JPH06511156A - 炎症性疾患状態に関連する症状の緩和 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 「炎症性疾患状態に関連する症状の緩和」本願出願は、放棄された１９９２年７ 月１６日に出願された米国特許出願Ｎｏ、　０７／９１５，０６８の一部継続出 願である、１９９３年５月１０日に出願された米国特許出願Ｎｏ、　０８１０６ ０，６９９の一部継続出願である。 発明の背景 本発明は一般に、炎症性疾患状態に関連する症状の緩和のための方法に関し、具 体的には、白血球表面に発現した分子と免疫学的に反応する抗体基質の薬学的有 効量の投与による多発性硬化症に含まれる炎症の進行阻害に関する。 炎症は、多数の疾患において観られる主要な身体の反応であり、感染に対する身 体の最初の防御でもある。　炎症プロセスは、組織損傷に対して生しる体系付け られた一連の工程を含む。 に対する白血球の流入を導く。　白血球か損傷部位に到達すると、それらは代謝 的に活性化され、例えば、細菌の根絶において、防御的重要性か認められている 特異的タンパク質〔媒介物〕を分泌し始める。 調節機能か作用しない場合、炎症状態は慢性炎症として知られている状況とされ る。　このような状況下では、生成した媒介物は炎症応答を増幅し、そして他の 正常組織にまで損傷を及はすことになる。　身体部位によって、かような組織損 傷は、関節炎、多発性硬化症、喘息、気腫、潰瘍性大腸炎、および様々な自己免 疫疾患のような慢性疾患をもたらす。 多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系の障害による神経性機能不全の再発を特徴 とする慢性疾患である。　「プラーク」と称するこれら障害は、多発性硬化症固 有の特徴である軸索脱髄の状態を指す。　この障害は、ミニリンが破壊されつつ ある状況下のリンパ球、マクロファーンおよび好中球などの炎症細胞を含む。　 多発性硬化症の典型的な臨床的特徴には、視野不良、および一つ以上の下肢の虚 弱化あるいは麻痺か含まれていた。 数年後に、患者は、緩やかで、着実な神経機能の悪化を経験する。　疾患の進行 は予期できるものではなく、また、患者の７５％において悪化と軽減か認められ ている。　一部の患者が疾患が生してから最初の数年の内に死亡しているか、疾 患の平均存続期間は３０年以上である。 米国には推定で２５０．０００症例の多発性硬化症かあり、そして毎年約１０． ０００症例が新たに発生している。　その原因は定かではないか、疫学的には脳 を慢性炎症状態にする免疫的あるいは感染的因子か関与しているものと考えられ ている。　多発性硬化症は、２０〜４０歳の年齢かその６６％を占めるなと若年 層の疾患であり、患者の６０％か女性である。　米国では多発性硬化症のために 、年間１００万Å以上もの通院者を出しているものの、目下のところ多発性硬化 症の効果的な治療方法か無いのが実情である。　治療は、専ら症状の急激な発現 の抑制および症状の再発防止に関するものである。　突然の症状の再発において 、ステロイドは症状を抑制し、急速な回復をもたらす。　シクロホスファミトの ような他の免疫抑制剤による実験的な治療か試みられているものの、限られた成 功例しかない。 ヒト多発性硬化症のモデルには、実験的アレルギー脳を髄炎（ＥＡＥ）　、急性 炎症、および中枢神経系の脱髄疾患（ＣＮＳ）がある。 （１９９１））。　ＥＡＥおよびＭＳ双方に関して、免疫学的および炎症性過程 か、疾患の病原に寄与するという有力な証拠かある。 （１９８７））。　このことは、損傷箇所に口管単核細胞侵入物の存在およびＣ ＮＳ白色物でのミニリンのマクロファージ依存性食作；　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ； 　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　ＢＶ　（１９８ ５）：ｌ。 これら血液細胞か標的器官として脳を最初に認識し、次いて、脳血液関門を横切 るという機構は良く理解されていない。 炎症の外管部位への血液細胞の移行は、１）回答化学定性の認識、１１）内皮細 胞への接着、１ｉｉ）内皮細胞を横切る漏出、およびｉｖ）内皮結合性組織を通 しる移行、を含んだ複雑な一連の工程を含む。　（Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ旦ａ１． 、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１３：　８３０−８３７（１９８１））。　血管の管腔 表面に認められる内皮細胞（ＥＣ）は、血液から外管空間へ移行する間に白血球 が出くわす最初の細胞である。　白血球および内皮細胞双方によって発現される 分子は、これら二つの細胞型の間の接着相互作用を調節する上で重要である。 「白血球インテグリン」、「白芽インテグリン」、およびｒｃＤ１１／ＣＤ１８ インテグリン」と様々に呼称される白血球受容体のある科は、すべての白血球の 細胞−細胞間および細胞−タン２９１８　（１９８３）　）。　ＣＤＩＩ／’Ｃ Ｄ１８抗原の科は、独特のα鎖（ＣＤ１１ａ　、　ＣＤ１１ｂもしくはＣＤ１１ ｃ）および共通するβ鎖（ＣＤ１８）をそれぞれ含んだ三つの異種二量体から構 成される。 ［Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ 、、　１５８：　１７５８−１８０３（１９８３））。　ＣＤＩ　ｌａ／ＣＤ１ ８インテグリンはＬＦＡ−１、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンはＭａｃ−１ ；　ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８インテグリンはｐ１５０．９５と称されている。 白血球インテグリンの共通β鎖（ＣＤ１８）のイソタイプを変化させたモノクロ ーナル抗体を生成する数々のマウス・ハイブリドーマ細胞か作製されている。　 