KR20150091193A - 인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자의 중화 항체 - Google Patents

인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자의 중화 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 영장류 GM-CSF에 특이적으로 결합하고 중화시키는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편에 관한 것이다.

Description

인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자의 중화 항체{Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor}
본 발명은 인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(human granulocyte macrophage colony stimulating factor; GM-CSF)의 활성을 중화시키는 항체 및 그 단편들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체 및 그 단편들을 포함하는 약학적 조성물 및 다양한 질병의 치료에 사용되는 의약품에 상기 항체 및 그 단편을 사용하는 방법에 관한 것이다.
인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 본래 인 비트로에서의 과립구 및 마크로파지 전구 세포의 성장 및 분화에 대한 강력한 자극제로 개시되었으며, 타입 1 사이토킨 수용체 패밀리에 속하는 하위 유니트로 구성된 헤테로다이머릭형 수용체에 결합하는 4개의 알파 나선형 번들 구조를 갖는 약 23kDa의 당단백질이다. 이는 마크로파지, 호중구, 과립구, 호산구 및 항원 제시 수지상 세포의 성숙을 자극하여 질병과 싸우는 이들의 기능적 능력을 향상시킨다. 마우스내에서의 유전적 제거 실험, 즉 관심 대상 유전자(본 발명에서는 GM-CSF)를 침묵시키거나 녹아웃시키는 실험은 GM-CSF가 폐에서 계면활성제를 제거하거나 특정 종류의 감염 또는 면역 반응에 반응하는데 관련되어 있는 일부 마크로파지 집단 등의 기능적 활성도를 유지하는데 필수적임을 보여주었다.
GM-CSF는 인 비트로에서 호중구, 호산구, 마크로파지, 및 다소 적은 정도로 적혈구성 세포 및 거핵구 세포의 전구 세포에 강력한 자극 활성을 가지고 있으며, 유전자 녹아웃 마우스를 사용한 인 비보에서 얻은 결과는 GM-CSF의 주요 생리적 역활이 성숙 마크로파지 및 과립구의 기능적 활성도를 유지하거나 자극하고, 면역 시스템에 항원 제시를 자극하는 것임을 제안한다. 항원 제시의 자극은 수지상 세포나 마크로파지 생산에 직접적으로 효과를 발휘하고, 클래스 II 주조직적합성 복합체 및 Fc 수용체의 마크로파지 및 수지상 세포상에서의 발현을 증가시킴으로써 이루어진다.
GM-CSF는 호중구, 호산구, 단핵구-마크로파지의 기능적 활성도를 자극한다. 이는 화학주화 활성의 증강, 세포부착분자의 발현 및 표면에의 부착증가, 식세포 활성의 증가 및 이들 세포의 아폽토시스의 지연 및 억제 등을 포함한다. 호중구는 외부의 침범에 대한 제1차 방어선이다. 이러한 호중구의 프로그램된 죽음은 GM-CSF를 포함하는 프로-염증성 자극(pro-inflammatory stimuli)에 의해 지연되어 시간과 장소에서의 염증의 적절한 해결을 보증한다. GM-CSF는 또한 이들 세포의 항체-의존적 세포 독성 매개 능력 및 세포내 미생물의 살상 능력을 자극하며, 이들 세포에 '프라이밍(priming)' 효과를 나타내어, 후속 자극에 대한 산화 방출(과산화 음이온 생산) 반응, 탈과립화 및 항균물질의 방출, 및 화학주화성을 증강시킨다. 또한, GM-CSF는 이들 세포들로부터 IL-I, G-CSF, M-CSF를 포함하는 이차적 사이토킨 및 매개자, 호중구로부터 류코트리엔 및 IL-I, TNF, IL-6, G-CSF, M- CSF 뿐 아니라 마크로파지에서 프로스타글란딘의 방출을 자극한다.
상기로부터 GM-CSF가 감염으로부터 보호에 필수적인 세포 집단의 활성화 및 유지에 핵심적인 역할을 하는 것이 명백하다. 그러나, 어떤 경우에는 이러한 세포 집단의 활성화가 바람직하지 못하다. 예를 들면, 병원균이 존재하지 않을 때, 상기 세포 계통의 활성화는 많은 경우 급성 및/만성 염증 상태를 초래하며, 극단적인 경우 생명을 위협할 수 있다. 유사하게, GM-CSF의 과발현은 과도한 면역 활성화를 초래하며, 염증을 결과한다. 이러한 경우, GM-CSF의 활성을 중화시켜 이러한 염증 상태의 증상을 제거하거나 최소한 경감시키는 것이 바람직하다.
이러한 중화 활성은 선행기술에 예시되어 있다. 예를 들면, 중화 항-GM-CSF 항체가 말초 혈액 샘플에서 호산구 아폽토시스 속도를 증가시키는데 기여함이 보고되었다(Kankaanranta 등. (2000) Journal of Allergy and Clinical Immunology 106, 77-83). 증강된 호산구 생존이 천식과 관련되어 있기 때문에, 호산구 아폽토시스의 증강은 천식 증상을 완화시킬 것으로 기대되었다.
천식, 류마티스성 관절염 및 다발성 경화증과 같은 만성 염증성 질환에서 GM-CSF의 수준은 국소적으로 증가되어 있으며, 어떤 경우에는 전신적으로 증가되어 있고, 이러한 질병에서 염증 과정과 연관되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 선행기술에서 알려진 바 있는 증강된 및/또는 바람직하지 못한 GM-CSF 활성을 중화시키는 방식에 있어서의 개선을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 영장류(primate) GM-CSF와 특이적으로 결합하고 중화시키는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편들에 관한 것이다.
"특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합", "특이적으로 결합하는". "특이적 결합자" 등과 같은 관련된 표현은 본 명세서에서 영장류 GM-CSF와 이 영장류 GM-CSF와 상이한 기타 잠재적 항원을 구별할 수 있는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편의 능력을 지칭하는 것이며, 상기 구별은 복수의 상이한 항원 풀에서 잠재적 결합 파트너로서 오직 영장류 GM-CSF와 결합하거나 상당한 정도로 결합하는 정도로 이루어진다. 여기에서 GM-CSF와 상당한 정도로 결합한다는 것은, 복수의 동등하게 접근가능한 상이한 항원 풀에서 잠재적 결합 파트너로서 영장류 GM-CSF가 기타 다른 항원보다 적어도 10배, 바람직하게는 50배, 가장 바람직하게는 100배 또는 더 이상 자주(동력학적 의미에서) 결합함을 의미한다. 이러한 동력학적 측정은 비아코르 장치에서 수행될 수 있다.
본 발명에서, "중화", "중화제", "중화하는" 및 문법적으로 관련있는 이들의 변형된 표현들은 GM-CSF의 생물학적 효과를 부분적으로 또는 완전히 약화시키는 것을 지칭한다. GM-CSF의 생물학적 효과의 부분 또는 완전한 약화는 GM-CSF-매개 시그널 전달의 변경, 방해 및/또는 철폐로부터 결과되며, 이는 예를 들면 세포내 신호전달, 세포 증식 또는 가용성 물질의 방출, 예를 들면 GM-CSF와 상이한 리간드에 대한 표면 수용체의 발현을 초래하는 세포내 유전자 활성의 상향 또는 하향 조절 등으로 발현된다. 본 기술분야의 당업자는 어떤 물질이, 예를 들면 문제의 항체 또는 그 단편이 중화제로 분류될 것인가를 결정하는데는 여러 모드가 존재함을 이해할 것이다. 예시로서 이는 일반적으로 하기와 같이 수행되는 인 비트로 표준 시험에 의해 수행된다: 첫번째 증식 실험에서, 증식 정도가 GM-CSF의 활성에 의존함이 알려져 있는 세포주를 GM-CSF의 농도를 다양하게 한 일련의 샘플내에 인큐베이션하고, 이어서 상기 세포주의 증식 정도를 측정한다. 이러한 측정으로부터, 상기 세포의 50% 최대 증식을 유도하는 GM-CSF 농도를 구한다. 이후 두번째 증식실험은 일련의 각 샘플에서 첫번째 증식 실험에 사용된 것과 동일한 세포수 및 상기 측정된 농도의 GM-CSF 농도를 사용하고, 이번에는 GM-CSF의 중화제일 것으로 생각되는 항체 또는 그 단편의 농도를 변경시켜 수행한다. 다시 세포 증식을 측정하여 50% 최대 성장을 유발하는 항체 또는 그 단편의 농도를 결정한다. 만약 성장 억제 대 항체(또는 그 단편) 농도 결과 곡선이 S자 형태의 곡선 인 경우, 항체(또는 그 단편)의 농도가 증가함에 따라 세포 증식이 감소하며, 어느 정도의 항체 의존적 성장 억제가 이루어짐, 즉 GM-CSF의 활성이 어느 정도 중화됨을 뜻한다. 이러한 경우, 항체 또는 그 단편은 본 발명의 의미에서의 "중화제"로 간주된다. 증식 정도가 GM-CSF의 활성에 의존하는 것으로 알려진 세포주의 한 예로서 TF-1 세포주를 들 수 있으며, 이는 Kitamura, T. 등. (1989). J Cell Physiol 140, 323-34에 개시되었다.
세포 증식의 정도가 중화 능력의 판단에 있어 유일한 파라미터는 아니다. 예를 들면, 분비 수준이 GM-CSF에 의존하는 신호 분자(예, 사이토킨)의 수준의 측정 등도 GM-CSF 중화제로 추측되는 물질의 확인에 사용될 수 있다.
문제의 항체 또는 그 단편이 영장류 GM-CSF 활성의 중화제인가를 판단하는데 사용되는 다른 세포주의 예로서 AML-193(Lange, B. 등 (1987). Blood 70, 192-9); GF-D8 (Rambaldi, A. 등 (1993). Blood 81, 1376-83); GM/SO (Oez, S. 등 (1990). Experimental Hematology 18, 1108-11); M07E (Avanzi, G. C. 등. (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64); TALL-103 (Valtieri, M. 등. (1987). Journal of Immunology 138, 4042-50); UT-7 (Komatsu, N. 등 (1991). Cancer Research 51, 341-8) 등을 포함한다.
본 발명에 따른 인간 항체 또는 그 단편들은 모노클로날이다. 본 발명에서 "모노클로날"은 본 기술분야에서 통상 사용되는 의미로 사용되며, 즉 B 세포와 같은 항체 생성 세포의 단일 클론에서 발생하는 항체(또는 그 단편)로서 결합된 항원상의 단일 에피토프를 인식한다. 모노클로날인 인간 항체의 제조는 특히 어렵다. 쥐 B 세포의 불멸 제포주와의 융합과 달리, 인간 B 세포의 불멸 세포주와의 융합은 생존가능하지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 항체 기술분야에 일반적으로 존재하는 것으로 인식되어온 중요한 기술적 장애를 극복한 결과이다. 항체의 모노클로날 특성은 치료제로서의 사용에 특히 적합하며, 이는 상기 항체가 단일, 동종성 분자종이기 때문에 매우 잘 특성화될 수 있고 재현가능하게 제조되고 정제가능하기 때문이다. 이러한 요인들은 생물학적 활성이 매우 높은 수준의 정밀성으로 예측될 수 있는 제품을 생산 가능하게 하고, 이러한 분자는 인간에서의 치료적 투여에 대한 관청에서의 허가를 얻어야 하기 때문에 상기 요인들은 특히 중요하다.
본 발명에 따른 모노클로날 항체(또는 대응하는 단편)들이 인간 항체(또는 대응하는 단편)라는 점이 특히 중요하다. 인간에 대해 치료적 투여로 사용하고자 하는 항체를 고려함에 있어서, 항체가 인간에서 기원된 것이 특히 유리하다. 인간 환자에 투여된 후, 인간 항체 또는 그 단편은 대부분 환자의 면역 시스템에 의해 강력한 면역학적 반응을 유발하지 않으며, 즉 비인간 단백질인 "이종(foreign)"으로 인식되지 않는다. 이는 치료적 항체에 대해 숙주, 즉 환자 항체가 생성되지 않는 것을 의미하며, 그렇지 않다면 숙주 항체는 치료 항체의 활성을 막고 및/또는 치료항체의 환자 체내에서의 제거를 촉진시켜, 치료항체가 원하는 치료적 효과를 내지 못하도록 할 것이다.
본 발명에서 "인간"항체는 본 발명의 항체, 또는 그 단편이 인간 배선 항체 목록(human germline antibody repertoire)에 포함된 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 정의에서, 항체, 또는 그 단편들이 인간 배선 아미노산 서열로 이루어져 있다면, 즉 문제의 항체 또는 그 단편들의 아미노산 서열이 발현된 인간 배선 아미노산 서열과 동일하다면, 인간 항체로 간주될 수 있다. 또한 어떤 항체 또는 그 단편들의 서열이 이와 가장 가까운 인간 배선 서열과의 차이가 체성 과돌연변이 흔적에 기인되는 것으로 예상되는 정도라면, 상기 항체 또는 그 단편들은 인간 항체로 간주될 수 있다. 또한 많은 비인간 포유류, 예를 들면 마우스 및 래트와 같은 설치류의 항체는 VH CDR3 아미노산 서열을 포함하고 있고, 이는 발현된 인간 항체 목록에도 존재하는 것으로 예측된다. 발현 인간 목록에 존재하는 것으로 예측되는 모든 인간 또는 비인간 기원의 서열은 본 발명의 목적을 위한 "인간" 항체로 간주될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 영장류 GM-CSF는 인간(호모 사피엔스)GM-CSF 또는 비인간 영장류 GM-CSF이다. 특히 바람직한 비인간 영장류 GM-CSF의 변종은 기봉 원숭이(nomascus concolor, 웨스턴 볏긴팔 원숭이로도 알려져 있다) GM-CSF 및 마카카 패밀리 원숭이의 GM-CSF, 예를 들면 레시우스 원숭이(Macaca mulatto) GM-CSF 및 시노몰구스 원숭이(Macaca fasciciilaris) GM-CSF를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 인간과 전술한 원숭이 종의 하나 이상 사이에 교차반응성을 나타낸다. 이는 인간 개체에 치료적 투여를 위한 항체 분자를 위해 특히 유리한데, 이러한 항체들은 통상 등록 허가 전 많은 시험을 거쳐야 하며, 이들 중 초기 시험은 비인간 동물 종을 사용하기 때문이다. 이러한 테스트를 수행함에 있어, 보통 인간과 유전적으로 상당히 유사한 종을 비인간 종으로서 사용하는 것이 바람직한데, 이는 얻어지는 결과가 통상 동일한 물질을 인간에 투여하였을 때 얻어질 수 있는 결과를 매우 높은 수준으로 예측가능하게 하기 때문이다. 이러한 동물 시험에 기반한 예측력은 최소한 일부는 분자 적합성에 의존하며, 동일한 치료 물질을 인간 및 동물 모델에 투여하였을 때 교차 반응성이 있는 경우 그 예측력이 매우 높다. 본 발명의 실시예에서와 같이 항체 분자가 동일한 항원에 대해 인간 및 다른 가까운 관련 종에서 상호 교차성이 있다면, 동일한 항체 분자를 인간에서 그리고 이 가까운 관련 종, 예를 들어 전술한 원숭이 종 중 어느 하나에 사용하여 테스트를 수행할 수 있다. 이는 이들 테스트의 효율성 및 인간 즉 치료학적 면에서 가장 관심의 대상이 되는 종에서의 항체의 행동에 대한 테스트의 예측력 모두를 증가시킨다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 인간 모노클로날 항체는 IgG 항체일 수 있다. IgG는 매우 구별적인 항체 인식 및 결합을 담당하는 가변성 항체 영역뿐 아니라 내인성으로 생산되는 항체에 통상 존재하는 중쇄 및 경쇄 항체 폴리펩타이드 사슬의 일정 영역을 포함하며, 어떤 경우에는 하나 이상의 부위가 탄수화물로 수식되어 있다. 이러한 당화(glycosylation)는 통상 IgG 형식의 홀마크이며, 이러한 일정 영역의 부분은 인 비보에서 다양한 효능자 기능을 유발하는 것으로 알려진 전체 항체의 소위 Fc 영역을 이룬다. 또한, Fc 영역은 IgG의 Fc 수용체에의 결합을 매개하며, 따라서 인 비보에서의 반감기를 연장시키고, Fc 수용체의 증가와 함께 예를 들면 염증 조직에 IgG의 호밍(homming)을 촉진시킨다. 바람직하게, IgG항체는 IgG1 항체 또는 IgG4 항체이며, 이들의 인 비보 작용기전이 특히 잘 규명되고 이해되어져 있기 때문이다. 특히 IgG1 항체가 그러하다.
본 발명의 추가적인 실시예에 따르면, 인간 모노클로날 항체의 단편은 scFv, 단일 도메인 항체(single domain antibody), Fv, VHH 항체, 디아체(diabody), 탠덤 디아체(tandem diabody), Fab, Fab' 또는 F(ab)2이다. 이러한 단편들은 통상 두개의 하위클래스로 분류되는데, 즉 단일 폴리펩타이드 사슬로 이루어진것과, 적어도 두개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 것이다. 전자의 하위클래스 구성원은 scFv (하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역이 폴리펩타이드 링커를 통해 하나의 단일 폴리펩타이드 사슬로 결합한다); VHH 항체(단일 VH 영역을 포함)과 같은 단일 도메인 항체(단일 항체 가변 영역을 포함한다)을 포함한다. 후자의 하위 클래스 구성원은 Fv (하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 독립된 폴리펩타이드 사슬로서 포함하며, 상기 독립된 폴리펩타이드 사슬은 서로 비-공유적으로 연합한다; 디아체(두개의 비공유적으로 연합한 폴리펩타이드 사슬을 포함하며, 이들 각각은 두개의 항체 가변 영역- 통상 폴리펩타이드 사슬 당 하나의 VH 및 하나의 VL을 포함하며, 이 두개의 폴리펩타이드 사슬은 머리 -꼬리 형상으로 배열되어 이가 항체 분자를 산출한다); 탠덤 디아체(4개의 공유 결합된 두 상이한 특이성의 면역 글로불린 가변 영역(VH 및 VL 영역)을 포함하고, 전술한 디아체보다 두배로 큰 호모다이머를 형성하는 이중특이적 단일 사슬 Fv 항체); Fab (한 폴리펩타이드 사슬로서 그 자체가 VL 영역 및 전체 경쇄 일정 영역을 포함하는 전체 항체 경쇄를 포함하고, 다른 폴리펩타이드 사슬로서, 전체 VH 영역 및 중쇄 일정 영역의 일부를 포함하는 항체 중쇄의 일부분을 포함하며, 상기 두 폴리펩타이드 사슬이 사슬간 디설파이드결합을 통해 분자간으로 결합된다); Fab'(상기 Fab에서 항체 중쇄상에 포함된 디설파이드 결합을 추가적으로 환원시킨 것); 및 F(ab)2 (두개의 Fab' 분자를 포함하고, 각 Fab' 분자는 사슬간 디설파이드 결합에 의해 각각의 다른 Fab' 분자에 연결된다). 통상적으로 전술한 형태의 항체 단편은 예를 들면 특정 긴급상태에의 치료적 투여를 위해 요망되는 항체의 약동력적 성질 등을 매우 유연성있게 테일러링(tailoring)할 수 있다. 예를 들면, 혈관 분포가 좋지 않은 것으로 알려진 치료 조직(예, 관절)을 치료할 때, 조직 침투도를 증가시키기 위해 투여되는 항체의 크기를 줄이는 것이 바람직하다. 어떤 경우에는 치료 항체의 몸에서의 제거 속도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있으며, 이 경우 상기 속도는 통상 투여되는 항체의 크기를 줄임으로써 가속화될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예를 따르면, 상기 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편들은 1가 단일특이적; 다가 단일특이적, 특히 이가 단일특이적; 또는 다가 다중 특이적 특히 이가 이중특이적 형태로 존재할 수 있다. 통상적으로, 다가 단일특이적, 특히 전술한 전체 인간 IgG와 같은 이가 단일특이적 항체는 치료학적 이점을 갖는데, 이러한 항체에 의해 발휘되는 중화는 결합성 효과(avidity effects), 즉 동일 항원(본 발명에서는 영장류 GM-CSF)의 다수 분자에 대한 동일 항체에 의한 결합에 의해 증강되는 이점을 갖는다. 본 발명의 항체 단편의 수개의 1가 단일특이적 형태는 전술되었다(예, scFv, Fv, VHH 또는 단일 도메인 항체). 본 발명의 다가 다중특이적, 특히 이가 이중특이적 형태의 인간 모노클로날 항-영장류 GM-CSF 항체는 전체 IgG를 포함할 수 있으며, 전체 IgG에서 하나의 결합 암이 영장류 GM-CSF 에 결합하고 다른 결합 암이 영장류 GM-CSF과 상이한 항원에 결합한다. 다가 다중특이적, 특히 2가 이중특이적 형태는 바람직하게 인간 단일 사슬 이중 특이적 항체, 즉 본 분야에 통상적으로 알려진 바와 같은 짧은 삽입 폴리펩타이드 스페이서(예를 들어, 항-CD19 x 항-CD3 이중특이적 단일 사슬 항체를 위한 WO 99/54440를 참조)에 의하여 하나의 인접하는 폴리펩타이드 사슬로 연결된, 전술한 바와 같은 두개의 scFv 본체를 포함하는 재조합 인간 항체 구축물(consruct)일 수 있다. 여기에서, 이중특이적 단일 사슬 항체내에 포함된 이중특이적 단일 사슬 항체의 한 scFv 부분은 특이적으로 전술한 영장류 GM-CSF과 결합하며, 이 이중특이적 단일 사슬 항체의 다른 scFv 부분은 치료적 효과를 내는 다른 항원과 결합한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편들은 예를 들어 하나 이상의 분자의 폴리에틸렌글리콜("PEG") 및/또는 폴리비닐피롤리돈("PVP")과 같은 유기 폴리머로 유도체화될 수 있다. 본 기술분야에 알려진 바와 같이, 이러한 유도체화는 항체 또는 그 단편의 약동력적 성질을 조절하는데 유리하다. 특히 바람직한 것은 PEG-말레이미드로 PEG분자 유도체화되는 것인데, 이는 시스테인 아미노산의 설프하이드릴기(sulfhydryl group)에 의해 부위 특이적 방식으로 항체 또는 단편에 결합한다. 이들 중 분지 또는 직선 사슬형 2OkD 및/또는 40 kD PEG-말레이미드가 특히 바람직하다. 이들은 특히 scFv 단편과 같이 인간 항-영장류 GM-CSF 항체 단편을 하나 이상의 PEG 분자, 특히 PEG-말레이미드와 결합시킴으로써 그 효과 분자량을 증강시키는데 유리하다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편들은 인간 또는 비인간 영장류 GM-CSF의 에피토프, 특히 아미노산 23-27 (RRLLN) 및/또는 아미노산 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL)을 포함하는 불연속 에피토프에 특이적으로 결합한다.
