KR20170128630A

KR20170128630A - 골관절염 치료

Info

Publication number: KR20170128630A
Application number: KR1020177032850A
Authority: KR
Inventors: 죤 알랜 해밀튼; 앤드류 데이빗 쿡
Original assignee: 더 유니버시티 오브 멜버른
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2017-11-22
Also published as: KR101799264B1; HUE028615T2; ES2572368T3; KR20110128273A; JP6458086B2; RU2016102339A3; RU2712273C2; HK1226938A1; US20200247895A1; AU2009329814B2; WO2010071924A1; EP2376121B1; ES2572368T5; CA2746827C; EP3056217B1; JP2017200933A; US20120003234A1; EP2376121A1; EP3056217A1; JP2015143233A

Abstract

본 발명은 골관절염(OA)의 치료 및/또는 예방하는 방법과 일반적으로 관련이 있다. 본 발명에 따르면, GM-CSF 길항제는 골관절염의 치료에 효과적일 수 있다. GM-CSF 길항제는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 특이적인 항체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 본 발명은 GM-CSF가 제거된 마우스와 같은 형질전환 동물을 추가적으로 제공하며, 이는 특정 질병 모델에서 길항제를 시험하기에 유용하다.

Description

골관절염 치료{OSTEOARTHRITIS TREATMENT}

본 출원은 2008년 12월 22일에 출원된 미국 가출원번호 61/139,679 및 2009년 3월 30일에 출원된 미국 가출원번호 61/164,486의 이익을 주장하며, 둘 다 전체가 참조 문헌으로 포함된다.

본 발명은 골관절염(OA)을 치료 및/또는 예방하는 방법과 일반적으로 관련이 있다. 본 발명에 따르면, GM-CSF 길항제는 골관절염의 치료에 효과적일 수 있다. GM-CSF 길항제는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체에 특이적인 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 GM-CSF 녹아웃 마우스와 같은 특정 질병 모델에서 길항제를 시험하기에 유용한 유전자 변형 동물을 추가로 제공한다.

퇴행성 관절염으로도 알려진, 골관절염(OA)은 노인과 비만 인에게서 널리 퍼져있는 질병이다. 골관절염은 관절 질병이지만, 류마티스 관절염(RA)과는 다르며, 상기 질병은 몸 전체에 영향을 주지 않으며, 대개 하나 또는 몇몇의 관절에만 영향을 준다. 상기 질병은 관절 연골의 총체적인 파괴, 뼈 밑의 경화 및 골증식체 형성을 초래하며, 그 결과로 거동성의 감소 및 통증을 가져온다. 최종적인 결과로 전체 관절의 교체가 종종 필요하다.

미국의 약 2100만 인구에 영향을 미치는 골관절염은 처음으로 내과의사를 방문하는 전체의 25 %를 차지하고, NSAID(비 스테로이드성 항 염증 약물)처방이 전체의 50 %에 해당한다. 질병의 진전을 늦추거나 멈추게 하는 적절한 치료법이 현재는 존재하지 않으며; 오늘날의 약물은 상기 증상을 거의 치료하지 않는다. 상기 질병의 발생 정도 및 심각성은 나이를 먹으면서 증가 된다. 65세가 되면, 그들의 60 %만이 증상을 보임에도 불구하고, 미국인의 80 %는 골관절염의 방사선 사진술의 흔적를 보인다. 65세 때의 모든 관절 질병의 65 %는 골관절염이다. 2006년에는, 735,000명의 골관절염과 관련하여 입원한 환자가 있었다.

현재의 골관절염 약물은 질병 자체를 치료하기보다는 골관절염의 증상을 치료하였다. 골관절염의 치료에 흔히 사용되는 약물은 비-스테로이드성 항 염증 약물(NSAIDs)이며, 이러한 예로는 다이아세린(diacerin), 볼타렌(voltaren), 모빅(mobic) 및 아트로텍(arthrotec)(일반적인 명칭 : 디클로페낙(diclofenac), 미소프로스톨(misoprostol), 멜록시캠(meloxicam))이 있다. NSAID는 중추신경계(CNS)에서 프로스타글란딘 합성을 억제함으로써 작용하는 경구 화합물이 주를 이룬다. 다른 흔히 사용되는 약물은 울트람(ultram)(트라마돌)과 같은 비마약성 진통제, 쎄레브랙스(celebrax) 및 알콕시아(arcoxia)(쎄레콕시브, 에토리콕시브)와 같은 콕스-2 억제물질, 듀라제식(duragesic)(덱스트로프로폭시펜 펜타닐(dextropropoxyphene fentanyl))와 같은 마약성 진통제, 슈파츠(suparts), 히알간(hyalgan), 오르토비스크(orthovisc) 및 신비스키(synvisc) (히알란 G-F20)와 같은 히알루라온산(hyaluraonic acids), 및 프레디니솔론(predinisolone) 및 메틸프레디니솔론과 같은 코르티코스테로이드이다. 골 관절염에 대한 현재의 치료법은 연골세포 이식과 같은 조직 공학을 통한 수술을 배제하기 위한 의도이지만; 이러한 치료법은 골 관절염의 마지막 단계의 치료에서만 적용된다. 고려되는 관절염의 치료에 대한 다른 접근법은 증식요법을 포함하며, 상기 증식요법에서는 덱스트로오스와 같은 자극물을 병에 걸린 관절에 주입하며, 이에 의하여 극심한 염증성 반응이 유발될 뿐만 아니라, 조직, 인대, 힘줄 및 연골의 보강 및 치유 또한 유발하게 된다. 따라서, 관절염의 치료에 대하여 아직 채워지지 않는 의학적 필요가 존재한다.

일부 시토킨은 골관절염에 수반된다고 알려져 있다(Blom 등, Current Drug Target (2008) 8:283). IL-1, '파괴적인' 시토킨 및 동화성 성장 인자 형질전환 성장 인자 β(TGF β)와 같은 약간의 시토킨은 잠재적인 약물 목표물질로서 고려된다.

과립대식세포집락자극인자(GM-CSF)는 백혈구 성장 인자로서 기능하는 사이토킨이다. GM-CSF는 과립구(호중구, 호산구 및 호염기구) 및 단핵구를 생산하도록 줄기세포를 자극한다. 단핵구는 순환을 떠나서 조직 안으로 이동하며, 그 결과 대식 세포로 성숙한다. 따라서, 이것은 자연적인 면역/염증성 케스케이드(cascade)의 일부이며, 이에 의하여 적은 수의 대식 세포의 활성은 그들의 수의 증가, 염증과 싸우는 중대한 과정을 빠르게 초래할 수 있다. GM-CSF의 활성 형태는 호모다이머(homodimer)로서 세포 밖에서 발견된다. 특히, GM-CSF는 류마티스 관절염 같은(RA) 자가면역 장애에서 염증성 매개체로서, 염증을 발생시키는 사이토킨, 케모킨 및 프로테아제의 생산의 증가를 초래하고, 이에 의하여 결국 관절을 파괴한다고 확인되었다.