これらには、モノクローナル抗体ＩＢ４　（ＩｇＧ２ａ；　Ｗｒｉｇｈｔ　ａｔ 　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ、　８０：　５６９９−５７０３　（１９８３）］　；　モ／　りｏ−− ３−ル抗体６ｏ、３［ＩｇＧ２ａ；　Ｂｅａｔｔｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、、　１３１：　２９１３−２９１８（１９８３）　）　；モノクロ ーナル抗体ＴＳＩ／１８　（ＩｇＧｌ；前出のＳａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ） 　；モノクローナル抗体Ｈ５２〔Ｈｉｌｄｒｅｔｈ　ａｔ工、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２４４　：　１０７５−１８０３　（１９８３））　；および、ＡＴＣＣＴＩ Ｂ　２１８　（ＩｇＧ２ａ　Ｋａｌ）Ｉ）ａ；　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ旦ａ１．、　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、。 亜影・５８６−６０２　（１９８３））か含まれる。　ヒトＣＤ１８に対するキ メラ体あるいはヒト型化モノクローナル抗体の生成は、Ｌａｗ、　ａｔ酎の１９ ９２年８月７日付欧州公開特許公開Ｎｏ、　４４０３５１　Ａ２にて言及されて いる。 白血球インテグリンの共通β鎖（ＣＤ１８）に対するモノクローナル抗体は、非 活性化内皮細胞およびｉｎ　ｖｉｔｒｏでの特定の基質タンパクへのＰＭＮＣｓ の接着を完全に阻害する。　（Ｈａｒｌａｎ　ｅｔａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ、　６ ６：　１６７−１７８　（１９８５）　；　Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ。 Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　８１：　５３１−５３７　（１９８８）　；　 Ｂｏｈｎｓａｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。 Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１７１：　１２２１−１２３７　（１９９０）　；　Ｌ ｕ５ｃｉｎｓｋａｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２：　２２５７−２２６３　（１９８９））。　さらに 、抗ＣＤＩＩ／ＣＤ１８抗体の全身投与は、ＰＭＮＣｓの組織蓄積を阻害する。 ＣＳｐｒｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　星４２５−４３４　（ １９９０）　；　Ｊｕｔｉｌａ旦ａｔ、、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、 　４８：　７２７−７３１　（１９８９）　；　Ａｒｆｏｒｓ、　ａｔ関する抗 ＣＤ１８抗体、モノクローナル抗体６０．３の効果を研究しており、ＰＭＮ蓄積 およびＰＭＮ依存依存性プラス用漏出双方化学走性因子ｆＭＬＰ、白血球トリエ ン（ＬＴＢ４）およびＣ５ａての経皮注射に先駆けて、モノクローナル抗体６０ ．３で処置したウサギの皮膚の炎症部位にて完全に消失した。　これら化学走性 薬剤により、アルブミン管外遊出か顕著に増加し、プラズマ漏出による化学走性 薬剤注入部位でのＰＭＮ　ｓの管外遊出が続く。　奇妙なことに、ヒスタミン誘 導したＰＭＮ依存性プラズマ漏出は、モノクローナル抗体６０．３による前処置 によっては影響を受けなかった。 ｔ（ｅｒｎａｎｄｅｚ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｍ、　、１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 、　２５３：　Ｈ６９９（１９８７）では、ネコをいずれかの生理食塩水、抗好 中球血清（ＡＮＳ）　、もしくはモノクローナル抗体６０．３で処置することで 、虚血／再潅流（＋／Ｒ）によって生成した微小血管の透過性の増加をＰＭＮｓ か媒介するかとうかを調査している。　その結果は、ＰＭＮ消耗およびＰＭＮ接 着の予防の双方か、Ｉ／Ｈによって誘導された微小血管の透過性の増加を軽減し 、モノクローナル抗体６０．３による好中球接着の予防が、１．／Ｒ誘導された 微小血管損傷に対する防御することを示していた。　米国特許Ｎｏ、　４，７９ ７．２７７も参照のこと。 同様に、Ｖｅｄｄｅｒ、旦ａ１．．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　８１ ：９３９　（１９８８）は、増大した白血球接着性か、一般的な虚血／再潅流後 の複数の器官損傷および死傷の改善において重要な役割を果たし、そして、この 損傷かモノクローナル抗体６０．３による白血球接着作用を妨げることでかなり 低減される、と結論付けている。　しかしなから、彼らが示した結果は、ＣＤ１ ８がすべての白血球に存在するように、他の白血球もしくは他の白血球接着作用 も含むとする可能性を除外していない。 前出のＤｏｅｒｓｃｈｕｋ、　ｅｔ　ａｌ、、は、ウサギの肺もしくは腹膜部位 での炎症への好中球（ＰＭＮ）の移動に関するモノクローナル抗体６０．３の異 なる効果を報告している。　ウサギの腹部側の炎症か誘導され、次いで、５ｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、エンドトキシン（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ　）　、塩酸、もしくはホルボールミリスチン酢酸（ＰＭＡ）のいずれか一つ を含むポリビニル製スポンジの移植を行塩酸、Ｅ、　ｃｏｌｉエンドトキシン、 もしくはＰＭＡのいずれかを気管支に滴下することで誘導した。　ウサギは、炎 症が生しる２０分前にモノクローナル抗体６０．３あるいは生理食塩水の静脈注 射により前処置された。　その結果は、モノクローナル抗体６０．３が、５ｔｒ ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、塩酸、Ｅ、　ｃｏｌｉエンドト キシンもしくはＰＭＡに対する腹部および肺腔双方へのＰＭＮ移動を阻害したこ とを実証した。　しかしながら、同じ動物において、モノクローナル抗体６０． ３は、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅあるいは塩酸に対し て、肺胞空間、内蔵胸膜、あるいは気管支上皮へのＰＭＮ移動をしなかった。　 