전술한 아미노산 서열 스트레치(stretch) 65-77 내의 67번 위치에서의 가변성은 이부분의 영장류 GM-CSF에 있어서의 이종성을 반영하며, 인간 및 기봉 GM-CSF은 67번 위치가 R인 반면, 시노몰거스 및 레시우스 원숭이와 같은 마카카 패밀리 원숭이는 67번 위치가 Q이다.
본 명세서에서, 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF의 넘버링은 성숙 GM-CSF, 즉 17 아미노산 신호 서열이 없는 GM-CSF(전술한 인간 및 비인간 영장류 종 양자에서 성숙 GM-CSF의 전체 길이는 127 아미노산이다)의 넘버링을 지칭한다. 인간 및 기봉 GM-CSF의 서열은 다음과 같다:
Figure pat00001
시노몰거스 및 레시우스 원숭이와 같은 마카카 원숭이 패밀리의 특정 구성원의 GM-CSF의 서열은 다음과 같다:
Figure pat00002
전술한 바와 같은 본 발명의 인간 모노클로날 항체(또는 그 단편)들에 결합하는 최소한의 에피토프, 바람직하게는 불연속 에피토프는 상기 GM-CSF 서열에서 굵게 표시하였다. 본 발명에서, "불연속 에피토프"는 주어진 폴리펩타이드 사슬, 본 발명에서 성숙 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF내에서, 동시에 그리고 특이적(전술된 정의와 같이)으로 하나의 항체에 결합되는 적어도 두개의 인접하지 않는 아미노산 서열 스트레치를 지칭한다. 본 정의에 따르면, 이러한 특이적인 동시 결합은 선형의 GM-CSF 폴리펩타이드에서 일 것이다. 여기에서, 연장 루프를 형성하는 성숙 GM-CSF 폴리펩타이드를 연상할 수 있는데, 상기 펩타이드의 한 영역에서 상기 굵게 표시한 두 서열이, 예를 들면 서로 근접한 위치에서 다소 평행으로 정렬된다. 이 상태에서 이들은 본 발명의 항체 단편과 특이적으로 그리고 동시에 결합된다. 본 정의에 따른 성숙 GM-CSF의 표시된 두개의 서열 스트레치의 동시적인 그리고 특이적인 결합은 입체형태적 에피토프에 항체 결합하는 형식으로 될 것이다. 여기에서, 성숙 GM-CSF는 인 비보에서 통상적으로 존재하는 것과 같은 3차 형태를 형성한다(Sun, H. W., J. Bernhagen, 등. (1996). Proc Natl Acad Sci USA 93, 5191-6). 이러한 3차 형태에서, 성숙 GM-CSF 폴리펩타이드 사슬은 상기 표시한 두개의 서열 스트레치가 공간적으로 근접하게, 예를 들면 접힌 성숙 GM-CSF의 특정 영역의 바깥 표면에 오도록 접혀지며, 이후 주위 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 3차원적 형성에 의해 인식된다.
바람직한 실시예에서, 상기(불연속)에피토프는 추가적으로 상기 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF의 서열에서 강조한 아미노산 28-31 (LSRD)를 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 (불연속) 에피토프는 추가적으로 아미노산 32-33 (TA) 및/또는 21-22 (EA)를 포함하며, 이들은 상기 인간 및 비인간 영장류 GM-CSF의 서열에서 밑줄친 부분이다.
본 발명의 추가적인 실시예에 따라, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편들은 그 중쇄 가변 영역에 서열번호: 1-13 또는 56에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 바람직하게 인간 모노클로날 항체 또는 단편은 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 1의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 2의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 3의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 4의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 5의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 6의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 7의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 8의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 9의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 10의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 11의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 12의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 13의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호: 14의 중쇄 가변영역 CDR1 서열, 서열번호: 15의 중쇄 가변영역 CDR2 서열 및 서열번호: 56의 중쇄 가변영역 CDR3 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 14개의 조합 중 어느 하나의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편이 추가적으로 그 경쇄 가변영역에 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호: 17의 아미노산서열을 포함하는 CDR2, 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
추가적인 실시예에 따르면, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편들은 그 경쇄 가변영역에 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 20의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 21의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 22의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 23의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 24의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 25의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 26의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 27의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 28의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 29의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 30의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 31의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 32의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 33의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 52의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 19의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 53의 아미노산서열을 포함한다.
또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 그 경쇄 가변영역에 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함한다. 바람직하게 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 경쇄 가변영역이 서열번호:54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 20의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 21의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 22의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 23의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 24의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 25의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 26의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 27의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 28의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 29의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 30의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 31의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 32의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 33의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 52의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 54의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 53의 아미노산서열을 포함한다.
또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 그 경쇄 가변영역에 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함한다. 바람직하게 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 경쇄 가변영역이 서열번호:55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 20의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 21의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 22의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 23의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 24의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 25의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 26의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 27의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 28의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 29의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 30의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 31의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 32의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 33의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 52의 아미노산서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄 가변영역이 서열번호: 55의 아미노산서열을 포함하고 중쇄 가변영역이 서열번호: 53의 아미노산서열을 포함한다.
보다 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편들은 그 경쇄 가변영역에 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역, 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하고 그 중쇄 가변 영역에 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호: 15 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 56 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시예에서 인간 모노클로날 항체는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 36의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 그 경쇄에 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고 그 중쇄에 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 바람직한 실시예 인간 모노클로날 항체 분자 및/또는 그 단편은 영장류, 특히 인간 GM-CSF의 활성 중화제로서 특히 유리하다. 이러한 특히 바람직한 실시예에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 하기와 같은 이유로 특히 유리하다.
첫째, 이들은 영장류 GM-CSF을 매우 특이적으로, 즉 영장류 GM-CSF와 다른 영장류 콜로니 자극 인자(예를 들면 영장류 G-CSF 및 M-CSF)와의 혼합물에서 영장류 GM-CSF을 매우 특이적으로 인식하며, 이들 특히 바람직한 실시예에 따른 결합 분자는 영장류 GM-CSF를 고도로 구별하는 반면 동일 환경내 존재하는 다른 콜로니 자극 인자는 인식하지 않는다. 이는 본 실시예에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편을 인간에게 투여할 때, 이들 항체 또는 그 단편은 원하는 표적에만 특이적으로 결합하여 중화시키고, 반면 다른 원하지 않는 표적에는 결합하지도, 중화하지도 않는 것을 의미한다. 결국 이는 인 비보에서의 치료적 활성 모드에 관하여 고도의 예측성을 부여한다.
두번째로, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 결합자는 영장류 GM-CSF에 매우 높은 친화성으로 결합한다. 약 4 x 10-9M 내지 0.04 x 10-9M(40 pM에 상당)의 KD값이 본 클래스의 분자들에 대해 보고되었다. 수성 매질내에서 이러한 분자의 키네틱 온 속도(kinetic on-rate)는 주로 확산에 의해 조절되므로 생리학적 조건에서 국소 확산 조건이 허용하는 이상으로 개선될 수 없으며, 낮은 KD는 일차적으로 키네틱 오프 속도(kinetic off-rate; k off)의 결과로서 발생되며, 가장 높은 친화 항체 결합자의 경우 약 10-5 s-1이다. 이는 일단 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편이 영장류 GM-CSF의 양쪽에 결합한 복합체가 형성되면, 이들 복합체는 쉽게 분리되지 않으며, 적어도 신속하게 분리되지 않음을 의미한다. 생물학적 활성의 중화제로 사용되는 결합 분자의 경우, 이러한 특성은 매우 유리한데, 원하는 중화 효과는 통상 중화시키고자하는 물질(여기에서는 영장류 GM-CSF)의 생물학적 활성이 중화 결합 분자에 의해 결합되어 있는 동안 지속되기 때문이다. 따라서 중화 분자가 원하는 표적에 결합을 유지하는 시간만큼 그에 상응하는 시간동안 중화 작용이 계속된다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편이 높은 결합 친화성으로 영장류 GM-CSF와 결합하는 것은 또 다른 이점을 제공한다. 통상적으로 항체 또는 그 단편은 크기-의존적으로 환자의 혈류에서 제거되며, 작은 분자가 큰 분자보다 먼저 배설 또는 제거된다. 두 폴리펩타이드-항체 또는 항체 단편 및 결합된 GM-CSF-의 복합체는 명백하게 항체 단독보다 크기 때문에, 앞서 언급한 낮은 k off로 인해 본 치료적 중화제는 GM-CSF에 결합되지 않은 경우보다 훨씬 느리게 환자 체내에서 배설 또는 제거되게 된다. 따라서, 중화 활성의 크기 뿐 아니라 인 비보에서의 지속 기간도 증가하게 된다.
마자막으로 본 발명의 실시예에 따른 결합자의 중화 활성은 놀라울정도로 높다. 후술하겠지만, 중화 활성은 인 비트로에서 TF-1 성장 억제 어세이(Kitamura, T. 등. (1989). J Cell Physiol 140, 323-34)에 의해 측정되었다. 중화력의 지표로IC50 값을 측정하였으며, IC50은 최대 TF-1 세포 증식 억제의 반을 유발하는데 요구되는 본 발명의 실시예에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편의 농도를 의미한다. 본 발명의 실시예에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편의 IC50값은 약 3 x 10-10 M, 또는 약 0.3 nM으로 측정되었다. 본 발명의 실시예에 따른 결합분자는 따라서 영장류 GM-CSF의 활성을 매우 강력하게 중화하는 물질임이 확인되었다.
요약하면 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 단편은 원하는 항원에 대하여 고도의 식별력을 나타내며, 이 항원에 극히 견고하게 그리고 상당히 오랜 동안 결합하며, 결합되어 있는 동안 매우 강력한 중화 활성을 나타낸다. 동시에 결합자-항원 복합체의 체내에 오래동안 존재할 수 있기 때문에 결합자가 체내에서 천천히 제거되고 따라서 인 비보에서의 원하는 치료적 효과의 지속기간이 길어진다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다. 상동성은 벡터 NTI (InforMax™, Maryland, USA)와 같은 표준 시퀀스 정렬 프로그램에 의해 측정될 수 있다. 이러한 프로그램은 정렬된 서열을 아미노산대아미노산 베이스로 서로 비교하며, 비교를 위해 상당히 다양한 수준의 엄중함(stringency)으로 세팅될 수 있다(예, 동일한 아미노산, 보존적인 아미노산 치환(conservative amino acid substitution) 등). 본 발명에서, 문제의 두 아미노산이 동일한 화학적 클래스, 즉 산성, 비극성, 비전하극성(uncharged polar) 및 염기성에 속하는 경우 서로의 "보존적 치환"으로 간주된다. 비제한적 예로서, 비극성 아미노산 클래스에 속하는 두 상이한 아미노산은 비록 이들 두 아미노산이 동일하지 않더라도 서로의 "보존적 치환"으로 간주되며, 반면 하나는 비극성 아미노산이고 다른 하나는 염기성 아미노산인 경우 이들은 서로의 "보존적 치환"으로 간주되지 않는다. Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts 및 Walter 그룹의 "Molecular Biology of the Cell", 4th Edition (2002)의 패널 3.1을 참조하면, 아미노산은 4개의 주 그룹으로 분류된다: 산성, 비극성, 비전하 극성 및 염기성. 이러한 그룹화는 본 발명의 목적을 위하여 특정 아미노산이 문제의 다른 아미노산의 보존적 치환인지 여부를 결정하는 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들 서열과 최소한 70% 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공하는 것이며, 여기에서 상동성은 서열번호: 1-48, 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 문제의 뉴클레오타이드 서열을 시퀀스 정렬(아미노산 서열에 대해 전술한 바와 같은)에 의해 비교함으로써 결정하고, 문제의 서열내 뉴클레오타이드는 이것이 서열번호: 1-48, 및/또는 52-56 중 어느 하나의 대응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열내 대응하는 뉴클레오타이드와 동일하거나, 또는 서열번호: 1-48, 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열내 대응하는 하나 이상의 뉴클레오타이드와 문제 서열내 하나 이상의 뉴클레오타이드의 차이(deviation)가 하나의 뉴클레오타이드 트리플릿(nucleotide triplet)을 결과하고, 번역되었을 때, 서열번호: 1-48, 및/또는 52-56 중 어느 하나의 대응하는 아미노산 서열내 대응하는 아미노산의 보존적 치환이거나 또는 퇴화 트리플릿(degenerate triplet)으로 인해 동일한 아미노산을 결과하는 경우, 상동성으로 간주된다. 여기에서, "보존적 치환"의 의미는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기에서 "상동성"은 전술한 바와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명의 "약학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에 투여하기 위한 조성물을 의미한다. 바람직한 실시예에서, 약학적 조성물은 비경구적(parenteral), 경피, 강내(intraluminal), 동맥내, 척수강내(intrathecal) 및/또는 비강내 투여 또는 조직으로의 직접적인 투여를 위한 조성물을 포함한다. 특히 상기 약학적 조성물은 주입(infusion) 또는 주사(injection)에 의해 투여된다. 적합한 조성물의 투여는 다양한 방법, 예를 들면 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피부내 투여로 시행된다. 본 발명의 약학적 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 인산 버퍼 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 형태의 습윤제, 멸균 용액, 리포좀 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함한 조성물은 공지된 종래 방법에 의해 포뮬레이션될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 개체에 적합한 용량으로 투여된다. 투여 계확은 의사 및 임상적 요인에 의해 결정된다. 의학 분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이 환자에 대한 용량은 환자의 크기, 표면적, 나이, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강 상태 및 동시에 투여되는 다른 약물 등과 같은 수많은 인자에 의존한다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비경구 용매의 예로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 들 수 있다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 식염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 매질은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 유당화된 링거액, 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 매질은 액상 영양성 보충액, 전해질 보충액(예, 링거 덱스트로즈에 기초한 것들) 등을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제는 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 가스 등이다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단백질성 담체, 예를 들면 혈청 알부민 또는 면역 글로불린 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 단백질성 담체는 인간 기원이다. 본 발명의 약학적 조성물은 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편(본 발명에 기재한)이외에, 추가적으로 상기 약학적 조성물을 사용하고자 하는 용도에 따라, 생물학적으로 활성인 약제를 포함할 수 있다. 이러한 약제는 위장관 시스템에 작용하는 약물, 세포증식억제제로서 작용하는 약물, 고요산혈증을 방지하는 약물, 면역 반응을 억제하는 약물(예, 코티코스테로이드), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계에 작용하는 약물, 및/또는 본 분야에 공지된 사이토킨 등이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 전술한 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자의 염증성 질환의 치료용 의약품 제조에서의 사용에 관한 것이며, 여기에서 상동성은 전술한 의미로 사용되며, 상기 의약품은 경우에 따라 하나 이상의 항염증제를 포함한다. 유리하게 사용될 수 있는 염증성 질환은 류마티스성 관절염(RA; TNF-alpha 중화제에 의한 치료에 저항적인 RA 포함), 천식, 다발성 경화증(MS), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 크론병, 특발성 폐섬유화증(IPF), 염증성 장질환(IBD), 포도막염, 황반변성, 대장염, 건선, 왈더변성, 항인지질증후군(APS), 급성 관상 동맥 증후군, 레스티노시스(restinosis), 죽상동맥경화증, 재발성 다발 신경병증(RP), 급성 또는 만성 간염, 실패한 정형외과적 임플란트(failed orthopedic implants), 사구체신염, 루프스, 또는 자가 면역 질환으로 구성된 군에서 선택된다.
특히, 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편은 RA(TNF-alpha 중화제에 의한 치료에 저항적인 RA 포함), 천식, MS 및/또는 크론병 치료용 의약품의 제조에 사용된다.
RA, 천식 및/또는 MS와 관련하여 류마티스성 관절염(RA)의 병리학적 기전에 관하여 두가지 지배적 이론이 있다. 첫번째는 T세포가 아직 규명되지 않은 어떤 항원과 상호작용을 하여 상기 질병의 개시 및 만성적인 염증 상태로 유도하는 일차적인 원인 세포라는 것이다. 이러한 이론은 RA와 클래스 II 주조직적합성 항원과의 알려진 결합, RA 윤활막에서의 다수의 CD4+ T 세포 및 구부러진 T 세포 수용체 유전자의 사용에 기반한 것이다. GM-CSF는 표면 클래스 II MHC 발현을 증가시켜 항원제시기능을 증강시키는 것으로 알려져 있으며, GM-CSF는 T-세포에 의해 생산되므로, T-세포 기반의 가설에 따른 질병 진전에 있어서 GM-CSF이 일정 역할을 할 것임을 추정할 수 있게 한다.
두번째 이론은 T 세포가 상기 질병을 개시하는데는 중요하지만 만성적인 염증은 마크로파지 및 섬유모세포(fibroblast)에 의해 T-세포 의존적 방식으로 자가-영속된다는 것이다. 이 이론은 만성 RA에 활성화된 T-세포 표현형의 상대적인 부존재 및 활성 마크로파지 및 섬유모세포 표현형의 우세에 기초한 것이다. GM-CSF는 마크로파지의 강력한 자극자이며 단핵구 및 마크로파지의 증식을 촉진한다. "효과"세포(마크로파지) 및 결합 조직 세포(섬유모세포)에 의해 주로 생산되는 것으로 알려져 있는 GM-CSF는 ELISA 또는 mRNA 연구에 의해 측정된 바에 의하면 RA 윤활막 및 윤활액에 풍부히 발현된다. RA의 "마크로파지-섬유모세포 이론"에 따르면 이들 두 세포 타입이 주도적으로 만성 염증의 자가-영속적 상태를 만들며, T 세포의 참여는 그다지 중요하지 않다. 이 시나리오에서, 활성화된 마크로파지는 계속적으로 IL-I 및 TNF를 분비하며 이들은 윤활 섬유모세포를 활성화 상태로 유지시킨다. 차례로 섬유모세포는 다량의 a) 사이토킨- IL6, IL8 및 GM-CSF; b) 프로스타글란딘; 및 c) 단백분해효소를 분비한다. GM-CSF는 피브백으로 새로이 보충된 단핵구를 마크로파지로 성숙하도록 촉진한다. IL-8 및 IL-6은 다른 세포 집단의 보충 및/또는 활성화에 기여하며, 프로스타글란딘과 프로테아제는 직접 뼈나 연골과 같은 인접 결합 조직을 침식하고 파괴한다.