WO 06/0234412는 단백질 마이크로분석법에 의해 식별된 골관절염에 대한 다양한 생물지표를 개시한다. 식별된 생물지표 중 하나는 GM-CSF이며, 이는 골 관절염 조직에서 4 배의 상향조절을 가져온다고 보고되었다. 반면에, GM-CSF가 치료적 개입을 할 수 있다는 사실에 대한 표시 또는 시사하는 바가 없고, WO 06/0234412에서 개시된 기술로 확인에 따르면 골관절염 조직에서 4배의 상향조절을 거의 가져오지 않고, 또한 이와 같은 것이 시사되어 있지 않다. 관련된 혈관에서, Devalaraja 등의 US20020141994A1은 집락자극인자의 길항제로 치료하기에 적합한 잠재적인 적합한 표시의 긴 목록 중에서 골관절염을 피상적으로 언급한다. 상기 표시 목록은 아테롬성 동맥경화증, 패혈증, 천식, 자가면역 질병, 골다공증 및 류마티스 관절염을 포함한다. M-CSF 및 G-CSF와 같은 다른 집락자극인자를 제외하고, GM-CSF는 Devalaraja 등에서 언급된 집락자극인자 중의 하나이다. 실제로는, Devalaraja 등의 문헌에서는 길항효과를 갖는 GM-CSF가 왜 골관절염으로 고통받는 피험자를 치료하기에 적합한지에 대한 데이터 또는 다른 인식을 포함하지 않는다.

Bellamy 등, J Rheumatol 15(12):1833-40, 1988 Blom 등, Arthritis Rheum 56:147-157, 2007 Ghose 등, J Combin Chem: 7:55-68, 1999 Knappik 등, J. Mol. Biol. 296:57, 2000 Krebs 등, J. Immunol. Methods. 254:67, 2001 Lipinski 등, Adv Drug Del Rev 23:3-25, 1997 Mills 등, J Immunol 164:6166-6173, 2000 Pritzker 등, Osteoarthritis Cartilage 14:13-29, 2006 Rothe 등, J. Mol. Biol. 376:1182, 2008

본 발명의 목적은 골관절염을 치료하는 것이다.

첫 번째로, 본 발명은 GM-CSF가 골관절염의 치료에 유효한 목표물이라는 것을 설명한다. 이러한 발견은 새롭고, 선행 문헌은 골관절염의 치료에서 개입이라는 이유로 어떠한 합리적인 것도 설명하거나, 제안하거나, 제공하기 않았다. 따라서, 본 발명은 예를 들어, 피험자의 골관절염의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 피험자의 골관절염을 예방하는 방법을 생각할 수 있으며, 상기 방법은 상기 피험자에게 유효량의 GM-CSF 길항제를 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 골관절염으로 고통받는 또는 골관절염으로 고통받는 것처럼 보이는 피험자의 세포의 성장 및/또는 생존을 활성, 증식, 유도하는 GM-CSF의 능력에 대적할 수 있는 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 목적으로 하며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 골관절염의 치료에 유용한 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 목적으로 하며, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다.

본 발명의 구체적인 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제는 GM-CSF에 특이적인 항체이다.

본 발명의 구체적인 양태에서, 상기 GM-CSF 길항제는 GM-CSF 수용체에 특이적인 항체이다.

다른 양태에서, 본 발명은 골관절염의 치료용 약제의 제조에 GM-CSF 길항제의 사용을 목적으로 한다.

다른 양태에서, 본 발명은 골관절염의 치료를 위한 GM-CSF 길항제를 제공한다.

본 명세서를 통하여, 문맥상 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다", "가지다" 및 "포함하는", "갖는", "가지는"과 같은 다양한 각각의 변형은 진술된 성분 또는 정수 또는 성분 군 또는 정수들이 포함하지만 임의의 다른 성분 또는 정수 또는 성분군 또는 정수들이 제외된다는 것을 함축하는 것으로 이해될 것이다.

도 1은 다른 영역의 관절 손상에 대하여 조직학상의 점수에 의해 평가된 양적 데이터를 보여준다. 실험 준비 및 점수 시스템은 실시예 2에서 개시된다. "Lat."은 외측을 의미하며, "Med."는 내측을 의미한다. 통계학적 분석은 Mann-Whitney를 통해 수행되었다. 상기 데이터는 외측 대퇴골(p=0.02), 외측 경골(p=0.003), 내측 경골 및 모든 영역에 걸쳐(평균; p=0.002)서 통계학적으로 중요하다.
도 2는 건강한 대조군 무릎의 예시적인 조직학 단면을 보여준다. 확대 비율은 100 배이다. 연골의 손상, 골증식체 형성, 활액막염 또는 변형이 보여지지 않았다. S=활액막, C=연골층.
도 3은 콜라게나제(collagenase)로 유래된 골관절염 모델인 C57/BL6 마우스의 좌측 무릎의 예시적인 조직학 단면을 보여준다. 확대된 개개의 단면이 표시된다. 사진의 상단은 연골 손상, 골증식체 형성 및 활액막염이 눈에 띈다는 것을 보여준다. O=골증식체. S=활액막. 사진의 하단은 관절 변형이 또한 존재한다는 것을 보여준다.
도 4는 콜라게나제로 유래된 골관절염 모델인 GM-CSF-/- 마우스의 좌측 무릎의 예시적인 조직학 단면을 보여준다. 확대된 개개의 단면이 표시된다. 여기서 볼 수 있듯이, C57/BL6 마우스와 비교할 때 기형 및/또는 손상은 덜 심각하고(도 3 참조), 건강한 대조군 쥐와 동등하다(도 2 참조). O=골증식체. S=활액막.
도 5는 관절염을 앓는 마우스 모델에 GM-CSF 항체로 치료상의 치료의 무릎관절 조직학 점수를 보여준다. Lat.=측방. Med.=내측. 결과는 평균 ± SEM으로 나타냈다. 항-GM-CSF 항체로 처치된 마우스가 더 적은 질병을 보이는 것으로 알 수 있었다.
도 6은 후지(hind limb) 중량 분포를 무력화도 측정기(incapacitance meter)에서 평가하는 실험의 결과를 보여준다. 데이터는 그래프에서 표시되듯이, 27 일째에 OA 유도 후로부터 중요하다(unpaired t-test).

본 발명은 GM-CSF 가 골관절염의 치료에 대한 유효한 목표물이라는 것을 입증한다. 이러한 관점에서 본 발명은 일 양태로, 골관절염 분야에서의 예방적 또는 치료적 이익을 가져오는 GM-CSF 길항제의 사용방법을 제공한다.

본 발명은 이러한 질병의 치료에 필요한 피험자에게 약학적으로 유효량의 GM-CSF 길항제의 투여를 포함하는 치료방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 원하는 생물학적 반응이 일어나는데 필요한 GM-CSF 길항제의 양을 의미한다. 본 발명의 약학적 유효량은 골관절염을 치료하거나 예방하는데 필요한 양이다.

