BRPI0918356B1

BRPI0918356B1 - Uso de um antagonista de gm-cfs

Info

Publication number: BRPI0918356B1
Application number: BRPI0918356-6A
Authority: BR
Inventors: John Allan Hamilton; Andrew David Cook
Original assignee: The University Of Melbourne
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2022-03-08
Also published as: RU2712273C2; EP3056217B1; RU2011127334A; ES2572368T3; JP5727379B2; EP2376121A1; JP6458086B2; SI2376121T2; RU2016102339A3; EP2376121A4; KR101799264B1; HRP20160577T4; HK1226938A1; KR101898982B1; US20180066062A1; WO2010071924A1; HUE028615T2; ES2572368T5; HRP20160577T1; DK2376121T3

Abstract

uso de um antagonista de gm-cfs.0 a presente invenção refere-se geralmente a um método para o tratamento e/ou profilaxia para osteoartrite (oa). de acordo com a presente invenção, um antagonísta de gm-csf pode ser eficaz no tratamento de osteoartrite. um antagonista de gm-csf inclui, entre outros, um anticorpo que é específico contra o gm-csf ou o receptor de gm-csf. a presente invenção ainda provê animais transgênicos, tais como um camundongo knock-out gm-csf, útil para os antagonistas de teste em certos modelos da doença.

Description

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano No 61/139.679, depositado em 22 de dezembro de 2008, e Pedido Provisório Norte-Americano No 61/164.486, depositado em 30 de março de 2009, ambas incorporadas por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se geralmente a um método para o tratamento e/ou profilaxia para osteoartrite (OA). De acordo com a presente invenção, um antagonista de GM-CSF pode ser eficiente no tratamento de osteoartrite. Um antagonista de GM-CSF inclui, entre outros, um anticorpo que é específico contra o GM-CSF ou o receptor de GM-CSF. A presente invenção ainda provê animais transgênicos, tais como um camundongo knock-out de GM-CSF, útil para antagonistas para teste em certos modelos da doença.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[003] Osteoartrite (OA), também conhecida como artrite degenerativa, é uma doença mais predominante em idosos e obesos. A OA é uma doença nas articulações, porém, diferente da artrite reumatóide (AR), a doença não é sistêmica, que geralmente afeta apenas uma ou algumas articulações. A doença resulta em total destruição da cartilagem articular, esclerose dos ossos subjacentes, formação de osteófito, que resulta em perda de movimento e dor. Normalmente, o resultado final é a necessidade de substituição total da articulação.

[004] A OA afeta aproximadamente 21 milhões de pessoas nos Estados Unidos, compreende 25% de todas as consultas em clínico geral e contabiliza 50% de todas as prescrições de NSAIDs (drogas anti-inflamatórias não esteroidais). Atualmente, não há nenhum tratamento disponível que reduza ou interrompa a progressão da doença, as drogas atuais tratam meramente os sintomas. A incidência e a gravidade da doença aumentam com a idade. Aos 65 anos de idade, 80% dos americanos apresentam evidência radiográfica de OA, sendo que apenas 60% deles serão sintomáticos. 65% de todas as doenças articulares após os 65 anos são OA. Em 2006, houve 735.000 hospitalizações nos Estados Unidos relacionadas à OA.

[005] As drogas atuais para OA tratam os sintomas de OA ao invés da doença em si. As drogas comumente utilizadas no tratamento de OA incluem drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs), tais como diacerein, voltaren, mobic e arthrotec (nomes genéricos: diclofenac, misoprostol, meloxicam). As NSAIDs são principalmente compostos orais que atuam inibindo a síntese de prostaglandina no sistema nervoso central (SNC). Outras drogas comumente utilizadas incluem analgésicos não- narcóticos, tais como ultram (tramadol), inibidores da COX-2, tais como celebrax e arcoxia (celecoxib, etoricoxib), analgésicos narcóticos, tais como duragesic (fentanil dextropropoxifeno), ácido hialurônicos, tais como suparts, hyalgan, orthovisc e synvisc (Hylan G-F20), e corticosteroides, tais como prednisolona e metilprednisolona. Tratamentos atuais para OA pretendem evitar a necessidade de cirurgia por meio da engenharia de tecidos, tais como transplante de condrócitos, no entanto, esses tratamentos são aplicáveis apenas para o tratamento do último estágio da OA. Outras abordagens no tratamento da OA que são consideradas incluem proloterapia, na qual um irritante, tal como a dextrose, é injetada na articulação afetada, causando assim uma reação inflamatória aguda, mas também reforçando e possivelmente cicatrizando os tecidos, ligamentos, tendões e cartilagem. Portanto, existe uma grande necessidade médica não atendida para o tratamento da OA.

[006] Sabe-se que algumas citocinas estão envolvidas com a osteoartrite (Blom et al., Current Drug Targets (2008) 8:283). Algumas citocinas, tais como IL-1, uma citocina “destrutiva”, e o fator de crescimento anabólico que transforma o fator de crescimento β (TGF β) são considerados alvos medicamentosos em potencial.

[007] O fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos (GM-CSF) é uma citocina que atua como um fator de crescimento de leucócitos. O GM-CSF estimula as células-tronco a produzir granulócitos (neutrófilos, eosinófilos, e basófilos) e monócitos. Os monócitos saem da circulação e migram para o tecido, no qual eles se transformam em macrófagos. Portanto, é parte do efeito cascata inflamatória/imune natural, cuja ativação de um pequeno número de macrófagos, pode resultar rapidamente em um aumento de seus números, um processo crucial para o combate contra a infecção. A forma ativa de GM-CSF é encontrada de forma extracelular como um homodímero. Especificamente, o GM-CSF foi identificado como um mediador inflamatório em distúrbios autoimunes, como a artrite reumatoide (RA), resultando em um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e proteases, e então, por último, a destruição articular.

[008] WO 06/0234412 revela diversos biomarcadores para osteoartrite, identificados por micro-arranjos de proteína. Um dos biomarcadores identificados é o GM-CSF, cuja regulação quatro vezes superior é relatada no tecido de OA. No entanto, não é fornecida nenhuma indicação ou sugestão de que o GM-CSF também possa ser um ponto para intervenção terapêutica, e uma mera regulação quatro vezes superior no tecido de OA, conforme identificado com a tecnologia revelada em WO 06/0234412, também não a sugere. Em uma veia relacionada, Devalaraja et al (US20020141994A1) menciona a OA superficialmente em uma vasta lista de indicações potencialmente adequadas para o tratamento com antagonistas de fatores estimulantes de colônia. A lista de indicações inclui aterosclerose, sepse, asma, doença autoimune, osteoporose e artrite reumatoide. Além de outros fatores estimulantes de colônia, tais como M-CSF e G-CSF, o GM- CSF é um dos fatores estimulantes de colônia mencionado em Devalaraja et al. Com certeza, Devalaraja et al. não inclui nenhum dado ou outros discernimentos, uma vez que o antagonista de GM-CSF seria apropriado para tratar um indivíduo que apresenta OA.