これに対して、モノクローナル抗体６０．３は、Ｅ、　ｃｏｌｉエンドトキシン に対する肺胞空間へのＰＭＮ移動を著しく阻害し、また、ＰＭＡに対する肺への 移動を消失した。　この結果は、肺および全身の内皮細胞の、同一刺激薬剤ある いはＰＭＮあるいは内皮細胞に影響を及ぼす二次的な媒体の部位特異的生成に対 する相違に基つく、ＰＭＮ接着機構における未同定の器官特異性および刺激特異 性がまだあることを実証している。 抗日血球インテグリン抗体調製物による潅流療法を開示した米国特許Ｎｏ、　４ ，７９７，２７７に加えて、かような抗体の治療的使用のための数多くの一般的 な提唱がなされてきた。　１９９２年３月１９日に発行されたＰＣＴ　Ｗｏ　９ ２１０４０３４は、エンドトキシン・ショックの治療における抗ＣＤ１８抗体の 使用を包括的に提案している。 １９９２年３月５日に発行されたＰＣＴ　Ｗｏ　９２１０３４７３は、「疾患」 の治療におけるＣＤ１８ペプチド断片とそれに対する抗体の使用を提唱している 。　前出の欧州特許出願Ｎｏ、　４４０４５１は、ウサギの皮膚炎症の治療にお ける組換ヒト型化抗ＣＤＬ８抗体の有用性を示しているが、「肺、中枢神経系、 腎臓、関節、心内膜、６膜、目、耳、皮膚、胃腸管および尿生殖路」での炎症の 治療の有用性を予測している。　「組換ヒト抗ＣＤ１８抗体に応答性のある」多 くの疾患状態の一つとして多発性硬化症が提唱されているか、慢性炎症疾患状態 に関するかような抗体の効果の研究は、公開された欧州特許出願には報告されて いない。 特に多発性硬化症に関して、Ｒａ１ｎｅ旦ａｔ、、　Ｌａｂユ側二旦」虹旦丑、 競遍：４７６−４８９　（ｉ９９０）は、様々な接着分子か、疾患状態にて存在 する白血球回帰および細胞誘発プロセスに含まれる旨を記している。　Ｒａ１ｎ ｅ　ｅｔ　ａｌ、は、必要とされたリガンドの対〔例えば、ＬＦＡ−１／ＩＣＡ Ｍ−１、ＣＤ−２／ＬＦＡ−３、ＣＤ４／クラスＩＩＭＭＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）］ の崩壊が、白血球交換、エフェクター細胞活性化、あるいはエフェクター細胞機 能における変化に結びつく旨をさらに記している。　しかしながら、同じ研究者 グループが後に、抗ＩＣＡＭ−１抗体で処置したＥＡＥマウスの治療ではある程 度の炎症の軽減が認められたものの、抗ＬＦＡ−１抗体での処置によれば高用量 で致命的となり、低用量ではＣＮＳ変化に関する効果は認められなかった、と報 告している。Ｃａｎｎｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。 Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、　ＥＸｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、、　５１：３８２　（１ ９９２年５月）を参照。 また、抗ＩＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ−１抗体の低用量がＥＡＥマウスの疾患を より重篤なものにする結果になったのに対し、高用量では疾患の発症が遅くなり 、双方の抗体調製物を用いた治療のみが臨床上の抑制効果か観察されたことを報 告している、Ｒａｃｋｅ。 旦ａ１．．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ、　１７Ａ：３５５　（１９９３）；および、抗ＬＦＡ−１抗体処置か、選 定的に移行したＥＡＥにおける疾患症状の重さを増大させたことを報告したＷｅ ｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。 Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　４３：１６１−１６８　（１９９３）も参 照のこと。 このように、当該技術分野では、多発性硬化症に関連した炎症の処置のための治 療用物質ならびに養生法に対する要望か依然として存在しているのである。 発明の要旨 本発明は、抗ＣＤ１８および／もしくは抗ＬＦＡ−１抗体基質の治療的有効量の 投与を含む、多発性硬化症に関連した炎症プロセスの処置および症状の緩和のた めの新規で効果的な方法を提供する。　換言すれば、本発明は、多発性硬化症疾 患状態に関連した症状の緩和のための医薬品の製造のための、抗ＣＤ１８および ／もしくは抗ＬＦＡ−１抗体の使用に関する。 本発明の実用に際して有用な抗体基質には、ヒト白血球インテグリンの共通β鎖 （ＣＤ１８）によって与えられる一つ以上のエピトープと免疫学的に特異的な反 応性を有する、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、抗体断片、一本鎖抗 体、キメラおよび／または（ヒト型化を含む）　ＣＤＲ−接合抗体などが含まれ る。 抗体は、［ｇＧ、ＩｇＡ、［ｇＤ、ＩｇＥおよび／またはＩｇＭを含む、いかな るクラスあるいはサブクラスであってもよい。　本発明の実用のための好ましい 抗体に、ＩｇＧ２ａイソタイプのマウスモノクローナル抗体ｍＡ８６０．３があ る。 本発明によって、２３Ｆ２Ｇ　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ　１１０８１）　、２３ １１１Ｂ、および２２Ｆ１２Ｃと称するハイブリドーマ細胞系か産生じたモノク ローナル抗ヒトｃＤ１８抗体も提供される。　これら抗体とノ１イブ１ノドーマ ２２Ｂ３Ｂおよび２２Ｊ４Ａか産生じた抗体は、Ｈｕｊ７８細胞のヒトＬＦＡ− １へのモノクローナル抗体６０，３の結合の拮抗阻害として特徴付けられる。　 Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ　１１０８１によって産生されｔこ２３Ｆ２Ｇ抗体は、対 応して「ヒト型化され」、そしてマウス２３Ｆ２Ｇ抗体のヒト型化体を発現する 形質転換した哺乳類細胞力＜、Ａ、Ｔ。 Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ　１１３９７およびＣＲＬ　１１３９８の受託番号番ごて寄託さ れて０る。 