본 명세서에서 사용된 "GM-CSF 길항제"는 가장 넓은 의미의 GM-CSF 길항제; GM-CSF의 활성 또는 기능을 억제하는 모든 물질, 또는 GM-CSF에 대한 약학적 효과를 이끌어내는 모든 방법이 포함된다. 상기 용어 GM-CSF 길항제는 GM-CSF에 특이적으로 결합하는 항체, GM-CSF에 특이적인 억제성 핵산 또는 GM-CSF에 특이적인 작은 유기 분자를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 또한 GM-CSF 길항제라는 용어의 의미 안에는 GM-CSF 수용체에 특이적으로 결합하는 항체, GM-CSF에 특이적인 억제성 핵산, GM-CSF에 특이적인 작은 유기 분자를 포함된다.

억제성 핵산은 안티센스(antisense) DNA, 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(triplex-forming oligonucleotides), 외부 가이드 서열(external guide sequence), siRNA 및 microRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유용한 억제성 핵산은 대조군에 비해 GM-CSF를 암호화하는 RNA의 발현을 최소한 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 %로 감소시키는 핵산을 포함한다. 억제성 핵산 및 이를 생산하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. siRNA 디자인 소프트웨어가 이용 가능하다.

GM-CSF 또는 상기 GM-CSF 수용체에 특이적인 작은 유기 분자는 천연물 스크리닝 또는 화합물 라이브러리(chemical libraries)의 스크리닝을 통해서 확인할 수 있다. 일반적으로 상기 SMOLs의 분자량은 500 Da 미만이며, 바람직하게는 160 내지 480 Da이다. 다른 SMOLs의 일반적인 특징은 하기에서 기술되는 특징 중 하나 이상이다.

- 분배계수 로그 P는 -0.4 내지 +5.6이다.

- 분자 골절도(refractivity)는 40 내지 130이다.

- 원자 번호는 20 내지 70이다.

검토를 위해서 문헌[Ghose 등, J Combin . Chem : 1:55-68, 1999] 및 [Lipinski 등, Adv Drug Del Rev: 23:3-25, 1997]을 참고하라.

바람직하게는 본 발명에서 사용하는 GM-CSF 길항제는, GM-CSF에 특이적인 항체 또는 GM-CSF 수용체에 특이적인 항체이다. 이러한 항체는 쥣과 항체, 쥐 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체와 같은 어떠한 유형일 수 있다. "인간" 항체 또는 기능성 인간 항체 절편(functional human antibody fragment)은 키메라가 아니고(예를 들어, "인간화 된"것이 아니며), 비인간 종으로부터 유래되지 않은 것(전체적 또는 부분적으로)으로 본 명세서에서 정의된다. 인간 항체 또는 기능성 항체 절편은 인간으로부터 유래 될 수 있거나, 합성 인간 항체일 수 있다. "합성인간 항체"는 인실리코(in silico)방식을 이용하여 알려진 인간 항체 서열의 분석에 기초한 합성 서열로부터 유래된 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 가지는 항체를 본 명세서에서 정의한다. 예를 들어, 인간 항체 서열 또는 이의 절편의 설계는 인간 항체의 데이터베이스 또는 항체 절편 서열을 분석하고, 이것으로부터 얻어진 데이터를 활용하여 폴리펩타이드 서열을 고안해냄으로써 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 기능성 항체 절편의 또 다른 예는 인간 유래의 항체 서열의 라이브러리로부터 단리된 핵산에 의해 암호화된 것이다(즉 인간 천연원(natural source)으로부터 얻은 항체에 기초한 라이브러리).

"인간화된 항체" 또는 기능성 인간화된 항체 절편은 (ⅰ) 인간 생식세포 서열에 기초한 비인간으로부터 유래한 항체(예를 들면, 이종의 면역체계를 나타내는 형질전환 마우스); 또는 (ⅱ) 가변 도메인(variable domain)은 비인간 유래이고 불변 도메인(constant domain)은 인간으로부터 유래한 키메라이거나 (ⅲ) 가변 도메인의 CDRs은 비인간 유래이고, 상기 가변 도메인의 하나 이상의 뼈대(framework)는 인간 유래이고 불변 도메인도(만약 존재한다면) 인간 유래인 이식된 CDR(CDR-grafted)로 본 명세서에서 정의된다.

상기 용어 "키메라 항체" 또는 기능성 키메라 항체 절편은, 어느 한 종에서 발견되는 서열 및 이와 다른 종으로부터 유래되는 가변 항체 영역에서 발견되는 서열로부터 유래하거나 이에 상응하는 불변 항체 영역을 가지는 항체 분자로서 본 명세서에서 정의된다. 바람직하게는, 상기 불변 항체 영역은 인간에게서 발견되는 서열, 예를 들어 인간 생식 주(germ line) 또는 체세포로부터 유래되거나 이에 상응하고, 상기 가변 항체 영역(예를 들어, VH, VL, CDR 또는 FR 영역)은 비인간 동물 예를 들어, 마우스, 쥐, 토끼 또는 햄스터에서 발견되는 서열로부터 유래한 것이다.

특이적 결합은 절대적인 것이 아니라 상대적인 것이기 때문에, 만약 항체가 어떠한 항원과 하나 이상의 기준 항원(reference antigen)을 구별할 수 있다면, 본 명세서에 사용된 "~에 특이적으로 결합하는", "~에 특이적 결합" 항체는 항원(본 명세서에서, GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체)에 대해 "특이적" 이거나 항원을 "특이적으로 인식"한다. 기준 항원은 하나 이상의 밀접한 관련을 갖는 항원(들)일 수 있으며, 이들은 기준점으로 예를 들어, IL3, IL5, IL-4, IL13 또는 M-CSF로서 사용된다. 이것의 가장 일반적인 형태에서(그리고, 정의된 기준이 언급되지 않은 경우), "특이적 결합"은 항체가 원하는 항원과 관련되지 항원을 구별할 수 있는 능력을 의미하며 이것은 다음과 같은 방법 중의 하나로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴블랏(Western blot), 엘리사(ELISA) 분석법, RIA-시험, ECL-시험, IRMA-시험 및 펩타이드스캔(peptide scan)을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 표준 엘리사(ELISA) 분석(assay)이 수행될 수 있다. 점수기입(Scoring)은 표준 색 발생(standard color development)을 이용하여 할 수 있다(예를 들어, 겨자무과산화효소(horseradish peroxide)를 포함하는 항체 및 과산화수소를 포함하는 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine)). 특정 웰(well)에서의 반응은 예를 들어, 450 nm에서의 광학 밀도로 점수를 매길 수 있다. 가장 일반적인 바탕(=음성 반응)은 0.1 OD 일 수 있다. 가장 일반적인 양성 반응은 1 OD 일 수 있다. 이것은 양성과 음성의 차이가 열 배 이상 일수 있다는 것을 의미한다. 일반적으로 결합 특이성의 결정은 단일의 기준 항원을 사용하지 않고, 우유파우더, BSA, 트랜스페린(transferring) 등과 같은 약 3개 내지 5개 정도의 관련되지 않는 항원의 세트를 이용하여 수행된다. 부가적으로, "특이적 결합"은 항체가 이것의 목표 항원의 다른 부분 예를 들면, GM-CSF 또는 GM-CSF수용체의 다른 부분, 또는 GM-CSF 또는 GM-CSF 수용체의 하나 이상의 주요 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 가지를 구별할 수 있는 능력과 관련될 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용된 "면역 글로불린 항체"(Ig)는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD(또는 임의의 상기의 하위 분류) 분류에 속하는 단백질을 나타내고, 상기의 종래에 알려진 항체 및 기능성 절편을 모두 포함한다. 항체/면역 글로불린 항체의 "기능성 절편"은 항원-결합 영역을 보유하는(예, IgG의 다양한 영역) 항체/면역 글로불린 항체의 절편을 나타낸다. 일반적으로 항체의 "항원-결합 영역"은 항체의 하나 이상의 초가변영역(hypervariable)에서 발견되고, 즉 CDR-1, -2, 및/또는 -3 영역에서 발견되며; 반면에, 가변성 "뼈대" 영역은 CDR에 대하여 스캐폴드(scaffold)를 제공하는 것과 같은 항원 결합에서 중요한 역할을 담당할 수 있다. 바람직하게는, 상기 "항원-결합 영역"은 적어도 아미노산 잔기가 4개 내지 103 개인 가변성 경(VL)쇄 및 5개 내지 109개인 가변성 중(VH)쇄를 포함하며, 더 바람직하게는 아미노산 잔기가 3개 내지 107개인 VL 및 4개 내지 111개인 VH, 가장 바람직한 것은 가능한 최대의 VL 및 VH 쇄이다(아미노산 위치가 1 내지 109인 VL 및 1 내지 113인 VH; WO97/08320에 따라 번호를 붙임). 본 발명에서 사용하기 위한 면역 글로불린 항체의 바람직한 분류는 IgG이다. 본 발명의 "기능성 절편"은 F(ab')₂ 절편, Fab 절편, scFv 또는 단일 면역 글로불린 항체 가변성 도메인 또는 단일 도메인 항체 폴리펩타이드, 예를 들어 단일 중쇄 가변성 도메인 또는 단일 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 구조물의 도메인을 포함한다. 상기 F(ab')₂ 또는 Fab는 C_H1과 C_L 도메인 사이에서 발생하는 분자간 이황화 상호작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 제작될 수 있다.