RESUMO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção, pela primeira vez, demonstra que GM- CSF é um alvo válido para o tratamento de OA. Este achado é novo, e a prioridade não ensina, sugere ou provê qualquer motivo para tal ponto de intervenção no tratamento de OA. Assim, a invenção provê, por exemplo, um método para o tratamento de osteoartrite em um indivíduo, o dito método compreende a etapa de administração de uma quantidade eficiente de um antagonista de GM-CSF ao dito indivíduo.

[0010] Em outro aspecto, a presente invenção contempla um método para a profilaxia de osteoartrite em um indivíduo, o dito método compreende a etapa de administração de uma quantidade eficiente de um antagonista de GM-CSF ao dito indivíduo.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma composição compreendendo um antagonista de GM-CSF capaz de antagonizar a habilidade de GM-CSF de ativar, proliferar, induzir crescimento e/ou sobrevida de células em um indivíduo que apresenta osteoartrite, ou suspeita-se que apresente osteoartrite, a dita composição ainda compreende um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis e/ou diluentes.

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma composição que compreende um antagonista contra GM-CSF útil no tratamento de osteoartrite, a dita composição ainda compreende um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis e/ou diluentes.

[0013] Em aspectos específicos da presente invenção, o antagonista de GM-CSF é um anticorpo específico contra GM-CSF.

[0014] Em aspectos alternativos da presente invenção, o antagonista de GM-CSF é um anticorpo específico contra o receptor de GM-CSF.

[0015] Em outros aspectos, a presente invenção é direcionada ao uso de um antagonista de GM-CSF na preparação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite.

[0016] Em outros aspectos, a presente invenção provê os antagonistas de GM-CSF para o tratamento de osteoartrite.

[0017] Por toda esta especificação, exceto se o contexto exigir de outro modo, as palavras “compreender”, “apresentar” e “incluir” e suas respectivas variações, tais como “compreende”, “compreendendo”, “apresenta”, “apresentando”, “inclui” e “incluindo” serão compreendidas para sugerir a inclusão de um elemento indicado ou inteiro, ou grupo de elementos ou inteiros, mas sem a exclusão de qualquer outro elemento ou inteiro ou grupo de elementos ou inteiros.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] A figura 1 ilustra dados quantitativos para lesão articular em diferentes regiões avaliadas para pontuação histológica. A configuração experimental e o sistema de pontuação são descritos no Exemplo 2 “Lat.” representa lateral, “Med.” representa medial. A análise estatística foi realizada por meio de Mann-Whitney. Os dados são estatisticamente significativos para Fêmur Lat. (p= 0,02), Tíbia Lat (p= 0,003), Tíbia Med. (p=0,001), e todas as regiões (Meio p= 0002).

[0019] A figura 2 ilustra seções histologicamente exemplares de joelhos controle saudáveis. A magnificação é de 100 vezes. Nenhuma lesão cartilaginosa, formação de osteófito, sinovite ou deformações podem ser observadas. S = alinhamento sinovial, C = camada cartilaginosa.

[0020] A figura 3 ilustra seções histologicamente exemplares dos joelhos esquerdos de camundongos C57/BL6 em um modelo de OA induzida por colagenase. A magnificação das seções individuais é indicada nas Figuras. O topo da lista de ilustrações mostra que lesão cartilaginosa, formação de osteófito e sinovite são evidentes. O = osteófito. S = alinhamento sinovial. A parte inferior das ilustrações mostra que a deformação articular também está presente.

[0021] A figura 4 ilustra seções histologicamente exemplares dos joelhos esquerdos de camundongos GM-CSF-/- em um modelo de OA induzida por colagenase. A magnificação das seções individuais é indicada nas Figuras. Conforme pode ser observado, as anormalidades e/ou lesões são muito menos graves se comparadas aos camundongos de C57/BL6 (vide Figura 3) e são comparáveis ao camundongo controle saudável (vide Figura 2). O = osteófito. S = alinhamento sinovial.

[0022] A figura 5 ilustra a pontuação histológica da articulação do joelho do tratamento terapêutico com um anticorpo contra GM-CSF em um modelo de camundongo de OA. Lat.= Lateral. Med.= Medial. Os resultados são expressos como meio ± SEM. Conforme pode ser observado, camundongos tratados com anticorpo anti-GM-CSF apresentam menos doença.

[0023] A figura 6 ilustra os resultados de um experimento que avalia a distribuição do peso dos membros superiores em um medidor de incapacitância. Os dados são significativos (t-teste ímpar) do dia 27 após a indução de OA em diante, conforme indicado no gráfico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0024] A presente invenção demonstra que o GM-CSF é um alvo válido para o tratamento de OA. A respeito disso, a invenção provê, em um aspecto, métodos de utilização de um antagonista de GM-CSF para realizar benefício terapêutico ou profilático na área da OA.

[0025] A presente invenção provê métodos terapêuticos compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um antagonista de GM-CSF em um indivíduo que necessita de tal tratamento. Uma “quantidade terapeuticamente eficiente” ou “quantidade eficiente”, conforme utilizado neste documento, referem-se à quantidade de um antagonista de GM-CSF necessária para obter a resposta biológica desejada. De acordo com a invenção do indivíduo, a quantidade terapêutica eficiente é a quantidade de um antagonista de GM-CSF necessária para tratar e/ou prevenir a osteoartrite.

[0026] “Antagonistas de GM-CSF”, conforme usados na presente invenção, incluem antagonistas de GM-CSF em seus sentidos mais amplos; qualquer molécula que inibe a atividade ou a função do GM-CSF, ou que por qualquer outra forma exerce um efeito terapêutico no GM-CSF está incluída. O termo antagonistas de GM-CSF inclui, entre outros, anticorpos que se ligam especificamente ao GM-CSF, ácidos nucléicos inibidores específicos para GM-CSF ou pequenas moléculas orgânicas específicas para GM-CSF. Também dentro do sentido do termo antagonista de GM-CSF estão os anticorpos que se ligam especificamente ao receptor de GM-CSF, ácidos nucléicos inibidores específicos para o receptor de GM-CSF ou pequenas moléculas orgânicas específicas para o receptor de GM-CSF.

[0027] Ácidos nucléicos inibidores incluem, entre outros, DNA anti- sentido, oligonucleotídios formadores triplex, sequências de guia externa, siRNA e microRNA. Os ácidos nucléicos inibidores úteis incluem aqueles que reduzem a expressão RNA que codifica GM-CSF em pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento quando comparados aos controles. Ácidos nucléicos inibidores e os métodos que os produzem são bem conhecidos na técnica. Existe o software de projeto siRNA.

[0028] Pequenas moléculas orgânicas (SMOLs) específicas para GM- CSF ou para o receptor de GM-CSF podem ser identificadas por meio da peneiração do produto natural ou pela peneiração das bibliotecas químicas. Tipicamente, o peso molecular das SMOLs é abaixo de 500 Dalton, mais tipicamente entre 160 e 480 Daltons. Outras propriedades típicas das SMOLs são uma ou mais das seguintes: • O coeficiente de partição log P está então na faixa entre - 0,4 e +5,6.

[0029] • A refratividade molar está entre 40 e 130.

