CN106872428A - 一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒。该试剂盒包括如下组分：PMA溶液、DHR123溶液、过氧化氢酶溶液、平衡液、洗涤液、红细胞裂解液和稀释液。本发明的试剂盒可用于检测中性粒细胞产生活性氧的能力，尤其适用于临床筛查慢性肉芽肿患者；还可用于其他各种生理病理条件下中性粒细胞呼吸爆发功能改变的检测，以及药物对中性粒细胞呼吸爆发功能影响的评价。本试剂盒不仅限于人类样本的检测，还可用于其他物种，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、猪等。本试剂盒主要基于DHR123流式细胞分析法，其需血量少；操作简单，检测速度快；成本低，推广性强，重复性好；检测结果精确、清晰、特异性强，易于分析。

Description

一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒，属于检验技术领域。
背景技术
正常机体受到外界病原微生物等的刺激后，通过一系列固有免疫和适应性免疫反应抵抗感染、行使免疫防御功能。其中，固有免疫是机体先天获得的第一道防线，出现早且反应迅速，在机体清除病原体的过程中发挥重要作用。中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分。中性粒细胞在吞噬病原体过程中产生超氧阴离子和其他反应性氧复合物，即“呼吸爆发”，参与机体非特异性的抗感染过程。中性粒细胞呼吸爆发功能缺陷常见于临床上的慢性肉芽肿患者，以及其他生理病理或药物作用导致中性粒细胞功能缺陷的患者。慢性肉芽肿一种罕见的原发性免疫缺陷病，患者由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶复合物组分缺陷，不能产生活性氧中间体(reactive oxygen intermediates，ROI)，因此临床表现反复细菌和真菌感染，严重者可危及生命。目前已发现慢性肉芽肿有2种不同的遗传方式，即X染色体隐性遗传(CYBB基因缺陷导致)和常染色体隐性遗传(CYBA、NCF1、NCF2和NCF4基因缺陷导致)两种方式。由于该病的临床表现与其他免疫缺陷类疾病以及感染类疾病十分类似，因此仅通过临床表现并不能将其与其他病种区分开来。因此，慢性肉芽肿病临床上主要是基于体外检测中性粒细胞刺激后消耗氧和产生氧代谢物是否缺陷来诊断的。然而目前，国内仅有北京和上海少数几家儿童专科医院能够行中性粒细胞呼吸爆发功能检测实验，绝大多数医院不具备检测技术和条件。大部分疑似病例需要从外地赶至北京上海进行相关检测，成本高且不易操作。另外，由于各家医院检测手段不完全相同，没有统一的判断标准。尤其针对常染色隐性遗传的患者来说，由于其中性粒细胞呼吸爆发功能并非完全丧失，因此实验偏差很容易影响到临床医师最后的诊断结果。另外，国内市场上仅有一家公司在售相关试剂盒，但未排除内源性过氧化氢酶对于实验结果的影响，这将会导致实验结果的不稳定性。因此，研发、制备稳定的中性粒细胞呼吸爆发功能检测试剂盒将极大地促进慢性肉芽肿病的诊断，并可促进中性粒细胞呼吸爆发功能相关的临床诊断和基础研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定的用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒。本发明的试剂盒用于检测中性粒细胞产生活性氧的能力，尤其适用于临床筛查慢性肉芽肿患者，亦可用于其他各种生理病理条件，以及药物作用对于中性粒细胞呼吸爆发功能的影响。本试剂盒不仅限于人类样本的检测，还可用于其他物种，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、猪等。
