモーター、例えばT7またはSP6と共に広く多様なベクターへ組込まれ得る。別法として、アンチセンスRNAを構成的または誘導的に合成するcDNA構築物は、セルライン、細胞または組織へ導入され得る。
【0093】
ベクターは、多くの利用可能な手段により細胞または組織へ導入され得、インビボ、インビトロまたはエクスビボで使用され得る。エクスビボ治療の場合、ベクターは、患者から採取された幹細胞へ導入され、同じ患者へオートロガス移植として戻すためにクローン増殖され得る。トランスフェクションおよびリポソーム注入による送達は、当業界で公知の方法を用いて達成され得る。
【0094】
本発明では、OAの処置方法として、例えば、関連調節タンパク質またはPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1、COL−3により修飾されるタンパク質についての遺伝子の機能および/または発現が、慣用的方法に従って、例えば、これらのタンパク質に対する抗体を設計および/または上記タンパク質についての遺伝子に対してターゲッティングされた阻害性アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、リボザイムおよびRNAアプタマーを設計することにより阻害され得ると考えられる。また、OA処置用の上記阻害性物質を含む医薬組成物も考えられる。
【0095】
本発明の興味深い実施態様は、ヒトPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3ポリペプチドまたはヒトPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3ポリペプチドの一部分について高度選択的である抗体を含む医薬組成物に関するものである。これらのタンパク質に対する抗体は、対象においてこれらのタンパク質の凝集を誘発することにより、PI3K、PKB、AGG−1および/またはCOL−3酵素の活性を低下させ得る。上記抗体はまた、例えば、活性部位と直接相互作用することにより、または活性部位への基質の接近を遮断することにより酵素活性を減少させ得る。PI3K、PKB、IL−1および/またはOSM抗体はまた、これらのタンパク質の調節またはPI3K/PKB経路に関与し、酵素活性に必要であり得るタンパク質‐タンパク質相互作用を阻止することによりこれらのタンパク質の酵素活性を阻害するのに使用され得る。阻害活性をもつ抗体、例えば本明細書記載のものは、当業者によく知られた標準的検定法にしたがって製造および同定され得る。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、OA罹患対象に、PI3K、PKB、IL−1、および/またはOSMに対する抗体または活性抗体フラグメントの有効量を投与することによる方法に関するものである。かくして使用される抗体は、PI3KおよびPKBの酵素活性を阻害し、それに応じてAGG−1および/またはCOL−3のレベルを低下させることを意図したものである。
【0096】
本発明の医薬組成物は、核酸レベルでPI3K、PKB、IL−1および/またはOSMの発現を阻害する物質を含み得る。上記分子には、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1、COL−3または核酸または興味の対象である関連調節ポリペプチドの適切なヌクレオチド配列に指向されたリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、RNAアプタマーおよび/または二本鎖RNAが含まれる。これらは、過度の負担または実験を伴わずとも当業者により慣用的技術を用いて生成され得る。例えば、遺伝子発現の修飾(例、阻害)は、本明細書で検討されたポリペプチドをコード化する遺伝子の制御領域、すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンに対しアンチセンス分子、DNAまたはRNAを設計することにより得られる。例えば、転写開始部位、例えば開始部位から−10位と+10位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが使用され得る。それにもかかわらず、遺伝子の全領域を用いてアンチセンス分子を設計することにより、mRNAと非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすものが生成され得、上記の適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドが当業者によく知られた標準検定手順により製造および同定され得る。
【0097】
本発明はまた、PI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変するモジュレーターのスクリーニングまたは同定方法を提供する。すなわち上記モジュレーターは、変形性関節症の予防、処置または改善に有用である。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変する能力について検定することを含む方法に関するものである。
【0098】
慣用的スクリーニング検定法(インビトロおよびインビボの両方)は、PI3K、PKB、IL−1およびOSMタンパク質活性および/またはmRNA発現を阻害する化合物を同定するのに使用され得る。タンパク質活性レベルは、慣用的酵素活性検定方法を用い、対象からの生物学的試料、例えば軟骨細胞の細胞ライゼートを用いて対象において検定され得る。遺伝子発現はまた、当業者によく知られた方法、例えば慣用的ノーザン分析または市販のガラスチップマイクロアレイを用いて測定され得る。タンパク質レベルは、本明細書記載の方法または任意の公知方法、例えばイムノアッセイおよび電気泳動検定法により生物学的試料から測定され得る。
【0099】
本明細書に開示された方法による分析用の候補化合物には、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSM阻害活性を有することが知られている化学的化合物およびいかなるレベルにせよこれらのタンパク質に対するその効果がまだ特性確認されていない化合物が含まれる。本発明では、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSM阻害活性有する化合物であれば、必ずしも特異的阻害活性を有するものに限るわけではなく、有用な治療薬であると証明され得ると考えられる。
【0100】
PI3K、PKB、IL−1および/またはOSMに対する効果を有する化合物の位置を確認するスクリーニング検定法が、当業者に常用される技術を含み得、例えば、インビトロ活性検定法が慣用的方法を用いて使用され得ることは、当業者には容易に理解できるはずである。さらに、試験化合物のPI3K、PKB、IL−1および/またはOSMの阻害およびそれによるAGG−1および/またはCOL−3レベルの改変効果は、AGG−1および/またはCOL−3の検出についてのELISA抗体ベース検定法または蛍光標識反応検定法で検出され得る。これらの技術は、高スループットスクリーニングについて容易に利用され得、当業者にはよく知られている。
【0101】
モジュレーターは、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSMのレベルに対する明確な効果を有し得るが、上記モジュレーターが相応じてAGG−1および/またはCOL−3のレベルを低下させる場合でも、必ずしもPI3K、PKB、IL−1および/またはOSMを阻害するわけではない。上記モジュレーターはPI3Kイソ型の活性化状態および経路を改変し得るため、調節されたPI3Kおよび/またはPKB酵素活性または調節されたIL−1またはOSM活性がAGG−1および/またはCOL−3の刺激を誘導することはない。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なPI3Kおよび/またはPKBモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させる能力について検定することを含む方法に関するものである。
【0102】
スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターは、インビトロまたはインビボで変形性関節症の動物またはヒト臨床モデルにおけるそれらの効果についてさらに証明され得、また同定されたモジュレーターがOAの動物モデルおよび/またはOA罹患対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力についてもさらに検定され得る。したがって、本発明の一実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なスクリーニングまたは同定検定法で同定されるPI3K、PKB、IL−1および/またはOSMのさらなる試験方法であって、同定されたPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターおよび/またはOSMモジュレーターが相応じてAGG−1および/またはCOL−3遺伝子および/またはタンパク質発現に影響する能力について、動物モデルまたはOA罹患対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去するそれらの能力について検定することを含む方法に関するものである。