[0030] O número de átomos está entre 20 e 70.

[0031] Para revisões, consultar Ghose et al, J Combin .Chem: 1:5568, 1999 e Lipinski et al, Adv Drug Del Rev: 23:3-25, 1997.

[0032] Preferivelmente, um antagonista de GM-CSF para uso na presente invenção é um anticorpo específico para GM-CSF ou específico para o receptor de GM-CSF. Este anticorpo pode ser de qualquer tipo, como um murino, um rato, um quimérico, um anticorpo humanizado ou humano. Um anticorpo “humano” ou um fragmento funcional de anticorpo humano é definido na presente invenção como um que não seja quimérico (por exemplo, não “humanizado”) e não de (seja no total ou em parte) uma espécie não humana. Um anticorpo humano ou fragmento funcional de anticorpo pode ser obtido de um humano ou pode ser um anticorpo humano sintético. Um “anticorpo humano sintético” é definido na presente invenção como um anticorpo tendo uma sequência obtida, no total ou em parte, in silico a partir de sequências sintéticas que se baseiam na análise de conhecidas sequências de anticorpos humanos. O projeto in silico de uma sequência de anticorpo humano ou de seu fragmento pode ser obtida, por exemplo, analisando uma base de dados de anticorpos humanos ou de sequências de fragmentos de anticorpos e visando uma sequência polipeptídica que utiliza os dados daí obtidos. Outro exemplo de um anticorpo humano ou fragmento funcional de anticorpo é aquele codificado por um ácido nucléico isolado de uma biblioteca das sequências de anticorpo de origem humana (isto é, essa biblioteca se baseando em anticorpos tomados de uma origem natural humana).

[0033] Um “anticorpo humanizado” ou fragmento funcional de anticorpo humanizado é definido na presente invenção como um que é (i) derivado de uma origem não humana (por exemplo, um camundongo transgênico que transporta um sistema imuno heterólogo), cujo anticorpo se baseia em uma sequência de linha genética humana; ou (ii) quimérico, onde o domínio variável é obtido de uma origem não humana e o domínio constante é obtido de uma origem humana ou (iii) CDR-enxertado, onde os CDRs do domínio variável são de uma origem não humana, enquanto uma ou mais frameworks do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (se houver) é de origem humana.

[0034] O termo “anticorpo quimérico” ou fragmento funcional de anticorpo quimérico é definido na presente invenção como uma molécula anticorpo que tem regiões de anticorpo constantes obtidas, ou correspondentes, às sequências encontradas em uma espécie e regiões de anticorpo variáveis obtidas de outras espécies. Preferivelmente, as regiões de anticorpo constantes são obtidas, ou correspondentes, às sequências encontradas em humanos, por exemplo na linha genética humana ou células somáticas, e as regiões de anticorpo variável (por exemplo VH , VL , regiões CDR ou FR) são obtidas de sequências encontradas em um animal não humano, por exemplo um camundongo, rato, coelho ou hamster.

[0035] Conforme usados na presente invenção, um anticorpo “liga-se especificamente a”, “especificamente liga-se a”, é “específico para” ou “reconhece especificamente” um antígeno (aqui, GM-CSF ou alternativamente, o receptor de GM-CSF) se esse anticorpo pode discriminar entre esse antígeno e um ou mais antígeno(s) de referência, já que a especificidade de ligação não é uma propriedade absoluta, mas uma propriedade relativa. O(s) antígeno(s) de referência pode(m) ser um ou mais antígenos intimamente relacionados, que sejam usados como pontos de referência, por exemplo IL3, IL5, IL-4, IL13 ou M-CSF. Em sua forma mais geral (e quando não é mencionada nenhuma referência definida), “ligação específica” refere-se à capacidade do anticorpo de discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não relacionado, como determinado por exemplo, de acordo com um dos seguintes métodos. Esses métodos compreendem, entre outros, Western blots, testes ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídios. Por exemplo, pode ser feito um ensaio padrão ELISA. A classificação pode ser feita por desenvolvimento de cor padrão (por exemplo, anticorpo secundário com peróxido de raiz forte e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em certos poços é classificada pela densidade óptica, por exemplo, a 450 nm. O background típico (= reação negativa) pode ser 0,1 OD; a reação positiva típica pode ser 1 OD. Isto significa que a diferença positivo/negativo pode ser maior que 10 vezes. Tipicamente, a determinação da especificidade de ligação é feita não usando um único antígeno de referência, mas um conjunto de cerca de três a cinco antígenos não relacionados, como leite em pó, BSA, transferrina ou similares. Além disso, “ligação específica” pode se relacionar à capacidade de um anticorpo em discriminar entre diferentes partes de seu antígeno alvo, por exemplo, diferentes domínios ou regiões do GM-CSF ou do receptor de GM- CSF, ou entre um ou mais resíduos principais de aminoácidos ou estiramentos de resíduos de aminoácidos do GM-CSF ou do receptor de GM-CSF.

[0036] Também, como usada na presente invenção, uma “imunoglobulina” (Ig) é definida na presente invenção como uma proteína que pertence à classe IgG, IgM, IgE, IgA, ou IgD (ou a qualquer uma de suas subclasses), e inclui todos os anticorpos convencionalmente conhecidos e seus fragmentos funcionais. Um “fragmento funcional” de um anticorpo/imunoglobulina é definido na presente invenção como um fragmento de um anticorpo/imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de um IgG) que retém a região de ligação de antígeno. Uma “região de ligação de antígeno” de um anticorpo, é tipicamente encontrada em uma ou mais região(regiões) hipervariável (hipervariáveis) de um anticorpo, isto é, as regiões CDR-1, -2, e/ou -3; Entretanto, as regiões variáveis “framework” podem também desempenhar um importante papel na ligação a antígeno, como pelo provimento de um suporte para os CDRs. Preferivelmente, a “região de ligação de antígeno” compreende pelo menos resíduos aminoácidos 4 a 103 da cadeia leve variável (VL) e 5 a 109 da cadeia variável pesada (VH), mais preferivelmente resíduos aminoácidos 3 a 107 de VL e 4 a 111 de VH, sendo particularmente pditas as cadeias completas VL e VH (posições de aminoácido 1 a 109 de VL e 1 a 113 de VH; numeração de acordo com a WO 97/08320). Uma classe pdita de imunoglobulinas para uso na presente invenção é a IgG. “Fragmentos funcionais” da invenção incluem o domínio de um fragmento F(ab')2, um fragmento Fab, scFv ou construções compreendendo domínios variáveis de imunoglobulinas simples ou polipeptídios de anticorpos de domínio simples, por exemplo, domínios simples de variáveis de cadeias pesadas ou domínios simples de variáveis de cadeias leves. O F(ab')2 ou Fab podem ser construídos para minimizar ou remover completamente as interações dissulfeto intermoleculares que ocorrem entre os domínios CH1 e CL.