크론병에 관해, 효모 기원의 재조합 인간 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자(rGM-CSF)가 중간 내지 중증의 크론병 치료에 효과를 나타냄이 보고되었다(Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet 360, 1478-80). 그 이후 수개의 리뷰 기사에 의해 염증 반응의 성격을 갖는 것으로 믿어져 왔던 이 질환에 있어서 상기 강력한 프로-염증성 사이토킨의 치료적 효과가 고찰되었다. 크론병에서 rGM-CSF의 작용기전에 대한 설명으로는 면역 결핍 구성요소, Th 2 스큐잉(skewing), 및 조절 T 세포의 분화를 촉진하는 수지상 세포의 팽창 등을 포함한다(WiIk NJ, Viney JL (2002). Curr Opin Invest Drugs 3, 1291-6; Folwaczny C 등. (2003). Eur J Gastroenterol Hepatol 15, 621-6). 본 발명자들은 다른 프로-염증성 질환에서 알려진 GM-CSF 역할과 보다 부합하고, 보다 간단한 작용기전이 제안될 수 있을 것으로 믿는다.
GM-CSF는 공지된 가장 강력한 아쥬번트(adjuvants) 중 하나이며, 사이토킨이 수많은 진행중인 백신화 시도에서 동시 투여되는 이유이다. 동시에 GM-CSF은 높은 면역원성을 가진다(Ragnhammar P 등. (1994). Blood 84, 4078-87). 최근 보고(Rini B 등. (2005) Cytokine 29, 56-66)에 따르면 효모에서 유래한 rGM-CSF를 매일 피하 처치하여 크론병 치료 시도를 하였다(Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet 360, 1478-80)에 따르면, 전립암 환자의 87% (13/15)에서 3개월내 이 사이토킨에 대해 항체가 생성되었다. 환자의 60%(9 /15)가 (폴리클로날) GM-CSF 중화항체를 생성하였다. GM-CSF에 대한 중화 반응의 가능성은 크론 질병 시도에서 조사되지 않았으며, 치료중 GM-CSF의 혈청 수준도 조사되지 않았다. 본 발명의 실시예 범위에서 rGM-CSF를 처치한 크론병 환자는 상기 사이토킨의 면역-자극 활성에 대해 직접적으로 반응하였을 뿐 아니라. 적어도 부분적으로 투여된 그리고 크론병에서 과생성되는 것으로 알려진 내인성 GM-CSF 양자를 중화하는 항체 반응에 임상적으로 반응하였다고 사료된다(Agnholt J 등. (2004) Eur J Gastroenterol Hepatol 16, 649-55). 따라서 중화 항-GM-CSF 항체는 rGM-CSF과 마찬가지로 크론병에서 유사한 치료적 활성을 나타낼 것이며, 대체적인 치료적 접근으로서 간주되어야 한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호: 1-48 및/또는 52-56 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자의 종양성 질환 또는 지연된 세포 아폽토시스, 증강된 세포 생존 또는 증식을 수반하는 다른 질환의 치료용 의약품의 제조에서의 사용에 관한 것이며, 여기에서 상동성은 전술한 의미로 사용되며, 상기 의약품은 경우에 따라 하나 이상의 부가적인 항암제를 포함한다. 유리하게 사용될 수 있는 종양성 질환은 암이며, 특히 바람직하게는 백혈병, 다발골수종, 위암 또는 피부암이다.
Olver 등 ((2002) Cancer Chemother Pharmacol. 50, 171-8)은 GM-CSF 수용체를 발현하는 것으로 알려진 고형 암 환자에 GM-CSF 길항제 E21R를 피하 투여하였으며, 그 결과 단지 일시적으로 PSA 혈청 수준이 저하되었다. 또한, 급성 골수성 백혈병("AML")에의 상기 GM-CSF 길항제의 투여는 아무런 임상적 활성을 나타내지 않았다(Jakupovic 등. (2004) Blood 103, 3230-2). 또한 AML 환자에 항-GM-CSF 모노클로날 항체의 투여는 충분한 혈청 농도 및 항체의 인 비보에서의 생물학적 활성에도 불구하고 항-백혈병 효과를 나타내지 못했다(Bouabdallah 등. (1998) Leuk Lymphoma 30, 539- 49). 따라서 상기 저자들은 항 GM-CSF 항체로의 치료는 AML 환자에서 효과적이지 않다고 결론을 내렸다.
하기의 비제한적 실시예 및 도면에 의해 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
도 1은 ELISA법에 의해 측정한, 파지 디스플레이에서 4 라운드 또는 5 라운드 패닝후 수득된 다양한 항-rhGM-CSF scFv 분자들의 흡수 강도(결합력에 직접 비례)를 도시한 것이고,
도 2는 유세포분류-기반 어세이에 의해 측정한, 다양한 항-rhGM-CSF scFv 및 다른 테스트 분자의 평균 형광 강도(중화력에 역비례)를 도시한 것이고,
도 3은 항-rhGM-CSF scFv 분자 5-306을 사용하여 수행된 TF-1 증식 억제 어세이의 결과이며,
도 4는 ELISA법에 의해 측정한 파지 디스플레이에서 4 또는 5회 패닝후 수득된 다양한 인간 항-rhGM-CSF scFv 분자들에 대한 흡수 강도(결합력에 직접 비례)를 도시한 것이고,
도 5는 다양한 대표적인 인간 항-rhGM-CSF scFv 히트들을 사용하여 수행된 TF-1 증식 억제 어세이의 결과이며,
도 6은 인간 GM-CSF 및 다른 인간 콜로니 자극 인자에 대한 인간 모노클로날 항체의 결합 특이성을 도시한 것이고,
도 7은 인간 모노클로날 항-GM-CSF 항체 및 그 단편의 동력학적 결합을 규명하는 표면 플라즈몬 공명 측정을 도시한 것이고,
도 8A는 비인간 영장류 GM-CSF 및 인간 GM-CSF의 시퀀스 정렬이고,
도 8B는 인간 모노클로날 항-GM-CSF 단편과 인간 GM-CSF의 결합을 보여주는 펩타이드 스폿 라디오그램이고,
도 9는 다양한 대표적인 인간 항-rhGM-CSF scFv 항체 단편들을 사용하여 수행한 TF-1 증식 억제 어세이의 정성적인 결과이고,
도 10은 다양한 대표적인 인간 항-rhGM-CSF IgGs 및 대응하는 scFv 단편들을 사용하여 수행한 TF-1 증식 억제 어세이의 정량적인 결과이고,
도 11은 다양한 대표적인 인간 항-rhGM-CSF scFv 항체 단편들을 사용하여 수행한 IL8 생산 어세이의 정량적인 결과이고,
도 12는 다양한 대표적인 인간 항-macGM-CSF IgGs 및 대응하는 scFv 단편들을 사용하여 수행한 TF-1 증식 억제 어세이의 정량적인 결과이고,
도 13은 재조합 인간 GM-CSF 및 다양한 비영장류 종 유래의 GM-CSF에 대한 항-GM-CSF 항체 IgG B의 결합 특이성을 보여주는 비교 결합시험의 결과이고,
도 14는 항-GM-CSF 항체 IgG B의 중화 잠재력의 GM-CSF의 당화에 대한 의존성을 규명한 어세이 결과이고,
도 15는 항-GM-CSF 항체 IgG B의 GM-CSF-매개 호산구 생존에 대한 효과 연구 결과이고,
도 16은 항-GM-CSF 항체 IgG B의 GM-CSF-매개 호산구 활성화에 대한 효과 연구 결과이고,
도 17은 과립구의 식세포 작용(A-C) 및 산화방출(D-F)에 기반하여 측정한, 항-GM-CSF 항체 IgG B를 사용한 엑스 비보 독성 연구의 결과이고,
도 18은 단핵구의 식세포 작용(A-C) 및 산화방출(D-F)에 기반하여 측정한, 항-GM-CSF 항체 IgG B를 사용한 엑스 비보 독성 연구의 결과이다.
실시예 1: 중화 인간 항체 및 그 단편들의 생성을 위해 사용된 재조합 인간("rh") GM-CSF 항원의 획득
실시예 1.1 : rhGM-CSF 항원의 클로닝, 발현 및 정제
인간 GM-CSF 항원을 코딩하는 유전자를 PCR-도입된 제한 효소 인식 부위 NdeI 및 XhoI를 통해 발현 벡터 pORF-hGM-CSF (Novagen, USA)에서 pET22b(+) 벡터(Novagene, USA)내로 서브클론하였다. pET22b(+) 내 hGM-CSF-코딩 유전자를 pelB 리더 서열에 융합하여 대장균 주변세포질에서 발현되기 적합하도록 하였다.
단백질 생산 및 정제는 제조자의 지시대로 수행하였다. 간략하게 설명하면, 대장균 BL21DE3를 발현 플라스미드로 형질전환하고, 선택 배지에서 37℃로 600 nm에서 광학 밀도 0.5-0.8 까지 배양하였다. IPTG 1 mM를 첨가하고 온도를 25℃로 감소시켜 단백질 생산을 유도하였다. 20% 슈크로스 용액을 사용한 삼투압 쇼크에 의해 세포막을 유지하는 세포벽을 선택적으로 파괴하여 주변세포질을 준비하였다. 천연 hGM-CSF는 두개의 디설파이드 가교를 포함하며, 대장균의 산화적 주변세포질에서의 발현에 의해 이들 기능적으로 중요한 디설파이드 가교가 형성된다.
재조합 인간 GM-CSF("rhGM-CSF")는 고정화된 금속 친화성 크로마토그라피(IMAC) 및 겔 여과의 두 단계 정제 과정을 통해 정제된다. Akta® FPLC 시스템 (Pharmacia) 및 Unicorn® 소프트웨어가 크로마토그라피를 위해 사용되었다. 모든 화합물은 연구 등급이며 시그마사(Deisenhofen) 또는 머크사(Darmstadt)에서 구입하였다.
IMAC는 Qiagen Ni-NTA 슈퍼플로 컬럼을 사용하여 제조자 프로토콜에 따라 수행하였다. 버퍼 A2(20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 0.4 M NaCl)으로 컬럼을 평형화시키고 준비된 주변세포질 제제("PPP") (100 mL)을 2 mL/min의 유속으로 컬럼(2 mL)에 적용하였다. 5 컬럼 볼륨 5% 버퍼 B2 (20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 0.4 M NaCl, 0.5 M 이미다졸)로 컬럼을 세척하여 미결합 샘플을 제거하였다. 결합된 단백질은 100% 버퍼 B2 5 컬럼 볼륨으로 용출시켰다. 용출된 단백질 분획은 추후 정제를 위해 보관하였다.
겔 여과 크로마토그라피는 PBS (Gibco)로 평형화시킨 Superdex 200 제조등급컬럼(Pharmacia)으로 수행하였다. 용출된 단백질 샘플(유속 1 mL/min)은 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 시행하여 검출하였다. 정제전에 분자량 결정(분자량 마커 키트,Sigma MW GF-200)을 위해 컬럼을 캘리브레이션하였다. OD 280 nm를 측정하고 서열-특이적 분자 흡광 상수(sequence-specific molecular extinction coefficient)를 사용하여 단백질 농도를 산출하였다.
실시예 1.2: rhGM-CSF 항원의 비오티닐레이션(biotinylation)
파지 라이버러리 선택을 위해 대장균내 제조된 rhGM-CSF 항원을 비오티닐화하였다. 비오티닐화는 5% DMSO(Sigma)와 5배몰 과량의 EZ-Link 술포 NHS-LC-LC-비오틴 (Pierce)을 포함하는 PBS액 내에서 실온에서 1시간 동안 샘플 믹서(Dynal)내에서 수행되었다. 자유 비오틴과 비오티닐화된 rhGM-CSF 항원을 분리하기 위하여 음이온 교환 크로마토그라피(Resource Q, Amersham Biosciences)를 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 크로마토그라피 결과 두개의 용출 피크가 얻어졌다(이하, A 및 B로 지칭). A 경우 주 용출 피크를 다시 제2차 음이온 교환 크로마토그라피 단계(전술한 바와 동일한 조건)에 의해 두개의 용출 피크로 분획화하였다. 얻어진 분획을 단계적으로 희석(희석 1:2 ; 시작 농도 6 μg/mL는 피크 높이에서 결정되었다)하고 96 웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 검출하였다. 검출은 A) 호스라디쉬 퍼옥시다제-콘쥬게이트 고우트 항-마우스-Fab2 특이적 폴리클로날 항체(Dianova, 1 μg/mL PBS/1 % BSA)로 검출되는 항-인간 GM-CSF 항체 M500-A (시그마, PBS/1%BSA내 2,5 μg/mL), 및 B) 호스라디쉬 퍼옥시다제-콘쥬게이트 고우트 항-래트-폴리클로날 항체(Dianova, 1 μg/mL PBS/1 % BSA)로 검출되는 모체 항체(maternal antibody; 1 μg/mL PBS/1 %BSA)를 사용하여 수행하였다. 호스라디쉬 퍼옥시다제-콘쥬게이트 스트렙토아비딘((Dako, 1 μg/mL PBS/1% BSA)을 사용하여 수행된 유사 ELISA 실험을 통해 비오티닐화가 성공적으로 수행되었음이 확인되었다. OPD 기질용액(시그마)를 첨가하여 시그널을 발생시키고, 492 nm의 파장에서 검출하였다(대조 파장 620 nm). 음이온 교환 분획을 직접 또는 6.7 x 107 스트렙토아비딘 자기 비드(Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal)와 30분간 부드럽게 진탕하면서 인큐베이션 단계를 거친 후 전술한 ELISA를 시행하여 비오티닐화 정도를 측정하였다. 생성되는 상등액을 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 전술한 바와 같이 검출하였다. ELISA 결과 상기 두번째 용출 피크는 비오티닐화된 rhGM-CSF을 포함하고, 용출된 rhGM-CSF의 약 95%가 콘쥬게이트됨을 확인할 수 있었다. 원래 물질을 표준으로 하여 농도를 측정한 결과 농도는 약 20 μg/mL이었다.
비오틴-라벨된 rhGM-CSF의 보유 생활성도는 하기 단일 사슬 항체(scFvs)의 특성화에 기재된 프로토콜에 따라 TF-1 증식 어세이로 확인하였다.
실시예 1.3: rhGM-CSF 항원의 형광 라벨링
TF-1 세포상의 결합 연구를 위해, 상기 실시예 1.2에서 대장균 내 생산된 재조합 인간 GM-CSF 항원을 형광-5(6)-카복시아미도카프로익산 N-숙시니미딜 에스테르(Fluka, 형광-NHS)와 콘쥬게이션하였다. 콘쥬게이션 단계는 17.5 % DMSO와 5배몰 과량의 형광-NHS를 포함하는 붕산염 버퍼(0.05 M 붕산, 0.1 M NaCl, pH 8.5)내에서 실온에서 1시간 동안 샘플 믹서내에서 수행하였다. 그 후 겔 여과(Sephadex G25, Amersham Biosciences)를 수행하여 자유 형광-NHS와 형광-라벨된 rhGM-CSF 항원을 분리하였다. 겔 여과 결과 485 nm (대조 파장 535 nm)에서 측정되는 두개의 피크가 생성되었으며, 주 피크는 FITC-라벨된 rhGM-CSF이었다. 라벨링 정도는 콘쥬게이트의 F/P 비율을 산출하여 결정하였다([mg/mL] = (A280 - 0.35 x A493) x 1.08; F/P=(A493/73.000) x (15.000/([mg/mL])). 측졍된 농도는 0.041 mg/mL이고, F/P 비율은 1.2이었다.
Example 2: 중화 인간 항-GM-CSF 항체 및 그 단편들의 생성 및 선택
실시예 2.1 : 하이브리도마 HB-9569에서 모체 VH의 클로닝
본 실시예에서 "모체(maternal)" V-영역은 문제의 V-영역이 전체 면역글로불린 분자에서 기원됨을 지칭한다.
본 실시예에서, "히트(hit)"는 관심 항원과 결합하는 것으로 알려져 있으나 그 결합이 정량적으로는 평가된 바 없는 분자를 지칭한다. "히트"는 동정의 초기단계에 있는 분자로서, 그 소규모 생산은 이미 수행되었을 수 있다. 이러한 분자는 특성화의 검증 단계에 있다.
본 실시예에서, "리드(lead)" 분자는 결합 및 중화 잠재력이 정량화된 분자를 지칭한다. "리드"분자는 이미 대규모로 생산되었다.
하기 실시예에서 인간 GM-CSF의 전체 인간 모노클로날 항체 중화제 및 그 단편들을 생산할 수 있는 방법을 기술한다.
본 실험의 목적은 하이브리도마 세포주 HB-9569에 의해 생산되는 모체 mAb내의 VH를 코딩하는 유전자의 분리 및 서브클로닝이었다. 하이브리도마 HB-9569는 ATCC(USA)에서 수득하였다. 상기 하이브리도마 세포는 ATCC 완전 성장 배지: 1.5 g/L 소듐 바이카보네이트, 4.5 g/L 글루코스, 10 mM HEPES, 및 1.0 mM 소듐 피로베이트를 포함하며, 0.05 mM 2-머캅토에탄올, 태아소혈청 10%를 보충한 2 mM L-glutamine 포함 RPMI 1640 배지에 37℃에서 5% CO2으로 배양되었다. 전체 RNA를 제조하기 위하여, 1 x 107 세포를 사용하였으며, RNA는 Qiagen Omni-Skript Kit (Qiagen, Germany)의 제품 매뉴얼에 따라 준비하였다. 표준 방법에 따라 cDNA를 합성하였다(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Second Edition).
중쇄 V-영역 DNA를 분리하기 위하여, MHALT1R.V: GCC GAA TTC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT 및 Race GSP rIgG2a/b: CAC ACC GCT GGA CAG GGC TCC AGA GTT CC 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR를 수행하였다. 증폭을 위해 하기 PCR 프로그램을 사용하였다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 90초간 프라이머 연장을 40 사이클 이상 수행하고, 72℃에서 10분간 최종 연장을 수행하였다. 이후 표준 프로토콜에 따라 중쇄 DNA V-단편을 분리하였다.
중쇄 DNA V-단편을 제조자 지시에 따라 PCR 스크립트-CAM (Stratagene)내로 클로닝하였다. 시퀀싱에 의해 서열을 동정하였다.
실시예 2.2: 인간 VL의 선택
본 실험의 목적은 상기와 같이 클로닝된 모체 VH와 짝을 이룰수 있는 인간 VL을 선택하는 것이다.
실시예 2.2.1 : 선택된 IgD-양성 B-세포에서 RNA의 분리
5명의 건강한 인간 공여자에서 혈액 100 mL을 채취하였다. 말초혈액단핵구세포(PBMCs)를 표준 방법에 따라 피콜-구배에 의해 분리하였다. IgD-양성 세포를 선택하기 위하여, 1 mL 항-마우스 IgG-비드(CELLection™ Pan Mouse IgG Kit; DYNAL)를 20 μg 마우스 항-인간 IgD-항체(PharMingen)로 코팅하였다. 약 2.5 x 107 PBMCs를 비드에 가하고, 4℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 1 mL RPMI-배지(BioChrom)로 4번 세척한 후, 8 μL 방출 버퍼(DNase)를 가하여 IgD-양성 세포를 비드에서 방출시키고 새 튜브에 가하였다. 이 방법으로 0.9 x 105 내지 3.7 x 106 IgD-양성 세포가 수득되었다. RNeasy® Midi Kit (QIAGEN)를 사용하고 제조자 지시에 따라 IgD-양성 세포에서 전체 RNA를 분리하였다. 표준 방법에 따라 cDNA를 합성하였다(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Second Edition).
실시예 2.2.2: 가변 경쇄 영역의 PCR-증폭(VL-영역)
경쇄 V-영역 DNA를 분리하기 위하여, V-kappa- (5'-huVKl-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC-3'), 5'-huVK2/4-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC- 3'), 5'-huVK3-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC-3'), 5'-huVK5-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC-3'), 5'-huVK6-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC-3'), 3'-hu-Vk-Jl-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI (5'- GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk- J3-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GAT ATCCACT TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC-3') 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. IgD-양성 B-세포에서의 RNA를 cDNA로 전사하고(전술한 바와 같이) PCR 반응에서 주형 DNA로 사용하였다. 매 PCR 반응마다 하나의 5 '-프라이머가 하나의 3 '-프라이머와 조합되었다. 상이한 PCR 반응의 수는 5'- 및 3'-프라이머의 가능한 조합 수로 결정되었다. 하기의 PCR-프로그램이 증폭을 위해 사용되었다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서50 초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 90초간 프라이머 확장이 40 사이클 이상 수행되고, 72℃에서 10분간 최종 확장을 수행하였다. 이후 표준 프로토콜에 따라 경쇄 DNA V-단편을 분리하였다.
실시예 2.2.3: 라이브러리 구축 - 인간 VL 풀의 클로닝
파지 디스플레이 라이브러리는 통상적으로 예를 들어 "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 개시된 바와 같은 표준 과정에 기초하여 구축되었다.