【0103】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変する能力を検定することを含む方法に関するものであり、この場合、上記モジュレーターは、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する。
【0104】
本発明はまた、上記スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターが、活動性または発生期変形性関節症罹患対象の臨床試験におけるそれらの効果についてさらに証明され得ることを示す。したがって、本発明の追加的態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、さらに同定された阻害性モジュレーターが変形性関節症対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去するその能力について検定することを含む方法に関するものである。
【0105】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質がPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている方法に関するものである。
【0106】
別の態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがPI3K、PKB、IL−1またはOSMを阻害し、その阻害を通じてAGG−1またはCOL−3の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記PI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1またはOSMに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがPI3KまたはPKBの酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【0107】
本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。
【0108】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含み、上記モジュレーターがPI3KおよびPKBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する医薬組成物に関するものである。
【0109】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターを含み、上記モジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する医薬組成物に関するものである。
【0110】
本発明の一実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターを含み、上記モジュレーターがLY249002 2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、医薬組成物に関するものである。
【0111】
本発明の別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含み、上記モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質がPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、医薬組成物に関するものである。
【0112】
本発明のさらに別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でPI3Kモジュレーター、PKBモジュレーター、IL−1モジュレーターまたはOSMモジュレーターを含み、上記モジュレーターが、PI3K、PKB、IL−1またはOSMに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがPI3KまたはPKBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、医薬組成物に関するものである。
【0113】
OAに罹患した個体を、伝統的な慣用的方法、例えばx線および自覚症状により診断するのは困難であり得る。OAは、病的状態の全体を通して交互の間隔で無症候であったり症候を発現し得る。さらに、発生期OAの対象は、病状が大きく悪化した段階に進行するまではほとんどの期間無症候であり得る。OAの早期発見および処置または予防は、病気の後期段階に付随する過度の身体的障害を阻止し得る。発生期または活動性OAについての生化学的試験手段は、早期検出および病気の確認を助ける。
【0114】
本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は、診断に使用され得る。例えば、慣用的方法に従って抗体を使用することにより、対象におけるPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のレベルを定量し得る。レベルの増加は、OAの重症度を示す。すなわち、異なるタンパク質レベルは、OAの様々な臨床形態または重症度を示すものである。上記情報はまた、本発明モジュレーターによる処置に応答し得るかまたは応答し得ない関節炎を経験している患者のサブセットを同定するのに有用である。同様に、本発明では、対象におけるPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のメッセージレベルを定量することは、診断および適切なOA治療法の決定に有用であると考えられる。適切な対照個体と比べてPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のmRNAレベルが高い対象は、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSM阻害剤による処置についての適切な候補とみなされる。
【0115】
本発明によると、診断に使用される本発明ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体の能力が提供される。したがって、一実施態様において本発明は、PI3K、PKB、IL−1、またはOSMモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてPI3Kのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3の1種またはそれ以上から選択される物質のmRNAレベルを検定することを含み、非変形性関節症対照レベルと比べてPI3K、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のレベルが変化、例えば増加または減少した対象が、PI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーター処置に適切な候補である方法に関するものである。上記診断方法では、非変形性関節症対照生物試料で観察されるレベルと比べてPI3K、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3のレベルが改変した対象として活動性または発生期変形性関節症罹患対象を同定することを意図し得る。
【0116】
本発明の別の態様は、発生期または活動性OAの診断を目的とする対象におけるPI3Kのα、β、γおよびδイソ型の割合の検出に関するもので、これらを提供する。例えば、PI3Kイソ型α、β、γおよびδに対する抗体は、対象におけるPI3Kのα、β、γおよびδイソ型の割合を検出するのに使用され得る。これらのイソ型の互いの割合は、正常軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合と比べて変形性関節症軟骨細胞では特徴的に改変されている。活動性または発生期OA罹患患者で見られるレベルの割合と関節軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合の比較結果は、臨床試験手順の一部としてPI3KおよびPI3Kイソ型、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3レベルをモニターするのに、例えば所定の処置プログラムの効力を測定または変形性関節症疾患の診断を補助するのに使用され得る。興味深いことに、軟骨細胞は、本明細書記載の通り変形性関節症の関節から得られ、PI3K発現の誘導因子であるPDGFの存在下で培養され得る。次いで、PI3Kのα、β、γおよびδイソ型の検出は、例えばウエスタンブロッティング検出方法またはイソ型に対する蛍光標識抗体を用いて遂行され得る。
【0117】