为实现上述目的，本发明中，我们提供一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能试剂盒。该试剂盒主要基于二氢罗丹明123(Dihydrorhodamine 123,DHR123)流式细胞分析法，利用少量的周血全血即可完成检测。其原理为：首先在测试样本中加入过氧化氢酶以分解内源性的过氧化氢，消除样本间差异，然后加入DHR123。DHR123是一种小分子化合物，可自由进入细胞。再加入佛波酯(Phorbol Myristate Acetate,PMA)溶液，中性粒细胞在PMA的刺激下可产生过氧化氢等活性氧。DHR123在过氧化氢和超氧阴离子等活性氧的作用下DHR123可生成罗丹明123(rhodamine123,R123)，产生绿色荧光。通过流式细胞术检测绿色荧光的表达情况即可判断中性粒细胞产生活性氧的能力。本发明的技术方案具体介绍如下。
一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒，该试剂盒包括如下组分：PMA溶液、DHR123溶液、过氧化氢酶溶液、平衡液、洗涤液、红细胞裂解液和稀释液。
本发明中，PMA溶液的浓度是20μg/ml；DHR123溶液的浓度是90μg/ml；过氧化氢酶溶液的浓度是20U/μl。
本发明中，平衡液为生理盐水；洗涤液为PBS溶液；稀释液为PBS溶液。
本发明中，试剂盒用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的方法如下：
第一步，取受试样本，置于流式细胞管底部，检测分别为静息组、对照组和实验组，每管50μl；如果受试样本为血液样本，则每管加入1ml 1x红细胞裂解液，室温避光孵育8～15分钟；然后离心，去除上清，并用洗涤液清洗1-2次，每管加入50μl稀释液；如果受试样本为细胞样本，则洗涤后直接加入50μl稀释液；
第二步，向静息组、对照组及实验组中分别加入5μl过氧化氢酶；后向静息组中加入50μl平衡液，对照组及实验组中分别加入50μl DHR123溶液，37℃孵育5分钟；
第三步，向静息组及对照组中分别加入50μl平衡液，实验组中加入50μl PMA溶液，37℃孵育15分钟后立即进行流式细胞术检测；
第四步，将上述静息组、对照组和实验组分别利用流式细胞术检测，圈出中性粒细胞，检测绿色荧光的表达情况，记录每组的平均几何荧光强度；
第五步，计算刺激指数SI，可利用如下公式：SI＝实验组平均几何荧光强度/对照组平均几何荧光强度；
第六步，判断受试样本中性粒细胞呼吸爆发功能强弱，分为如下3种情况：
1)利用对于人类慢性肉芽肿患者的临床检验，SI的正常参考值如下：
a.正常值：85.2-264.6；
b.X连锁慢性肉芽肿病：0.9-3.2，部分可>4.5；
c.常染色体慢性肉芽肿病：3.5-52.1；根据正常参考值判定受试者中性粒呼吸爆发功能缺陷与否。
利用本发明的试剂盒用于临床筛查慢性肉芽肿患者的结果分为如下几种：
①在正常健康人中，中性细胞受PMA刺激后可产生活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成具有绿色荧光的罗丹明123，流式细胞术检测可见几乎全部的中性粒细胞均带有绿色荧光，中性粒细胞峰值明显右移；
②在X染色隐性遗传CYBB基因突变导致的慢性肉芽肿患者中，中性粒细胞产生活性氧的能力完全丧失，DHR123无法转化成罗丹明123，因此中性粒细胞峰值无位移；
③在X染色隐性遗传CYBB基因突变携带者中，由于只有一条染色体基因缺陷，另一条染色基因正常，因此检测结果会出现双峰，即一部分中性粒细胞峰值有明显位移，而另一部分中性粒细胞峰值无位移；
④在常染色隐性遗传基因突变导致的慢性肉芽肿患者中,中性粒细胞产生活性氧的能力缺陷，DHR123无法或只能部分转化成R123，因此中性粒细胞峰值无位移或者仅有较少位移。
2)对于其他各种生理病理条件，以及药物作用下中性粒细胞呼吸爆发功能改变的实验室检测，可对比对照组的SI值进行判断。