본 발명의 항체는 아미노산 서열에 기초하는 재조합 항체 도서관으로부터 유래될 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 인실리코(in silico)로 설계되고 합성으로 만들어진 핵산에 의해 암호화된다. 아미노산 서열의 인실리코 설계는 예를 들어, 인간 서열의 데이터베이스를 분석하고 이로부터 얻은 데이터를 이용하여 폴리펩타이드 서열을 창안함으로써 달성된다. 인실리코로 만들어진 서열을 설계하고 얻는 방법은 예를 들어, 문헌[Knappik 등, J. Mol . Biol . 296:57, 2000]; 문헌[Krebs 등, J. Immunol . Methods. 254:67, 2001], 문헌[Rothe 등, J. Mol . Biol . 376:1182, 2008] 및 2000 년도 이전에 Knappik 등에 의해 공개된 미국특허 제6,300,064호에서 개시되며, 이들의 전부가 참조로써 포함된다.

GM-CSF에 특이적인 임의의 항체는 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 항체는 미국특허출원 제11/914,599호에서 개시되며, 이는 전체가 참조로써 포함된다. 다른 예시적인 항체는 서열번호: 1에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 2에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 서열번호: 1에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 2에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로부터 유래된 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 동일한 특이성을 가지고/가지거나 서열번호: 1에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 2에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 서열번호: 1에서 묘사되는 서열에 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 상동하는 중연쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 서열번호: 2에서 묘사되는 서열에 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 상동하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.

서열번호 1 : Met Glu Leu Ile Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln GIn Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly The Thr Leu Arg Val Ser Ser Val Ser Gly Ser

서열번호 2 : Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Ile Gln Ser Gln Lys Phe Val Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Ala Trp Leu Gln Gin Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Thr Thr Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln GIn Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys Gly Glu Phe

본 발명에 사용될 수 있는 대안적 예시적인 항체는 서열번호: 3에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역(heavy chain variable region) 또는 서열번호: 4에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역(light chain variable region)을 포함하는 항체이다. 다른 예시적인 항체는 서열번호: 3에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 4에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로부터 유래된 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 동일한 특이성을 가지고/가지거나 서열번호: 3에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 4에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 서열번호: 3에서 묘사되는 서열에 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 상동하는 중연쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 서열번호: 4에서 묘사되는 서열에 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 상동하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.

서열번호 3 : 중(heavy) MOR

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVSGBENKYAGGATYYAASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFGTDFWGQGTLVTVSS

서열번호 4 : 경(light) MOR

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVLVIYKKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSAWGDKGMVFGGGTKLTVLGQ

본 발명에서 사용될 수 있는 대체가능한 예시적인 항체는 하기로부터 선택되는 H-CDR3 서열을 포함하는 항체이다.

서열번호 5 : Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp,

서열번호 6 : Ser Gly Leu Ile lie Asp Ala Leu Ser Pro,

서열번호 7 : Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr,

서열번호 8 : Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr,

서열번호 9 : Ser Gly Leu Ile Asn Leu Gly Met His Pro,

서열번호 10 : Ser Gly Leu Ile Phe Asp Ala Leu Arg Asp,

서열번호 11 : Ser Gly Leu Ile Phe Asp Lys Leu Thr Ser,

서열번호 12 : Ser Gly Leu Ile Asn Leu His Phe Asp Thr,

서열번호 13 : Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr,

서열번호 14 : Ser Gly Leu Ile Met Asp Lys Leu Asp Asn,

서열번호 15 : Ser Gly Leu Ile lie Asp Asn Leu Asn Pro, 및

서열번호 16 : Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr.

바람직하게는, 서열번호 5 내지 16 중 어느 하나로부터 선택되는 H-CDR3 서열을 포함하는 상기 항체는, 하기 H-CDR1 서열:

서열번호 17 : Asp Tyr Leu Leu His,

및/또는 하기 H-CDR2 서열:

서열번호 18 : Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly,

및/또는 하기 L-CDR1 서열:

서열번호 19 : Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile Leu Asn

및/또는 하기 L-CDR2 서열:

서열번호 20 : Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser

및/또는 하기 L-CDR3 서열을 부가적으로 포함한다.

서열번호 21 : Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg Thr

본 발명에서 사용될 수 있는 대체가능한 예시적인 항체는 하기 L-CDR1 서열:

서열번호 22 : Arg Ala Ser His Arg Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala

및/또는 하기 L-CDR2 서열:

서열번호 23 : Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr

및/또는 하기 L-CDR3 서열:

서열번호 24 : Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Val Thr

및/또는 하기 H-CDR1 서열:

서열번호 25 : Gly Tyr Ile Phe Pro Thr Phe Ala Leu His

및/또는 하기 H-CDR2 서열:

서열번호 26 : Ser Ile Asn Thr Ala Ser Gly Lys Thr Lys Phe Ser Thr Lys Phe Gln

및/또는 하기 H-CDR3 서열을 부가적으로 포함한다.

서열번호 27 : Asp Arg Phe Gln Asn Ile Met Ala Thr Ile Leu Asp Val

바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 22 내지 27의 모든 CRD를 포함한다.