[0037] Um anticorpo da invenção pode ser obtido a partir de uma biblioteca de anticorpos recombinantes que se baseie em sequências de aminoácido que tiverem sido projetadas in silico e codificadas por ácidos nucléicos criados sinteticamente. É obtido o projeto in silico de uma sequência de anticorpos, por exemplo, analisando uma base de dados de sequências humanas e projetando uma sequência polipeptídica que utilize os dados daí obtidos. Os métodos para o projeto e a obtenção das sequências criadas in silico são descritas, por exemplo, em Knappik et al, J. Mol. Biol. 296:57, 2000; Krebs et al, J. Immunol. Métodos 254:67, 2001, Rothe et al, J. Mol. Biol. 376:1182, 2008 e na patente norte-americana No. 6,300,064 expedida por Knappik et al 2000 supra incorporada à presente por referência em sua totalidade.

[0038] Qualquer anticorpo específico para GM-CSF pode ser usado com a presente invenção. Anticorpos exemplares são revelados na US 11/914,599, incorporada à presente por referência em sua totalidade. Outros anticorpos exemplares incluem anticorpos compreendendo uma sequência de aminoácido de região variável de cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No.: 1 ou uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve como mostrada na SEQ ID No.: 2. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que são obtidos a partir de anticorpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No.: 1 ou uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve como mostrada na SEQ ID No.: 2. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que tiverem a mesma especificidade e/ou se liguem ao mesmo epítopo como anticorpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No.: 1 ou uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve como mostrada na SEQ ID No.: 2. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia pesada que seja pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% homóloga à sequência mostrada na SEQ ID No.: 1. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia leve que seja pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% homóloga à sequência mostrada na SEQ ID No.: 2. SEQ ID No.: 1: Met Glu Leu Ile Met Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp TYR Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Arg Val Ser Ser Val Ser Gly Ser SEQ ID No.: 2: Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Ile Gln Ser Gln Lys Phe Val Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr Ile Thr Thr Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys Gly Glu Phe

[0039] Anticorpos exemplares alternativos que podem ser usados na presente invenção são anticorpos compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No.: 3 ou uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve como mostrada na SEQ ID No.: 4. Outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que sejam obtidos de anticorpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No.: 3 ou uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve como mostrada na SEQ ID No.: 4. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que tenham a mesma especificidade e/ou que se liguem ao mesmo epítopo como os anticorpos compreendendo a região variável de cadeia pesada como mostrada na SEQ ID No.: 3 ou uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve como mostrada na SEQ ID No.: 4. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que compreendem a região variável de cadeia pesada que seja pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% homóloga à sequência mostrada na SEQ ID No.: 3. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que compreendem a região variável de cadeia leve que seja pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%- ou pelo menos 95% homóloga à sequência mostrada na SEQ ID No.: 4. SEQ ID No.: 3: MOR pesada QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVSGIENKYAGGATY YAASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFGTDFWGQGTLVTVSS SEQ ID No.: 4: MOR leve DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVLVIYKKRPSGIPERFSG SNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSAWGDKGMVFGGGTKLTVLGQ

[0040] Anticorpos exemplares alternativos que podem ser usados na presente invenção são anticorpos compreendendo uma sequência H-CDR3 selecionada de: Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp 1 5 10 (SEQ ID No.: 5), Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro 1 5 10 (SEQ ID No.: 6), Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 (SEQ ID No.: 7), Ser Gly Leu Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 (SEQ ID No.: 8), Ser Gly Leu Ile Asn Leu Gly Met His Pro 1 5 10 (SEQ ID No.: 9), Ser Gly Leu Ile Phe Asp Ala Leu Arg Asp 1 5 10 (SEQ ID No.: 10), Ser Gly Leu Ile Phe Asp Lys Leu Thr Ser 1 5 10 (SEQ ID No.: 11), Ser Gly Leu Ile Asn Leu His Phe Asp Thr 1 5 10 (SEQ ID No.: 12), Ser Thr His Phe Ser Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 (SEQ ID No.: 13), Ser Gly Leu Ile Met Asp Lys Leu Asp Asn 1 5 10 (SEQ ID No.: 14), Ser Gly •Leu Ile Ile Asp Asn Leu Asn Pro 1 5 10 (SEQ ID No.: 15), e Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 (SEQ ID No.: 16).

[0041] Preferivelmente, os anticorpos compreendendo uma sequência H-CDR3 selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs. 5-16, também compreendem a seguinte sequência H-CDR1: Asp Tyr Leu Leu His 1 5 (SEQ ID No.: 17), e/ou a seguinte sequência H-CDR2: Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly (SEQ ID No.: 18), e/ou a seguinte sequência L-CDR1: Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile Leu Asn 1 5 10 (SEQ ID No.: 19), e/ou a seguinte sequência L-CDR2: Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 (SEQ ID No.: 20), e/ou a seguinte sequência L-CDR3: Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg Thr 1 5 (SEQ ID No.: 21).

[0042] Outros anticorpos exemplares que podem ser usados na invenção são anticorpos compreendendo a seguinte sequência L-CDR1: Arg Ala Ser His Arg Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 (SEQ ID No.: 22), e/ou a seguinte sequência L-CDR2: Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 (SEQ ID No.: 23), e/ou a seguinte sequência L-CDR3: Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Val Thr 1 5 (SEQ ID No.: 24), e/ou a seguinte sequência H-CDR1: G1y Tyr Ile Phe Pro Thr Phe Ala Leu His 1 5 10 (SEQ ID No.: 25), e/ou a seguinte sequência H-CDR2: Ser Ile Asn Thr Ala Ser Gly Lys Thr Lys Phe Ser Thr Lys 1 5 10 Phe Gln 15 (SEQ ID No.: 26), e/ou a seguinte sequência H-CDR3: Asp Arg Phe Gln Asn Ile Met Ala Thr Ile Leu Asp 1 5 10 Val (SEQ ID No.: 27).

[0043] Preferivelmente, o dito anticorpo compreende todos os CRDs de SEQ ID NOs. 22-27.

[0044] O receptor de GM-CSF é um membro da superfamília do receptor da hematopoietina. É heterodimérico, consistindo de uma subunidade alfa e uma beta. A subunidade alfa é altamente específica para GM-CSF considerando que a subunidade beta é compartilhada com outros receptores de citoquina, incluindo IL3 e IL5. Isto se reflete em uma maior distribuição tissular da subunidade do receptor beta. A sub-unidade alfa, GM-CSFR α, é primariamente expressa nas células mielóides e nas células não hematopoiéticas, como os neutrófilos, macrófagos, eosinófilos, células dendríticas, células endoteliais e células epiteliais respiratórias. O GM-CSFR α de comprimento total é uma glicoproteína de membrana tipo I constituída por 400 aminoácidos que pertence à família do receptor de citoquina tipo I e que consiste de um peptídio de sinal constituído por 22 aminoácidos (posições 1-22), um domínio extracelular constituído por 298 aminoácidos (posições 23-320), um domínio de transmembrana das posições 321 - 345 e um curto domínio intracelular constituído por 55 aminoácidos. O peptídio de sinal é clivado para prover a forma madura do GM-CSFR α como uma proteína constituída por 378 aminoácidos. São disponíveis os clones cDNA de GM- CSFR α de humanos e murinos e, no nível protéico, as subunidades receptoras têm 36% de identidade. O GM-CSF pode ligar com afinidade relativamente baixa à subunidade individualmente (Kd 1-5 nM), mas não à subunidade β individualmente. Entretanto, a presença tanto das subunidades α e β resulta em um complexo ligando-receptor de alta afinidade (Kd>>100pM). A sinalização GM-CSF ocorre por meio de sua ligação inicial à cadeia GM-CSFR α e então a ligação cruzada com uma subunidade maior, a cadeia β comum para gerar a interação de alta afinidade, que fosforila o caminho JAK-STAT.