すなわち、酵素活性の阻害に関するこれらの抗体の使用に加えて、またはPI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3のアップレギュレーションに関与し得るタンパク質−タンパク質相互作用を阻止するため、上記抗体は、例えばPI3Kおよび差次的PI3Kイソ型レベル、PKB、IL−1、OSM、AGG−1および/またはCOL−3レベルをモニターする方法として診断に使用され得、すなわち変形性関節症対象の特性確認に使用され得る。
【0118】
従って、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、
(a)対象においてPI3Kのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAおよび/またはタンパク質レベルについて検定し、そして
(b)対照のレベルと比べてPI3Kのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3のmRNAおよび/タンパク質レベルが増加した対象に、PI3KモジュレーターまたはPKBモジュレーターを、変形性関節症の病理学的影響を処置または改善するのに十分な量で投与する
ことを含む方法に関するものである。
【0119】
OA罹患対象を検出するための診断ツールに関するもので、これを提供する別の実施態様は、生物学的試料においてPI3Kのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルを検出するための診断用キットであって、
(a)PI3Kのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3の1種またはそれ以上から選択された物質のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、
(b)(a)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(c)PI3Kのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3の1種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドまたはそのフラグメント(上記ポリペプチドまたはそのフラグメント)、または
(d)PI3Kのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、AGG−1およびCOL−3の1種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドに対する抗体
を含み、成分(a)、(b)、(c)または(d)が重要な成分を含み得るキットに関するものである。
【0120】
ただし、上記キットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)は、重要な成分を含み得るものとする。また、上記キットは、本明細書で検討されている通りイソ型を含むPI3K、PKB、IL−1またはOSM、関連調節タンパク質またはこれらのタンパク質により修飾されるタンパク質のレベルを検出するように設計された成分(a)−(d)を含み得ることが考えられる。
【0121】
患者に対して治療法を最適化するために考慮される因子には、処置されている特定の状態、処置されている特定哺乳類、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定タイプ、投与方法、投与スケジュール、および専門家に知られている他の因子がある。投与すべき活性化合物の治療有効量は、上記の考慮すべき事項により決定され、変形性関節症の処置に必要とされる最少量である。
【0122】
本明細書で開示されている医薬組成物は、OAの処置、予防および/または改善に有用であり、上記疾患の症状を処置または改善するのに治療上有効な用量で患者に投与されるべきである。治療有効量とは、PI3K、PKB、IL−1および/またはOSMを阻害することによりAGG−1および/またはCOL−3のレベルを減少させるかまたはOAを予防、処置または改善するのに十分な化合物の量をいう。
【0123】
本発明の阻害性化合物は、医薬組成物として投与され得る。本発明に従って使用される上記医薬組成物は、1種またはそれ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて慣用的方法により処方され得る。
【0124】
すなわち、化合物およびそれらの生理学的に許容される塩類および溶媒和物は、吸入または通気(口または鼻を通して)による投与用または局所、経口、頬側、非経口または直腸投与用に処方され得る。
【0125】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、医薬上許容される賦形剤、例えば結合剤(例、糊化済トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例、乳糖、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)、滑沢剤(例、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例、じゃがいも澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム)、または湿潤剤(例、ラウリル硫酸ナトリウム)による慣用的手段により製造される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当業界で公知の方法によりコーティングされ得る。経口投与用液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとり得るか、またはそれらは使用前に水または他の適切な賦形剤により構成される乾燥製品としての形態をとり得る。上記液体調製物は、医薬上許容される添加剤、例えば懸濁剤(例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂)、乳化剤(例、レシチンまたはアラビアゴム)、非水性賦形剤(例、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油)および保存剤(例、メチルまたはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)による慣用的手段により調製され得る。調製物はまた、適切な場合緩衝塩類、調味、着色および甘味剤を含み得る。
【0126】
経口投与用調製物は、活性化合物を放出制御するように適切に処方され得る。
頬側投与の場合、組成物は、慣用的方法で処方される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【0127】
吸入投与の場合、本発明に従って使用される化合物は、好都合には、適切な高圧ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体の使用を伴う、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾル噴霧適用形態で送達される。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、バルブを設けて計量された量を送達することにより決定され得る。吸入器または注入器で使用される例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉の粉末混合物を含むものとして処方され得る。
【0128】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方され得る。非経口処方物の送達経路は、興味の対象である罹患組織または身体の他の部分への例えば、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内または直接的経路であり得る。好ましい実施態様において、非経口投与は、患部である関節への直接関節注射により行われ得る。注射用処方物は、保存剤を加えた単位用量形態、例えばアンプルまたは多用量型容器を呈し得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとしての形態をとり得、処方剤、例えば懸濁、安定および/または分散剤を含み得る。別法として、有効成分は、使用前に適切な賦形剤、例えば滅菌発熱物質不含有水により形成させる粉末形態であり得る。
【0129】
化合物はまた、例えば慣用的坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリドを含む、直腸組成物、例えば坐剤または停留浣腸で処方され得る。
【0130】
前記処方物に加えて、化合物はまた、デポー型調製物として処方され得る。上記の長期作用処方物は、移植(例えば、皮下、筋肉内、腹腔内または関節)または筋肉内または関節注射により投与され得る。すなわち、例えば、化合物は、適切なポリマー性または疎水性材料(例えば許容される油中エマルジョンとして)またはイオン交換樹脂により、または難溶性誘導体、例えば難溶性塩として処方され得る。
【0131】
組成物は、所望ならば、有効成分を含有する1個またはそれ以上の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置で装填され得る。パックは、例えば金属またはプラスチックフォイル、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与用の使用説明書が添付され得る。