상기 GM-CSF 수용체는 조혈소 수용체 상과의 일부이다. 이것은 헤테로다이머릭(heterodimeric)이며, 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된다. 상기 알파 서브유닛은 GM-CSF에 고도로 특이적이지만, 상기 베타 서부유닛은 IL3 및 IL5를 포함하는 다른 사이토킨(cytokine) 수용체와 함께 공유된다. 이는 상기 베타 수용체 서브유닛의 넓은 조직 분포를 나타낸다. 상기 알파 서브유닛, GM-CSFR α는 골수세포, 및 호중구, 대식 세포, 호산구, 수지상 세포, 상피 세포 및 기도 상피 세포와 같은 비조혈성 세포에서 최초 발현된다. GM-CSFR α의 전체길이는 유형 I 사이토킨 수용체 과에 속하는 400개의 아미노산 유형 I의 막 당단백질이고, 22 개의 아미노산 신호 펩타이드(위치 1-22), 298개의 아미노산 세포 밖의 영역(위치 23-320), 막횡단 영역(위치 321-345) 및 짧은 55 개의 아미노산 세포내의 영역으로 구성된다. 상기 신호 펩타이드는 GM-CSFR α의 성숙한 형태를 제공하도록 378개의 아미노산 단백질로서 절단된다. 인간 및 쥣과의 GM-CSFR α의 cDNA 클론이 사용될 수 있고, 단백질 수준에서 상기 수용체 서브유닛은 36 %의 동일성을 갖는다. GM-CSF는 상대적으로 낮은 친화성을 갖고 α서브유닛에 홀로(Kd 1-5nM) 결합할 수 있지만, β서브유닛에는 홀로 전혀 결합할 수 없다. 반면에, α 및 β서브유닛 모두의 존재하에서는 고도의 친화성 리간드 수용체 복합체(Kd >> 100 pM)를 낳는다. GM-CSF 신호는 상기 GM-CSFR α 쇄에 최초 결합한 후에, JAK-STAT 경로를 인산화하는 고친화성 상호작용을 발생시키도록 더 큰 서브유닛과 보통의 β 쇄가 가교되어 발생한다.

GM-CSF 수용체에 특이적인 임의의 항체는 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 항체는 서열번호: 28-46 중에서 묘사되는 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 다른 예시적인 항체는 서열번호: 29-46 중에서 묘사되는 H-CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체로부터 유래된 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 동일한 특이성을 가지고/가지거나 서열번호: 29-46 중에서 묘사되는 H-CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 예시적인 항체는 서열번호: 28-46 중에서 묘사되는 H-CDR3 서열에 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 상동하는 H-CDR3 서열을 포함하는 항체를 포함한다.

서열번호 28 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Ile Ala Tyr Arg Pro

서열번호 29 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu Arg Pro

서열번호 30 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr

서열번호 31 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Pro Tyr Arg Pro

서열번호 32 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu

서열번호 33 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Val Tyr Gly Leu

서열번호 34 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Ala Tyr Arg Pro

서열번호 35 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Val Thr Tyr Gly Leu

서열번호 36 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Arg Pro

서열번호 37 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Ile Thr Tyr Gly Leu

서열번호 38 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

서열번호 39 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

서열번호 40 : Leu Gly Ser Val Thr Ala Trp Ala Phe Asp Tyr

서열번호 41 : Ala Gly Ser Ile Pro Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

서열번호 42 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu

서열번호 43 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu

서열번호 44 : Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu His Leu

서열번호 45 : Val Gly Ser Val Ser Arg Ile Thr Tyr Gly Phe

서열번호 46 : Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu

특정 양태에서, 본 발명은 피험자의 골관절염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 GM-CSF 길항제를 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여 사용된 "피험자"는 임의의 포유류를 나타내며, 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey)(군 필리핀원숭이), 붉은털원숭이(뱅골원숭이) 또는 인간(호모사피엔스)과 같은 영장류 및 마우스 또는 쥐와 같은 설치류를 포함한다. 바람직하게, 상기 피험자는 영장류이며, 가장 바람직하게는 인간이다.

특정 양태에서, 본 발명은 골관절염으로 고통받는 또는 골관절염으로 고통받는 것처럼 보이는 피험자의 세포의 성장 및/또는 생존을 활성, 증식, 유도하는 GM-CSF의 능력에 대적할 수 있는 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 목적으로 하며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 항-GM-CSF 항체는 골관절염에서 GM-CSF의 임의의 역할에 적대감을 일으킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 피험자의 골관절염을 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 GM-CSF 길항제를 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여 사용된 "예방"은 질병의 시작을 막거나 질병의 시작을 지연시키는데 목적을 두는 방법을 나타낸다.

본 발명의 특정 양태는 골관절염의 치료에 유용한 GM-CSF 길항제를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다.

본 발명의 다른 양태는 골관절염의 치료를 위한 약제의 제조에 GM-CSF 길항제의 사용을 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 골관절염의 치료를 위한 GM-CSF 길항제를 제공한다.

본 발명의 상기 조성물은, 바람직하게는, 골관절염의 치료를 위한 GM-CSF 길항제 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이다. 이러한 담체, 희석제 및 부형제는 당해 분야에 잘 알려진 것이고, 숙련된 기술자는 본 발명의 GM-CSF 길항제로 피험자를 치료하는 가장 적합한 제제 및 투여 경로를 발견할 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 GM-CSF-/- 유전자형을 가지는 유전자 변형된 포유류를 제공한다. 구체적인 양태로, 상기 포유류는 마우스이다. 상기 용어 "녹아웃" 마우스(또는 포유류), 특정 유전자가 "파괴된" 마우스(또는 포유류), 및 "-/- 유전자형"을 갖는 마우스(또는 포유류)는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되고, 당해 분야에서 인정된다. 각각의 동물은 대립 형질 염색체 모두 상의 각각의 유전자에서, 여기서는 GM-CSF의 결핍이 있다.

GM-CSF-/-마우스의 생산

GM-CSF-/-마우스의 생산은 Stanley 등(1994)에 개시된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5592). 요약하자면, 파괴된(disrupted) GM-CSF 유전자와 함께 129/OLA 유래 ES 세포(H-2b)를 C57BL/6(H-2b) 숙주 배반포에 미량주입하여 키메라 마우스를 생산하였다. 돌연변이된 GM-CSF 유전자의 생식세포 전이자를 C57/BL6 마우스에서 11세대에 걸쳐 교배시키고, 실험을 위해 사용되는 GM-CSF-/-, GM-CSF+/-, GM-CSF +/+를 얻도록 만들어진 GM-CSF+/- 마우스를 교배했다. GM-CSF 유전자형의 상태는 테일(tail) DNA의 PCR 분석을 통해 결정되었다. 동물들에 일반적인 쥣과의 사료를 먹였고, 임의로 물을 급수하였고 한배에서 난 동일한 성을 가진 동물끼리 우리에 넣어두었다. 실험을 위해 두 성(sex)의 마우스의 나이를 8 내지 15주로 맞추었다.

골관절염에 대한 목표물로서 GM-CSF의 확인

골 관절염의 실험적 모델인 C57/BL6 마우스는 GM-CSF-/- 마우스와 비교했다(예를 들어, Mills 등, J Immunol 164:6166-6173, 2000 참조).