[0045] Pode ser usado qualquer anticorpo específico para o receptor de GM-CSF com a presente invenção. Os anticorpos exemplares incluem anticorpos compreendendo uma sequência de aminoácido de uma sequência H-CDR3 mostrada em qualquer das SEQ ID Nos.: 28-46. Outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que são obtidos de anticorpos compreendendo uma sequência de aminoácido de uma sequência H-CDR3 mostrada em qualquer das SEQ ID Nos.: 28-46. Ainda, outros anticorpos exemplares incluem anticorpos, que tenham a mesma especificidade e/ou que se liguem ao mesmo epítopo como os anticorpos compreendendo uma sequência de aminoácido de uma sequência H-CDR3 mostrada em qualquer das SEQ ID Nos.: 28-46. Ainda outros anticorpos exemplares incluem anticorpos que compreendem uma sequência H-CDR3 que seja pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% homóloga à sequência H-CDR3 mostrada em qualquer das SEQ ID Nos.: 28-46. SEQ ID No.: 28: Val Gly Ser Phe Ser Gly Ile Ala Tyr Arg Pro 5 10 SEQ ID No.: 29: Val Gly Ser Phe Ser 5 Gly Pro Ala Leu Arg 10 Pro SEQ ID No.: 30: Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr 5 10 SEQ ID No.: 31: Val Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Pro Tyr Arg Pro 5 10, SEQ ID No.: 32: Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu 5 10 SEQ ID No.: 33: Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Val Tyr Gly Leu 5 10 SEQ ID No.: 34: Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Ala Tyr Arg Pro 5 10 SEQ ID No.: 35: Val Gly Ser Phe Ser Pro Val Thr Tyr Gly Leu 5 10 SEQ ID No.: ,36: Val Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr. Arg Pro 5 10 SEQ ID No.: 37: Val Gly Ser Phe Ser Pro Ile Thr Tyr Gly Leu 5 10 SEQ ID No.: 38: Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr SEQ ID No.: 39; Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10 SEQ ID No.: 40: Leu Gly Ser Val Thr Ala Trp Ala.Phe Asp Tyr 5 10 SEQ ID No.: 41: Ala Gly Ser Ile Pro Gly Trp Ala Phe Asp Tyr 5 10 SEQ ID No.: 42: Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu 5 10 SEQ ID No.: 43: Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Met Gly Leu 5 10 SEQ ID No.: 44: Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu His Leu 5 10 SEQ ID No.: 45: Val Gly Ser Val Ser Arg.Ile Thr Tyr Gly Phe 5 10 SEQ ID No.: : 46: Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu 5 10

[0046] Em certos aspectos, a presente invenção provê métodos para o tratamento da osteoartrite em um indivíduo, o dito método compreendendo a etapa de administração de um antagonista de GM-CSF ao dito indivíduo. “Indivíduo”, como usado neste contexto se refere a qualquer mamífero, incluindo roedores, como camundongos ou ratos e primatas, como o macaco cynomolgus (Macaca fascicularis), macaco rhesus (Macaca mulatta) ou humanos (Homo sapiens). Preferivelmente, o indivíduo é um primata, mais preferivelmente um humano.

[0047] Em certo aspecto, a presente invenção provê uma composição compreendendo um antagonista GM-CSF capaz de antagonizar a capacidade do GM-CSF contra a ativação, proliferação, indução do crescimento e/ou a sobrevivência das células em um indivíduo que estiver sofrendo de osteoartrite, ou com suspeita de estar sentindo osteoartrite, a dita composição compreendendo ainda um ou mais veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Os anticorpos anti-GM-CSF da presente invenção podem antagonizar todos os papéis do GM-CSF na osteoartrite.

[0048] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para a profilaxia da osteoartrite em um indivíduo, o dito método compreendendo a administração de um antagonista de GM-CSF ao dito indivíduo. “Profilaxia”, como usada neste contexto, refere-se a métodos que visam evitar o início de uma doença ou que retarde o início de uma doença.

[0049] Em certos aspectos, a presente invenção provê uma composição compreendendo um antagonista de GM-CSF útil no tratamento da osteoartrite, a dita composição compreendendo ainda um ou mais veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[0050] Em outros aspectos, a presente invenção provê o uso de um antagonista de GM-CSF na preparação de um medicamento no tratamento da osteoartrite.

[0051] Em outros aspectos, a presente invenção provê um antagonista de GM-CSF para o tratamento da osteoartrite.

[0052] As composições da presente invenção são preferivelmente composições farmacêuticas que compreendem um antagonista de GM-CSF e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento da osteoartrite. Esses veículos, diluentes e excipientes são bem conhecidos na técnica, e o técnico no assunto encontrará uma formulação e uma via de administração melhor adequada para o tratamento de um indivíduo com os antagonistas de GM-CSF da presente invenção.

[0053] Em outro aspecto, a presente invenção provê um mamífero modificado geneticamente tendo um genótipo GM-CSF-/-. Em aspectos particulares, o dito mamífero é um camundongo. Os termos camundongo (ou mamífero) “knock-out”, um camundongo (ou mamífero) “desligado de” um determinado gene, e um camundongo (ou mamífero) com um “genótipo -/-” são usados de forma intercambiável na presente invenção e são reconhecidos na técnica. Os respectivos animais são deficientes de um respectivo gene, aqui GM-CSF, em ambas as alelas do cromossomo.

Exemplo 1: Geração de um camundongo GM-CSF-/-

[0054] A geração de um camundongo GM-CSF-/- é descrita em Stanley et al (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5592. Resumidamente, os camundongos quiméricos foram gerados por micro-injeção de células de ES (H-2b) derivadas de 129/OLA com um gene de GM-CSF interrompido em blastocistos receptores de C57BL/6 (H-2b). Transmissores germinativos do alelo de GM-CSF mutado foram cruzados com camundongos C57BL/6 por 11 gerações, fornecendo camundongo GM-CSF+/- miscigenado para produzir os camundongos GM-CSF-/-, GM-CSF+/-, e GM-CSF+/+ utilizados para o experimento. O status do genótipo de GM-CSF foi determinado por análise de PCR do DNA da cauda. Os animais foram alimentados com ração padrão para roedores e água à vontade e foram alojados com ninhadas de mesmo sexo em gaiolas forradas com serragem. Os camundongos de ambos os sexos foram transferidos para experimentos quando tinham de 8 a 15 semanas de idade.