PCR 증폭을 위해 선택된 프라이머들은 경쇄 V-단편을 위한 5'-SacI 및 3'-SpeI 인식부위를 발생시켰다. 각각 400 ng의 카파 경쇄 단편(SacI-SpeI 소화) 및 1400 ng의 플라스미드 pBluescript KS+ (SacI-SpeI 소화; 큰 단편)으로 이루어지는 두개의 리게이션 반응 계획이 세워졌다. 두개의 생성되는 항체 V-경쇄 풀은 이후 각각 전기천공(2.5 kV, 0.2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser)에 의해 300 μL의 일렉트로콤피턴트(electrocompetent)한 대장균 XLl Blue내로 형질전환되어 5.8 x 108 독립적인 클론 사이즈의 라이브러리를 생성하였다.
상이한 PCR 증폭 유래의 카파(경쇄)DNA-단편은 각 리게이션을 위해 하기와 같이 칭량하였다: 각 5'-프라이머가 특정 그룹을 구획한다. 이 그룹내에서 3'-프라이머가 하위 그룹을 구획한다. 이 하위그룹은 3'-hu-Vk-Jl-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI : 3'- hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI 프라이머들에 대응하여 1:2:1:1로 칭량되었다. 상기 그룹들은 5'-huVKl-Sac-2001 : 5'-huVK3-Sac-2001 : 5'- huVK2/4-Sac-2001 : 5'-huVK5-Sac-2001 : 5'-huVK6-Sac-2001 프라이머들에 대응하여 그들의 배선 분포에 따라 1:1:1:0.2:0.2로 칭량되었다.
전기천공후, 표현형 발현을 위해 상기 시험물을 SOC 브로쓰(Fluka)내에서 인큐베이션하였다. 이후 배양물 각각을 50 μg/mL 카베니실린 및 2 % w/v 글루코스를 포함하는 SB 선택 배지 500 mL에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 원심분리로 세포를 수집하고 시판 플라스미드 제조 키트(Qiagen)를 사용하여 플라스미드를 제조하였다.
실시예 2.2.4: 인간 VL-모체 VH 항체 라이버러리의 구축
실시예 2.1에 기재된 모체 VH를 포함하는 벡터에서 모체 VH를 증폭하기 위하여 PCR을 수행하였다. 표준 과정에 따라 5 '-프라이머 MVH8 (5'-GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT-3') 및 3'-프라이머 3'-MuVHBstEII (5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3')를 사용하여 PCR 프로토콜에 따라 증폭하였다.
분석 아가로스 겔에서 약 350 bp 증폭 산물을 정제한 후에, 제한 효소 BstEII과 XhoI으로 DNA 단편을 절단하였다. 파지미드(phagemid) pComb3H5BHis (이 벡터는 RaIf Lutterbuse 박사의 박사논문에 기재되어 있다)를 소화시키고, 큰 단편을 상기 단편과 리게이션하였다. 대장균 XLl blue내로 형질전환한 후, 단일 클론을 100 mL SB 배지(50 μg/mL 카베니실린 포함)에서 배양하고 플라스미드를 표준 프로토콜에 따라 제조하였다. 인서트 시퀀싱 결과 클로닝이 성공적임이 확인되었다(Sequiserve, Munich).
벡터 pComb3H5BHis/모체 VH를 제한 효소 SacI 및 SpeI로 제한하였다. 큰 벡터 단편이 분리되었다. 실시예 2.2.3의 VK-라이브러리를 함유하는 플라스미드-DNA를 제한효소 SacI 및 SpeI로 처리하였다. 작은 VK 단편 밴드(약 350 bp)가 분리되었다.
1200 ng의 벡터 단편을 400 ng의 VK 단편과 리게이션하고 300 μL의 일렉트로콤피턴트 대장균 XLl Blue내에 전기천공(2.5 kV, 0.2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm)에 의해 형질전환하여 2.8 x 108 독립 클론 사이즈의 전체 scFv 라이브러리를 생성하였다.
표현형을 발현시키고 카베니실린에 천천히 적응시킨 후, 상기 항체 라이브러리를 SB-카베니실린(50 μg/mL)선택 배지내로 이송하였다. 이후 항체 라이브러리를 감염량 1 x 10l2 입자의 헬퍼 파지 VCSM13로 감염시켜 필라멘트의 Ml3 파지가 생성 및 분비되었으며, 각 파지 입자는 반-인간(half-human)scFv-단편을 코딩하는 단일 가닥의 pComb3H5BHis-DNA를 포함하고, 대응 scFv-단백질을 파지 코트 단백질 III(phage coat protein III)에 번역적 융합(translational fusion)으로서 디스플레이하였다.
실시예 2.2.5: 인간 VL의 파지 디스플레이 선택
scFv-목록을 운반하는 파지 입자를 PEG8000/NaCl 침전 및 원심분리에 의해 배양 상청액으로부터 수집하였다. 이후 약 1 x lOll 내지 1 x 10l2 scFv 파지 입자를 0.4 mL의 PBS/0.1% BSA에 재현탁시키고, 재조합 비오티닐화 가용성 rhGM-CSF (실시예 1의 대장균에서 생산된)과 함께 부드럽게 진탕하면서 전체 부피 0.5 mL로 인큐베이션하였다(항원 농도 1-3 라운드: 100 nM ; 4 라운드: 10 nM ; 5 라운드: 1 nM). 이후 6.7 x 107 스트렙토아비딘 자기 비드(Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal)를 가하고 부드럽게 진탕하면서 30분간 더 인큐베이션하였다.
표적 항원에 특이적으로 결합하지 않는 scFv 파지는 PBS/0.1 % BSA로 세척하는 단계에서 제거되었다. 이 목적을 위해 비오티닐화 항원 - 스트렙토아비딘 비드 복합체(잠재적 scFv 결합자와 함께)이 자석으로 수집되고, 1 mL의 세척 용액(일 세척 단계)에 재현탁하였다. 이 세척 단계는 이후 라운드에서 4번까지 반복되었다.
세척후, HCl-글라이신(pH 2.2)을 사용하여 결합 물질을 용출하였다. 후속하여 2 M Tris(pH 12)로 중화하고, 용출액을 신선한 미감염대장균 XLl Blue 배양물을 감염시키는데 사용하였다. 남아 있는 고 결합 물질을 용출하기 위해 HCl-글라이신(pH 1.0)을 사용하여 상기 단계를 반복하였다. 이 두번째 용출액을 다시 중화하고 신선한 미감염 대장균 XLl Blue 배양물을 감염시키는데 사용하였다. 상기 두 감염 대장균 배양물을 혼합하고, 파지미드 카피내로 성공적으로 형질 도입된 인간 scFv-단편을 코딩하는 세포를 다시 카베니실린 내성으로 선택하고 이어 VCSM13 헬퍼 파지로 감염시켜 두번째 라운드의 항체 디스플레이 및 인 비트로 선택을 시작하였다.
4 및 5 라운드의 패닝(panning)에 해당하는 플라스미드 DNA들을 대장균 배양물에서 분리하였다. 가용성 scFv-단백질을 생산하기 위해 플라스미드(Sacl-Spel)에서 VL-DNA 단편을 절단하고, 발현 조립체(예, scFv)가 플래그-태그(TGDYKDDDDK)를 scFv 및 His6-태그 사이에 포함하고, 부가적인 파지 단백질이 삭제된 점에서 초기 pComb3H5BHis/모체 VH와 상이한 모체 VH와 함께 VL-DNA 단편을 동일한 제한 부위를 통해 플라스미드 pComb3H5B플래그/His내로 클로닝하였다.
리게이션한 후, 각 풀(패닝의 상이한 라운드)의 플라스미드 DNA를 100 μL 열 쇼크 콤피턴트 대장균 XLl blue내로 형질전환하고, 카베니실린 LB-아가 상에 플래이팅하였다. 단일 콜로니를 100 μL의 LB carb(50 μg/mL)에 넣었다.
10 μl의 세포 현탁액을 카베니실린 50 μg/ml 농도 및 MgCl2 최종 농도 20 mM로 보충된 SB 배지 5ml에서 6시간 동안 37℃에서 진탕하 인큐베이션하였다. 이후 IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하고 30℃ 진탕기상에서 밤새 인큐베이션을 계속하였다.
세포를 원심분리하여 펠렛으로 수거하고, 이 펠렛을 0.5 ml PBS에 재현탁하였다. -70℃에서의 동결 및 37℃에서 해동하는 4번의 라운드에 의해, 박테리아의 외막이 삼투압 쇼크에 의해 파괴되고, scFvs를 포함하는 가용성 주변세포질 단백질이 상청액에 방출되었다. 완전 세포 및 세포 부스러기를 추가적인 원심분리(10,000 x g에서 5분)로 제거한 후, scFvs를 포함하는 상청액(즉, PPP)을 수거하고 더 검사하였다.
RhGM-CSF 항원(Leukine Liquid, Immunex)을 ELISA 플레이트에 4℃에서 밤새 고정시켰다(웰당 50 μl의 1 μg 항원/ml PBS). 상기 웰들을 PBS로 한차례 세척하고 1시간 실온에서 PBS 3% BSA로 차단시킨 후, scFvs 함유 100 μl PPPs를 상기 웰에 가하고 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다. PBS/0.05% 트윈20으로 세번 세척한 후, 고정화된 항원에 결합한 scFv-단편을 항-플라그 M2 (1 μg/mL PBS/1 % BSA)을 사용하고, 호스라디쉬 퍼옥시다제- 콘쥬게이트 고우트 항 마우스 Fab2 특이적 폴리클로날 항체(Dianova, 1 μg/mL PBS/1 % BSA)로 검출하였다. 2,2'-아지노-디 [3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산] ("ABTS") 기질 용액을 가하여 시그널을 발생시키고, 표준 프로토콜에 따라 405 nm의 파장에서 검출하였다.
테스트된 20 클론(패닝의 4 라운드 후 수득된 10개 및 5라운드 후에 수득된 10개)에서, 5개의 용해물이 재조합 항원상에 음성 대조로 사용한 PBS에 대조되는 강한 ELISA 시그널을 나타내었다. ELISA 결과를 도 1에 도시하였으며, 여기에서 테스트된 다양한 scFv 분자가 x-축을 따라 배열되며, y-축은 측정된 흡수 강도를 나타내며, 높은 흡수는 강한 결합을 의미한다. 음성 대조인 PBS는 x-축 가장 왼편에 도시하였다. 상당한 결합을 나타내는 ScFv 분자는 각 흡수 강도 칼럼 상부에 다이아몬드 또는 별표로 표시하였다. 도 1의 다이아몬드 및 별표는 두개의 상이한 서열을 표시하는데, 즉 다이아몬드로 표시한 scFv는 한 서열을 가지며, 반면 별표로 표시한 모든 scFvs들은 동일한 공통 서열을 공유한다.
5개의 ELISA-양성인 클론을 DNA 시퀀싱하였다. 시퀀싱은 Sequiserve (Munich)에서 수행되었다. 전체 4개의 클론은 scFv 5-306에 대응하는 DNA 서열을 공유하였으며, 다른 서열(4-301)은 단지 한번 동정되었다. scFv 5-306에 대응하는 지배적 서열 및 서열 4-301은 인간 기원이었으며, 인간 배선 서열 VkI -012와 매우 근접한 상동성을 나타내었다.
실시예 2.2.6: huVL 선택에서 유도된 scFv 히트 구축물의 특정화
하기 실험의 목적은 전술한 방법에 의해 생성된 scFv 히트의 특성을 규명하기 위함이다.
실시예 2.2.6.1 : 대장균에서의 scFv 히트(전술한 바와 같이 유도된)의 소규모 발현 및 정제
PPP를 수득하기 위해, 세포들을 20 mM MgCl2 및 카베니실린 50 μg/mL를 보충한 SB-배지내에 성장시키고, 수확후 1 mL PBS에 재용해시켰다. 박테리아의 외막은 온도 쇼크(4 라운드의 -70℃에서의 동결 및 37℃에서의 해동)에 의해 파괴시키고, scFvs를 포함하는 가용성 주변 세포질 단백질을 상청액에 방출시켰다. 완전세포 및 세포 부스러기를 원심분리로 제거하고, scFvs를 포함하는 상청액을 수집하고 추후 검사하였다. 정제를 위해 25 μL 20 mM NaH2PO4, 400 mM NaCl, 250 mM 이미다졸(pH 7.0)을 각 PPP에 첨가하였다. 상기 PPP는 매뉴얼에서 추천한대로 Ni-NTA 스핀 칼럼(Qiagen)를 통해 정제하였다. 요약하면, 각 PPP 용액을 미리 평형화시킨 컬럼에 추가하여 레진에 결합하도록 하였다. 상기 스핀 칼럼을 20 mM NaH2PO4, 400 mM NaCl, 20 mM 이미다졸(pH 7.0)로 두번 세척하였다. 결합된 단백질은 200 μL 20 mM NaH2PO4, 400 mM NaCl, 250 mM 이미다졸(pH 7.0)에 두번 용출하였다. 정제된 scFv 단백질을 그 결합 강도(키네틱 오프 속도) 및 중화능(GM-CSF 의존적 TF-1 증식의 억제)의 면에서 후술하는 바와 같이 분석하였다. 비록 가능한 상이한 구조의 scFv로 분리 또는 구별할 수 없었지만, 이 PPP의 조 정제에 의하여 80 % 순수한 scFv 단백질을 수득하였음을 웨스턴 블롯으로 확인할 수 있었다(데이타 미도시).
실시예 2.2.6.2: FITC-라벨된 rhGM-CSF의 억제
본 실험의 목적은 동정된 scFv 클론이 TF-1 세포 표면에 발현된 GM-CSF 수용체 복합체에 rhGM-CSF가 결합하는 것을 억제할 수 있음을 보여주기 위한 것이다. 중화 scFv 구축물은 rhGM-CSF 분자상의 수용체-결합 에피토프에 경쟁하여 rhGM-CSF가 GM-CSF 수용체 복합체에 결합하지 못하도록 할 것이 예측되었다. 상기와 같은 방식으로 수용체에 대한 rhGM-CSF 결합이 억제되는 범위까지, 유세포분류-기반 어세이에서 형광-라벨된 rhGM-CSF (rhGM-CSF-FITC)에 의한 TF-1 세포의 형광 염색의 강도가 줄어들 것이다.
하기는 이러한 유세포분류-기반 어세이의 실행을 기술한다. PBS내 최종 농도 0.4 μg/mL rhGM-CSF-FITC 콘쥬게이트를 10 μg/ml의 모체 항체 또는 NiNTA 스핀 컬럼으로 정제한 희석되지 않은 주변세포질 추출물과 인큐베이션하였다. 단백질 샘플은 25℃에서 1시간 동안 평형화시키고, 그 후 TF-1 세포 현탁액을 가하였다. 상기 TF-1 세포는 RPMI 1640 배지(Gibco; L-glutamine, phenol-red free), 10% 열-불활성화된 FCS에서, rhGM-CSF가 없는 채로 밤새 배양되었다. 최종 농도 2 x 106 세포/mL 및 150 μL의 세포현탁액이 샘플로서 사용되었다. 상기 세포를 4℃ 500 x g 속도의 원심분리로 수집하고, FACS 버퍼로 2번 세척하였다. 세척된 세포를 100 μL의 미리 평형화시킨 rhGM-CSF-FITC 함유 단백질 샘플, 및 모체 항체 또는 scF에 재현탁시켰다. 상기 샘플을 4℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 두차례 세척후 상기 세포를 150 μL 얼음냉각한 FACS 버퍼에 재현탁시키고, 이어 유세포분류분석을 시행하였다. 그 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2에서 다양한 테스트 분자가 x-축을 따라 배열되고, 그 평균 형광 강도("MFI")가 y-축에 표시되었다. 도 2에서 보인 바와 같이, 모체 항체의 경우 TF-1 세포의 형광 강도가 명백히 소실되었다(x-축 좌측에서 두번째). 5-306로 표시된 scFv 분자의 rhGM-CSF에의 경합적 결합이 TF-1 세포의 형광 염색의 소실로 관찰되었으나, scFv 분자 4-301는 거의 아무런 효과를 나타내지 않았다. 이 결과는 5-306로 표시된 scFv 분자가 GM-CSF의 유망한 중화제일 것을 제시하므로, 차후 중화능의 분석은 scFv 분자 5-306로 제한하여 시행하였다.
실시예 2.2.6.3: scFv 리드의 대규모 발현 및 정제
대규모 단백질 생산 및 정제는 아래와 같이 수행되었다. 간략하게, 대장균 BL21DE3을 발현 플라스미드내로 형질전환하고 37℃, 1 L 선택배지내에서 600 nm에서 광학 밀도 0.5-0.8까지 성장시켰다. 단백질 생산은 IPTG을 1 mM로 가하여 유도시키고, 배양액을 25℃에서 진탕하며 16시간 더 인큐베이션하였다. 5,000 x g의 속도로 10분간 원심분리하여 상기 세포를 수집하고, 100 mL 1 x PBS에 재현탁하였다. 주변세포질 단백질은 에탄올/드라이아이스에서의 동결 및 37℃ 물 중탕에서의 해동을 4번 연속적으로 시행하여 추출하였다. 최종적으로 추출물을 10,000 x g에서 20분간 원심분리하였다.
상기 scFv 5-306는 고정 금속 친화성 크로마토그라피(IMAC) 및 겔 여과의 두단계 정제 과정으로 분리하였다. 모든 리드 분자는 이 방법으로 정제하였다. 크로마토그라피를 위해 Akta® FPLC 시스템 (Pharmacia) 및 Unicorn® 소프트웨어를 사용하였다. 모든 화합물은 연구 등급이고, 시그마사(Deisenhofen) 또는 머크사(Darmstadt)에서 구입하였다.
IMAC은 Qiagen Ni-NTA 슈퍼플로 칼럼을 사용하여 제조자 프로토콜에 따라 수행하였다. 버퍼 A2(20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 0.4 M NaCl)으로 컬럼을 평형화시키고 주변세포질("PPP")제제(100 mL)를 2 mL/min의 유속으로 컬럼(2 mL)에 적용하였다. 5 컬럼 볼륨 5% 버퍼 B2(20 mM 인산나트륨 pH 7.2, 0.4 M NaCl, 0.5 M 이미다졸)로 컬럼을 세척하여 미결합 샘플을 제거하였다. 결합된 단백질은 100% 버퍼 B2 5 컬럼 볼륨으로 용출시켰다. 용출된 단백질 분획은 추후 정제를 위해 보관하였다.
겔 여과 크로마토그라피는 PBS (Gibco)로 평형화시킨 HiLoadTM 16/60 Superdex 75 제조등급컬럼(Pharmacia)으로 수행하였다. 용출된 단백질 샘플(유속 1 mL/min)은 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 시행하여 검출하였다. 정제 전에 분자량 결정(분자량 마커 키트, Sigma MW GF-200)을 위해 컬럼을 캘리브레이션하였다. Superdex 75 제조등급컬럼상의 크기 의존적 분리에 의해 명백하게 구별가능한 모노머 및 scFv 리드들의 회합적 다이머 피크 분획을 산출되었다. 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하고 각 scFv 리드들의 서열-특이적 분자 흡광 상수를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다.
실시예 2.2.6.4: scFv 리드에 의한 rhGM-CSF-의존적 TF-1 세포 증식의 억제
본 실험의 목적은 hGM-CSF 의존성 세포주 TF-1(DSMZ ACC 334)를 사용하여, 반-인간 scFv 5-306의 중화 활성에 대한 정성적인 정보를 얻는 것이다.
TF-1 세포는 RPMI 1640 배지(Gibco; L-글루타민, 페놀-레드 없음), 10% 열-불활성화된 FCS에서 2.5 ng/mL rhGM-CSF 존재하에 제조자 지시대로 배양되었다(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany). 세포는 세포 밀도 0.5 x 106 세포/mL까지 성장되었다. 증식 어세이를 위해, 300 x g에서 4 분간 원심분리에 의해 TF-1 세포를 수집하고, 1 x PBS(Dulbecco's, Gibco)로 세척하였다. 세포는 최종 농도 1 x 105 세포/mL로 RPMI 1640 및 10 % FCS 에 재현탁하였으며, 마이크로테스트 평면 바닥 세포 배양 플레이트 웰당 90 μL 세포 현탁액이 사용되었다(0.9 x 104 세포/웰). 최종 농도 0.3 ng/mL rhGM-CSF이 TF-1 세포 증식의 자극을 위해 사용되었다. hGM-CSF 의존성 증식의 중화를 위하여, 10 μL의 정제된 scFv가 100 μL TF-1 및 rhGM-CSF 용액에 약 100 μg/ml 내지 100 pg/ml의 희석 시리즈로 첨가되었다. 상기 샘플을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간후 TF-1 세포 증식 상태는 WST-1을 가하고 450 nm에서 ELISA 판독기로 비색 변화를 모니터하여 결정하였다. 데이타는 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 곡선을 사용하여 IC50을 구하도록 피팅하였다.
scFv 5-306는 명백한 용량-의존적 증식 억제 효과를 나타내었으며, 모노머 및 다이머 구조 형태에 대해 유사하였다. 모노머 형태의 경우 IC50은 7.3 nM였으며, 다이머 형태의 경우 3.5 nM 이었다. 그 결과를 도 3에 도시하였다.