3)对于其他物种中性粒细胞呼吸爆发功能的检测，可参照对照组SI值进行判断。
本发明的试剂盒是用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒，具有如下优点：
1)需血量少。利用本试剂盒检测中性粒细胞呼吸爆发功能，仅需少量样本即可完成检测过程。
2)操作简单，仅需按照产品说明书进行简单操作即可。无需特别的实验技巧，可操作性强。按照产品说明进行操作，仅需1小时即可完成整个检测过程。
3)成本低，推广性强。因本试剂盒内包含的试剂造价低，因此试剂盒成本低，适用于各经济阶层的患者使用。
4)重复性好。流式检测法可直观真实地反应中性粒细胞受到刺激后产生活性氧的情况，不受操作者主观判断影响，结果可重复性强。
5)去除样本间差异，实验结果更为精确。本试剂盒加入过氧化氢酶去除样本内源性过氧化氢对于实验结果的影响，去除了样本间的差异，使实验结果更为精确。
6)检测结果清晰、特异性强，易于分析。能够对中性粒细胞产生活性氧的能力进行定性和定量分析。对于慢性肉严重患儿的临床诊断，可大致区分其的不同遗传类型。
本试剂盒可用于检测受试者中性粒细胞呼吸爆发功能，尤其用于慢性肉芽肿病的临床筛查；亦可用于其他生理病理条件或药物作用下中性粒细胞呼吸爆发功能改变的实验室检测。除人类样本外，还可用于其他物种中性粒细胞呼吸爆发功能的检测。
附图说明
图1为本发明基于DHR123流式细胞分析法检测中性粒细胞呼吸爆发功能的原理图示。
图2为本试剂盒操作说明示意图。
图3是慢性肉芽肿病筛查的检测结果图示，即DHR123流式峰图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。
实施例1
图1为本发明基于DHR123流式细胞分析法检测中性粒细胞呼吸爆发功能的原理图示。
通过本试剂盒可对于检测受试者中性粒细胞呼吸爆发功能进行检测，以此判定受试者是否为慢性肉芽肿患者。通常需要获取待诊患儿的外周血全血作为实验组，其父母的外周血全血作为对照组进行检测。
患者发生突变的X染色体通常是由母亲的1条X染色体遗传而来，少数为新发突变。患儿的父亲因只有1条X染色体，如果其父亲没有慢性肉芽肿病相关的临床症状，则默认其为健康对照。如果待查患儿中兴细胞呼吸爆发功能缺如或仅余少量功能，刺激指数远低于正常值；且其母亲中性粒细胞流式图显示双峰，则可判定患儿为X染色体隐性遗传慢性肉芽肿病。可继续行基因检测CYBB基因突变进一步明确致病基因突变。
如果患儿中性粒细胞呼吸爆发功能完全缺如或仅余少量功能，刺激指数远低于正常值；而其母亲中性粒细胞呼吸爆发功能正常，通过本实验只可判断患者是否患慢性肉芽肿，而无法判定其遗传方式为X染色体隐性遗传或者常染色体隐性遗传慢性肉芽肿病。需行基因检测相关致病基因突变进一步明确其类型。
图2为实施例1的具体操作示意图，具体步骤如下：
第一步，裂解红细胞，制备样本。取就诊患儿及对照组外周血全血置于流式细胞管底部，每人分3管，分别为静息组、对照组和实验组，每组50μl。分别向每管中加入1ml 1x红细胞裂解液，室温避光孵育10分钟。然后离心，去除上清，并用洗涤液清洗1-2次。每管加入50μl稀释液。
第二步，加入过氧化氢酶分解内源性过氧化氢。再加入DHR123，使其扩散进入中性粒细胞内。取就诊患儿及对照组外周血全血置于流式细胞管底部，每人分3管，分别为静息组、对照组和实验组，每组50μl。向每管中分别加入5μl过氧化氢酶，以分解样本内源性过氧化氢酶，消除样本间差异。再向静息组加入50μl平衡液，对照组及实验组中分别加入50μlDHR123溶液，37度孵育5分钟，使DHR123自由扩散进入细胞内。