Exemplo 2: Validação de GM-CSF como um alvo para osteoartrite

[0055] Camundongos GM-CSF-/- foram comparados aos camundongos C57/BL6 (vide, por exemplo, Mills et al, J Immunol 764:6166-6173, 2000) em um modelo experimental de osteoartrite.

[0056] Método: Administrar injeção intra-muscular de colagenase em camundongo (n= 10 por grupo) no joelho esquerdo no dia -2 e dia 0 (Blom et al, Arthritis Rheum 56:147-157, 2007). No dia 42, o camundongo foi eutanasiado, as articulações do joelho foram coletadas, consertadas, decalcificadas, inseridas em parafina e cortadas em 7 μm com um micrótomo. Depois, as lâminas foram coradas com Safranina-O/Fast Green e Hematoxilina-Eosina para demonstrar patologia articular. A patologia investigada incluiu: lesão cartilaginosa, sinovite, formação de osteófito e deformação da articulação.

[0057] O sistema de pontuação utilizado para patologia cartilaginosa foi o seguinte: Grau 0 Normal 1 Irregular, mas intacto 1,5 Irregular com superfície áspera 2 Fibrilação Superficial 2,5 Fibrilação Superficial com células reduzidas em camada cartilaginosa 3 Fissuras Verticais 3,5 Fissuras ramificadas e/ou horizontais, rupturas do limite de referência 4 Perda cartilaginosa não se estendendo até o limite de referência 4,5 Perda cartilaginosa se estendendo até o limite de referência 5 Perda cartilaginosa além do limite de referência, mas sem se estender até o osso 5,5 Perda cartilaginosa se estendendo até o osso 6 Perda óssea/remodelagem/deformação Estágio 1 < 10% da área lesionada 2 10-25% da área lesionada 3 25-50% da área lesionada 4 50-75% da área lesionada

[0058] O grau foi multiplicado pelo estágio para fornecer a pontuação.

[0059] O sistema de pontuação baseia-se em um método reconhecido para avaliar a histopatologia de OA em OA clínico e experimental. Vide Pritzker et al, Osteoarthritis Cartilage 74:13-29, 2006. O grau é definido como a progressão profunda de OA na cartilagem. O estágio é definido como a extensão horizontal do envolvimento da cartilagem, isto é, o quanto da cartilagem está afetado. O grau é multiplicado pelo estágio para fornecer a pontuação fornecendo uma pontuação geral, e então para representar uma avaliação combinada de gravidade e extensão de OA. Até seis seções são pontuadas por camundongo.

[0060] Resultados: Inspeção das articulações revelou que os camundongos GM-CSF-/- apresentam menos patologia na articulação do joelho do que os camundongos controle, que indica um papel de GM-CSF em patologia e progressão normais de osteoartrite. A patologia observada nos camundongos C57/BI6 inclui lesão grave à camada cartilaginosa, formação de osteófito, deformação na articulação e sinovite. Os camundongos GM-CSF-/- não revelaram nenhuma formação de osteófito ou deformação na articulação e muito menos lesão cartilaginosa e sinovite.

[0061] Dados quantitativos quanto a lesões articulares em diferentes regiões são apresentados na Figura 1. Histologia representativa é apresentada nas figuras 2 (joelhos controle saudáveis), 3 (joelhos esquerdos de C57/BL6) e 4 (joelhos esquerdos de GM-CSF-/-). Camundongos deficientes de gene GM-CSF desenvolveram menos patologia de OA induzida por colagenase, em comparação aos camundongos de C57BL/6.

[0062] Em resumo, os camundongos GM-CSF-/- apresentaram patologia de articulação do joelho bem menor em comparação aos camundongos C57/BL6 em um modelo experimental de osteoartrite e GM- CSF validado como uma droga alvo para intervenção terapêutica para osteoartrite.

Exemplo 3: Eficácia terapêutica de antagonistas de GM-CSF no tratamento de OA.

[0063] Neste experimento, nós utilizamos um anticorpo monoclonal específico contra GM-CSF para demonstrar que o antagonista de GM-CSF pode ser eficaz no tratamento da osteoartrite.

Modelo de camundongo com OA induzida por colágeno:

[0064] Os camundongos C57BL/6 receberam 1 unidade de colagenase do tipo VII via intra-articular no joelho direito nos dias 0 e 2 para induzir instabilidade articular (vide Blom et al. (2004) Osteoarthritis Cartilage. 12; 627-35).

Tratamento de anticorpo anti-GM-CSF:

[0065] 20 camundongos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos (10 camundongos/grupo).

[0066] Grupo 1 (n = 10): anticorpo anti-GM-CSF (22E9)

[0067] Grupo 2 (n = 10): anticorpo controle de isotipo de lgG2a.

[0068] Os camundongos foram tratados intraperitonealmente, três vezes por semanas durante 6 semanas com 250 ug/camundongo/tratamento com anticorpo (22E9) anti-GM-CSF ou anticorpo controle de isotipo de lgG2a.

[0069] O tratamento iniciou 4 dias antes da indução de OA (profilático), ou seja, os camundongos foram tratados no dia -4, dia -2, dia 0 (o dia da primeira injeção de colagenase), depois 3 vezes por semana até o final do experimento durante 6 semanas). Foi coletado sangue dos camundongos nas semanas 2, 4 e 6. O soro será verificado por conteúdo de anticorpo e imunogenicidade contra 22E9. Tanto o anticorpo controle quanto o anticorpo anti-GM-CSF foram purificados para conter menos do que 10 Unidades/ml de Endotoxina.

[0070] O anticorpo de 22E9 foi utilizado como um exemplar de anticorpo anti-GM-CSF. 22E9, que é de isotipo de lgG2a é um anticorpo específico contra GM-CSF rato de anti-camundongo. Foi adquirido 22E9 da AbD Serotec (Martinsried, Germany; Cat.No. 1023501). Existem fornecedores alternativos, por exemplo, eBioscience (SanDiego.CA, USA, Cat. No. 14-7331).

Histologia:

[0071] Seis semanas após as injeções finais, a histologia foi realizada nas articulações do joelho dos camundongos. As articulações do joelho foram coletadas, consertadas, descalcificadas, inseridas em parafina e cortadas em 7 μm com um micrótomo. As lâminas foram coradas com Safranina-O/Fast Green e Hematoxilina-Eosina para demonstrar patologia articular. A patologia investigada incluiu: lesão cartilaginosa, sinovite, formação de osteófito e deformação da articulação.

[0072] O mesmo sistema de pontuação, como no Exemplo 2, foi utilizado para patologia cartilaginosa. O grau foi multiplicado pelo estágio para fornecer a pontuação.

[0073] O seguinte sistema de pontuação foi utilizado para sinovite (sistema de pontuação de camada sinovial): 0 Sem alterações em comparação às articulações normais 1 Espessamento do alinhamento sinovial e certo influxo de células inflamatórias 2 Espessamento do alinhamento sinovial e influxo intermediário de células inflamatórias 3 Profundo espessamento do alinhamento sinovial e influxo máximo observado de células inflamatórias:

Medições de dor:

[0074] Um indicador de dor utilizado para modelos de OA é a distribuição diferencial de peso medida utilizando um Medidor de Incapacitância. Este instrumento mede alterações na distribuição do peso entre os membros superiores inoperados, contralaterais e operados. Os camundongos foram permitidos a aclimatar ao equipamento em três ocasiões anteriores ao experimento. O peso inserido em cada membro superior foi medido por um período de 5 segundos. Depois, foi calculada a média de três medidas separadas coletadas por camundongo para cada timepoint. As medições foram realizadas 2 vezes por semana por todo o experimento. Os resultados foram expressados como membro injetado com colagenase/membro controle x 100.