本発明の他の態様ならびに利点は、本発明の態様の詳細な説明に関する記載を考 慮し、図面を参照すれば明ら力＼となるであろう。 図ＩＡ、　ＩＢ、　ＩｃおよびＩＤ、および図２Ａ、　２Ｂ、　２Ｃ，２Ｄ、　 ２Ｅ、　２Ｆおよび２Ｇは、実験的アレルギー脳を髄炎（ＥＡＥ）モデルでの本 発明の実用の結果を磁気共鳴画像で示しており。 図３Ａおよび３Ｂ、および図４Ａ、　４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄｉま、ＥＡＥモデル での本発明の実用の結果を組織学的に示しており、および図５および６は、本発 明の抗体のヒト型化ＨおよびＬ鎖それぞれをコードする発現ヘクターの概略を示 してし入る。 詳細な説明 下記の詳細な説明は、マカークサルでの実験的アレルギー脳を髄炎（ＥＡＥ）の 進行を緩和するための、マウスモノクローナル抗ＣＤ１８抗体ｍＡＢ　６０．３ 、マウスモノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇ　、およびヒト型化抗体２３Ｆ２Ｇの使 用を通して、本発明を説明してし）る。 多くの免疫学的および神経生理学的に類似するＥＡＥ力＜ＭＳと共存しており〔 前出のＲｏｓｅ　ｅｔ　ａｌユ、〕、また、モノクローナル抗体６０．３によっ て認識されるＣＤ１８抗原か、サル抹消血液白血球にて高密度で存在している！ ：　Ｒｏｓｅ旦ａ１．、　Ｃｌ１ｎ、＋ｍｍｕｎｏｌ。 Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、、　四９３−１０６　（１９８７）　）ので、症状 か進んだＥＡＥ　。 中枢神経系の急性炎症疾患、およびヒト疾患ＭＳのモデルか誘発されたヒト以外 の霊長類が選抜された。 実施例Ｉは、サルにおけるＥＡＥの誘発に関する。　実施例２には、モノクロー ナル抗体６０．３抗体融合による処置か記され、また、実施例３は、死後に得た 凍結組織画分の免疫細胞化学的染色を含んだ、臨床評価、血液分析、および磁気 共鳴画像の組み合わせにより監視された疾患進行の評価に関する。　実施例４に は、抗ヒトＣＤ１８抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系の調製を記しており、 実施例５は、ハイブリドーマ２３Ｆ２Ｇからのモノクローナル抗体のＥＡＥ治療 における使用に関する。　実施例６には抗体２３Ｆ２Ｇのヒト型化を、また、実 施例７には抗体２３Ｆ２Ｇおよびヒト型化２３Ｆ２ＧによるＥＡＥマカークザル の追加処置を記した。 ２〜３ｋｇの１８匹の雄のＭａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓザルをＳ５ ．０ｍｇのサル塩基性タンパク質（ＢＰ）および０．５ｍｇの熱処理したＭ、　 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含んた０、１ｍｌのエマルジョンの経皮注射によっ てミ主すン塩基性タンパク質感受性とした。　各動物は、シアトルのワシントン 大学地域霊長類研究センターから入手して飼育した。　霊長類センターは、実験 動物の飼育と使用の健康指針の国立機関である。　ＢＰ感受性にてから１０日後 、各動物は、大腿部にカテーテルか装着され、採血のために縛り、そして磁気共 鳴画像（ＭＲｌ　）の処置あるいは麻酔を施した。　動物には、静脈中での血液 凝固を避けるために、静脈にヘパリン（１８単位／時間）を送給し続けた。 動物をＢＰ＠受性にする以前に、任意に特異的処置グループとした。　これは、 ＭＨＩの予定を立て、そして、臨床評価の厳正さに、選択療法の影響か及ぶこと を予防するために行われた。 動物を処置あるいは層殺する際の決定の責任を負う霊長類センターの人事は、各 動物の処置経過について全く知らされていなかった。　下記表１は、動物のＥＡ Ｅの臨床評価と等級の決定のための評価基準を述べたものである。 評価　症状 Ｄ　死亡 開始時の臨床評価（士から＋）にて、６匹のＥＡＥ動物にモノクローナル抗体６ ０．３　（２ｍｇ／ｋｇ）とデキサメタシン（４ｍｇ／ｋｇ）の丸薬注射を行っ た。　デキサメタシンは、即座に処置しなければ４８時間以内に急速に致命的と なる、急性ＥＡＥの発生を抑制するために投与された。　急性ＥＡＥは、ＥＡＥ が誘発された動物の約２５％に発生し、脳幹あるいは大脳皮質を含むあるいはそ こに影響を与える領域にて浮腫によって引き起こされる。　丸薬の注射に続いて 、これら６匹の動物は、７日間にわたってモノクローナル抗体６０．３　（２ｍ ｇ／ｋｇ／日）の継続的注入により処置した。 ７日間の処置期間において、４　ｍｇ／ｋｇで始めたデキサメタシンの用量は、 １ｍｇだけで３日間効果か得られるまで２日毎に半分ずつに減らした。　６匹の 対照ＥＡＥ動物は、上記に概要を示したのと同じ手順で、デキサメタシンだけで 処置され、そして、６匹の別の対照動物は、生理食塩水の継続的注入で処置した 。 治療の結果、改善および／または安定した動物は、臨床兆候が見られてから６週 間後に層殺された。　治療の中止後６週間が経過する以前に、幾度か症状の再発 （臨床評価≧＋＋）を経験した動物は、症状の再発後間もなく層殺した。　治療 効果か見られず、症状か悪化している（臨床評価≧＋十）動物は、治療プログラ ムの終了を待たずして層殺した。　各処置グループでの生存時間の相違の統計上 の重要性は、両側検定分析により決定した。 疾患の進行は、臨床評価、血液分析、および磁気共鳴画像の組み合わせによって 監視した。　臨床評価は日に２回行った。 下記表２に示したように、ミニリン塩基性タンパク質感受性になってから１３〜 ２６日後に、本研究でのすべての動物にＥＡＥの臨床評価か認められた。 表２において、動物に付した太字番号はＭＨＩにより走査した動物を示していり 、開始／等級の欄は、感受性化後の日数および開始時の臨床評価（表１参照）を 示しており、生存／等級の欄は、開始後の生存日数および屠殺時の臨床評価を示 している。 表２に示したように、１８匹すべての動物において、疾患の発症時に士から＋の 範囲のＥＡＥの臨床評価か認められた。　１８匹のＥＡＥ動物の内の６匹（３３ ％）か、試験開始後１〜５日後に急性ＥＡＥのために死亡した。　６匹の内４匹 か生理食塩水で、１匹かデキサメタシンで、他の１匹かモノクローナル抗体６０ ．３とデキサメタシンの組み合わせで処置されていた。　残りの１２匹は、開始 後に、臨床状態の悪化、あるいは６週間の処置プロトコールの完了のいずれかの 理由により、様々な時点で層殺された。 ６匹のモノクローナル抗体処置した動物の内、５匹は引き続き改善もしくは安定 化したものの、臨床評価は悪くならなかった。　８９０７１の動物は改善したか 、処置中止後２週間が経過した時点で急性再発を起こし、２１日目間層殺した。 　８９０７４の動物は、ヒト以外の霊長類での脱髄の研究のために開発された技 た異常な脂質シグナルを調査するために、処置中止後１週間の１３日回心層殺し た。　この動物は、治療の結果、症状の改善が見られ、屠殺時には臨床的に安定 していた。　８９０７５．８９０８０および８９０６９の動物はすべて、開始後 ６週間経過しても臨床的に安定していた。　モノクローナル抗体６０．３で処置 した動物の平均生存時間は、３０日であった。　生理食塩水で処置された対照動 物（８７２２０の動物を除く）は、開始後１〜５日生存し、平均生存時間は３日 であった。　デキサメタシンで処置した動物は、開始後１〜１７日生存し、平均 生存時間は７日であり、６匹の内３匹はその疾患のために開始後１〜２日で死亡 し、６匹の内３匹は、臨床評価が悪化して（≧＋＋）層殺されるまで、それぞれ 、９．１３および１７日間生存した。 磁気共鳴画像 モノクローナル抗体処置したＥＡＥ動物６匹すべて、デキサメタシン処置した２ 匹の動物、および生理食塩水処置した２匹の動物における病変の解剖学的分布を 調査するためにＭＨＩを用いた。　従来のスピン−ワープ画像を、Ｒｏｓｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｍｅｄ。 ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、、　４３：３４７−３５３　（１９８９） に記載されているようにして、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｃ３Ｉ−１ １ＮＭＲイメージ／分光計（２テスラの磁石）を用いて行った。　臨床評価前に 週一度、そして臨床評価後の週二度に、画像を得た。　動物をケタミンで麻酔し 、脳の中心か磁石の等中心となるように置いた。　正常および異常な脳領域を見 つけるために、コロナルＴ２荷重画像（ＴＥ＝８０ｍｓｅｃＳＴＲ＝３０００ｍ ｓｅｃ）を用いた。　臨床評価時あるいはそれ以前に、走査した動物の６０％に 病変か検出された。　病変部は、Ｔ２荷重ＭＲ画像の明るさか増した（白い）部 分として表れた。 走査した４匹の対照動物の内、１匹だけか処置走査を受けるに十分なだけ生存し た。　このデキサメタシン処置した動物（８７０６９）の、臨床評価の一日前に 検出された脳幹病変は、図１に示すように、動物が９日後に屠殺されるまで、そ の大きさならびに強度が進行していた。　プレートＡは、感受性化後２１日の「 正常な」脳の走査を示し、プレートＢは、臨床評価開始後二日目、すなわち、感 受性化後２８日目での脳幹病変の検出を示し、プレートＣおよびＤは、感受性化 後３５および３８日目それぞれに、脳幹病変の進行か徐々に進行していることを 示している。 モノクローナル抗体６０．３での処置に続き、ＭＲＩは６匹の内、５匹の動物に おいて大きさおよび強度共に減少した病変を検出した。　３匹の動物（８９０７ ５，８９０７１および８９０７４）は、臨床評価開始時に、脳幹病変の形跡を有 していた。　かような病変は処置せずにいるとしばしば致命的になるか［：　Ｓ ｈａｗ　ｅｊ工幻工。 Ａｎｎ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　２４ニア３８−７４８　（１９８８））　、これら 病変はモノクローナル抗体６０．３での処置により３匹すべてにおいて消失した 。 図２は、８９０７１の動物の脳幹病変の進行を実証するものである。 この図において、プレートＡは、感受性化後１５日目の正常な脳の走査を示し、 プレートＢは、臨床評価開始時、すなわち、感受性化後１８日目の脳幹病変を示 し、プレートＣからＦは、感受性化後２２．２５．２９および３２日目に確認し た抗体治療を経た脳幹病変の緩やかな消失を示しており、プレートＧは、感受性 化後３９日目で、処置を中止してから１４日目の臨床再発による、同じ領域での 病変の再出現を示している。　拡大した病変部は、走査画像の明るさの増した（ 白い）際立った部分として表れている。　上記したように、２週間後に治療は停 止され、８９０７１の動物は病変の再発を引起し、ＭＲ面画像脳幹ての大きさ、 強度共に増大した病変を証明していた。　再発した病変は治療されず、動物は屠 殺された。 ８９０８０の動物は、外側膝状関節核および関節溝に大きな出血性病変を有して いた。　出血性病変は、通常致命的であり、また処置しても効果が見られない（ 前出のＳｈａｗ　ｅｔ　ａｌ、、）が、この病変は、モノクローナル抗体６０． ３での処置によりほとんど完全に消失した。　８９０６９の動物は、ＭＲＩで決 定したような、いずれの動物よりも軽い、数個の小さいが強度の大きい、後続の 処置で消失する皮質の白い病変疾患を有していた。 最も長く生存した二つの動物（８９０８０および８９０６９）は、処置停止後の ２５および２２日目にそれぞれ、新たな、小さな、ＭＲＩ検出可能な病変の出現 によって特徴付けられる慢性疾患を有していた。　これら二次的病変は、−次的 病変と同じようには機能せず、処置されなかった緩やかな臨床評価を伴っていた 。８９０７４の動物は、ＭＲ３で検出された異常な脂質シグナルを調査するため に、疾患の開始後１３日目に屠殺された。　処置停止後６日目の屠殺時に、当初 の病変はなくなっていたが、脳の反対側に新規の小さな臨床病変か現れていた。 　８９０７５の動物は、処置停止後に、新たな病変は検出されなかった。 細胞質侵入物を分析するために、小脳および大脳のクリオスタト画分を、ヘマト キシンおよびエオシン、そしてヒト白血球膜抗原に対するモノクローナル抗体を 用いたイムノペルオキシダーゼ法で染色した。　すべての白血球に共通するＣＤ １８決定基を認識するモノクローナル抗体６０．３による免疫細胞化学的染色は 、ＥＡＥ病変での白血球の存在を確認するために用いられてきた。　８９０７０ の動物の脳から得、モノクローナル抗体６０．３で染色された組織画分を図３に 示した。　パネルＡは、３９０倍拡大で、ウサギ抗マウスＩｇＧで染色されてお り、マウスＩｇＧ被覆した細胞は、血管の管腔に見られるものの、脳組織には認 められていない、そして、パネルＢは、３９０倍拡大で、モノクローナル抗体６ ０．