실시예 2.3: 인간 VHs의 항체 라이브러리 구축 및 파지 디스플레이 선택
하기 실험의 목적은 상기 선택된 scFv 5-306의 인간 VL 영역과 짝을 이루는 인간 VH 영역 세트를 선택하기 위함이다.
실시예 2.3.1 : 말초혈액단핵구세포(PBMCs)에서의 RNA 분리
5명의 건강한 인간 공여자로부터 100 mL 혈액을 채취하였다. 말초혈액단핵구세포(PBMCs)는 표준 방법에 따라 피콜 구배법으로 분리하였다. 전체 RNA는 RNeasy® Midi Kit (QIAGEN)을 사용하고 제조자 지시에 따라 PBMCs에서 분리하였다. cDNA는 표준 방법에 따라 합성하였다(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Second Edition).
실시예 2.3.2: 중쇄 가변 영역(VH-영역)의 PCR-증폭
VH 라이브러리가 구축되고, Lib 134-VH로 명명하였다. 상기 VH-라이브러리는 상기 기재의 PBMC 풀의 PCR 증폭된 VH-영역에서 유래하고, 모체 항체의 VH CDR3에 작동가능하게 연결되며 인간 FR4 배선 서열이 뒤따르는 FR1-CDR2-FR2-CDR2-FR3의 인간 목록으로 구성된다.
인간 주형 VH-영역의 분리를 위하여, RT-PCR를 5'-VH-특이적 프라이머 세트(5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 (5'-AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3'), 5'-huVH4-XhoI-2001 (5'-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'), 5'-huVH4B-XhoI- 2001 (5'-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3') 및 두개의 3'-VH-특이적 프라이머 세트(3'-hu-VH-BstEII-2001 (5'-CTG AGG AGA CGG TGA CC-3'), 3'-hu-VH-J3-BstEII- 2001 (5'-CTG AAG AGA CGG TGA CC-3'))를 사용하여 수행하였다. PCR 반응마다, 하나의 5'-프라이머가 하나의 3'-프라이머와 조합되었다; 상이한 PCR 반응의 수는 가능한 5'- 및 3'-프라이머의 조합 수로 결정되었다. PBMC cDNA (전술한 공여자 중 4명만이 VH-유전자의 공급원으로 사용되었다). 하기 PCR-프로그램이 증폭을 위해 사용되었다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 60초간 프라이머 확장이 40 사이클 이상 수행되고, 72℃에서 10분간 최종 확장되었다. 약 350 bp 크기의 증폭 산물이 표준 방법에 의해 분리되었다.
Lib 134-VH-영역의 분리를 위해, RT-PCR이 두단계로 수행되었다. 첫 단계로, 인간 중쇄 VH-세그먼트(FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3)가 분리된 주형 VH 단편에서 전술한 동일한 5'-VH-특이적 프라이머 세트(5'- huVHl,3,5-XhoI-2001, 5'-huVH4-XhoI-2001, 5'-huVH4B-XhoI-2001) 및 3'-특이적 프라이머 세트(3'-Lib 134-VH-l A-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACA GTA ATA CAC GGC-3'), 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACA GTA ATA CAY RGC-3'), 3 '-Lib 134-VH-3A- MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NGY ACA GTA ATA CAC RGC-3'), 3 '-Lib 134-VH-3B-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NGC ACA GTA ATA CAA RGC-3'), 3'-Lib 134-VH-4-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT SGC ACA GTA ATA CAC RGC-3'))를 사용하여, FR3의 최말단 영역이 매칭되는 인간 VH 하위 패밀리 1, 3 및 4를 위해 PCR-증폭되었다.
하기의 프라이머 조합이 사용되었다:
a) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3
b) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3
c) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3
d) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3
e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3
f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3
PCR 반응마다, 하나의 5'-프라이머가 3'-프라이어와 조합되었다; 상이한 PCR 반응의 수는 가능한 5'- 및 3'-프라이머의 조합수로 결정되었다. 하기 PCR-프로그램이 증폭을 위해 사용되었다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 90초간 프라이머 확장이 40 사이클 이상 수행되고, 72℃에서 10분간 최종 확장되었다. 이러한 PCR 단계 및 각각의 3'-프라이머 서열을 통해, 인간 VH 세그먼트가 모체 VH CDR3의 부분으로 연장되며, 이후 차례로 두번째 PCR 3 '-프라이머를 위한 프라이밍 사이트가 된다.
이들 VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) DNA-단편은 이후 주형으로서 두번째 PCR반응에 사용되며, 상기 반응은 다시 각 5' VH-특이적 프라이머 및 증폭된 DNA-다단편의 공통된 3'-말단에 매칭되는 공통된 3' 프라이머를 사용하였다(3'-Lib 134-JH3-BstE2, 5'-AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC TTG GCC CCA GTA ATC AAA GTA GAC TGC-3').
하기 PCR-프로그램이 증폭을 위해 사용되었다: 94℃에서 15초간 변성, 52℃에서 50초간 프라이머 어닐링 및 72℃에서 60초간 프라이머 확장이 40 사이클 이상 수행되고, 72℃에서 10분간 최종 확장되었다. DNA V-단편이 표준 프로토콜에 따라 분리되었다.
실시예 2.3.3: 라이브러리 구축 - 인간 VH 풀의 클로닝
앞의 방법의 제2 라운드에서, scFv 5-306의 인간 VL이 먼저 동정되고, 전술한 선택이 선택되며, 후속적으로 실시예 2.3.2에서 기술된 인간 VH 단편의 라이브러리와 조합되어 인간 scFv를 생성하였다. 파지 디스플레이 라이브러리는 일반적으로 표준 과정에 의해 구축되었으며, 예를 들어, "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor laboratory Press, 2001에 개시된 바와 같다.
상이한 PCR 증폭에서 유래한 중쇄 DNA-단편을 각 리게이션을 위해 하기와 같이 칭량하였다; a:b:c:d:e:f = 3:1:3:1:1:1, 여기에서 a-f는 하기의 의미를 가진다:
a) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
b) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
c) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
d) 5'-huVH 1,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2
e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134- VH-4-MH3 x 3'-Lib 134-JH3 -BstE2
f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'- Lib 134-JH3-BstE2
하나의 리게이션 반응은 400 ng의 인간 Lib 134-VH 단편 풀(XhoI-BstEII 소화) 및 1200 ng의 플라스미드 pComb3H5BHis/5-306 VL (scFv 5-306의 VL 영역을 코딩하는 DNA가 제한 부위 SacI 및 SpeI을 통해 pComb3H5BHis내로 표준 과정을 통해 클론되었다)으로 구성된다. 생성되는 항체 인간 VH 풀은 이후 300 μL의 일렉트로콤피턴트 대장균 XLl Blue내로 전기천공(2.5 kV, 0.2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser)에 의해 형질전환되어 전체 사이즈 1.6 x 108 독립 클론 크기의 라이브러리가 생성된다.
전기천공후, 상기 시험물은 표현형 발현을 위해 SOC 브로쓰(Fluka)내에 인큐베이션하였다. 이후 상기 배양물을 각각 50 μg/mL 카베니실린 및 2 % v/v 글루코스를 포함하는 500 mL의 SB 선택배지에 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 배양액의 세포를 원심분리로 수집하고, DNA 라이브러리를 보존하기 위해 시판 플라스미드 제조 키트(Qiagen)를 사용하여 플라스미드를 제조하였다.
1.5 μg의 상기 각각의 scFv 풀을 코딩하는 플라스미드 풀을 대장균 XLlblue (2.5 kV, 0.2 cm gap cuvette, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser)내로 전기천공에 의해 도입하여 전체 사이즈 2.4 x 109 독립 클론 크기의 라이브러리를 생성하였다. 표현형을 발현시키고 카베니실린에 천천히 적응시킨 후, 상기 항체 라이브러리를 SB-카베니실린(50 μg/mL)선택 배지내로 이송하였다. 이후 항체 라이브러리를 감염량 1 x 10l2 입자의 헬퍼 파지 VCSM13로 감염시켜 필라멘트상의 M13 파지를 생성 및 분비시켰으며, 각 파지 입자는 인간 scFv-단편을 코딩하는 단일 가닥의 pComb3H5BHis-DNA를 포함하고, 파지 코트 단백질 III에 번역적 융합으로서 대응 scFv-단백질을 디스플레이하였다.
실시예 2.3.4: 인간 VH의 파지 디스플레이 선택
생성되는 클론된 scFv-목록을 수반하는 파지 라이브러리는 배양물 상청액에서 PEG8000/NaCl 침강 및 원심분리에 의해 수집하였다. 약 1 x lO11 내지 1 x 1012 scFv 파지 입자를 0.4 mL의 PBS/0.1% BSA에 재현탁하고 재조합 비오티닐화 가용성 rhGM-CSF (실시예 1의 대장균 물질)과 함께 1시간 동안 부드럽게 진탕하면서 전체 부피 0.5 mL로 인큐베이션하였다. 이후 6.7 x 107 스트렙토아비딘 자기비드(Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal)를 추가하고 부드럽게 진탕하면서 30분간 더 인큐베이션하였다.
표적 항원에 특이적으로 결합하지 않는 scFv 파지는 PBS/0.1 % BSA로 세척하는 단계에서 제거되었다. 이 목적을 위해 비오티닐화 항원 - 스트렙토아비딘 비드 복합체(잠재적 scFv 결합자와 함께)이 자석으로 수집되고, 1 mL의 세척 용액(일 세척 단계)에 재현탁되었다. 이 세척 단계는 4번까지 반복되었다. 세척후, HCl-글라이신(pH 2.2)을 사용하여 결합 물질을 용출하고 2 M Tris(pH 12)로 중화하고, 용출액을 신선한 미감염 대장균 XLl Blue 배양물을 감염시키는데 사용하였다.
남아 있는 고 결합 물질을 용출하기 위해, 상기 비드를 직접 200 μL의 신선한 대장균 XLl blue 배양액(OD600 > 0.5)내에 재현탁하고, 부드럽게 진탕하면서 10분간 인큐베이션하였다. 양 배양물을 혼합하고 세포들을 연속적으로 파지미드 카피로 형질 도입하고, 인간 scFv-단편을 코딩하는 세포를 다시 카베니실린 내성으로 선택하고 이어 VCSM13 헬퍼 파지로 감염시켜 두번째 라운드의 항체 디스플레이 및 인 비트로 선택을 시작하였다.
전체 4 라운드의 선택이 두 항체에 대하여 수행하였다. 항원 농도는 선택중 하기와 같은 최종 농도까지 감소되었다:
1 라운드 10O nM
2 라운드 1O nM
3 라운드 1O nM
4 라운드 1O nM
대장균 배양물에서의 플라스미드 DNA는 대응하는 3 및 4 라운드 패닝에서 분리되었다.
가용성 scFv-단백질의 제조를 위해, VH-VL-DNA 단편을 플라스미드(XhoI-SpeI)에서 잘라내어 동일 제한 부위를 통해 플라스미드 pComb3H5BFlag/His (파지 감염에 요구되는 부가적 파지 단백질이 없음)내에 클론되었다. 리게이션후 플라스미드 DNA의 각 풀(패닝의 상이한 라운드)을 100 μL 열 쇼크 콤피턴트 대장균 TG1내로 형질 전환하고 카베니실린 LB-아가에 플레이팅하였다. 단일 콜로니를 채취하여 96-웰 플레이트(Greiner)의 LB carb (50μg/mL) 1% 글루코스 120 μL에 접종하였다. 상기 웰을 반투성 막(Greiner)으로 밀봉하고, 플레이트들을 진탕 인큐베이터내에서 37℃로 밤새 인큐베이션하였다(마스터 플레이트). 이후 10 μL의 상기 마스터 플레이트 배양물을 웰마다 90 μL LB carb (50μg/mL) 0.1% 글루코스를 포함하는 두번째 96 웰 플레이트(워킹 플레이트)내로 이송하였다. 37℃ 진탕 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 20 μL LB carb 6 mM IPTG를 각 웰에 첨가하여 scFv 생산을 유도하였다. 30℃에서 진탕하면서 밤새 더 인큐베이션한 후, 40 μL 용해 버퍼(400 mM 붕산, 320 mM NaCl, 4 mM EDTA pH 8, 2.5 mg/mL 라이소자임)로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 세포를 용해시켰다. l,900 x g로 12분간 원심분리(Hettich)하여 잔여 세포 및 세포 부스러기를 분리하였다.
이후 scFv 분자를 포함하는 상청액에 대해 ELISA 어세이로 결합 시험을 시행하였다. 고정 rhGM-CSF 항원(Leukine)에 결합된 scFv-단편의 검출은 항-플래그 M2 (l μg/mL PBS/1 % BSA)를 사용하여 호스라디쉬 퍼옥시다제- 콘쥬게이트 고우트 항 마우스 Fab2 특이적 폴리클로날 항체(Dianova, 1 μg/mL PBS/1 % BSA)로 검출하였다. ABTS 기질 용액을 가하여 시그널을 발생시키고, 405 nm의 파장에서 검출하였다.
제3 선택 라운드 후 테스트된 약 100개의 클론 중에 12개의 클론이 rhGM-CSF에 대해 강한 결합을 나타내었다. 제4 라운드 후 테스트된 약 160개의 클론 중 80 % 이상의 용해물이 재조합 항원에 대해 음성 대조인 PBS에 비교하여 강한 ELISA 시그널을 보였다. 대표적인 클론의 결과를 도 4에 도시하였으며, 도면에서 대표적 클론들은 x-축을 따라 배열되고, 흡수 강도가 y-축에 도시되었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, PBS 음성 대조(x-축 오른쪽에서 두번째)는 아무런 결합을 나타내지 않았으며, 반면 대표적 scFv 클론들 scFv A, scFv 3035, scFv 3039, scFv 3080 및 scFv 5-306는 ELISA에 의해 상이한 정도의 결합 강도를 나타내었다.
차단제에 대한 비특이적 결합을 위한 병행 실험에서, 모든 용해물을 rhGM-CSF이 없는 상태에서 시험되었다. 의미있는 검출 가능한 시그널이 관찰되지 않았으며, 이는 rhGM-CSF에 대한 결합 특이성을 나타낸다.
13개 이상의 ELISA-양성 scFv 클론의 DNA 서열이 결정되었다. 전체로 6개의 상이한 서열이 동정되었다. 모든 서열은 인간 기원이었으며, 인간 배선 서열 VH-1 1-02와 매우 밀접하게 관련되었다.
실시예 2.3.5: 인간 VL 및 VH 영역을 포함하는 인간 scFv 구축물의 특정화
실시예 2.3.5.1: 실시예 3 기재의 방법으로 제조된 scFv 리드 구축물의 대규모 생산 및 정제
scFv 리드들은 실시예 2.2.6.3.에 기재된 바와 같이 분리 및 정제되었다.
실시예 2.3.5.2: 표면 플라스몬 공명( SPR )에 의한 scFv 리드의 결합 반응 속도 분석
본 실험은 scFv 리드를 보다 상세히 특정화하기 위한 것이다. scFv 리드의 결합 반응 속도(kd 및 ka)는 10 μL의 정제 단백질을 10 μg/mL 내지 1 pg/mL의 범위로 단계적으로 희석한 정제 scFv에 가하고, 25℃에서 100초간 해리를 모니터함으로써 측정하였다. 단백질은 HBS-EP액(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % 계면활성제 P20)에서 완충하였다. 데이타는 BIAevalution™ 소프트웨어로 피팅하여 1:1 랑그뮈러 결합 방정식 (식 1 및 2)로 해리 및 결합 운동 속도 상수를 결정하였으며, 여기에서 A는 가해진 분석물의 농도이고, B는 리간드의 농도이다.
dB/dt = -(ka * [A]* [B]-kd *[AB]) (1)
dAB/dt = -(ka * [A]* [B]-kd * [AB]) (2)
반응속도 곡선은 분석되는 각 scFv 리드의 8개 농도까지 측정되었다. 원자료를 독립 피팅하여 해리 및 결합 속도 상수를 구하고, 이들을 사용하여 평형 해리 상수(KD)를 산출하였으며, 그 결과를 표 1에 도시하였다.
[표 1]
Figure pat00003
실시예 2.3.5.3.: scFv 리드에 의한 rhGM-CSF 의존성 TF-1 세포 증식의 억제
특이적 결합 강도가 scFv 리드에 보존되는 것을 확인한 후, 본 시험의 목적은 상기 scFv 리드들과 항원 rhGM-CSF과의 상호결합 특이성을 평가하기 위함이다. scFv 결합에 의한 항원 rhGM-CSF의 생물학적 기능의 억제는 TF-1 증식 억제 실험에 의해 특성화되었다.
TF-1 증식 억제 실험은 전술한 바와 같이 수행되었다. 세포는 최종 농도 1 x 105 세포/mL로 RPMI 164010 및 % FCS에 재현탁하였으며, 웰당 90 μL 세포 현탁액이 사용되었다(0.9 x 104 세포/웰). 최종 농도 0.3 ng/mL rhGM-CSF이 TF-1 세포의 증식을 자극하기 위해 사용되었다. rhGM-CSF 의존성 증식의 중화를 위하여, 1 x PBS 내 정제 scFv를 최종 단백질 농도 100 μg/ml 내지 10 pg/ml로 단계 희석물에 가하였다. 10 μL의 투석 및 멸균 여과된 단백질 용액(0.22 μm 필터)를 100 μL TF-1 및 rhGM-CSF 용액에 가하였다. 상기 샘플을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간후 TF-1 세포 증식 상태는 WST-1을 가하고 450 nm에서 ELISA 판독기로 비색 변화를 모니터하여 결정하였다(도 5). 도 5에 나타낸 바와 같이 인간 GM-CSF 중화 활성을 명백히 확인할 수 있었다. ScFv A가 가장 강력한 중화 활성을 나타내었다.
실시예 2.4: 선택된 scFv의 결합 특성의 적정화
중화제 및 리간드 사이의 결합 세기를 증가시킴으로써, 특히 중화제의 오프-속도를 증가시킴으로써 모노머 리간드에 대한 중화제의 생물학적 활성이 개선되거나 또는 적정화될 수 있을 것으로 사료되었다.
이는 바람직하게 각 VH 및 VL 영역의 서열을 랜덤한 방식으로 (i) 전체 서열을 통해 랜덤하게 하나 이상의 돌연변이를 삽입하거나 또는 (ii) 단일 돌연변이 또는 복수의 인접 돌연변이(즉, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 스트레치)를 항원과 상호작용할 가능성이 높은 scFv 영역내로 삽입함으로써 돌연변이시켜 성취될 수 있다. 이들 각각의 돌연변이들은 이후 활성의 증가 등이 특성화되어야 하며, 또는 그 특성화전에 적절한 선택 방법(예, 파지 디스플레이)를 통해 우선적인 질(예, 보다 강한 결합)을 위해 강화되어야 한다.
실시예 2.4.1 : VH CDR3의 하나 이상의 위치에서의 돌연변이에 의한 친화성 증가
단일 점 돌연변이 또는 짧은 아미노산 스트레치에 의해 항체 단편, 예를 들면 scFv 분자의 결합 특성을 개선하기 위해서는, 각 항원과 상호작용할 가능성이 매우 높은 아미노산 잔기들이 표적화되어야 한다. 이러한 접근에 의해 성공 가능성을 경감시킴 없이 단지 한정된 수의 돌연변이를 스크리닝하여 성공할 수 있다. 항체 또는 그 단편의 중쇄 CDR3은 통상 이 항체 또는 항체 단편에 의한 항원과의 전체적 결합에 중요하게 기여한다. 따라서, 항체 또는 항체 단편의 결합 친화성을 높일 수 있는 유망한 방법은 VH CDR3를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 돌연변이시키는 것으로 사료되었다.