방법 : 마우스(군 당 n=10)는 -2일째 및 0일째에 좌측 무릎내의 관절 내로 콜라게나제를 수용했다(Blom 등, Arthritis Rheum 56:147-157, 2007). 42일째에 마우스를 죽였고, 무릎관절 조직을 모으고, 고정하고, 칼슘을 제거하고 파라핀에 담그고, 박편절단기(microtome)으로 7 μm의 크기로 절단했다. 관절의 병리학적 상태를 확인하기 위해 슬라이드를 사프라닌-오/패스트 그린(safranin-O/Fast Green)과 헤마토실린/에오신(haematoxylin/Eosin)으로 염색을 하였다. 병리학적 소견은 연골 손상, 활액막염, 골증식체 형성, 관절변형을 포함한다.

연골 병리에 대한 점수 시스템(scoring system)은 다음과 같다.

등급(Grade)

0 정상

1 불규칙하지만 온전함

1.5 거친 표면을 갖는 불규칙함

2 얕은 세동(superficial fibrillation)

2.5 연골층에 줄어든 세포수를 포함하는 얕은 세동

3 수직으로 벌어짐

3.5 분지 및/또는 수평으로 벌어짐, 최고수위로 파열

4 최고 수위까지 확장되지 않은 연골 소실

4.5 최고 수위까지 확장된 연골 소실

5 최고 수위를 넘어서 연골소실이 확장되었지만 뼈까지는 확장되지 않음

5.5 뼈까지 확장된 연골소실

6 골 소실/개조/변형

단계(Stage)

1 10% 미만의 면적이 손상

2 10 내지 25%의 면적이 손상

3 25 내지 50%의 면적이 손상

4 50 내지 75%의 면적이 손상

등급을 단계와 곱해주어 점수를 산출하였다.

이 점수 시스템은 임상적, 실험적 골관절염에서 골관절염의 조직병리를 평가하기 위한 공인된 방법에 기초한 것이었다(Pritzker 등(2006) Osteoarthritis Cartilage; 14;13-29 참조). 등급은 골관절염의 연골로의 진행 깊이로 정의된다. 단계는 관련된 연골의 양적인 정도, 즉, 얼마나 많은 연골이 영향을 받았는지로 정의된다. 골관절염의 심각성과 정도의 복합적인 평가를 나타내기 위해서, 전체적인 점수를 산출하기 위해 등급을 단계와 곱한다. 마우스 한 마리당 최대 여섯 부위에서 점수를 매겼다.

결과: 이러한 관절의 검사는 GM-CSF-/- 마우스에서 대조군 마우스에 비해 보다 적은 무릎관절 병리를 보인다는 것을 보여주었고, 이는 보통의 골 골관절염 병리 및 진행에서 GM-CSF의 역할을 나타낸다. C57/BL6 마우스에서 관찰된 병리는 연골층, 골증식체 형성, 관절의 변형 및 활액막에 극심한 손상을 포함한다. 상기 GM-CSF-/- 마우스는 골증식체 형성 또는 관절의 변형을 보이지 않았고, 보다 적은 연골 손상 및 활액막을 보였다.

다른 영역에서 관절의 손상에 대한 양적 데이터는 도 1에서 보여진다. 대표적인 조직학은 도 2(건강한 대조군 무릎), 도 3(C57/BL6의 좌측 무릎) 및 도 4(GM-CSF-/-의 좌측 무릎)에서 보여진다. GM-CSF 유전자가 결손된 마우스는 C57BL/6 마우스와 비교할 때 콜라게나제로 유래된 골관절염 병리가 보다 적게 발달되었다.

요약하자면, GM-CSF-/- 마우스는 골관절염을 앓는 실험용 모델에서 C57/BL6 마우스와 비교할 때 무릎관절 병리의 눈에 띄는 감소를 보여주었고, 골관절염에 대한 치료적 간섭을 목적으로 하는 약물로서 GM-CSF가 승인되었다.

골관절염의 치료에서 GM-CSF 길항제의 치료적 효과

이 실험에서, 우리는 GM-CSF 길항제가 골관절염의 치료에 효과적일 수 있다는 것을 증명하기 위하여 GM-CSF에 특이적인 단일클론 항체를 사용했다.

콜라겐-유발 골관절염 마우스 모델:

C57/BL6 마우스는 관절의 불안정을 유도하기 위해 1 단위의 콜라게나제류 VII을 0일째 및 2일째에 우측 무릎의 관절 내에 주입하였다(Blom 등, (2004) Osteoarthritis Cartilage. 12; 627-35 참조).

항-GM-CSF 항체로 처치:

20마리의 마우스는 무작위로 2개의 군으로 나뉘었다(10 마리의 마우스/군).

군 1(n=10): 항-GM-CSF 항체(22E9)

군 2(n=10): IgG2a 동기준 표본 대조군 항체.

마우스에 6주 동안 일주일에 3번씩 마우스 한마디랑 250 μg의 항-GM-CSF 항체(22E9) 또는 IgG2a 동형(isotype) 대조군 항체를 복강 내에 투여하였다. 처치는 골관절염의 유도 4일 전부터 시작하였다(예방). 즉, -4일째, -2일째, 0일째(첫 번째 콜라게나아제를 주입한 날)에 쥐를 처치하였다. 2, 4, 6주째에 마우스에서 채혈을 하였다. 항체 함량 및 22E9에 대한 항체면역원성에 대하여 혈청을 검사할 것이다. 대조군 항체와 항-GM-CSF 항체는 10 내독소단위(endotoxin unit)/ml 미만의 값을 가지도록 정제되었다.

예시적인 항-GM-CSF 항체로서 상기 항체 22E9를 사용했다. IgG2a 대조군에 대한 22E9는 쥐 항-마우스 GM-CSF 특이 항체이다. IgG2a 대조군인 22E9는 쥐의 항-마우스 GM-CSF에 특이적인 항체이다. 22E9는 AbD Serotec(Martinsried, Germany; Cat.No. 1023501)에서 구입하였다. eBioscience(SanDiego, CA, USA, Cat.No. 14-7331)과 같은 대체 구입처도 존재하였다.

조직학:

마지막 주사 후 6주째에, 마우스 무릎관절에 대한 조직학적 분석을 수행하였다. 무릎관절 조직을 모으고, 고정하고, 칼슘을 제거하고 파라핀에 담그고, 박편절단기(microtome)으로 7 μm의 크기로 절단했다. 관절의 병리학적 상태를 확인하기 위해 슬라이드를 사프라닌-오/패스트 그린(safranin-O/Fast Green)과 헤마토실린/에오신(haematoxylin/Eosin)으로 염색을 하였다. 병리학적 소견은 연골 손상, 활액막염, 골증식체 형성, 관절변형을 포함한다.

연골 병리에 대하여 실싱예 2에서와 같은 동일한 점수 시스템을 사용했다. 점수를 주기 위하여 단계마다 등급을 곱했다.

활막염에 대한 점수 시스템은 다음과 같다(활막층 점수 시스템).