【0132】
本発明での使用に適切な医薬組成物には、有効成分が意図された目的を達成するための有効量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者が行える範囲内に十分含まれる。
【0133】
いずれの化合物についても、治療有効量は、最初に例えば新生物細胞の細胞培養検定法または通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタの動物モデルで評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用され得る。用量は、IC50(すなわち、徴候の半最大阻害を達成する試験化合物濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで処方され得る。次いで、上記情報は、ヒトでの投与に有用な用量および経路を決定するのに使用され得る。
【0134】
治療有効量は、OAの病理学的影響を処置、予防および/または改善するのに有用である、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3遺伝子発現を阻害するように設計された有効成分、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNA、これらのタンパク質または関連調節タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの量をいう。治療効力は、本明細書に記載されたPI3KまたはPKB酵素検定法またはIL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3発現レベル検定法により、または細胞培養物または実験動物における医薬上の手順により測定され得る。例えば、効力は、PI3K、PKB、IL−1、OSMの阻害またはそれによるAGG−1および/またはCOL−3の減少レベルとして現わされ得る。この効力はIC50(50%阻害濃度)として現わされ得、そのIC50とは、インビトロまたはインビボPI3K、PKB、IL−1またはOSM阻害試験またはAGG−1またはCOL−3発現試験において、同じ試験条件下で阻害されないときに得られるレベルと比べて上記酵素のレベルまたはメッセンジャーRNAレベルの50%縮小となるPI3KまたはPKB酵素活性のレベルまたはIL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3発現レベルを得るために加えられなければならない化合物の量である。効力の別の尺度は、ED50(50%有効量)であり、ED50は集団の50%において治療上有効な用量である。毒性は、LD50(試験動物または細胞の集団の50%に対する致死量)として表され得る。LD50および治療効力間の用量比が治療指数であり、それはLD50/ED50の割合として表され得る。大きな治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養検定法および動物試験から得られるデータは、ヒトに使用する場合の範囲の用量を処方するのに使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくはED50を含む循環濃度の範囲内であり、毒性をほとんどまたは全く伴わない。用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変化する。
【0135】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関する因子を考慮しながら専門家により決定される。活性部分の十分なレベルを達成するように、または所望の効果を維持するように、用量および投与を調節する。考慮され得る因子には、病状の重症度、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与時間および頻度、薬剤の組合わせ(複数も可)、反応感受性、および治療に対する耐性/応答がある。長時間作用医薬組成物は、特定処方物の半減期およびクリアランス速度により3〜4日ごと、1週間ごと、または2週間ごとに1回投与され得る。
【0136】
通常の投薬量は、投与経路によって、総用量約1グラム以下、0.1〜100000マイクログラムの範囲で変化し得る。特定投薬および送達方法に関するガイダンスは、文献に示されており、一般的に当業界の専門家にとって利用可能なものである。当業者であれば、タンパク質またはそれらの阻害剤ではなくヌクレオチドについての種々の処方物を使用するはずである。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所に特異的である。タンパク質の経口投与に適切な医薬処方物は、例えば米国特許第5008114、5505962、5641515、5681811、5700486、5766633、5792451、5853748、5972387、5976569および6051561号に記載されている。
【0137】
以下、実施例により本発明についてさらに説明するが、本発明を限定する意図はない。
【0138】
実施例
方法:
以下の技術および実験方法は、本明細書記載の実施例で使用される。実施例で以下の技術について示す場合、下記要領で遂行される実験方法の確認を意図したものである。
【0139】
単離された正常および変形性関節症軟骨:軟骨を大腿骨顆およびヒト膝の脛骨プラトーから摘出する。関節炎の病歴が無く、肉眼で見える軟骨病変を全く伴わない死体から正常軟骨を入手する。関節置換治療が行われている患者から変形性関節症軟骨を入手する。
【0140】
単離された正常および変形性関節症軟骨RNA:正常および変形性関節症軟骨を、上記と同様大腿骨顆およびヒト膝の脛骨プラトーから摘出する。摘出した軟骨を液体窒素浴中で急速冷凍する。
【0141】
RNA単離:RNAを、急速冷凍軟骨からフリーザー・ミル中でホモジネートし、1ml/100mg(組織)トリゾール(ライフ・テクノロジーズ、ロックビル、メリーランド)中でホモジネートを抽出することにより単離する。ホモジネートした軟骨試料をクロロホルムで抽出し、15000倍重力加速度で20分間遠心分離し、水相を集める。等量の70%エタノールを水相に加え、混合し、次いでRNイージーカラム(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)に適用する。リボグリーン試薬(モレキュラー・プローブ、ユージーン、オレゴン)を用いてRNA濃度を測定する。
【0142】
単離された正常および変形性関節症軟骨からのcDNA:1μg総単離量の正常または変形性関節症軟骨RNAを、デオキシリボヌクレアーゼ緩衝液(アンビオン、オースティン、テキサス、10μl総反応量とするのに十分な量)中デオキシリボヌクレアーゼ(アンビオン、オースティン、テキサス)により処理し、37℃で30分間加熱する。デオキシリボヌクレアーゼ酵素を、EDTAを加え、5分間75℃で加熱することにより不活化する。次いで、スーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム(ライフ・テクノロジーズ、ロックビル、メリーランド)でオリゴdT12−18を用いて上記反応混合物からcDNAを合成する。次いで、最終反応量を300μlに調節する。シクロフィリンRT−PCRを各試料について実施することにより、比較正規化PI3K、PKB、AGG−1またはCOL−3遺伝子定量が可能となる。まず、シクロフィリンについての逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を、エクスパンド・ロングPCRシステム(ロシュ・バイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ)の使用により3μlのテンプレートを用いて遂行する。シクロフィリンRT−PCRを各試料について28サイクル実施することにより、PCR産物の飽和を阻止するが、存在量の少ない遺伝子の検出には35〜40サイクルが必要である。ローディング染料を、50μlのRT−PCR反応混合物に加え、10μlの染色RT−PCR反応混合物を、4〜20%TBE勾配ゲル(バイオラッド、ハークルズ、カリフォルニア)にローディングし、200Vで45分間分離する。ゲルを、1時間SYBRグリーン(1:10000)(モレキュラー・プローブス、ユージーン、オレゴン)を含む1×TBE(シグマ、セントルイス、ミズーリ)溶液中で染色し、次いでストーム860−青色蛍光/化学蛍光スキャナー(モレキュラー・ダイナミクス、アマーシャム・ファルマシア事業部、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)で走査する。ImageQuantソフトウェア(モレキュラー・ダイナミクス、アマーシャム・ファルマシア事業部、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)を用いて、個々のバンドを定量する。特定遺伝子を表す各PCRバンドについて測定された蛍光値を、同じドナー試料中におけるシクロフィリンバンドについての蛍光値に対して正規化する。
【0143】