이러한 표적화된 랜덤 돌연변이를 수행하는 데 있어 다양한 여러 방법이 존재하고, 이들 중 일부를 전술한 scFv 분자의 결합 친화성을 어떻게 증가시킬 수 있는가의 견지에서 하기에 기술한다:
A) VH CDR3를 표적화하기 위하여 적합한 제한 부위가 VH CDR3내 뉴클레오타이드 서열내로 도입되어야 하며, 바람직하게는 개질된 CDR3 뉴클레오타이드 서열로 전체 VH 영역을 유전자 합성하고 원래 아미노산 서열을 유지함으로써 수행되는 것이다(Entelechon, Germany). 각 제한 효소에 의한 분해 및 Sl 뉴클레아제/클레나우 DNA 폴리머라제 I 및 dGTP의 첨가 및 이어서 돌연변이성 올리고머 듀플렉스의 첨가를 통해, 하나 이상의 아미노산 위치에서의 표적화된 랜덤 돌연변이가 Matteucci 및 Heyneker, Nucleic Acids Research 11: 3113 ff (1983)에 따라 수행될 수 있다. 돌연변이된 VHs는 이후 각 VL (적합한 링커에 의해)와 적합한 scFv 발현 벡터내에서 조합되고, 대장균 세포내로 형질전환된다. 전술한 실시예의 scFv 히트 및 리드의 스크리닝 및 특성화에서 기재한 바와 같이, 변이체 scFv를 발현하는 단일 콜로니를 채집하여, 개선된 scFv를 스크리닝한다.
B) 대체적인 방법은 Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) "A laboratory manual"에 기재된 바와 같은 이중 프라이머법에 의한 올리고뉴클레오타이드-매개 돌연변이이다. VH 영역을 M13-기반 벡터내로 클로닝하고 단일 가닥 플라스미드를 분리한다. 랜덤 서열을 포함하는 단일 가닥 플라스미드 주형에 혼성화될 수 있는 프라이머가 어닐링되고 확장된다. 대장균내 각 플라스미드 풀의 전파 후, 돌연변이된 VH들이 플라스미드 풀에서 수집되고, 적합한 scFv 발현 벡터내 원래의 VL과 조합되며(적합한 링커를 통해), 대장균 세포내 형질전환된다. scFv 변이체들을 발현하는 단일 콜로니들을 채집하고 전술한 실시예의 scFv 히트 및 리드의 스크리닝 및 특성화에 기재된 바와 같이 개선된 scFv를 스크리닝한다.
C) 또 다른 대체방법은 6개까지 또는 그 이상의 인접 아미노산들을 돌연변이하는 것이다. 이를 위하여 CDR3 및 FR4가 삭제된, VH 뉴클레오타이드 서열의 삭제 변이체를 구축한다. 이 구축물을 일- 또는 이-단계 PCR 증폭의 주형으로서 사용하고, 여기에서 적합한 5'-프라이머(VH 서열의 5' 말단에 혼성화되고 적합한 클로닝 부위를 추가한다)가, FR3 영역의 3' 말단에 주형으로서 혼성화하고 CDR3 및 FR4 영역(적합한 제한 부위로)을 증폭 단편에 추가하는 3'-프라이머 세트와 조합된다. 이 3'-프라이머 세트는 하나 이상의 트리플릿 서열을 포함하며, CDR3 서열내에 랜덤 코돈을 삽입한다. 랜덤화된 CDR3 영역을 갖는 VH 영역 풀은 이후 후속하여 각각의 VL (적합한 링커를 통해)와 적합한 scFv 발현 벡터내에서 조합되며 대장균내로 형질전환된다. scFv 변이체들을 발현하는 단일 콜로니들을 채집하고 전술한 실시예의 scFv 히트 및 리드의 스크리닝 및 특성화에 기재된 바와 같이 개선된 scFv를 스크리닝한다.
더 높은 다양성(용이하게 스크리닝될 수 있는)을 갖는 돌연변이된 scFv 각 풀은 적합한 파지 디스플레이 벡터내로 클로닝될 수 있으며, 이후 개선된 scFv는 파지 디스플레이에 의해, 바람직하게 더 높은 친화성을 갖는 것을 선택하기 위해 항원 농도를 경감시키는 조건하에서 관심 항원상에서 선택될 수 있다. 파지 디스플레이 선택은 전술한 바와 같은 표준 프로토콜에 의해 수행된다. 상기 A 내지 C의 방법들은 조합되거나 반복 사이클로 수행되어 이미 개질된 scFv들을 추가적으로 개선하거나 적정화할 수 있다.
실시예 2.4.2: 전체 서열을 통한 V-영역의 랜덤게 돌연변이에 의한 친화성의 증가
각 항원과 상호작용할 가능성이 높은 scFv의 특정 부위를 돌연변이하는 대신, 보다 실용적인 접근이 수행될 수 있는데, 즉 전체 VH 및/또는 VL 서열을 통해 점 돌연변이를 도입하고 이후 적정화된 scFvs를 스크리닝하거나 또는 적정화된 scFvs를 선택 및 스크리닝하는 것이다. 예로써, VH 및/또는 VL 서열은 대장균 돌연변이 균주(Low 등. 260: 359 ff J MoI Biol (1996)에 기재된 바와 같은)를 사용하거나 또는 Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) "A laboratory manual"에 기재된 바와 같이 DNA 폴리머라제에 의한 뉴클레오타이드를 잘못 삽입함으로써 돌연변이될 수 있다. 적정화된 scFv 분자의 클로닝, 발현 및 선택은 파지 디스플레이 또는 빈번하게 사용되는 리보솜 디스플레이 기술(EP 0 975 748 Al에 기재된 바와 같은)을 사용할 수 있다. 적정화된 것들은 적합한 벡터/대장균 시스템에서 발현시켜 개선된 scFv 후보를 스크리닝할 수 있다.
실시예 2.4에 전술한 바와 같은 적합한 방법이 한 대표적 scFv 리드(scFv A)를 적정화하기 위해 적용되었고, scFv 분자 B-N으로 표시되는 일클래스의 모노클로날 인간 항-GM-CSF 중화 항체 단편들이 생성되었다. 이들 scFv 분자의 특성화는 하기 실시예에서 보다 자세히 기술된다. 선택된 scFv 분들자에서 모노클로날 IgG 분자의 생성은 하기 실시예에서 기술된다.
실시예 3: 선택된 scFv에서 모노클로날 항체의 클로닝 및 진핵 발현
비록 박테리아는 기능적 Fab 단편을 발현하는 것으로 알려져 있지만, 이들은 통상적으로 완전한 기능적 면역글로블린을 생산할 수 없다. 완전한 기능적 항체를 생산하기 위해서는, 포유동물 세포가 사용되어야 하며, 따라서, scFv 5-306의 VL 영역 및 이전 실시예에서 선택된 scFv 분자들의 상이한 VH 영역이 포유류 발현 벡터내에 서브클로닝되었다(특히 scFv A 및 scFv B의 VH 영역).
Example 3.1 : scFv 5-306에 기초한 인간 경쇄의 클로닝
적합한 말단 제한 부위를 생성하기 위하여, scFv 5-306의 VL 영역을 코딩하는 DNA 단편을 PCR에 의해 재증폭하여, 5'- 말단에 Bsu36I-부위 및 3'-말단에 Xho I-부위를 갖는 Vkappa 단편을 생성하였다. 이후 이 단편을 Bsu36I 및 XhoI에 의해 5'-프라이머(5'-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGT GTCTGC -3') 및 3'-프라이머(5'- CATGCACTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAAAG-3')를 사용하여 플라스미드 BSPOLL내로 서브클로닝하고, 포유 리더 서열(mammalian leader sequence) 및 인간 Ckappa 일정 영역을 추가하고 시퀀싱에 의해 검증하였다. EcoRI 및 Sa1I를 사용하여 5-306 VL-Ckappa DNA를 BSPOLL에서 절단하고, 이를 발현 벡터 pEF-DHFR (Mack 등. (1995) Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 92, 7021-5)에서 뮤린 디하이드로폴레이트리닥타제(DHFR)를 코딩하는 cDNA를 뮤린 아데노신 데아미나제(ADA)로 대체하여 유도한 진핵 발현 벡터 pEF-ADA내로 서브클로닝하였다.
실시예 3.2: 인간 중쇄 가변 도메인의 클로닝
이전 실시예에서 선택된 상이한 인간 VH 영역에서(특히 scFv A 및 scFv B의 VH 영역), 가변 영역이 PCR로 재증폭되어, 양 말단에 Bsu36I 제한 부위를 생성하였다. 모든 구축물에서 두개의 프라이머 조합이 사용되었다: 5'-프라이머 VH-Bsu36I (5'-ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGT CCAGTCTGGGGCT GAGGTGAAGAAGC-3') 및 3'-프라이머(5'-ACGTCACCTGAGGAGACGGTGACCATTGTC CCTTG-3'). 이후 생성되는 DNA-단편을 이들 제한 부위를 사용하여, 이미 진핵 리더 서열 및 인간 IgGl 중쇄 일정 영역을 코딩하는 DNA-단편을 포함하고 있는 진핵 발현 벡터 pEF-DHFR내로 서브클로닝하였다. 이들 중쇄 가변 영역은 상기 리더 및 중쇄 가변 영역 사이에 삽입되었다. 가변 영역의 정확한 서열은 시퀀싱에 의해 확인되었다.
실시예 3.3: scFv 단편의 전체 인간 IgG로의 전환
상기 경쇄(VL 5-306/Ckappa)를 코딩하는 플라스미드 및 하나의 중쇄(VH/인간 IgGl 일정 영역)를 코딩하는 플라스미드를 일시적 단백질 발현을 위한 표준 프로토콜에 의해 HEK 세포내로 공형질감염하였으며, 상기 세포를 배양하여 배양 배지내에 면역 글로불린을 발현 및 생산하도록 하였다. 이러한 방식으로, scFv A 유래의 IgG A, scFv B 유래의 IgG B를 생산하였다. 각 생산 기간 후, 상청액을 수집하고 인간 면역글로불린을 단백질 A 크로마토크라피를 통해 면역글로불린의 정제를 위한 표준 프로토콜에 따라 분리하였다. 정제된 면역글로불린은 이후 특성화 실험에 사용되었다.
실시예 3.4: IgGs 특이성의 scFv 단편으로의 재전환
IgG 구축물(전술한 IgG A 및 IgG B)에서의 VH 영역은 적합한 scFv 발현 벡터내로 표준 프로토콜에 따라 재클로닝되었으며, 유연성 링커에 의해 실시예 3.1의 인간 경쇄에서 유래하는 VL 영역에 작동 가능하게 연결되었다. 이 구축물은 전술한 바와 같이 대장균의 주변세포질내에 가용성으로 생산되었다. 이들 scFvs(IgG A 유래의 scFv O 및 IgG B 유래의 scFv P)의 특성화는 하기 실시예에서 기술된다.
실시예 4: 영장류 및 인간 GM- CSF에 대한 인간 모노클로날 항-GM- CSF항체의 결합 특이성의 평가
본 실험의 목적은 전술한 바와 같이 수득된 항체가 GM-CSF에 특이적으로 결합하는 것을 보여주기 위한 것이다. 따라서, 이러한 항체의 상이한 재조합 인간 ("rh") 콜로니-자극 인자(rhG-CSF 및 rhM-CSF, Strathmann)에 대한 결합을 동일 항체의 rhGM-CSF에 대한 결합과 ELISA로 비교하였다.
50 μL의 특정 항원(1 μg/mL in PBS)을 1시간 동안 실온에서 ELISA 플레이트에 코팅하였다(Nunc, Maxisorp). PBS/0.05% 트윈 20으로 3차례 세척한 후, 웰을 웰당 200 μL PBS/ 3% 비-지방 건조 우유 분말로 1.5 시간 동안 실온에서 차단한 후, PBS/0.05% 트윈 20으로 3차례 세척하였다. 서열번호: 34에 따른 동일한 경쇄 서열 및 서열번호: 35-48에 따른 상이한 중쇄 서열을 갖는 일련의 인간 항체들(예를 들어 IgG A 및 IgG B) 50 μL을 1 μg/mL 내지 0.5 ng/mL (PBS/0.05% 트윈 20/3% 비지방 건조 우유 분말 내)의 범위의 희석 시리즈로 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS/0.05% 트윈 20으로 3차례 세척하고, 결합 항체를 50 μL의 호스라디쉬 퍼옥시다제-콘쥬게이트 고우트 항-인간 IgG 항체(Dianova, PBS/0.05% 트윈 20/3% 비지방 건조 우유 분말 내 1:1000로 희석)를 사용하여 검출하였다. 시그널은 ABTS 용액 (Roche) 50μL/웰을 첨가하여 발생시키고, 흡수는 대조로 450nm의 파장을 사용하여, 405nm에서 측정하였다.
상업적으로 시판하는 rhM-CSF 및 rhG-CSF에 특이적인 각 래빗 항체들(Strathmann Biotech AG)를 이들 항원에 대한 결합의 양성 대조로 사용하고, 상기 결합은 알칼리성 프로파타제-콘쥬게이트 고우트 항-래빗 항체로 검출하였다. 시그널은 pNpp-용액(Sigma) 50 μL/웰으로 발생시키고, 흡수는 대조로 450nm의 파장을 사용하여, 405nm에서 측정하였다.
그 결과를 두개의 대표적 인간 항체 IgG A 및 IgG B에 대하여 도 6A, 6B 및 6C에 도시하였다.
도 6A에 나타낸 바와 같이, 적정된 항체의 농도가 증가됨에 따라 흡수가 증가 되었고, 이는 두 대표적 항체 IgG A 및 IgG B가 rhGM-CSF에 대해 양호하게 결합함을 의미한다. 도 6B는 동일한 두 대표적 항체의 rhM-CSF에 대한 결합 결과를 보여준다. 본 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 래빗 항-rhM-CSF 항체의 농도가 증가됨에 따라 흡수가 증가되었고, 즉, 대조 항체(점)는 결합이 증가되었으나, 반면 상기 두 대표적 전술 항체는 테스트 항체의 농도가 증가하여도 흡수도는 그대로 기저흡수도로 서로 겹쳐져 나타난다(사각형 및 삼각형). rhG-CSF에 대한 결과를 도 6C에 나타내었으며, 두 대표적 테스트 IgG A 및 B 뿐 아니라 대조항체에 대해 완전히 유사한 결과가 보여졌다.
도 6A, 6B 및 6C의 데이타들을 고려하면, 이는 두개의 대표적 테스트 항체 IgGs A 및 B는 rhGM-CSF에 특이적으로 결합하며, M-CSF 및 G-CSF와 같은 다른 콜로니 자극 인자에는 그렇지 않음을 보여준다. 이러한 항원 결합 특이성은 유망한 항체 치료제에 매우 중요하다.
실시예 5: 인간 모노클로날 항-GM- CSF 항체 및 그 단편에 대한 결합 데이타의 특성화
실시예 2에 기재한 바와 같이 ELISA에 의해 rhGM-CSF의 양성 결합자로 동정된 다양한 구성원의 정성적 순위를 생성하는 것이 요망되었다. 상기 순위는 동정된 다양한 대표적 항체 결합자의 키네틱(오프-속도) 및 평형(친화성) 파라미터를 반영하기 위한 것이다. 이러한 목적을 위하여, 표면 플라스몬 공명(SPR)이 비아코르™ 2000 장치상에서 수행되었으며, 비아코르 AB (Uppsala, Sweden)는 유속 5 μL/min 로 HBS-EP(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % 계면활성제 P20)을 러닝 버퍼로 하여 25℃에서 수행되었다. 효모에서 생산된 재조합 인간 GM-CSF(Leukine, Berlex, 이하 "항원" 또는 "rhGM-CSF"로 지칭됨)을 CM5 센서 칩상의 흐름 세포 2-4에 고정화하였다. 칩의 표면을 80 μL의 0.1 M 소듐-하이드록시숙신이미드, 0.4 M N-에틸-N'(3-디메틸 아민프로필)-카보디이미드(NHS/EDC)를 주사하여 활성화시켰다. 상기 항원은 0.01 M 소듐-아세테이트 pH 4.7내의 10 μg/mL rhGM-CSF를 수동으로 주입하여 결합시켰다. 수동 주사 시간의 량을 조절하여 항원을 상이한 밀도로 흐름 세포 2-4에 고정화하였다. 흐름 세포 1은 개질되지 않았고, 흐름 세포 2는 rhGM-CSF의 가장 높은 가능 밀도(800 RU)로 코팅되었다. 흐름 세포 3은 흐름 세포 2 상에 고정된 항원 양의 50 %로 코팅되었으며, 흐름 세포 4는 가장 낮은 밀도(통상 10 %)의 rhGM-CSF로 코팅되었다. 상기 센서 칩의 활성화 표면을 85 μL의 1 M 에탄올아민을 주입하여 차단하고, 상기 칩을 HBS-EP 5 μL/분의 일정한 유속으로 밤새 두어 평형화시켰다.
실시예 5.1: 인간 모노클로날 항-GM- CSF 항체의 scFv 단편에 대한 키네틱 결합 파라미터(오프-속도)의 정성적 결정
비아코르 실험은 전술한 바와 같이 수행되었다. 실험전에 주변세포질 제제 의 용출된 단백질 용액("PPP")을 PBS에 대하여 25℃에서 2시간동안 투석하고, HBS-EP에서 1:1로 희석하였다. 본 발명의 클래스 구성원들의 결합 키네틱은 10 μL의 정제된 주변세포질 단백질 용액을 25℃에서 센서칩 상에 주입함으로써 측정하였다. 개질되지 않은 센서 칩 표면(FC1)에 대한 단백질의 비특이성 배경 흡착은 rhGM-CSF 고정화된 흐름 세포(FC2, FC3, FC4)에서의 반응 시그널에서 차감되었다. 상대적인 반응 시그널(FC2-1, FC3-1, FC4-1)이 측정되고, 특이적 해리 속도가 100초 동안 모니터되었다.
ELISA 실험에서 양성 rhGM-CSF 결합자로서 미리 동정된 일련의 대표적 scFv 단편에 대한 실험 결과를 도 7A에 도시하였다. 도 7A에 비아코르 데이타가 도시된 대표적 scFv 항체 단편은 아래와 같다: scFv A, scFv B, scFv C, scFv D, scFv E, scFv F, scFv G, scFv H, scFv I, scFv J, scFv K, scFv L, scFv M 및 scFv N.
일반적으로, 비아코르 결과를 해석함에 있어서, 결합 피크의 진폭(RUmax)은 주입된 샘플의 단백질 농도에 직접 비례한다. 키네틱 온-속도(ka)는 농도 의존적이며, PPP내의 단백질 농도의 다양성으로 인하여 청구된 클래스 구성원의 정성적인 순위로 사용될 수 없다. 모든 동정된 청구된 클래스 구성원은 고정화된 rhGM-CSF에 특이적 결합을 나타내었다. 가장 좋은 겉보기 오프-속도를 나타내는 청구된 클래스의 구성원을 동정하고, 저해데이타와 spr 데이타의 추가적 관련성이 비아코르상에서의 평형 결합 실험을 통한 친화성 결정을 위해 제출되었다.
도 7A에서 나타낸 바와 같이, 대표적인 scFv 항체 단편 A-N의 각각에 대하여 뚜렷한 피크가 관찰되었으며, 각 상부 부분들은 문제의 scFv 단편의 오프-속도를 얻을 수 있도록 외삽가능한 특징적인 곡률을 나타내었다. 이로써 정성적으로 각 대표적인 scFv 단편들이 인간 GM-CSF에 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5.2: 특정 인간 항-GM- CSF 항체 및 그 scFv 단편들에 대한 평형 결합 파라미터(친화성)의 정량적 결정
ELISA에 의해 rhGM-CSF에 대해 양성으로 테스트된 수개의 항-GM-CSF 항체의 scFv 단편들에 대해 실시예 5.1에 보인 바와 같이 정성적으로 인간 GM-CSF에 결합할 때 합리적인 키네틱 오프-속도를 나타내는 것을 확인하고, 이후 재조합 인간 GM-CSF에의 평형 결합 특성에 포커싱함으로써 이들 항체 및 그 단편에 대한 정량적인 결과를 수득하였다. 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 항원(여기서는 rhGM-CSF)에의 특이적인 결합은 본 청구된 항-GM-CSF 항체 및 그 단편 클래스의 특징적이고 특이적인 이점이다.