３で染色されており、ＰＭＢＣｓの大量侵入か滲出物中に見られ、近接する 白色物にまで及んでいる。 ８９０７０の動物は、処置完了前に死亡したモノクローナル抗体のみで処置した 動物である。　この動物から採取した脳組織は、処置したモノクローナル抗体か 動物か死亡する以前にＣＮＳに移行したか否かを決定するために、ヤギ抗マウス ＩｇＧ抗体で染色した。　モノクローナル抗体６０．３は、白血球および脳の小 膠細胞双方と反応した。　もしこのモノクローナル抗体が、処置期間中に血液− 脳一障壁を透過するのであれば、図３に示したのと同様のパターンかパネルＢに おいても得られるであろう。 あるいは、処置したモノクローナル抗体かＣＮＳに移行し、血液白血球のみと結 合するのであれば、小膠細胞は染色されないであろう。　むしろ、マウス１ｇ被 覆した細胞は血管の管腔でしか検出されず、層管空間では全く検出されなかった 。　ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色した病変部にて染色された白血球が存在しな いことは、死亡した動物の治療か開始される前に炎症条件か存在しており、そし て処置した抗体の投与が効果を得るには遅すぎたことを示唆するものである。 白血球数に関する治療の効果 未処置ＥＡＥの血液学的特徴は、臨床評価開始に先駆ける進行性の白血球増加と リンパ球減少である。　白血球増加は、循環ＰＭＮＣの数の４倍程度の増加、そ して、単核白血球、エオシン好性白血球、もしくは好塩基球の頻度もしくは絶対 数における顕著な変化か認められないことで示される。　ＥＡＥの処置を首尾よ く終えた後に、リンパ球とＰＭＮＣの絶対数か、処置開始直後に、前感受性化し ヘルにまで回復した。　このように、血液白血球の継続的な監視は、臨床評価と 磁気共鳴画像と符合して疾患の進行の有用な測定手段を提供するものである。 臨床疾患の開始まで週単位で血液を採取し、そして採取頻度を上げた。　０．５ ｍｌをＷＢＣおよび異なる計測のために血液学研究室に送った。　その結果を、 全血ｍｍ３当たりの日車細胞数（ｘ　１０３）で示した下記表３に示した。　ｒ ＮＡ」は、データが入手できなかったことを示す。　破線は、その時点で動物が 屠殺されたことを示す。 動物：　８９０７０８９０７５８９０８０８９０６９８９０７１８９０７４対照 ＥＡＥ動物のＷＢＣ分析 デキサメタシン対照 動物＋　８７１４３８７１２５８７２０９８９０７７８７２００８７０６９生理 食塩水対照 動物：　８４２２８８４２１８８４２１９８６１４０８６１８７８６２０９モノ クローナル抗体６０．３およびデキサメタシンで処置しｔ二動物において、表３ に示したようにデキサメタシンのみで処置した動物と比較して遅れた白血球の消 散か観察されｔこ。　９日間もしくはそれ以上生存したデキサメタシン処置した ２匹の動物にて、処置の開始後２日目にして、前感受性化しヘルにまで白血球細 胞数が減少した。　モノクローナル抗体６０．３処置した動物にて、治療期間全 体にわたって続いた、顕著な白血球増加（前感受性化値の４〜１２倍以上）か認 められた。　これら動物にて、治療期間か終了してから３〜７日後に、前感受性 イヒレベルにまでＷＢＣが回復した。　１ル／ぐ球減少と白血球増加の過渡的再 発か、生存動物にて引き続き観察され、そして、ある症伊１では臨床再発の再現 と相関していた。 処置用モノクローナル抗体と血液白血球との反応を、抗マウス・カッパ鎮モノク ローナル抗体（Ｂａｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンホセ、カリフォルニア 州〕で細胞を染色することで確認した。 血球数分析を、ＦＡＣ３ＣＡＮ分析器［Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サ ン　ホセ、カリフォルニア州〕で行った。　前方および右隅の放出口には、染色 パターンの分析のためのリン、＜球あるいは大きな多形核顆粒球を置いた。　１ ９８球減少に関する結果を下記表４に示した。 表　４ マウス１ｇ被覆した細胞（％） 動物：　８９０７０８９０７５８９０８０８９０６９８９０７１８９０７４動物 に与えたモノクローナル抗体の用量は、すべての実施例において、循環０血細胞 の９５％を超える部分を覆０、また、下記表５に示したように、循環している遊 離抗体の検出レベルを維持するために十分なものであった。　表に示したデータ （ま、全血ｍｍ３当たりの循環マウスＩｇＧのｍｇで示している。 表　５ 循環マウスＩｇＧ 動物：　８９０７０８９０７５８９０８０８９０６９８９０７１８９０７４７日 目以降、注射したモノクローナル抗体は、循環系にてもはや検出されなかった。 　マウスＩｇＧの消失と、各動物の循環系での抗マウスＩｇＧ抗体の出現とは一 致している。 神経病理学 ＥＡＥの原因を確認するために、ＢＰ感受性とした動物の脳とを髄を、その死後 の検査した。　動物をネンブタールの過剰量で安楽死させ、脳とを髄を除去腰そ して、１０％中性ホルマリンにその大きな画分が固定される前に新鮮な凍結試料 か得られるように切開した。　組織の標本部分をパラフィンに埋設し、画分をヘ マトキシリンおよびニオシン、ガロシアンーダロウレツド、過沃素酸スキフ（Ｐ ＡＳ）およびヘマトキシリンと併用したルクソファストブル−（ＬＦＢ）　、そ して壊死からの脱髄を区別するために、ホルムの軸索染色のみあるいはＬＦＢと の併用による染色した。　鏡像ブロックの凍結画分を、脂質で満ちたマクロファ ージを同定するために、オイルレットオー（ＯＲＯ）　（Ｋｉｌ。 ５ｔａｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　４７：２７１　（１９７２）　〕で染色 した。 ＥＡＥに関して、１８匹のＥＡＥ動物すべてをその死後に、病理学的に評価した 。　すべての動物か、一般に、疾患の重さと期間に相関する軽度から強度の急性 ＥＡＥあるいは超急性ＥＡＥのいずれかの顕微鏡観察による特徴が得られた。　 １２匹の対照動物の内の２匹を除いたすべてか、出血、全体的な壊死、脱髄、お よび好中球のＣＮＳ組織への広範囲に及ぶ侵入によって特徴付けられる支配的な 超急性病変、あるいは、非常に緻密で、超急性病変よりも側管病変空間に限定さ れ、そして、リンパ球とマクロファージとわずかの好中球から大半か構成されて おり、豊富な脱髄ならびにいくらかの軸索断片を伴った急性層管病変のいずれか か見られた。　