軟骨細胞培養:単離した正常および変形性関節症軟骨試料を、燐酸緩衝食塩水(PBS)中ですすぎ、切り刻み、ストレプトマイシス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のプロテアーゼ(シグマ、セントルイス)およびコラゲナーゼ−2(ワーシントン・バイオケミカルズ、レイクウッド、ニュージャージー)で消化する。上記消化段階により、単離した軟骨試料から個々の軟骨細胞が遊離される。10%熱不活化ウシ血清(インビトロジェン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア)を含む高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)(インビトロジェン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア)中の6ウェルプレートにおいて1×106細胞/ウェルの高密度で軟骨細胞を播種し、細胞が飽和密度の80%に達するまで37℃、5%CO2でのCO2インキュベーター(ケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ、ニュータウン、コネティカット)中において維持する。
【0144】
培養軟骨細胞におけるPI3K/PKBの誘導または阻害:下記の全試験において、軟骨細胞を、10%胎児ウシ血清(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)含有または不含有のDMEM培地中で培養した。培養された軟骨細胞を、血清不含有培地(DMEM)中で一晩インキュベーションし、次いで、以下の試料タイプの一つとして、すなわち、1)培養物を24時間血清不含有培地(DMEM)中でインキュベーションすることにより、対照試料を、2)PI3K/PKB誘導物質PDGF−BB(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)を含む血清不含有培地中で24時間培養物をインキュベーションすることにより、誘導試料を、または3)試料を1時間PI3K/PKB阻害剤LY294002(シグマ、セントルイス、ミズーリ)中でプレインキュベーションし、次いでPDGF−BBを含む血清不含有培地(DMEM)中で培養物を24時間インキュベーションすることにより、PI3K/PKB阻害試料を処理する。図3は、一次ヒト軟骨細胞中のPDGFによるPI3K/PKB発現の活性化を示す。図4は、一次ヒト軟骨細胞におけるPDGF活性化PI3K/PKB発現のLY249002(2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)阻害を示す。
【0145】
ウエスタン・ブロッティング−細胞を血清不含有培地(DMEM)中で一晩インキュベーションし、次いでPDGF−BB(50ng/ml)+/−LY294002(20μM)含有の新しい血清不含有培地中で10分間インキュベーションする。細胞を氷冷PBS中で洗浄し、こすり落し、そして50mMのトリスpH7.4、1%NP−40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、150mMのNaCl、1mMのEGTA、1mMのPMSF、アプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチン(全て1μg/ml、1mMのバナジウム酸ナトリウム、1mMのNaF、および1μMのマイクロシスチン)(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を含む氷冷溶解緩衝液中で音波処理する。ミクロビシンコニン酸検定法(ピアス、ロックフォード、イリノイ)を用いてライゼートのタンパク質濃度を測定し、1レーン当たり20μgのライゼートをホスホ−PKBおよびホスホ‐フォークヘッドおよび5μgを抗His抗体[ウサギ抗ホスホPKB−Ser473NEB、ウサギ抗ホスホ−FKHRL1−Thr32 NEB、マウス抗ペンタ−His(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)]について実施する。ペルオキシダーゼ標識二次抗体をジャクソン・ラボラトリーズ(バー、ハーバー、メイン)から購入する。ブロットをECL試薬(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)で視覚化する。PDGF(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)および/またはLY294002(シグマ、セントルイス、ミズーリ)24時間処理軟骨細胞からの培地を用いてウエスタンブロットを実施し、マウス抗COL−3(MMP−13、オンコジーン、ケンブリッジ、マサチューセッツ)によりプローブし、ECL(+)試薬(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)で視覚化する。
【0146】
レトロウイルス−PKB構築物−ヒトPKB−1と95%より大きい相同性を共有するMyc−His標識ネズミPKB−1(ジェンバンク受入番号NM−009652)からレトロウイルス構築物を調製する。この構築物は、5'末端でのミリストイル化に必要とされるc−src誘導残基を含む(アップステート・バイオテクノロジーズ、レークプラシッド、ニューヨーク)。この配列をPCR増幅し、配列証明し、MoMuLV(モロニーネズミ白血病ウイルス)に基くレトロウイルス発現ベクターへ挿入する。リン酸カルシウムを用いてウイルスgagおよびpolタンパク質を安定発現するGP2−293細胞(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア)へプラスミドを一時的にトランスフェクションする。また、パッケージング細胞をVSV−Gコートタンパク質(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)と共トランスフェクションすることにより、シュードタイプ化レトロウイルス粒子を生成させる。形質導入実験用にウイルス上清を48時間後に集める。レトロウイルスベクターを単独で対照としてトランスフェクションする。PKBを過剰発現する細胞を、下記要領に従って2ラウンドで形質導入する。第2ラウンドの形質導入後、PKBおよびFKHRL1タンパク質測定に使用する細胞を、一晩血清不含有培地中で回復させる。
【0147】
レトロウイルス形質導入軟骨細胞:トランスフェクション効率を最大にするため、軟骨細胞を2ラウンドでレトロウイルス形質導入する。これを達成するため、上記と同様、正常および変形性関節症軟骨を単離し、ストレプトマイシス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のプロテアーゼおよびコラゲナーゼ−2(ワーシントン・バイオケミカルズ、レイクウッド、ニュージャージー)で消化する。しかしながら、今度は遊離した軟骨細胞を培養用に上記より低密度で播種することにより、細胞を複製させる。軟骨細胞を、8μg/mlのポリブレン(シグマ、セントルイス、ミズーリ)中において形質導入24時間前に、6ウェルプレートにおいて1ウェルにつき2×105細胞で播種する。他方、細胞を培養軟骨細胞に関する上記要領と同様にして播種する。翌日以下の要領で細胞を形質導入する。培地を除去し、10μMのHEPESおよび8μg/mlのポリブレン(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を含む上記要領で調製した3mlの新鮮なウイルス上清を細胞に加える。細胞を32℃、1000×gで1.5時間スイング式バケットローター中で遠心分離する。遠心分離後、3mlの新鮮なポリブレン含有培地を各ウェルに加える。さらに細胞を、16〜24時間上記と同条件でインキュベーションする。次いで、培地を新鮮なポリブレン不含有培地と交換し、細胞をさらに24時間インキュベーションする。この最初の形質導入後、第2ラウンドの形質導入を実施し、さらに24時間の回復期間をおく。細胞は低密度で播種されるが、それらは依然として、下記の通りIL−1に応じて亜硝酸塩を生成するそれらの能力により評価される軟骨細胞的性質を保持していた。
【0148】
亜硝酸塩生成検定法:Green et al.により報告されたグリエス方法(L.C.Green、Analytical Biochemistry 126、131−138(1982))(出典明示により援用)を用いて、軟骨細胞培養培地における亜硝酸塩蓄積を測定することにより、NOの生成を評価した。簡単に述べると、レトロウイルス形質導入軟骨細胞を、2ng/mlのIL−1β(ペプロテック、ロッキーヒル、ニュージャージー)で処理した。24時間のIL−1とのインキュベーション後、培養培地を集め、各培養ウェルからの上清50μlを、96ウェルの平底プレート(コーニング、コーニング、ニューヨーク)において等量のグレイス試薬(1:1、v/v、の蒸留水中0.1%N−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩および5%リン酸中1%スルファニルアミド)に加えた。バースマックス(Versemax)マイクロプレートリーダー(モレキュラー・ディヴァイス、サニーベール、カリフォルニア)を用いて、吸光度を550nmで測定した。デュプリケイトウェルからの平均測定値を最終分析で用いた。標準としてNaNO2を用いて各実験用に作製した標準曲線から亜硝酸塩濃度を計算した。