Resultados:

[0075] Para todas as áreas analisadas na histologia (exceto o Fêmur medial), ou seja, o Fêmur Lateral, a Tíbia Lateral e a Tíbia Medial, houve uma tendência clara em relação a menos doença em camundongos tratados com anticorpo anti-GM-CSF. Os resultados estão representados na Figura 5.

[0076] A avaliação da distribuição de peso, conforme uma medição de dor associada à artrite, revelou uma alteração significativa no peso distante do joelho artrítico do dia 27 em diante no grupo tratado com anti-GM-CSF mAb em comparação ao grupo controle tratado com mAb. Os resultados estão representados na Figura 6.

[0077] Os camundongos tratados com um antagonista de GM-CSF demonstraram menos doença em comparação aos camundongos tratados com o anticorpo controle. Os camundongos tratados com o antagonista de GM- CSF também demonstraram significativamente menos dor nos estágios tardios da doença em comparação aos camundongos tratados com o anticorpo controle. Os camundongos tratados com o anticorpo controle de isotipo demonstraram aumento significativo dos sinais de osteoartrite conforme comparado aos camundongos que receberam o anticorpo específico contra GM-CSF. Isso demonstra que os antagonistas de GM-CSF são eficazes no tratamento de OA.

Exemplo 4: Eficácia terapêutica de um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo os SEQ ID No.: 1 ou 2

[0078] O Exemplo 3 é repetido, no qual é utilizado um antagonista de GM-CSF, um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada conforme representada em SEQ ID No.: 1 ou compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve conforme representada em SEQ ID No.: 2. Podem ser utilizadas outras espécies diferentes de camundongos, em específico uma espécie na qual o anticorpo utilizado neste experimento seja reativo cruzado. Preferivelmente, a espécie de animal utilizada neste experimento é o rato.

[0079] Os animais tratados com anticorpo controle isotipo demonstram aumento significativo dos sinais de osteoartrite conforme comparado aos animais que receberam anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada conforme representada em SEQ ID No.: 1 ou compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve conforme representada em SEQ ID No.: 2.

[0080] Isso demonstra a eficácia dos anticorpos no tratamento de OA.

Exemplo 5: Eficácia terapêutica de um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo SEQ ID NOs. 3 ou 4

[0081] O Exemplo 3 é repetido. Uma vez que se utiliza antagonista de GM-CSF, um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada conforme representada em SEQ ID No.: 3 ou compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve conforme representada em SEQ ID No.: 4. Podem ser utilizadas outras espécies diferentes de camundongos, em específico uma espécie na qual o anticorpo utilizado neste experimento seja reativo cruzado. Preferivelmente, a espécie de animal utilizada neste experimento é o rato.

[0082] Os animais, por exemplo, o rato, tratados com o anticorpo controle isotipo demonstram aumento significativo dos sinais de osteoartrite conforme comparado aos animais que receberam um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada conforme representada em SEQ ID No.: 3 ou compreendendo uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve conforme representada em SEQ ID No.: 4. Isso demonstra a eficácia dos anticorpos no tratamento de OA.

Exemplo 6: Eficácia terapêutica de um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo SEQ ID NOs. 5 a 20

[0083] O Exemplo 3 é repetido. Como antagonista de GM-CSF, é utilizado um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo uma sequência de H-CDR3 selecionada de uma das SEQ ID NOs. 5-16. Preferivelmente, os ditos anticorpos compreendem adicionalmente a sequência H-CDR1 de SEQ ID No.: 16, e/ou a sequência H-CDR2 de SEQ ID No.: 17, e/ou a sequência L-CDR1 de SEQ ID No.: 18, e/ou a sequência L- CDR2 de SEQ ID No.: 19, e/ou a sequência L-CDR3 de SEQ ID No.:20. Podem ser utilizadas outras espécies diferentes do camundongo, em específico uma espécie na qual o anticorpo utilizado neste experimento seja reativo cruzado. Preferivelmente, a espécie de animal utilizada neste experimento é o rato.

[0084] Os animais, por exemplo, o rato, tratados com o anticorpo controle isotipo demonstram aumento significativo dos sinais de osteoartrite conforme comparado aos animais que receberam um anticorpo específico contra GM-CSF de acordo com o presente exemplo. Isso demonstra a eficácia dos anticorpos no tratamento de OA.

Exemplo 7: Eficácia terapêutica de um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo SEQ ID NOs. 21-26

[0085] O Exemplo 3 é repetido. Como antagonista de GM-CSF, é utilizado um anticorpo específico contra GM-CSF compreendendo uma sequência de L-CDR1 de SEQ ID No.:22, e/ou a sequência L-CDR2 de SEQ ID No.:23, e/ou a sequência L-CDR3 de SEQ ID No.: 24, e/ou a sequência H- CDR1 de SEQ ID No.: 25, e/ou a sequência H-CDR2 de SEQ ID No.:26, e/ou a sequência H-CDR3 de SEQ ID No.:27. Preferivelmente, o dito anticorpo compreende todas as CRDs de SEQ ID NOs. 22-27. Podem ser utilizadas outras espécies diferentes do camundongo, em específico uma espécie na qual o anticorpo utilizado neste experimento seja reativo cruzado. Preferivelmente, a espécie de animal utilizada neste experimento é o rato.

[0086] Os animais, por exemplo, o rato, tratados com o anticorpo controle isotipo demonstram aumento significativo dos sinais de osteoartrite conforme comparado aos animais que receberam um anticorpo específico contra GM-CSF de acordo com o presente exemplo. Isso demonstra a eficácia dos anticorpos no tratamento de OA.

Exemplo 8: Eficácia terapêutica de um anticorpo específico contra receptor de GM- CSF

[0087] O Exemplo 3 é repetido com a diferença de que um anticorpo monoclonal específico para o receptor de GM-CSF é utilizado invés de um anticorpo monoclonal específico contra o GM-CSF.

[0088] Como antagonista de GM-CSF, é utilizado um anticorpo específico contra receptor de GM-CSF compreendendo uma sequência de aminoácido de uma sequência H-CDR3 representada em qualquer uma das SEQ ID No's.:27-45. Podem ser utilizadas outras espécies diferentes do camundongo, em específico uma espécie na qual o anticorpo utilizado neste experimento seja reativo cruzado. Preferivelmente, a espécie de animal utilizada neste experimento é o rato.

[0089] Os animais, por exemplo, o rato, tratados com o anticorpo controle isotipo demonstram aumento significativo dos sinais de osteoartrite conforme comparado aos animais que receberam um anticorpo específico contra GM-CSF de acordo com o presente exemplo. Isso demonstra a eficácia dos anticorpos no tratamento de OA.