１３〜１７日間のＥＡＥの二つの例外的な対照のサルは、リンパ 球とマクロファージとわずかの好中球から大半か構成されており、豊富な脱髄な らびに微量あるいは皆無の軸索断片を伴った、適度から強度の脱髄病変の範囲に 属する病変の混合物を有していた。　モノクローナル抗体処置したサルの１匹を 除くすべてか、（ａ）豊富なミニリン断片、シュダノフイリック脂質、および微 量あるいは皆無の軸索反応物、あるいはリンパ球侵入物を有する、脱髄が非常に 進んだ古いプラーク。 および（ｂ）緻密で、側管病変空間に限定され、リンパ球、単球、あるいは好中 球（適度から強度の急性ＥＡＲの原因である）およびいくらかのミニリン断片か らなる構成割合を変化している、末端未処置部分の再発に対応する最近発生した 病変；との組み合わせを有していた。　同じ動物（Ｎｏ、　８９０６９）に見ら れた、これら二つのタイプの病変を図４に示した。 図４にて、パネルＡは、２倍拡大で、無数の炎症（領域１）および／または脱髄 （領域２）病変が、白色として確認でき、パネルＢは、３２５倍拡大で、パネル Ａの領域２が、ＰＡＳ陽性グリコ−リポタンパク質を構成する小さな黒い顆粒と 共に、組織および血管中に散乱したマクロファージからその大半が構成されてい ることか、そして、パネルＣおよびＤは、それぞれ１３０倍ならびに３２５倍拡 大で、パネルＡの領域ｌが、ＰＭＮＣｓでその大半か構成されており、ＰＡＳ陽 性陽性不溶性グリコタンパ解質まれていないことを示している。 結果の概要 臨床評価、血液細胞の揺らぎ、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）の組み合わせによる疾患 の進行の監視について以下に記した。　抗体処置した動物は、デキサメタシンあ るいは生理食塩水処置した動物よりも有為に（それぞれ、ｐ　＜０．０２；　ｐ 　＜０．００１）長く生存した。　治療の効果を、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）によ ってさらに確認した。　未処置動物での脳幹病変は致命的であったことから、三 つの異なる動物の脳幹での大きな病変の大半の消失は先例の無いことであった。 　モノクローナル抗体６０．３の投与に続くＭＲＩ検出可能な病変の消失は、脳 病変での浮腫を生成する炎症反応における効果を実証するものである。　モノク ローナル抗水の特徴の変化か、ＭＨＩ走査での画像強度の変化として視覚化され るのでおそら（、ＭＨＩ検出可能な病変の改善における最も重要な因子であろう 。 各サルかミニリンＢＰによる感受性に対して異なる反応をするので、ＥＡＥ開始 時における臨床評価の強度は一定していない。 にもかかわらず、ＥＡＥ開始時における臨床評価の強度と処置に対する動物の反 応能力との間には相関かなかった。　６匹のモノクローナル抗体処置した動物の 内、４匹の開始時の臨床評価は十で、２匹は士であった。　１２匹の対照動物（ ６匹のデキサメタシン処置した動物および６匹の生理食塩水処置した動物）の内 、８匹は十で、４匹は士であり、モノクローナル抗体処置した動物と同し分布で あった。　開始時の臨床評価の強度と、全身麻酔下でのＭＲＩ検査のストレスの 多い方法との間に相関はなかった。　ＭＲＩで走査した１０匹の動物の内、６匹 の開始時の臨床評価は十で、４匹４ｉ士であった。　免疫反応の一般化した抑制 の結果を得るために、動物の走査ならびに麻酔の頻繁な投Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｔ ｍｍｕｎｏｌ、、　４７：４５７−４６６　（１９８２））。　しかしながら、 その結果は、この仮説を支持するものではない。 デキサメタシン処置した動物は、生理食塩水処置した対照（３日間）よりも長い 平均生存時間（７日間）であったが、その相違は満足のゆくほど顕著なものでは なかった（ｐ＜０．１）。 そして、デキサメタシンは疾患プロセスを緩やかなものにしたか、疾患の最終結 果に関してはほとんど効果かなかった。　これに対して、モノクローナル抗体６ ０．３と併用することで、生存期間が延長され、ある症例ではＥＡＥの臨床およ びＭＲＩ結果に逆転した効果が得られた。 実施例４ ６〜１２週齢のＢａ１ｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｉｃａｌＳｅｒｖｉｃｅｓ、Ｉｎｃ、、ウィルミントン、マサチューセッツ 、ＩＡＣＵＣＮｏ、　９０１１０３）を、抗ＣＤ１８抗体を生成するために、ヒ トＴ細胞系Ｈｕｔ　７８で免疫処置した。　二つのハイブリドーマが生成した（ 融合体２２および２３と称する）融合体の各々のために、二つのＢａ１ｂ／ｃマ ウスを、０回目での前免疫血清の回収のために、従来の手段で採血した。　２８ 目に、各動物に、滅菌した０、２ｍｌ　ＰＢＳ中の合計５　Ｘ　１０’　Ｈｕｔ 　７８細胞を静脈中に投与した。　そして、マウスは２週間間隔で６週間、そし て、１ケ月間隔で３ケ月間にわたって免疫処置した。　最後の１ケ月単位の投与 は、グルタルアルデヒド固定したＨｕｔ　７８細胞で行った。　固定液の最終濃 度か０．０５％と等しくなるように、細胞（２Ｘ１０”）とグルタルアルデヒド （０，１％）の等量を混合することで細胞を固定した。 混合物を３０秒間渦巻き攪拌しなからインキュベートし、反応を停止するために 、等量の（ＰＢＳ中の）０．２Ｍグリシンを添加した。 反応混合物を、（ＰＢＳ中の）０．２Ｍグリシンで一度、そして、ＰＢＳで二度 洗浄した。　０．２ｍＩ　ＰＢＳ当たり５ｘｌＯ６細胞の濃度にて、ＰＢＳで細 胞を再懸濁した。　免疫血清のイムノグロブリン（Ｈｕｔ７８細胞）との反応性 を決定するために、免疫血清を従来の手段で採血して回収し、５６日目間Ｆ　Ａ 　ＣＳで試験した。　予定していた融合日の３日前に、最終濃度５Ｘ１０６のグ ルタルアルデヒド固定した細胞を静脈注射することで、動物を免疫処置した。 各融合のために、免疫原に対して最も高い免疫血清価を示したマウスから、無菌 的に膵臓を取り出した。　２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭナトリウムピルベート 、　１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン （ＲＰＭｆ）（Ｇｉｂｃｏ　、カナダ）を補充した血清を含まないＲＰＭＩ　１ ６４０に浸した二枚の顕微鏡用スライドの凍結した端部の間て膵臓細胞を粉砕す ることで、単細胞懸濁液を形成した。　