第三步，PMA刺激中性粒细胞产生过氧化氢等活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成R123。向静息组及对照组中分别加入50μl平衡液，实验组中加入50μl PMA溶液，37度孵育15分钟。健康人中性粒细胞在PMA的刺激下可产生大量活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成带有绿色荧光的R123；而慢性肉芽肿患者不能产生或较少产生活性氧，因此不能将DHR123转化成R123，或者仅能将少量的DHR123转化成R123。
第四步，流式细胞术检测R123的转化率。将上述静息组、对照组和实验组分别利用流式细胞术检测。圈出中性粒细胞，检测绿色荧光的表达情况，记录每组的平均几何荧光强度。
第五步，计算刺激指数SI，判断中性粒细胞呼吸爆发功能强弱，指导慢性肉芽肿的临床诊断。利用如下公式进行计算：SI＝实验组平均几何荧光强度/对照组平均几何荧光强度。可根据如下SI的正常参考值指导慢性肉芽肿的诊断：1)正常值：85.2-264.6；2)X连锁慢性肉芽肿病：0.9-3.2，部分>4.5；3)常染色体慢性肉芽肿病：3.5-52.1。根据正常参考值判定受试者中性粒呼吸爆发功能缺陷与否。
图2是实施例1的试剂盒操作说明示意图。图3为检测结果图示DHR123流式峰图。通常情况下，慢性肉芽肿患者外周全血经PMA刺激后，中性粒细胞柱状图没有向右偏移或者仅有少量偏移；健康对照中性粒细胞柱状图明显向右偏移；CYBB基因突变携带者，即患儿母亲中性粒细胞柱状图有两个峰值，其中一个峰值没有向右或仅有少量偏移，另一个峰值明显向右偏移。

Claims (4)

1.一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下组分：PMA溶液、DHR123溶液、过氧化氢酶溶液、平衡液、洗涤液、红细胞裂解液和稀释液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，PMA溶液的浓度是20μg/ml；DHR123溶液的浓度是90μg/ml；过氧化氢酶溶液的浓度是20U/μl。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，平衡液为生理盐水；洗涤液为PBS溶液；稀释液为PBS溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的方法如下：
第一步，取受试样本，置于流式细胞管底部，检测分别为静息组、对照组和实验组，每管50μl；若受试样本为血液样本，则每管加入1ml 1x红细胞裂解液，室温避光孵育8～15分钟；然后离心，去除上清，并用洗涤液清洗1-2次，每管加入50μl稀释液；若受试样本为细胞样本，则洗涤后直接加入50μl稀释液；
第二步，向静息组、对照组及实验组中分别加入5μl过氧化氢酶；后向静息组中加入50μl平衡液，对照组及实验组中分别加入50μl DHR123溶液，37℃孵育5分钟；
第三步，向静息组及对照组中分别加入50μl平衡液，实验组中加入50μl PMA溶液，37℃孵育15分钟后立即进行流式细胞术检测；
第四步，将上述静息组、对照组和实验组分别利用流式细胞术检测，圈出中性粒细胞，检测绿色荧光的表达情况，记录每组的平均几何荧光强度；
第五步，计算刺激指数SI，利用如下公式：SI＝实验组平均几何荧光强度/对照组平均几何荧光强度；
第六步，判断受试样本中性粒细胞呼吸爆发功能强弱，分为如下3种情况：
1)利用对于人类慢性肉芽肿患者的临床检验，SI的正常参考值如下：
a.正常值：85.2-264.6；
b.X连锁慢性肉芽肿病：0.9-3.2，部分可>4.5；
c.常染色体慢性肉芽肿病：3.5-52.1；
根据正常参考值判定受试者中性粒呼吸爆发功能缺陷与否；
2)对于其他各种生理病理条件，以及药物作用下中性粒细胞呼吸爆发功能改变的实验室检测，对比对照组的SI值进行判断；
3)对于其他物种中性粒细胞呼吸爆发功能的检测，参照对照组SI值进行判断。
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