0 정상적인 관절에 비해 차이가 없음

1 활막선(synovial lining)의 비후(thickening) 및 염증세포의 일부 유입

2 활막선의 비후 및 염증세포의 중간 정도의 유입

3 활막선의 비후 및 염증세포의 최대로 관찰된 유입

통증측정:

골관절염 모델에서 이용되는 통증의 지표는 무력화도 측정기를 이용한 중량의 구별되는 분포이다. 이 장치는 후지가 움직이는 것과 반대쪽에서 움직이는 것, 움직이지 않은 것 사이의 중량분포의 변화를 측정한다. 쥐를 장치에 적응시키기 위해 실험 전에 3번을 순응하도록 하였다. 각각의 후지에 가해진 중량을 5초마다 측정하였다. 각각의 시간마다 마우스 한 마리마다 3번의 분리된 측정을 하였고 이것을 평균 내었다. 측정은 실험기간 동안 일주일에 2번씩 수행하였다. 결과는 콜라게나제 주사된 다리/대조군 다리 x 100으로서 표시되었다.

결과

외측 대퇴골, 외측 경골, 내측 경골과 같은 조직학적 분석이 된 모든 영역에서(내측 대퇴골제외) 항-GM-CSF 항체로 처리된 마우스에서 적은 이상을 보이는 명백한 경향이 나타났다. 결과는 도 5에 나와있다.

관절염과 관련된 통증의 측정을 위한 중량 분배의 평가에서, mAb로 처치된 대조군에 비해 항-GM-CSF mAb로 처치된 군에서 27일째 이후부터 관절염이 걸린 무릎으로부터 멀리 중량이 현저하게 이동한다는 것이 나타났다. 결과는 도 6에 나와있다.

GM-CSF 길항제에 의해 처치된 마우스는 대조군 항체에 의해 처치된 마우스와 비교했을 때 더 적은 이상을 보였다. 또한, GM-CSF 길항제에 의해 처치된 마우스는 대조군 항체에 의해 처치된 마우스와 비교했을 때 질병의 후기 단계에서 현저하게 적은 통증을 보였다. 동형 대조군 항체로 처치된 마우스에서는 GM-CSF 특이적인 항체가 투여된 마우스와 비교했을 때 현저하게 증가된 골관절염의 증상을 보였다. 이것은 GM-CSF 길항제가 골관절염의 치료에 효과적이라는 것을 증명한다.

서열번호: 1 또는 2를 포함하는 GM-CSF 특이 항체의 치료적 효과

실시예 3을 반복했다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호: 1에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역(heavy chain variable region) 또는 서열번호: 2에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역(light chain variable region)을 포함하는 GM-CSF 특정 항체를 사용했다. 마우스 말고 다른 종을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 본 실험에서 사용되는 항체와 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 실험에서 사용되는 상기 동물은 쥐이다.

동형 대조군 항체로 처리된 동물들은 서열번호: 1에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 2에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 GM-CSF 특정 항체가 수용된 동물과 비교할 때, 골관절염의 상당히 증가된 징후를 보여준다. 이러한 것은 골관절염의 치료에 있어서, 항체의 효과를 입증한다.

서열번호: 3 또는 4를 포함하는 GM-CSF 특이 항체의 치료적 효과

실시예 3을 반복했다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호: 3에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 4에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 GM-CSF 특이 항체를 사용했다. 마우스 말고 다른 종을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 본 실험에서 사용되는 항체와 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 실험에서 사용되는 상기 동물은 쥐이다.

상기 동물들, 예를 들어 동형 대조군 항체로 처리된 쥐는 서열번호: 3에서 묘사되는 아미노산 서열의 중연쇄 가변 영역 또는 서열번호: 4에서 묘사되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 GM-CSF 특정 항체가 수용된 동물과 비교할 때, 골관절염의 상당히 증가 된 징후를 보여준다. 이러한 것은 골관절염의 치료에 있어서, 항체의 효과를 입증한다.

서열번호: 5-20을 포함하는 GM-CSF 특이 항체의 치료적 효과

실시예 3을 반복했다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호 5 내지 16 중에서 선택되는 H-CDR3 서열을 포함하는 GM-CSF 특이 항체를 사용했다. 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 16의 H-CDR1 서열, 및/또는 서열번호 17의 H-CDR2 서열, 및/또는 서열번호 18의 L-CDR1 서열, 및/또는 서열번호 19의 L-CDR2 서열, 및/또는 서열번호 20의 L-CDR3 서열을 더 포함한다. 마우스 말고 다른 종을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 본 실험에서 사용되는 항체와 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 실험에서 사용되는 상기 동물은 쥐이다.

상기 동물, 예를 들어 동형 대조군 항체로 처리된 쥐는 본 실시예에 따른 GM-CSF 수용체 특이 항체가 수용된 동물과 비교할 때, 골관절염의 상당히 증가된 징후를 보여준다. 이러한 것은 골관절염의 치료에 있어서, 항체의 효과를 입증한다.

서열번호: 21-26을 포함하는 GM-CSF 특이 항체의 치료적 효과

실시예 3을 반복했다. GM-CSF 길항제로서, 서열번호 22의 L-CDR1 서열, 및/또는 서열번호 23의 L-CDR2 서열, 및/또는 서열번호 24의 L-CDR3 서열. 및/또는 서열번호 25의 H-CDR1 서열, 및/또는 서열번호 26의 H-CDR2 서열, 및/또는 서열번호 27의 H-CDR3를 포함하는 GM-CSF 특이 항체를 사용했다. 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 22 내지 28의 모든 CRD들을 포함한다. 마우스 말고 다른 종을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 본 실험에서 사용되는 항체와 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 실험에서 사용되는 상기 동물은 쥐이다.

상기 동물들, 예를 들어 동형 대조군 항체로 처리된 쥐는 본 실시예에 따른 GM-CSF 수용체 특이 항체가 수용된 동물과 비교할 때, 골관절염의 상당히 증가된 징후를 보여준다. 이러한 것은 골관절염의 치료에 있어서, 항체의 효과를 입증한다.

GM-CSF 수용체에 특이적인 항체의 치료적 효과

GM-CSF에 특이적인 단일클론 항체 대신에 GM-CSF 수용체에 특이적인 단일클론 항체를 사용하는 차이점을 가지고 실시예 3을 반복했다.

GM-CSF 길항제로서, 서열번호: 27-45 중 어느 하나로 묘사되는 H-CDR3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 GM-CSF 수용체 특이 항체가 사용했다. 마우스 말고 또 다른 종을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 본 실험에서 사용되는 항체와 교차반응하는 종을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 실험에서 사용되는 상기 동물 종은 쥐이다.

상기 동물들, 예를 들어 동형 대조군 항체로 처리된 쥐는 본 실시예에 따른 GM-CSF 수용체 특이 항체가 수용된 동물과 비교할 때, 골관절염의 현저히 증가된 징후를 보여준다. 이러한 것은 골관절염의 치료에 있어서, 항체의 효과를 입증한다.

임상실험

임상실험은 무릎 골관절염으로 고통받고 있는 성인 환자에게서 수행되었다. 무작위법, 이중 맹검법, 플라세보 통제된 임상실험의 목적은 무릎 골관절염 진단을 받은 총 30명의 환자의 전체적인 골관절염의 완화 및 삶의 질에 대해서, 본 발명의 GM-CSF 길항제 및 플라세보의 비교를 통한 차이점을 확인하는 것이다. 또 다른 목적은 부작용, 신체검사 및 바이탈 사인을 확인함으로써 본 발명의 GM-CSF 길항제의 안정성 및 내성을 확인하는 것이다.