【0149】
COL−3についてのELISA−軟骨細胞培養細胞を、血清不含有培地(DMEM)中で一晩インキュベーションし、次いで1時間(50ng/ml)PDGF−BB(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)不含有または含有の新鮮な血清不含有培地中でインキュベーションし、各ウェルに加え、さらに24時間インキュベーションする。細胞培養上清を集め、アマーシャム(ピスキャタウェイ、ニュージャージー)ヒトコラゲナーゼ−3ELISAを用いて各処理用にCOL−3タンパク質のレベルを測定する。図5は、COL−3タンパク質分泌およびLY249002による阻害のELISAを示す。
【0150】
PCRプライマー:下記表1は、本明細書記載の手順で使用したPCRプライマーのリストである。
【0151】
表1:
【表1】
【0152】
統計的分析−RT−PCRデータの統計的分析をスチューデントt検定により実施する。
【0153】
実施例1
AGG−1およびCOL−3生成に影響するPI3K阻害剤についての検定
マトリックス分解酵素AGG−1およびCOL−3のレベルは、正常軟骨に対し変形性関節症軟骨では増加している。AGG−1およびCOL−3プロテアーゼのこれらのレベル変化は、変形性関節症の発症および進行の一因であり得る。非OAおよびOA軟骨細胞ライゼートにおけるAGG−1およびCOL−3遺伝子発現レベルの比較を下記表2および3に示す。AGG−1およびCOL−3遺伝子発現またはタンパク質生成の増殖阻害剤は、潜在的に有用なOA治療剤である。したがって、この実施例は、PI3Kおよび/またはPKB調節を通じてAGG−1および/またはCOL−3遺伝子またはタンパク質を減少させる能力を有する化合物に関するスクリーニング方法について説明している。この検定で試験される阻害剤を、AGG−1および/またはCOL−3遺伝子発現に対するそれらの効果について調べる。
【0154】
表2
【表2】
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【0155】
表3
【表3】
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【0156】
PI3Kおよび/またはPKB調節または阻害を介して、変形性関節症を処置および/または予防する能力について候補化合物を試験するのに有用であるスクリーニング検定法を作り出すため、我々は、対照阻害剤としてPI3K阻害剤LY294002を用いてスクリーンを作製した。PI3K阻害活性について化合物をスクリーニングするため、ヒト軟骨細胞を活動性変形性関節症と診断された個体から上記と同じ方法で得、次いで上記と同様にして培養し得る。細胞を血清不含有培地中で一晩インキュベーションし、次いでPDGF−BB(インビトロジェン‐ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)を加える前に、50ng/mlのPDGF−BBを含む新鮮な血清不含有培地(陰性対照)、PDGF−BB(50ng/ml)+20μMのLY294002(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を含む新鮮な血清不含有培地(陽性対照)、または50ng/mlのPDGF−BB+10または20μM試験化合物を含む新鮮な血清不含有培地(試験試料)中で1時間インキュベーションし得る。次いで、細胞を上記と同様に洗浄および溶解し、上記の逆転写PCRおよびウエスタンブロット検出法によりAGG−1またはCOL−3mRNAレベルについてライゼートをプローブし得る。AGG−1またはCOL−3mRNAの発現レベルを下げる候補化合物は、阻害活性を立証するため、OAおよび/または関連状態を臨床的に処置、予防または改善するのに有用であり得る。
【0157】
結果:
PDGFによるAGG−1およびCOL−3の誘導は、下記表4および5で示されている通りPI3K/PKB経路の活性化に伴うもので、それに左右される。集合的にこれらのデータは、PI3Kおよび/またはPKBがAGG−1およびCOL−3遺伝子発現およびタンパク質分泌を活性化することを立証している。また、これらのデータは、PI3K阻害剤、LY2490002がPKBのPDGF誘導活性化を減少させ(表3)、またAGG−1およびCOL−3についてのmRNAの下流生成を阻害することを示している(表4)。PI3K阻害剤LY2490002はまた、表5で示されている通りCOL−3タンパク質の分泌を阻害する。集合的に、これらの発見は、PI3K酵素が軟骨マトリックス分解性酵素AGG−1およびCOL−3の誘導に至る重要な経路の一部であることを示唆している。
【0158】
表4:
【表4】
一次ヒト軟骨細胞(非OA関節)におけるPDGFによるPI3K/PKBの活性化およびその結果としてLY294002による活性化の阻害を示す。軟骨細胞ライゼートのウエスタンブロットを、上方セットのデータでは抗ホスホ−PKBでプローブした。第2セットのデータでは、軟骨細胞ライゼート試料を、抗ホスホ−FKHRL1(PKBの下流プロモーター)でプローブすることにより、PKB経路が刺激されることを明確に確認した。
【0159】
表5:
【表5】
AGG-1およびCOL-3mRNAのPDGF刺激による誘導のLY294002阻害を示す。一次ヒト軟骨細胞ライゼート(非OA関節)からのAGG−1およびCOL−3のPCRアンプリコンを、アガロースゲル電気泳動により分析した。ゲル画像を、ストラタジーンのイーグル・アイII静止ビデオシステム(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)へそれらを走査することにより分析した。
【0160】
実施例2
COL−3に対して生じた効果についてのPI3K阻害剤の迅速なスクリーニング方法
上記(実施例1)のAGG−1およびCOL−3生成に影響するPI3K阻害剤についての検定法で発見される阻害剤は、下記のELISA検定法を用いることによりCOL−3タンパク質分泌に対する影響について二次的にスクリーニングされ得る。記載されている通り、この検定手段は市販されており、当業者であれば、ヒトCOL−3タンパク質に対する放射性標識モノクローナル抗体を用いる新規のELISAに基く免疫検定手段を作り出す手法については熟知しているはずである。この商業ベースのスクリーニング方法は、アマーシャム(ピスキャタウェイ、ニュージャージー)から市販されている。
【0161】
COL−3についてのELISA:
上記要領で単離した軟骨細胞を、血清不含有培地中で一晩インキュベーションし、次いでLY294002含有または不含有の新鮮な血清不含有培地(DMEM)中で1時間インキュベーションする。次いで、50ng/mlのPDGF−BB(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を、各ウェルに加え、さらに24時間インキュベーションする。軟骨細胞培養上清を集め、市販されているアマーシャム(ピスキャタウェイ、ニュージャージー)ヒトコラゲナーゼ−3ELISAベースの検定手段を用い、各処理についてCOL−3タンパク質のレベルを測定する。
【0162】
結果:
一次ヒト軟骨細胞におけるCOL−3タンパク質分泌レベルに対する対照標準PI3K阻害剤、LY294002の効果を下記表6に示す。上記と同様ELISA試験を用いてこれらのデータを作成した。
【0163】
表6:
【表6】
一次ヒト軟骨細胞(非PA関節)を、24時間PDGF(50ng/ml)の存在下様々な濃度のPI3K−キナーゼ阻害剤LY294002で処理した。軟骨細胞上清におけるコラゲナーゼ−3タンパク質レベルを、ヒトコラゲナーゼ−3ELISAシステム(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を用いて測定した。
【0164】
実施例3:
診断用ツールとしてのPI3Kイソ型のレベル改変の検出:
この方法は、PI3Kイソ型α、β、γおよびδの改変されたレベルを検出し得る診断用ツールを提供する。出願者等は、驚くべきことに非OA関節の場合と比べてOA罹患関節軟骨細胞ではこれらのPI3Kイソ型のレベルが改変されていることを発見した。すなわち、この方法は、OAに罹患している疑いがある対象を診断する方法を提供する。
【0165】
軟骨細胞は、OAに罹患している疑いのある対象の関節から単離され得る。細胞は血清不含有培地(DMEM)中に置かれ得る。次いで、上記「方法」記載の要領で細胞を洗浄および溶解し、ライゼートを、上記と同様逆転写PCRおよびウエスタンブロット検出を介してPI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγおよび/またはPI3Kδ mRNAレベルについてプローブし得る。下記表7で示されている通り、正常軟骨試料と比べて改変されたPI3Kイソ型レベルまたは傾向を示す対象は、OAと診断され得る。例えば、対象が、下記表7、8、9および10に示された対照正常軟骨試料と比べて以下の傾向を示す場合、その対象は明らかにOAを有するものとして確認され得る:
PI3Kαレベルの減少;および/または
PI3Kβレベルの減少;および/または
PI3Kγレベルの増加;および/または
PI3Kδレベルの減少。