Exemplo 9: Estudo clínico

[0090] Um estudo clínico é realizado em pacientes adultos que apresentam osteoartrite do joelho. O objetivo do estudo clínico controlado por placebo, duplo-cego e randomizado é determinar as diferenças comparativas entre os antagonistas de GM-CSF da presente invenção e placebo no alívio geral da dor e qualidade de vida em um número de amostra de 30 pacientes que apresentam osteoartrite (OA) diagnosticada do joelho. Outro objetivo é determinar a segurança e tolerabilidade dos antagonistas de GM-CSF da presente invenção conforme determinado pelos eventos adversos, exame físico e sinais vitais.

Métodos:

[0091] Trinta pacientes (aproximadamente 15 homens adultos e 15 mulheres adultas), de 40 anos idade e acima, que apresentam diagnóstico clínico de osteoartrite do(s) joelho(s) e dor verificada no joelho por pelo menos 15 dias no mês anterior ao exame serão admitidos ao estudo. Os pacientes recebem uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonistas de GM-CSF ou placebo (por exemplo, uma vez a cada duas semanas por aproximadamente seis meses). Neste estudo, são utilizados Índice de Osteoartrite das universidades de Western Ontario e McMaster (WOMAC; Bellamy et al, J Rheumatol 15(12): 1833-40, 1988) e escalas de intrumento de Qualidade de Vida SF-36v2 (Quality Metric Health Outcomes Solutions, Lincoln, Rl). A WOMAC é uma medida de status de saúde, auto-administrada e específica da doença. Isso evidencia os sintomas clinicamente importantes nas áreas da dor, rigidez e função física em pacientes que apresentam osteoartrite do quadril e/ou joelho. O índice consiste de 24 perguntas (5 sobre dor, 2 sobre rigidez e 17 sobre função física) e pode ser preenchido em menos de 5 minutos. A WOMAC é um instrumento válido, confiável e delicado para a detecção de alterações clinicamente importantes no status de saúde seguido por uma variedade de intervenções (farmacológica, nutricional, cirúrgica, fisioterápica, etc.). O questionário WOMAC é válido para avaliar os efeitos de intervenção na osteoartrite no quadril ou joelho. O instrumento de Qualidade de Vida SF-36v2 é um questionário sobre saúde, curto e para vários objetivos com 36 perguntas. Ele fornece um perfil de 8 escalas sobre a saúde funcional e pontuações de bem-estar, bem como medições psicometricamente resumidas da saúde mental e física e um índice utilitário com base na preferência. É um método genérico, ao contrário daqueles que tem como alvo uma idade específica, doença, ou grupo de tratamento. De acordo, provou-se que o SF-36v2 é útil em pesquisas em populações gerais e específicas, em comparação aos pesos relativos das doenças, e diferenciando os benefícios da saúde produzidos por uma variação ampla de diferentes tratamentos. O SF-36v2 fornece informações sobre os seguintes aspectos e subconjuntos de saúde; Saúde Física (compreendendo funcionalidade física, papel físico, dor corporal e saúde geral) e Saúde Mental (compreendendo vitalidade, funcionalidade social, papel emocional e saúde mental).

RESULTADOS:

[0092] Alteração da dor corporal: A melhora na dor corporal SF-36v2 é estatisticamente significativa em pacientes tratados com antagonistas de GM-CSF da presente invenção conforme comparado com placebo. Uma pontuação maior é melhor porque significa que o paciente sente menos dor após administrar o produto. Há uma melhora estatística significativa na pontuação de dor corporal no grupo que recebeu os antagonistas de GM-CSF da presente invenção versus grupo placebo.

[0093] Alteração na pontuação no papel físico: O efeito superior dos antagonistas de GM-CSF da presente invenção em comparação com placebo é estatisticamente significativo na semana 8, semana 12 e semana 20 em termos de limitações do papel devido à saúde física (papel físico). Uma pontuação maior é melhor porque significa que o paciente percebeu uma melhora física e uma redução nas limitações apresentadas nas atividades da vida diária. Há uma melhora estatística significativa na pontuação de dor corporal no grupo que recebeu os antagonistas de GM-CSF da presente invenção versus grupo placebo.

[0094] Alteração na pontuação total de WOMAC: A pontuação total de WOMAC do grupo tratado com antagonistas de GM-CSF da presente invenção é estatisticamente significativa melhor que a pontuação total de WOMAC do grupo placebo (uma pontuação menor é melhor).

[0095] Alteração na WOMAC ADL: A melhora nas atividades da vida diária (medida conforme uma sub-pontuação de WOMAC ADL) é maior no grupo tratado com os antagonistas de GM-CSF da presente pontuação do que no grupo placebo. Há uma melhora estatisticamente significativa na pontuação de WOMAC ADL no grupo tratado com antagonistas de GM-CSF da presente invenção em comparação ao grupo placebo (uma pontuação menor é melhor).

CONCLUSÕES:

[0096] O estudo clínico demonstra a eficácia dos antagonistas de GM- CSF da presente invenção na melhora da qualidade de vida de pacientes que apresentam osteoartrite do joelho. Os resultados do estudo clínico também demonstram a segurança e a tolerância do produto, dado que nenhum efeito adverso sério foi constatado.

[0097] A eficácia dos antagonistas de GM-CSF da presente invenção também pode ser estabelecida por meio de estudos em outras espécies aos quais os antagonistas de GM-CSF da presente invenção sejam reativos cruzados (por exemplo, em cavalos, para avaliar o movimento articular); e utilizando estudos in vitro para determinar a habilidade de antagonistas de GM-CSF da presente invenção para inibir a degradação de agrecan induzida por IL-1, conduzindo um ensaio sobre culturas de condrócitos.

[0098] O técnico no assunto avaliará que a invenção descrita no presente documento está suscetível a variações e modificações, além daquelas especificamente descritas. Deve-se compreender que a invenção inclui todas as variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos ditos ou indicados nesta especificação, individual ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações de qualquer dois ou mais das ditas etapas ou características.

BIBLIOGRAFIA

[0099] Bellamy et al, J Rheumatol 15(12)A 833-40, 1988

[00100] Blom et al, Arthritis Rheum 56:147-157, 2007

[00101] Ghose et al, J Combin Chem: 7:55-68, 1999

[00102] Knappik et al, J. Mol. Biol. 296:57, 2000

[00103] Krebs et al, J. Immunol. Methods. 254:67, 2001 Lipinski et al, Adv Drug Del Rev 23:3-25, 1997 Mills et al, J Immunol 764:6166-6173, 2000

[00104] Pritzker et al, Osteoartrite Cartilage 74:13-29, 2006

[00105] Rothe et al, J. Mol. Biol. 376:1182, 2008

Claims

1. Uso de um antagonista de GM-CFS, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar osteoartrite, em que o antagonista é um anticorpo específico para GM-CFS, e em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 ou a região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 4.

2. Uso de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está presente em uma composição para o tratamento de osteoartrite.

3. Uso de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

4. Uso de um anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.