방법:

실험을 하기 1달 전에, 무릎 골관절염의 임상진단 및 적어도 15일 동안 무릎 골관절염을 갖는다고 확인된 40살 이상인 30명의 환자가 본 연구를 위해 채택되었다. 환자들은 치료적 유효량의 GM-CSF 길항제 또는 플라세보를 수용한다(예, 약 6달 동안 2주마다 한번씩).

웨스턴 온타리오(Western Ontario) 대학 및 맥마스터(McMaster) 대학교의 골관절염 지수(WOMAC; Bellmy 등, J Rheumatol 15(12):1833-40, 1988) 및 SF-36v2 삶의 질 등급(Quality Metric Health Outcomes Solutions, Lincoln, RI)를 연구에서 사용했다. 상기 WOMAC는 질병-특이적, 자가 투여, 건강 상태 측정이다. 이는 둔부 및/또는 무릎의 골관절염을 앓는 환자에게서 통증, 경직성 및 신체 기능의 임상적으로 중요한 증상을 조사한다. 상기 지수는 24개의 질문으로 구성되고(5-통증, 2-경직성 및 17-신체 기능), 5 분 미만의 시간에 완료될 수 있다. WOMAC는 다양한 간섭(약학상의, 영양상의, 수술의, 물리치료 등) 이후에 건강 상태에서 임상적으로 중요한 변화를 감지하기 위한 유효하고, 신뢰할 수 있는, 민감한 기구이다. 상기 WOMAC 설문지는 둔부 또는 무릎 골관절염 상의 간섭의 효과를 평가하기에 유효하다. 상기 삶의 질의 SF-36v2 는 36개의 질문으로 이루어진 다목적의 간단한 건강 설문조사이다. 이는 기능상의 건강 및 행복 점수의 8단계 프로파일로 산출될 뿐만 아니라 정신측정학상으로 기초된 신체 및 정신 건강의 간략한 측정 그리고 선호도에 기초한 건강 효용 지수도 8단계 프로파일로 산출된다. 이것은 특정 나이, 질병 또는 처치 군을 목표로 삼는 것과는 대조적으로 전반적인 측정이다. 그래서, 상기 SF-36v2는 질병의 상대적인 존재량과 비교할 때 보편적이고 특정한 인구의 설문조사 및 광범위한 상이한 처치에 의해 생기는 건강상의 이익을 구별하는 것에 유용하다고 증명되었다. 상기 SF-36v2는 다음의 양태 및 건강상의 일부분; 신체 건강(신체 기능, 신체 역할, 몸의 골관절염 및 종합적 건강으로 구성됨) 및 정신 건강(활력, 사회적 기능, 감정적 역할 및 정신 건강의 역할로 구성됨)에 대한 정보를 산출한다.

결과:

몸의 통증의 변화 : SF-36v2 몸의 통증의 호전은 플라세보로 처치한 것과 비교할 때 본 발명의 GM-CSF 길항제로 처치한 환자에게서 통계학적으로 상당한 호전이 있다. 높은 점수가 더 좋으며, 그 이유는 상기 산물을 복용한 이후에 보다 적은 통증을 환자가 느낀다는 것을 의미하기 때문이다. 플라세보로 처치한 군과 비교할 때 본 발명의 GM-CSF 길항제를 수용한 군에서 몸의 통증 점수가 통계학적으로 상당한 진전이 있다.

신체 역할 점수의 변화 : 상기 플라세보와 비교할 때 본 발명의 GM-CSF 길항제의 우수한 효과는 신체 건강(신체 역할) 때문에 역할 제한의 면에서 8주, 12주 및 20주째에 통계학적으로 상당하다. 높은 점수가 더 좋으며, 그 이유는 환자가 신체상의 호전 및 일상 생활의 활동에서 고통받는 제한의 감소를 의식하는 것을 의미하기 때문이다. 상기 플라세보로 처치한 군과 비교할 때 본 발명의 GM-CSF 길항제를 수용한 군에서 신체 역할 점수의 통계학적으로 상당한 진전이 있다.

총 WOMAC 점수의 변화 : 본 발명의 GM-CSF 길항제로 처치된 군의 총 WOMAC 점수는 플라세보 군의 총 WOMAC 점수보다 통계학적으로 상당히 더 좋다(낮은 점수가 더 좋음).

WOMAC ADL의 변화 : 일상 생활의 활동의 호전(WOMAC ADL 개별점수로 측정됨)은 상기 플라세보로 처치된 군보다 본 발명의 GM-CSF 길항제로 처치된 군에서 더 크다. 상기 플라세보로 처치된 군과 비교할 때, 본 발명의 GM-CSF 길항제로 처치된 군에서 WOMAC ADL 점수의 통계학적으로 상당한 진전이 있다(낮은 점수가 더 좋음).

결론:

상기 임상 실험은 무릎 골관절염을 앓는 환자의 삶의 질을 향상시키는데에 본 발명의 GM-CSF 길항제의 효능을 보여준다. 또한, 상기 임상실험의 결과는 심각한 부작용이 발견되지 않는, 산물의 안정성 및 내성을 보여준다.

또한, 본 발명의 GM-CSF 길항제의 효능은, 본 발명의 GM-CSF 길항제가 다른 종에서 교차 반응을 하는지에 대한 연구를 통해서 밝혀질 수 있고; 본 발명의 GM-CSF 길항제가 Il-1 유도된 아그레칸(agrecan) 저하를 억제하는 능력을 결정하기 위한 시험관 내 연구를 이용함으로써 밝혀질 수 있으며, 이는 연골세포 배양 조직 상에서 분석이 행해진다.

당해 기술자는 본 명세서에서 개시된 발명이 구체적으로 개시된 것과 다른 변화 및 변형을 할 수 있다고 인식할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변화 및 변형을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 나타내거나 표시된 모든 단계, 모든 특징, 모든 조성물 및 모든 화합물을 개별적으로 또는 전체로 포함하며, 그리고 두 개 이상의 상기 단계 또는 특징의 모든 가능한 조합을 포함한다.

SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF MELBOURNE HAMILTON, John (US Only) COOK, Andrew (US Only) <120> OSTEOARTHRITIS TREATMENT <130> 30898448/EJH <150> US 61/139,679 <151> 2008-12-22 <150> US 61/164,486 <151> 2009-03-30 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of heavy chain variable region <400> 1 Met Glu Leu Ile Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His 1 5 10 15 Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 20 25 30 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp 50 55 60 Ile Gly Tyr Ile Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Glu 65 70 75 80 Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 85 90 95 Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ala Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Arg Val Ser Ser 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Claims

GM-CSF 길항제의 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 피험자의 골관절염을 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 피험자는 인간인 것을 특징으로 하는 피험자의 골관절염을 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 피험자는 마우스인 것을 특징으로 하는 피험자의 골관절염을 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 길항제는 GM-CSF에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 피험자의 골관절염을 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 길항제는 GM-CSF 수용체에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 피험자의 골관절염을 치료하는 방법.