【0166】
PI3Kイソ型レベルにおける上記傾向の一つまたはそれ以上を示す対象は、OAの存在について明白に診断され、すなわちPI3K阻害剤での処置に潜在的に応答性であるものとして、AGG−1および/またはCOL−3のレベルを低下させることが確認され得る。
【0167】
表7:
【表7】
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【0168】
表8
【表8】
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【0169】
表9:
【表9】
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【0170】
表10:
【表10】
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【0171】
実施例3
PI3K/PKB経路を介したIL−1およびOSMによるAGG−1およびCOL−3の超誘導
我々は、IL−1およびOSMが、相乗的にAGG−1およびCOL−3(MMP−13)の超誘導を誘発し、この効果はまた、LY294002またはPKB(Akt)の優位抑制型についてのレトロウイルスベクターでPI3キナーゼ経路を阻害することにより遮断されることを示す。
【0172】
サイトカイン類、例えばIL−1およびOSMは、OAに伴う軟骨喪失においてある一定の役割を有することが立証されている。それらは、マトリックスメタロプロテイナーゼ遺伝子発現を顕著にアップレギュレーションすることが示された。我々は、PI3キナーゼ阻害剤LY294002およびAkt/PKBの優位突然変異体の過剰発現を用いることにより、PI3キナーゼ経路が、ヒト関節軟骨細胞におけるアグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3のサイトカイン仲介誘導で重大な役割を有することを初めて立証している。
【0173】
方法:
軟骨細胞を2名の正常者および2名のOA患者から単離した。細胞単独またはAktの優位抑制型を過剰発現する(レトロウイルス仲介遺伝子導入)細胞を、PI3K阻害剤LY294002の存在および不存在下でIL−1ベータ、OSMまたはIL−1ベータ+OSMにより処理した。RNAを単離し、Agg−1、Col−3mRNAのレベルをリアルタイムPCRにより測定した。異なる4ドナーにおける処理は全てデュプリケイトで行った。典型的実験から得られた値を表に示す。
【0174】
RNA単離およびリアルタイムPCR:
製造業者の使用説明書に従ってキアゲンRNイージー96キット(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)を用いて、総RNAをプールしたデュプリケイト96ウェルプレートから単離した。最適なオン‐カラムデオキシリボヌクレアーゼI消化を用いて、混入しているゲノムDNAを排除した。100μlの反応量においてハイ‐キャパシティーcDNAアーカイブキット(PEアプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)でランダムプライマーを用いて、第一鎖cDNAを合成した。
【0175】
SYBRグリーンPCRマスターミックス(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)を用いて、リアルタイムPCRを、ABIプリズム7900HT配列検出システム(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)における384ウェルフォーマットで実施した。20μlの反応物は、5μlのcDNA、200nMのフォワードおよびリバースプライマー、およびSYBRグリーンPCRマスターミックスを含んでいた。デフォルトサイクリングプログラム(10'間95℃および40サイクルの95℃、15"、60℃、1')の後、融解曲線を作成する低速ランピング段階が続くことにより、PCR産物の特異性およびプライマー二量体の不存在が確認される。
【0176】
プライマー:
実施例4については、デフォルトパラメーターおよび反応条件下でプライマーエクスプレスソフトウェア(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)によりcDNA標的についてのプライマーを以下の通り設計した:
アグリカナーゼ I フォワード 5’TTTCCCTGGCAAGGACTATGA3’
アグリカナーゼ I リバース 5’AATGGCGTGAGTCGGGC3’
MMP13 フォワード 5’TGATCTCTTTTGGAATTAAGGAGCAT3’
MMP13 リバース 5’ATGGGCATCTCCTCCATAATTTG3’
GAPDH フォワード 5’ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3’
GAPDH リバース 5’TAAAAGCAGCCCTGGTGACC3’
【0177】
GAPDHの増幅を用いて、反応に加えられる試料cDNAの量を標準化した。標準物質(キャリブレーター)サンプルを利用する比較Ct方法を用いて、遺伝子発現における変化を計算した。これは、他の全てが比較されるもので、従って、その値が1に設定されるサンプルである。従って、他の値は全てキャリブレーターに対して表される。cDNA挿入体不含有レトロウイルスベクターは、キャリブレーターサンプルを表す。キャリブレーターに対する標的の量は、ABI User Bulletin #2(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)で概説されている通り、式2−□□CTに従って計算される。
【0178】
結果:
表11は、IL−1およびOSMが相乗的にAGG−1およびCOL−3(MMP−13)の超誘導を誘発し、この効果はまた、LY294002またはPKB(Akt)の優位抑制型についてのレトロウイルスベクターでPI3キナーゼ経路を阻害することにより遮断されることを示している。
【0179】
表11
【表11】
【0180】
これは、一OA患者から単離された軟骨細胞からの典型的結果である。他の4患者からも本質的に類似した結果が得られた。
Claims (34)
- アグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1またはOSMを調節し得、その調節を通してアグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3の遺伝子および/またはタンパク質発現を改変させる化合物の有効量を投与することを含む方法。
- 変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1またはOSMを調節し得、その調節を通してアグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3の遺伝子および/またはタンパク質発現を改変させる化合物の有効量を投与することを含む方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターが、上記対象においてホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項2記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼBモジュレーターが、上記対象においてホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項2記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼBモジュレーターが、LY249002 2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項2記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項2記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、またはOSMに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項2記載の方法。
- 変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、OSMのモジュレーターの有効量を含み、その調節(モジュレーション)を通してアグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3の遺伝子および/またはタンパク質発現を改変させる医薬組成物を投与することを含む方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターが、対象においてホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項8記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼBモジュレーターが、対象においてホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項8記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼBモジュレーターが、LY249002(2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項8記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項8記載の方法。