이 인간 항-GM-CSF 항체들 및 그 단편 클래스의 특정 대표적 구성원의 결합 키네틱(오프-속도, kd, 및 온-속도, ka)는 10 μL의 정제 단백질(즉, 항체 또는 그 단편)을 10 μg/mL 내지 1 pg/mL 범위의 희석 시리즈로 주입하고, 25℃에서 100초간 해리를 모니터링함으로써 측정하였다. 정제 단백질은 HBS-EP내에서 완충되었다. 데이타를 BIAevalution™ 소프트웨어를 사용하여 피팅하고, 1:1 랑그뮈러 결합 방정식 (이하 식 1 및 2)로 해리 및 결합 운동 속도 상수를 결정하였으며, 여기에서 A는 주입된 정제 단백질 분석물의 농도이고, B[O]는 Rmax이다.
dB/dt = -(ka * [A]* [B]-kd *[AB]) (식 1)
dAB/dt = -(ka * [A]* [B]-kd * [AB]) (식 2)
반응속도 곡선은 분석되는 각 대표적 인간 항-GM-CSF 항체 또는 그 단편의 8개의 농도까지 측정되었다. 원자료를 독립 피팅하여 해리 및 결합 속도 상수를 구하고, 이들을 사용하여 평형 해리 상수(KD)를 산출하였다. 각 대표적인 인간 항-GM-CSF 또는 그 단편에 대한 수득한 결과를 도 7B-7I에 도시하였다. 특히 도 7B는 대표적 IgG B에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이며; 도 7C는 대표적 IgG A에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이며; 도 7D는 대표적 scFv C에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이며; 도 7E는 대표적 scFv I에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이며; 도 7F는 대표적 scFv B에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이며; 도 7G는 대표적 scFv A에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이며; 도 7H는 대표적 scFv E에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이며; 및 도 7I는 scFv D에 대해 수득한 결합 데이타를 나타낸 것이다. 상기 데이타는 아래 표 2에 요약하였다.
[표 2] 특정 대표적 인간 항-GM-CSF 항체 및 그 단편들의 정량적인 친화성 결합 데이타
Figure pat00004
실시예 6: 인간 항-GM- CSF항체의 특정 대표적인 단편에 대한 최소한의 에피토프 요구 조건
본 명세서 기재의 청구된 인간 항-GM-CSF 항체 및 단편들에 의해 결합되는 에피토프를 결정하기 위함이다. 이 목적을 위해, 펩타이드 스포팅(peptide spotting;"펩스포트")분석이 본 클래스의 분자의 대표적 구성원으로서 scFv A를 사용하고 항원으로서 인간 GM- CSF을 사용하여 수행되었다.
통상적으로, 펩스포트 실험은 다음과 같이 수행된다. hGM-CSF의 아미노산 서열(인간 또는 특정의 기타 다른 영장류의 GM-CSF 서열은 전술한 기재 및 도 8A, 서열번호: 49-51 참조)에서 유도한 오버래핑 13mer 펩타이드를 화트만 50 셀룰로스 막에 C-말단에 의해 공유 결합에 의해 고정시키고, 아세틸화된 N-말단은 자유롭게 두었다. 생성된 개별적인 13mer 펩타이드(JPT Peptide Technology GmbH)를 하기 표 3에 나타내었다. 모든 두 개의 개별적 펩타이드의 오버래핑 서열의 길이는 11 아미노산으로 세팅하였다. 제조자 프로토콜에 따라 막을 절대 EtOH에 1시간동안 헹구고, TBS로 세척하고 TBS/3% BSA로 밤새 차단하였다. 모든 후속하는 인큐베이션, 세척 및 차단은 실온에서 수행되었다. TBS /0.05% 트윈 20으로 10분간 세번 세척한 후, 상기 막은 2.5 시간 동안 TBS / 3% BSA내의 1 μg/mL scFv A과 함께 인큐베이션하고, 전술한 바와 같은 세척을 수행하였다. scFv의 검출은 항-펜타-히스(anti-Penta-His) 항체(Qiagen, 0.2 μg/mL in TBS / 3% BSA)를 사용하여 수행하고 이어 호스라디쉬 퍼옥시다제- 콘쥬게이트 고우트 항 마우스 IgG(Fc-gamma-특이적)항체(Dianova, PBS/3% BSA내 1 :10.000)와 이들 각 항체들과 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBS / 0.05% 트윈 20으로 10분간 3차례 세척한 후, 증강 화학 발광(SuperSignalWest Pico 루미놀/증강제 용액 및 SuperSignalWest Pico 안정 퍼옥시다제 용액; Pierce)에 의하여 시그널을 발생하고, 바이오맥스 필름에 현상하였다(Kodak).
인간 GM-CSF 스트레치에 대한 강력한 scFv A 결합 시그널이 스폿 A와 B의 펩타이드-스폿의 스트레치상 및 스폿 C상에 검출되었다(하기 표 3 및 도 8B 참조). 도 8B에서 나타낸 바와 같이 다른 스폿에의 결합은 더 낮은 강도로 나타났다. 포인트 A와 B의 스폿 스패닝 스트레치는 아미노산 잔기 15-35에 대응한다. 이 영역을 이루는 모든 13mer 펩타이드는 아미노산 23-27 (RRLLN)의 하나의 최소 아미노산 스트레치를 포함한다. 스폿 C는 인간 GM-CSF의 아미노산 잔기 65-72 (GLRGSLTKLKGPL)에 대응한다. 이러한 결과는 scFv A가 불연속 에피토프를 인식하는 것을 의미한다.
인간 GM-CSF의 2차 구조에서, 아미노산 15-35는 나선 A에 위치하며, 스폿 C에 대응하는 잔기는 나선 C 및 D 사이에 위치하는 루프-구조의 일부이다. 이 분자의 3차원 폴딩 모델은 이들 부위가 서로에 대해 공간적으로 가까이 위치함을 보여준다.
스폿 A-B 펩타이드의 최소 아미노산 서열 모티프는 인간 GM-CSF의 잔기 23-27(RRLLN)에 대응한다. 스폿 A에서 스폿 B까지의 시그널 강도 증가는 스폿 A에 해당하는 펩타이드에서보다 스폿 B에 해당하는 펩타이드에서의 RRLLN 에피토프 접근성이 더 좋기 때문으로 설명될 수 있다. 펩타이드 A에서 에피토프는 막에 결합되어 있는 C-말단에 직접 위치하나, 펩타이드 B에서는 보다 접근하기 쉬운 펩타이드의 N-말단에 위치한다.
[표 3] 셀룰로스 막에 고정화된 오버래핑 13mer 펩타이드의 서열
Figure pat00005
실시예 7: 특정 인간 항-GM-CSF 항체/항체 단편들의 중화 효과
실시예 7.1: 특정 대표적 인간 항-인간 GM- CSF 항체 및 그 단편의 중화력의 정성적 평가
본 실험의 목적은 대표적 인간 항-GM-CSF 중화 항체 및 그 단편들의 중화 활성에 대한 정량적 정보를 얻는 것이다. 이 목적을 위하여, 인간 GM-CSF-의존성 세포주 TF-1 (DSMZ, ACC 334)이 사용되었다. 이 세포주의 증식 속도는 인간 GM-CSF의 존재에 의존하며, GM-CSF-중화 활성을 나태내는 것으로 의심되는 항체 존재하 또는 비존재하에서 상기 세포와 인간 GM-CSF를 함께 인큐베이션하고 상기 세포의 성장을 측정함으로써 중화 활성이 실재 존재하는지 여부를 결정할 수 있다.
TF-1 세포는 판매자(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)에 의해 기재된 바와 같이 2.5 ng/mL rhGM-CSF의 존재하에 RPMI 1640 배지(Gibco; L-glutamine, phenol-red free), 10% 열 불활성화 FCS내에서 배양되었다. 세포는 세포 밀도 0.5 x lO6 세포/mL 까지 성장시켰다. 증식 어세이를 위해 300 x g에서 4분간 원심분리하여 TF-1 세포를 수집하고, 1 x PBS(Dulbecco's, Gibco)로 세척하였다. 세포를 최종 농도 1 x 105 세포/mL로 RPMI 1640 및 10 % FCS에 재현탁하였으며, 마이크로테스트 평면 바닥 세포 배양 플레이트 웰당 90 μL 세포 현탁액이 사용되었다(0.9 x 104 세포/웰). 최종 농도 0.3 ng/mL rhGM-CSF이 TF-1 세포의 증식을 자극하기 위해 사용되었다. hGM-CSF 의존성 증식의 중화를 위하여, 인간 항-GM-CSF 항체의 대표적 단편들의 정제 PPP를 1 x PBS에 대해 25℃에서 2시간 동안 투석하였다. 10μl의 투석되고 멸균 여과(0.22 μm 필터)된 단백질 용액를 TF-1 및 rhGM-CSF을 포함하고 있는 용액 100 μl에 첨가하였다.
37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, TF-1 세포 증식 상태는 살아있는 세포에서의 미토콘드리아 데하이드로게나제에 의한 테트라졸늄 염(WST-1, Roche) 분해에 기초한 비색 검사에 의해 결정하였다. 대사적으로 활성인 세포에 의해 형성된 포마잔 염료는 450 nm에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정함으로써 정량화되었다.
시험된 대표적 인간 항-인간 GM-CSF 항체 단편들에 의한 인간 GM-CSF-의존성 TF-1 세포의 증식의 억제는 그 강도에서 다양하게 나타났다(도 9). 두개의 단편은 중화 효과를 나타내지 않은 반면(scFv F 및 scFv L); 5개의 구축물은 (scFv J, scFv K, scFv M, scFv N, 및 scFv H) 중간 정도의 억제를 나타내었으며, 7개의 구축물(scFv B, scFv I, scFv E, scFv D, scFv G, scFv C, scFv A)은 강력한 GM-CSF의존성 TF-1 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 중화 효과를 나타내지 않거나, 낮은 정도의 중화효과는 특정 대표적 scFv의 낮은 발현 수준에서 기인하거나 또는 37℃에서 72시간 인큐베이션 동안 특정 대표적 scFv 및 rhGM-CSF간에 다소 덜 안정한 복합체가 형성되기 때문일 수 있다.
실시예 7.2: 세포 증식에 의해 측정한 특정 대표적 인간 항-인간 GM- CSF 항체 및 그 단편들의 중화력의 정량적 평가
전술한 강력한 TF-1 증식 억제 효과를 나타내는 대표적 scFv 분자들을 선택하여 중화 역가의 정량적 분석을 시행하였다. 이 목적을 위하여 동일한 인간 GM-CSF-의존성 세포주 TF-1 (DSMZ ACC 334)이 사용되었다. 실시예 7.1에 기재된 바와 같이 TF-1 세포를 배양하고 증식 어세이를 준비하였다. 최종 농도 0.3 ng/mL rhGM-CSF가 TF-1 세포의 증식을 자극하기 위해 사용되었다. GM-CSF-의존성 증식을 중화하기 위하여, lOμl의 대표적 인간 항-인간 GM-CSF 중화 모노클로날 항체 또는 그 단편들의 정제 샘플이 100 μl TF-1 및 rhGM-CSF에 단계 희석 방식으로 첨가되었다. 최종 단백질 농도는 10 μg/ml 내지 10 pg/ml의 범위였다.
샘플을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간 후 실시예 7.1에 기재한 바와 같이 TF-1 세포의 증식 상태를 측정하였다. 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 곡선 피팅을 이용하여 IC50을 산출하도록 데이타를 피팅하였다.
상기 실시예 7.1에 기재된 정성적 증식 억제 시험에서 보인바와 같은 명백한 GM-CSF 중화효과가 확인되고 정량화되었다. 인간 항-인간 GM-CSF 모노클로날 중화 항체의 모든 시험된 scFv 단편들은 이 증식 억제 시험에서 나노몰 범위의 IC50은 나타내었다. 도 1OA에 나타낸 바와 같이 중화 역가의 명백한 순위가 수립되었다.
시험된 인간 항-인간 GM-CSF 모노클로날 중화 IgG 항체는 그 scFv 대응물보다 상당히 더 높은 중화 효능을 나타내었다. 이 설험에서 생성된 IgG 분자들의 IC50은 나노몰-이하의 범위였다. 도 1OB에 도시한 바와 같이, IgG A에 대해 평가된 IC50는 0.9 nM이고, IgG B의 IC50은 0.3 nM이었다.
IgGs A 및 B에서 생성된 scFv 항체 단편들(각각 scFvs O 및 P)이 그 중화력에 있어서 정량적으로 scFvs A 및 B에 대응하는지를 확인하기 위하여, 시험 분자로 scFvs O 및 P을 사용하는 것 이외에는 전술한 바와 동일하게 TF-1 중화 어세이를 수행하였다. 그 결과를 scFvs P 및 O에 대하여 각각 도 1OC 및 1OD에 도시하였다. 도 1OD에 나타낸 바와 같이, scFv O는 scFv A과 동일한 중화력을 나타내며, 생물학적 활성의 소실없이 IgG에서 다시 scFv 형태로의 재전환이 가능함을 보여준다.
실시예 7.3: IL-8 생산 감소에 의해 측정한 특정 대표적 인간 항-인간 GM-CSF 항체 및 그 단편들의 중화력의 정량적 평가
본 시험은 U-937 세포에 의한 GM-CSF-의존성 IL-8 생산의 측정으로써, 대표적 인간 항-인간 GM-CSF 항체 및 그 단편들의 중화 활성을 정량화하기 위해 수행되었다. 이하 실험에서 사용된 GM-CSF 항원은 rhGM- CSF이다. 단핵구 U-937 세포는 제조자(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)가 기재한 바와 같이 10% 열 불활성화 FCS로 보충된 RPMI 1640 배지 Gibco (L-glutamine, phenol-red free)에서 배양되었다. 세포는 세포 밀도 1 x 106 세포/mL까지 성장시켰다.
IL-8 생산의 측정에 기초한 억제 시험을 수행하기 위하여, 세포는 300 x g에서 4 분간 원심분리에 의해 수집되고, 최종 농도 1 x 106 세포/mL로 RPMI 1640, 10 % FCS내에 재현탁되었다. 1.8 x 105 세포/웰 (180 μL 세포 현탁액)이 마이크로테스트 평면 바닥 세포 배양 플레이트 웰에 시딩되었다. 최종 농도 1 ng/mL rhGM-CSF이 U-937 세포에 의한 IL-8 생산을 자극하기 위해 사용되었다. 2Oμl의 정제 scFv 또는 IgG가 180 μl U-937 세포 및 rhGM-CSF 용액에 단계 희석 방식으로 첨가되었으며, 최종 단백질 농도는 10 μg/ml 내지 10 pg/ml의 범위였다.
샘플을 37℃, 5% CO2에서 18시간 동안 인큐베이션하고, 세포를 배양 플레이트를 600 x g에서 2분간 원심분리하였다. 배양 상청액을 새로운 플레이트에 피페팅하여 수집하고, OptEIA 인간 IL-8 ELISA 세트 (Becton Dickenson and Company)를 사용하여 그 안의 IL-8 농도를 분석하여 측정하였다.
ELISA 검출은 제조자 지시에 의해 수행되었다. 간략하게, 0.1 M 소듐카보네이트, pH 9.5에 희석한 50 μL의 포획항체를 밤새 4℃에서 마이크로테스트 플레이트에 코팅하였다. PBS/0.05% 트윈 20으로 3차례 세척하고, 상기 웰을 웰당 200 μL PBS/ 10% FCS로 1시간동안 실온에서 차단하고, PBS/0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 이후 50 μL의 배양 상청액 샘플을 웰에 가한 후 2시간동안 실온에서 인큐베이션하였다. 추후 정량을 위해 과정 중에 제조자에 의해 공급된 IL-8 표준 단계 희석을 수행하였다.
PBS/0.05% 트윈 20으로 5회 세척한 후, OptEIA 인간 IL-8 ELISA 세트에 제공된 작업 검출자(Ab + Av-HRP 검출) 50μL을 사용하여 검출을 수행하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 7회 더 세척하였다. OPD 기질용액 (Sigma)을 가하여 시그널을 발생시키고, 490 nm의 파장에서 검출하였다(대조 파장 620 nm 사용).
IL-8 표준 커브를 캘리브레이션을 위해 플로팅하고, 배양 상청액 샘플내의 IL-8 농도를 캘리브레이션 커브에 따라 산출하였다. 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 곡선 피트를 사용하여 IL-8 생산의 IC50을 산출하도록 데이타를 피팅하였다.
검사된 모든 대표적 인간 항-rhGM-CSF 모노클로날 중화 항체의 단편이 명백한 U-937 세포의 GM-CSF 의존성 IL-8 생산 억제를 나타내었으며, 이는 도 11에서 scFv 농도의 증가에 따라 IL-8 농도의 감소에 의해 확인된다. 이 실험에서의 중화 역가의 순위는 전술한 TF-1 증식-억제 실험에서의 중화 효과에 대한 동일한 시험 분자의 순위와 일치하였다.
이 시험에서 결정된 IC5O 값이 전술한 TF-1 증식 시험에서 동일한 분자에 대해 수득된 값에 비하여 더 높다. 이는 TF-1 자극에 요구되는 것보다 U-937 세포에 의한 IL-8 생산의 자극에 요구되는 GM-CSF의 농도가 더 높기 때문이다.
실시예 7.4: 세포 증식에 의해 측정한 대표적 인간 항-인간 GM- CSF 항체 및 그 단편들의 재조합 마카칸 GM-CSF에 대한 중화력의 정량적 평가
본 실험의 목적은 비인간 영장류인 마카카 패킬리들의 GM-CSF("macGM-CSF")에 대한 대표적 인간 항 인간 GM-CSF 항체 및 그 단편들의 중화 효능을 보여주기 위함이다.
macGM-CSF에 대한 선택된 scFv 및 IgG 분자의 중화 효과를 나타내기 위하여, 증식-억제 실험은 실시예 7.1 및 7.2에 기술한 프로토콜에 의해 hGM-CSF 대신 macGM-CSF을 사용하여 수행하였다. hGM-CSF 및 macGM-CSF 양자는 동일한 EC50으로 TF-I 세포의 증식을 자극한다. scFv 분자 및 0.3 ng/mL rhGM-CSF를 테스트하는 실험에서 최종 농도 3 ng/ml macGM-CSF가 TF-I 세포의 증식을 자극하기 위해 사용되었으며, 대표적 인간 항-인간 GM-CSF 항체로서 IgG B를 사용하였다. TF-1 세포 증식을 중화하기 위해, 10 μl의 정제 인간 항-인간 GM-CSF 항체 또는 그 단편들이 100 μl TF-I 및 macGM-CSF 용액에 희석 시리즈로 첨가되었다. 최종 단백질 농도는 10 μg/ml 내지 10 pg/ml의 범위였다. 샘플을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간 후 실시예 7.1 및 7.2에 기재한 바와 같이 TF-1 세포의 증식 상태를 측정하였다. 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 곡선 피팅을 이용하여 IC50을 산출하도록 데이타를 피팅하였다.
도 12A에 도시한 바와 같이, 특정 대표적 인간 항-인간 GM-CSF 모노클로날 항체 단편들(scFv B, scFv E, scFv C, scFv I, scFv A)은 mac GM-CSF에 명백한 중화능을 나타내었다. 도 12B에 나타낸 바와 같이, 대표적 인간 항-인간 GM-CSF 모노클로날 항체 IgG B의 농도 증가는 명백하게 TF-I 증식 감소를 초래하였으며, 이는 이 항체의 중화력을 나타낸다. 흥미롭게도, 이 실험에서 TF-1 세포 증식을 유도하기 위해 mac GM-CSF을 사용한 이 실험에서 IgG B에 대해 생성된 IC50값(0.3 nM)이 hGM-CSF를 사용한 실험에서 생성된 값과 동일하였으며, 이는 이 종에서 GM-CSF에 대한 명백한 IgG B의 교차 반응성을 보여준다.
실시예 8: 다양한 종에서의 GM-CSF과 IgG B의 교차반응성
IgG B의 다양한 비인간 종에서의 GM-CSF와의 교차반응성이 추후 인 비보 연구에 적합한 종을 동정하기 위해 연구되었다. 첫번째 세트의 실험에서, IgG B의 시판 재조합 인간 GM-CSF(Leukine®, Berlex), 돼지 GM-CSF, 개 GM-CSF, 래트 GM-CSF(R&D Systems, Wiesbaden, Germany) 및 마우스 GM-CSF(Strathmann Biotech, Hamburg, Germany)에의 결합이 ELISA 실험으로 수행되었다. 특히 ELISA-플레이트는 상기 언급한 다양한 종에서의 GM-CSF 1 μg/mL로 코팅되었다. IgG B를 단계 희석 방식으로 첨가하고, 호스라디쉬 퍼옥시다제- 콘쥬게이트 항-인간 IgG1 항체를 사용하여 검출하였다. ELISA는 OPD o-페닐렌디아민("OPD", 퍼옥시다제와 반응시 황-오렌지색을 나타낸다)기질 용액(Roche, Germany)로 발색시키고, 490 nm에서 측정하였다.
도 13에서 나타낸 바와 같이, IgG B는 재조합 인간 GM-CSF에 강력한 결합을 보였으며, 반면 시험된 다른 종의 GM- CSF들은 인식되지 않았다. 돼지, 개, 래트 또는 마우스는 따라서 인 비보 테스트에서 적합한 종이 아니다. 그러나 실시예 7.4에서 본 바와 같이, IgG B는 macGM-CSF (시노몰거스 원숭이, macaca fascicularis 에서의)와는 현저한 교차 반응성을 나타내었으며, 이는 마카칸 패밀리의 하나 이상의 원숭이 종의 IgG B의 인 비보 연구 적합성을 의미한다.