- 変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、またはOSMを阻害し、その阻害によってアグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3の遺伝子および/またはタンパク質発現を改変させる能力について検定することを含む方法。
- さらに、同定されたホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、またはOSM阻害性モジュレーターが変形性関節症の動物モデルで観察される病理学的影響を除去する能力について検定することを含む方法である、請求項13記載の方法。
- モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項13記載の方法。
- モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項13記載の方法。
- さらに、同定された阻害性モジュレーターが変形性関節症対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力について検定することを含む方法である、請求項13記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項13記載の方法。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、またはOSMに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項13記載の方法。
- 変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターを含む医薬組成物。
- モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択される1種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項20記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3から選択される1種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項20記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、LY249002(2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項20記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、1本鎖DNA、リボザイム、RNAアプタマーおよび二本鎖RNAから選択されるいずれか1種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、PI3K、PKB、IL−1、OSM、AGG−1またはCOL−3タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項20記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、OSMに対する1種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド3キナーゼおよびプロテインキナーゼBから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項20記載の医薬組成物。
- ホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、対象からの生物学的試料においてホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAレベルを検定することを含み、非変形性関節症対照レベルと比べてホスホ‐イノシチド3キナーゼ、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3のレベルが変化した対象が、ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーター処置に適切な候補である方法。
- 変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、
(a)対象においてホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAおよび/またはタンパク質レベルについて検定し、そして
(b)対照のmRNAおよび/またはタンパク質レベルと比べて、ホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3のレベルが変化した対象に、ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターを、変形性関節症の病理学的影響を処置または改善するのに十分な量で投与することを含む方法。 - ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、対象からの生物学的試料においてホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAレベルを検定することを含み、非変形性関節症対照レベルと比べてホスホ‐イノシチド3キナーゼ、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3のレベルが増加した対象が、ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーター処置に適切な候補である方法。
- 変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、
(a)対象においてホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAおよび/またはタンパク質レベルについて検定し、そして
(b)対照のmRNAおよび/またはタンパク質レベルと比べて、ホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3のレベルが増加した対象に、ホスホ‐イノシチド3キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼBモジュレーター、IL−1モジュレーター、またはOSMモジュレーターを、変形性関節症の病理学的影響を処置または改善するのに十分な量で投与することを含む方法。 - 生物学的試料においてホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルを検出するための診断用キットであって、
(a)ホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、
(b)(a)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(c)ホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドまたはそのフラグメント(上記ポリペプチドまたはそのフラグメント)、または
(d)ホスホ‐イノシチド3キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、IL−1、OSM、アグリカナーゼ−1およびコラゲナーゼ−3の1種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドに対する抗体
を含み、成分(a)、(b)、(c)または(d)が重要な成分を含み得るキット。 - アグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気を処置するための医薬の製造を目的とするホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、またはOSMを調節し得る化合物の使用。
- 変形性関節症処置用医薬の製造を目的とするホスホ‐イノシチド3キナーゼ、プロテインキナーゼB、IL−1、またはOSMを調節し得る化合物の使用。
- アグリカナーゼ−1またはコラゲナーゼ−3のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気を処置するための医薬の製造を目的とする2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の使用。
- 変形性関節症処置用医薬の製造についての2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)の使用。
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