실시예 9: 상이한 당화 GM-CSF 변이체에 대한 IgG B의 결합성
본 실험의 목적은 IgG B의 GM- CSF에 대한 결합이 후자의 당화 파턴에 어느 정도까지 의존하는지를 결정하는 것이다. 이 목적을 위해 천연 hGM-CSF (인간 당화) 및 대장균(당화 없음) 및 효모(효모 당화) 유래의 재조합 hGM-CSF 및 재조합 마카커 GM-CSF를 포함하는 조절 배지의 희석 시리즈에 대하여 그 TF-1 증식을 유도하는 이들의 역가를 측정하였다.
인간 당화 GM-CSF는 IL-lβ-처리 BEAS-2B 세포(ATCC CRL-9609에서 수득한 인간 폐 세포)의 배양 상청액으로부터 수득하였다. BEAS-2B 세포는 BEGM Bullet 키트로 대체된 BEBM-배지(Cambrex, Verviers, Belgium)에서 전파시켰으며, GM-CSF 생산을 유도하기 위해 50 ng/mL IL-IB (Strathmann Biotech, Hamburg, Germany) 존재하에서 RPMI 1640, 10 % FCS에서 배양하였다. 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, OptEIA 인간 GM-CSF Elisa 세트 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 사용하여 제조자 지시에 따라 배양 상청액의 GM-CSF 함량을 분석하였다.
대장균에서의 재조합 hGM-CSF은 WO 2005/105844호의 실시예 1.1에 기재된 바에 따라 내부적으로 생산하였다. 효모에서의 재조합 hGM-CSF는 시판 중인 상품명 "Leukine"(Berlex, USA)를 구입하여 준비하였다. 마카커 GM-CSF는 HEK293 세포에서 재조합적으로 생산하였다.
천연 hGM-CSF, 대장균 및 효모에서의 재조합 hGM-CSF, 및 재조합 마카커 GM-CSF를 포함하는 조절 배지의 희석 시리즈들에 대하여 먼저 TF-1 증식을 유도하는 역가를 측정하였다. 모든 세개의 인간 GM-CSF 당화 변이체 및 마카커 GM-CSF는 TF-1 활성화에 있어 매우 유사한 EC50값을 나타내었다. 대장균-생산된 hGM-CSF에 대해서는 10 pg/mL, 효모-생산된 hGM-CSF에 대해서는 15 pg/mL, 인간 폐세포-생산된 hGM-CSF에 대해서는 36 pg/mL, 및 마카커 GM-CSF에 대해서는 11 pg/mL을 각각 나타내었다(도 14A).
이후 IgG B의 중화 활성을 0.3 ng/mL 재조합 hGM-CSF, 또는 0.2 ng/mL 생리학적 hGM-CSF의 존재하에 측정하였다. 72시간 후, 상이한 IgG B 농도 존재하의 TF-1 세포의 증식 상태를 비색 반응에 의해 정량화하였다(도 14B).
종합하면, 도 14의 데이타는 IgG B가 명백하게 인간 GM-CSF의 당화 패턴에 관계없이 나노-몰 이하의 농도에서 GM-CSF-의존성 TF-1 세포 증식을 억제함을 보여준다. 따라서 인간 GM-CSF의 당화 패턴은 GM-CSF 활성을 중화하는 IgG B의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
실시예 10: 호산구에 대한 GM-CSF의 생리학적 활성에 대한 IgG B의 효과
실시예 10.1 : GM-CSF-매개 호산구 생존에 대한 IgG B의 효과
GM-CSF의 다양한 생리학적 활성 중 하나는 호산구 및 호중구 과립구 생존을 연장하는 것이다. 폐 염증 질환이 호산구의 국소적 축적에 기인하고, 호산구는 염증을 유지시키는데 중요한 역할을 하므로, GM-CSF 매개 호산구 생존을 방해하는 IgG B의 효능을 시험하였다.
호산구는 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 분리하고, 수득한 과립구 집단에서 밀도 구배 원심분리로 CD16+ 호중구를 제거하고 적혈구를 용혈시켰다. 막 분리한 말초 혈액 호산구를 5 x 104 세포/웰의 밀도로 96-웰 평면 바닥 마이크로테스트 플레이트내 RPMI 1640 / 10% FCS 및 Pen/Strep에 시딩하였다. GM-CSF를 33 ng/mL 내지 10 pg/mL 범위의 희석 시리즈로 가하여 농도 의존성 호산구 생존을 모니터하였다. GM-CSF-의존성 호산구 생존에 대한 IgG B의 억제능을 분석하기 위하여, 항체를 10 μg/mL 내지 0.1 ng/mL 범위의 희석 시리즈로 가하였다. 최종 농도 0.1 ng/mL GM-CSF가 호산구 생존에 효과를 나타내기 위해 사용되었다. 37℃, 5% CO2에서 72시간동안 인큐베이션 한 후, WST-1 시약을 가하였다. 살아있는 세포의 부분에 대응하는 생성된 비색 반응을 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 상기 데이타를 분석하고 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 곡선 피트를 사용하여 데이타를 분석 피팅하여 IC50를 산출하였다. 도 15A에 나타낸 바와 같이 rhGM-CSF의 50% 최대 유효량(EC 50)은 0.02 ng/mL이었다. 도 15B에 나타낸 바와 같이, 강력한 IgG B 중화작용 호산구 생존의 저해를 나타내었으며, IC50은 0.13 nM이었다.
이들 데이타는 IgG B가 GM-CSF-의존성 호산구 생존을 억제하는데 있어 용량-의존적으로 효과적임을 보여준다.
실시예 10.2: GM-CSF-유도 호산구 활성화에 대한 IgG B의 효과
GM-CSF-유도 호산구 활성화에 대한 IgG B의 효과를 확인하는 것이 요망되었다. 인간 혈액에서 말초 호산구(CD16-)를 분리하고 (a) 0.1 ng/mL GM-CSF 또는 (b) 0.1 ng/mL GM-CSF, IL-3 및 IL-5로 20시간 또는 3일간 자극하는 경우, CD69 발현이 상승 조절되었으나, (c) 0.1 ng/mL IL-3 및 IL-5 단독으로 자극하는 경우에는 그렇지 않았다(도 16A). 배지에만 배양된 호산구는 CD 69의 상승 조절을 나타내지 않았다. 따라서, CD 69는 GM-CSF에 의한 호산구 활성화의 마커로서 사용될 수 있으며, CD69 발현 수준은 GM-CSF-유도 호산구 활성화에 대한 척도로서 모니터될 수 있다. 두 개의 시점(20시간 및 3일)에서, IgG B는 거의 완전하게, 호산구의 GM-CSF-의존성 활성화를 방지하였으며, 이는 유세포분류분석에서의 CD69 발현의 미검출로 나타났다.
호산구는 실시예 10.1에 기재된 바와 같이 분리되고 5 x 105 세포/웰의 밀도로 48-웰 평면 바닥 마이크로테스트 플레이트의 RPMI 1640 / 10% FCS 및 Pen/Strep에서 배양되었다. 세포는 배지 단독 또는 0.1 ng/mL GM-CSF 단독 존재하 또는 0.1 ng/mL IL-3 또는 IL-5와 함께 인큐베이션되었다. 10 μg/mL IgG B가 GM-CSF의 중화를 위해 사용되었다. 1 또는 3일간의 인큐베이션 후, 유세포분류분석에 의해 상기 세포에서 CD69 발현을 분석하였다.
유세포분류분석에 의한 CD69 검출: 호산구상에서의 CD69 발현은 FACS Calibur 장치(Becton Dickinson)상에서 결정되었다. 105 세포를 각각 5 μL의 FITC-콘쥬게이트 항-인간 CD16 항체(clone 3G8, BD Biosciences) 및 PE-콘쥬게이트 항-인간 CD69 항체(clone FN50, BD Biosciences)와 함께 1시간 동안 40℃에서 인큐베이션하였다. 음성대조로서, 관련없는 동형-매치 FITC- 및 PE-콘쥬게이트 항체가 사용되었다. 인큐베이션후, 상기 세포를 PBS, 1% FCS, 0.05% NaN3로 2회 세척하고, 250 μL PBS, 1% FCS, 0.05% NaN3에 재현탁시켰다. FACS 분석 바로전에 프로피듐 요오드를 최종 농도 1 μg/mL로 가하여 죽은 세포를 라벨링하였다. 데이타 해석은 CellQuestPro software (BD Biosciences)을 사용하여 수행하였다. 프로피듐 요오드-양성(즉, 죽은)세포는 CD69 발현의 분석에서 배제하였다.
IgG B는 또한 살아있고 활성화된 호산구의 퍼센트를 경감시켰으며, 이는 0.1 ng/mL GM-CSF 존재하 CD16-/CD69+ 세포의 프로피듐 요오드 염색에 의해 모니터되었다. IgG B는 배양 1일 후 활성화 세포를 35%에서 8%로 경감시켰으며, 배양 3일 후 43%에서 3%로 경감시켰다. 0.1 ng/mL GM-CSF, IL-3 및 IL-5의 존재하에서 살아있고 활성화된 호산구의 퍼센트가 배양 1일 및 3일 후 각각 32%에서 8%로, 48%에서 11%로 경감되었다. 비록 CD69의 상향 조절은 IgG B에 의해 완전히 억제되었지만, 더 많은 수의 휴지 호산구(CD16-/CD69-)가 배지 또는 GM-CSF 단독에서 배양된 세포에 비하여 0.1 ng/mL GM-CSF, IL-3 및 IL-5 존재하에서 3일간 생존하였다(도 16 A, 마지막 칼럼). 0.1 ng/mL IL-3 및 IL-5 존재하에서 인큐베이트된 세포의 경우 동일하였다.
용량 검출 시험에서, IgG B를 0.1 ng/mL GM-CSF 존재하에서 배양된 호산구에 희석 시리즈로 첨가하였다(도 16B). CD69-의존성 메디안 형광 강도(MFI)에 대한 IgG B의 억제효과는 0.22 nM IgG B의 50% 최대 농도에서 관찰되었다.
종합하면, 이들 결과는 IgG B가 예를 들면 천식과 같이 염증성 기도 질환에 밀접한 생물학적 현상인 GM-CSF 활성의 효과적인 중화제임을 보여준다.
실시예 11: IgG B를 사용한 엑스 비보 독성 예비 연구
전술한 바와 같이 GM-CSF 활성의 중화는 수많은 질병에서 치료적으로 유리하다. 그러나 동시에 GM-CSF는 예를 들면 호중구 및 단핵구에 의한 식세포 작용과 같은 외인성 병원균과 싸우는 면역 시스템의 정상적인 기능에서 중요한 역할을 한다. 이러한 호중구 및 단핵구의 자연 기능은 치료적 량의 IgG B의 존재하에서 영향을 받지 않고 그대로 남아있어야 한다. 따라서, 식세포 작용의 두가지 측면을 연구하였다: 1) 박테리아의 섭취 (식세포작용); 및 2) 산화 방출 활성(oxidative burst activity ; 세포내 살해에 대한 지표). 이러한 연구는 하기에서 자세히 설명한다.
실시예 11.1 : 박테리아의 섭취(식세포 작용;phagocytosis)
헤파린처리된 전혈의 과립구 및 단핵구의 식세포 활성은 Phagotest Kit by Orpegen (Heidelberg, Germany)를 사용하여 측정되었다. 이 시험은 식세포 세포에 의한 옵손화된, 형광 라벨된 대장균의 섭취에 기반한다. 이후 이들 세포는 유세포 분류분석에서 녹색 형광으로 검출된다. 20 μl 형광 라벨되고 옵손화된 대장균을 100 μl의 헤파린 처리된 전혈에 가하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 음성 대조로 0℃에서 인큐베이션하였다. 10분 후 100 μl 퀀칭 용액(Orpegen)을 가하고 얼음위에서 샘플을 냉각시켜 식세포 작용을 중지시겼다. 이 용액은 내재화된 입자의 형광은 영향을 주지 않은 채, 표면에 결합된 박테리아의 FITC 형광을 퀀칭시킴으로써 박테리아의 부착 및 내재화를 구별할 수 있게 한다. 3 ml 세척 용액(Orpegen)으로 3회 세척 단계를 거친 후, 적혈구가 용해되었다. 남아 있는 백혈구는 3 ml 세척용액(Orpegen)으로 1회 세척하였다. 응집된 박테리아 또는 세포를 배제시키는 200 μl DNA 염색 용액을 첨가한 후, 상기 세포를 유세포분류분석으로 분석하였다. 식세포작용을 수행한 세포의 퍼센트를 FITC-형광으로 수행하였다.
IgG B의 식세포작용에 대한 영향을 결정하기 위하여, 세개의 동일한 혈액 샘플에 최종 농도 10 μg/ml로 IgG B를 첨가하였다. 이후 이들 세개의 샘플을 37℃에서 IgG B와 함께 다양한 시간 동안 인큐베이션하고, 대장균을 첨가하였다. 대장균은 제1 샘플에는 즉시 첨가하였으며, 제2 및 제3 샘플에는 각각 24시간 및 48시간 후에 첨가하였다.
과립구에 대한 결과: 혈액 채취 직후, 98% 이상의 과립구가 IgG B가 존재하든 존재하지 않든 박테리아를 섭취하였다(도 17A). 혈액 샘플을 IgG B와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후에는, IgG B 미존재하에서는 약 92%로, IgG B 존재하에서는 90%로 감소되었다(도 17B). 48시간 후, IgG B 미존재하에서는 81%의 과립구가 식세포-양성이었으며, IgG B 존재하에서는 89%의 과립구가 식세포작용-양성이었다 (도 17C).
단핵구에 대한 결과: IgG B의 존재에 관계 없이 혈액 채취 직후 98%의 단핵구가 식세포작용을 나타내었다(도 18A). IgG B와의 전-인큐베이션 24시간 후, 90%의 단핵구가 양성이었다 (도 18B). IgG B 비존재하 전-인큐베이션 24시간 후,92%의 단핵구가 양성을 나타내었다. 48 시간 후, IgG B 미존재하에서는 81%의 단핵구가, IgG B 존재하에서는 89%의 단핵구가 식세포작용-양성을 나타내었다(도 18C).
실시예 11.2: 산화 방출
헤파린 처리된 전혈내의 과립구 및 단핵구의 산화 방출 활성은 Orpegen의 P hagoburst 키트(Heidelberg, Germany)를 사용하여 측정하였다. 이 어세이에서 반응성 산화물을 생성하는 식세포성 세포의 퍼센트를 측정할 수 있으며, 기질 디하이드로로다민(DHR)123는 형광 R 123으로 산화된다. 산화 방출 활성을 나타내는 세포는 유세포분석에서 동정될 수 있다. 헤파린처리된 혈액은 다양한 자극과 함께 인큐베이션되어 산화방출 활성을 유도시킨다: 포볼 12-미리스테이트 13 아세테이트(phorbol 12-myristate 13- acetate; "PMA")가 강력한 자극으로 사용되며; 라벨화되지 않은 옵손화된 대장균이 중간 자극으로서, 주화성 펩타이드 N-formyl-MetLeuPhe (fMLP)가 약한 자극으로서 사용되었다. 100 μl의 전혈이 상기 자극과 함께 37℃에서 인큐베이션되었다. 음성 대조로서 자극없이 인큐베이션되었다. 10분 인큐베이션후, DHR 123 기질 용액을 가하고, 10분 더 인큐베이션하였다. DHR 123은 산화 세포에 의하여 형광성 R 123로 전환되었다. 3 ml 세척 용액 (Orpegen)으로 3회 세척 후, 적혈구는 용해되었다. 남아 있는 백혈구는 3 ml 세척 용액(Orpegen)으로 1회 세척하였다. 응집된 박테리아 또는 세포를 배제시키는 200 μl DNA 염색 용액을 첨가한 후, 상기 세포를 유세포분류분석으로 분석하였다.
산화방출에 대한 IgG B의 영향을 분석하기 위하여, IgG B을 세개의 동일한 혈액 샘플에 최종 농도 10 μg/ml로 첨가하였다. 이들 세개의 샘플 각각을 세개의 부분으로 나누고 다양한 시간동안 37℃에서 인큐베이션 한 후, 상기 부분들을 분리하여 대장균, fMLP 또는 PMA를 첨가하였다. 대장균, fMLP 또는 PMA는 즉시 제1 샘플의 세 부분에 첨가된 반면, fMLP 또는 PMA는 각각 24시간 및 48시간 후에 상기 제2 및 제3 샘플의 세부분에 가하였다. IgG B가 없는 병행 혈액 샘플을 대조로서 상기와 동일하게 처리하였다. 결과는 하기 표 4에 나타내었으며, 여기에서 왼쪽에서 2번째 칼럼의 "+" 는 시험된 샘플 부분에 IgG B기 존재함을 의미하며, "-"는 IgG B-가 없는 대조를 의미한다.
[표 4] 과립구의 산화 방출 행동에 대한 IgG B 효과
Figure pat00006
과립구 대신 단핵구를 사용하였을 때에도 동일한 결과가 얻어졌다. 실험은 전술한 바와 유사하게 수행되었으며, 그 결과는 하기 표 5에 도시하였고, 여기에서 왼쪽에서 2번째 칼럼의 "+" 는 시험된 샘플 부분에 IgG B기 존재함을 의미하며, "-"는 IgG B-가 없는 대조를 의미한다.
[표 5] 단핵구의 산화 방출 행동에 대한 IgG B 효과
Figure pat00007
따라서 생리학적으로 관련있는 온도에서 IgG B의 존재는 과립구 또는 단핵구에 의한 식세포작용이나 산화적 박테리아 살해작용에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 결론지을 수 있다. 인 비보에서도, 이들 결과는 IgG B의 치료적 투여가 환자의 정상적인 면역 방어 기능에 불리한 영향을 미치지 않을 것으로 예측됨을 제시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Research (Munich) GmbH <120> Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor <130> IPA110266-DE-D2 <150> EP 05 008 410.2 <151> 2005-04-18 <160> 56 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 7A-701 <400> 1 Ser Gly Leu Ile Ala Asn His Met Thr Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 7B1-502 <400> 2 Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-A1 <400> 3 Ser Gly Leu Ile Phe Asp Tyr Trp Leu Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-A12 <400> 4 Ser Gly Leu Ile Ile Asp Ala Leu Ser Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L38-G7 <400> 5 Thr Ser Leu Met Ser Ile Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 L39-D11 <400> 6 Ser Gly 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Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 3077 <400> 56 Ser Gly Leu Ile Ala Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10

Claims (18)

  1. 경쇄 가변영역에 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRl, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하고; 중쇄 가변영역에 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDRl, 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호: 2-10, 12, 13 또는 56 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, 영장류 GM-CSF에 특이적으로 결합하고, 이를 중화시키는, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 영장류는 인간 또는 비인간 영장류인, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 비인간 영장류는 시노몰거스 원숭이, 레시우스 원숭이 또는 기봉인, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 IgG인, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 IgG가 IgG1 또는 IgG4인, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단편이 scFv, Fv, 디아체(diabody), 탠덤 디아체(tandem diabody), Fab, Fab' 또는 F(ab)2인, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  7. 제1항에 있어서, 경쇄 가변영역에 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDRl, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 중쇄 가변영역에 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDRl, 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  8. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역에 서열번호: 19, 54, 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  9. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역에 서열번호: 21 - 30, 32, 33, 52 또는 53 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  10. 제1항에 있어서, 서열번호: 34의 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 35, 37 - 44, 또는 46 - 48 중 어느 하나의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호: 34의 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 35의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편.
  12. 제1항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  13. 제1항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편, 또는 제12항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는, 염증성 질환 또는 종양성 질환 치료용 약학적 조성물.
  14. 제1항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 제12항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자와, 경우에 따라 하나 이상의 부가적 항염증제를 포함하는 염증성 질환의 치료용 의약품의 제조에 사용하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 염증성 질환이 류마티스성 관절염(RA), TNF-alpha 중화제에 의한 치료에 저항적인 RA, 천식, 다발성 경화증(MS), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 특발성 폐섬유화증(IPF), 염증성 장질환(IBD), 포도막염, 황반변성, 대장염, 건선, 왈더변성, 항인지질증후군(APS), 급성 관상 동맥 증후군, 레스티노시스(restinosis), 죽상동맥경화증, 재발성 다발 신경병증(RP), 급성 또는 만성 간염, 사구체신염, 루프스, 또는 자가 면역 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 따른 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편, 또는 제12항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자와, 경우에 따라 하나 이상의 부가적 항암제를 포함하는, 종양성 질환의 치료용 의약품의 제조에 사용하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 종양성 질환이 암인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 암이 백혈병, 다발골수종, 위암 또는 피부암인 방법.
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