細胞懸濁液を、滅菌した７０メツシュＮ １ｔｅｘ細胞濾過器（Ｂｅｃｋｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、パージｌ々ニー、ニ ューシャーシー州）で濾過し、２００ｇで５分間、２回遠心分離して洗浄し、そ して、ペレットを２０ｍ　ｌの血清を含まないＲＰＭＩζこ再懸濁した。　３匹 の新規Ｂａ１ｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞も、同様の方法で調製した。 融合前の３日間、１１％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）　（Ｈｙｃｌｏｎｅしａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、ロガン、ユタ州）を含むＲＰＭＩでの対数増殖期に 保たれたＮ５−１骨髄腫細胞を、２００　ｇで５分間遠心分離し、そして、前述 の段落で述べたようにして２回洗浄を行った。 洗浄後、各細胞懸濁液を血清を含まないＲＰＭＩにて最終体積か１０ｍ１となる ようにし、その１０μｍを１：１００に希釈した。　各希釈液の２０μＩを除去 し、０．８５％生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）中の２０μｍの０４％４％トリバンブ ルー液を混合し、血球計算器（ＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃｏｒｐ、 、　ディアフィールド、イリノイ州）に適用し、そいで計測した。 各融合体について、２ＸＩＯ８牌臓細胞を４　ｘ　１０’　Ｎ５−１細胞と組み 合わせ、遠心分離し、上清を吸引した。　細胞ペレットを試験管を叩くことで取 り出し、２ｍｌの３７℃ＰＥＧ　１５００　（７５ｍＭＨｅｐｅｓの５０％、ｐ Ｈ８，０）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、振りながら１分間 にわたって添加し、そして、血清を含まないＲＰＭＩの１４ｍ１を７分間にわた って添加した。　さらに］、６６ｍのＲＰＭＩを添加し、細胞を２００ｇで１０ 分間遠心分離した。　上清を廃棄した後、１５％ＦＢＳ、　１００ｍＭナトリウ ムヒボキサンチン、０４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）　（ Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌ　ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ）　、および１．５ｘ　１０６／ｍｌの胸腺細胞を含む２００ｍ　ｌのＲ ＰＭＩにペレットを再懸濁した。　懸濁液を、１０枚の９６ウ工ル平板組織培養 板（Ｃｏｒ旧ｎｇ　、英国）へ、２００μｌ／ウエルで置いた。　平板中の細胞 に、融合後２．４および６８目に、１０単位／ｍｌ　ＩＬ−６を含み、胸腺細胞 を含んでいない以外は前述の培地と同しである培地の約１００μｍ／ウェルを吸 引して補給した。 ロウにプールし、そして、Ｈｕｔ　７８細胞に結合するためのＦＩＴＣ−６０， ３接合体（Ｇｏｄｉｎｇの’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　 Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、”　２ｄ　Ｅｄ、、　ｐ、２ ４１−２８０．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８６に従 って調製した）と拮抗できる抗体の存在を分析した。　拮抗分析は下記のように して行った。　１０ｘｌＯ６Ｈｕｔ７８細胞／ｍｌを含む細胞懸濁液の２５μｍ を、Ｆ　ＩＴＣ−６０，３（ｘ　２５６０　”；＝０．８μｇ／ｍｌ）の略飽和 用量の２５μｍと融合上清の５０ｍ　ｌと組み合わせ、４℃で３０分間インキュ ベートし、細胞混合物へ培養液を添加して洗浄し、そして１８００ｒｐｍで３分 間遠心分離した。　上清を吸引して除去し、ＲＰＭＩ、　２％ＰＢＳ　、および ０８１％ＮａＮ　３を含む血球計算用分析（ＦＡＣＳ）培地でペレットを２回洗 浄した。　反応混合物を、１％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中のｐＨ７，２） の添加により固定し、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　ＦＡＣ走査分析器を 用いたＦＡＣＳのためのポリスチレンチューブに移した。　融合体２２で生じた ９６０のハイブリドーマの内、ハイブリドーマＮｏ、　２２Ｆ１２Ｃの上清は、 ＦＩＴＣ−６０，３の結合を約９０％阻害し、ハイブリドーマＮｏ、　２２Ｊ４ Ａおよび２２８３Ｂからの上清は、それぞれ結合を約４０％および１０％阻害し た。　融合体２３からの二つのハイブリドーマ、２３Ｆ２Ｇおよび２３１１１Ｂ は、ＦＩＴＣ−６０，３結合を９５％以上阻害した抗体を産生じた。　これら５ つのハイブリドーマをクローニングした。　ハイブリドーマ細胞系２３Ｆ２Ｇは 、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド州、２０８５２ 米国に所在のアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクションに、１９９２年６ 月３０日に寄託され、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ１）ＩＢ　１１０８１の受託番号か付与さ れた。　ハイブリドーマ細胞系２３Ｆ２Ｇによって産生された抗体のイソタイプ （以下、モノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇと称する）は、ＩｇＧ２ａと決定された 。　バイブリド−？２２Ｆ１２Ｃおよび２３１１１ＢもＩ　ｇＧ２ａイソタイプ の抗体を産生じたが、ハイブリドーマ２２８３Ｂおよび２２Ｊ４ＡはＩｇＧ１抗 体を産生じた。 ハイブリドーマ２２Ｆ１２Ｃ１２３Ｆ２Ｇ　、および２３１１１Ｂからの抗体す べてにおいて、程度は異なるが、（１）活性化ＨＵＶＥＣ単一層へのヒトＴ細胞 の接着の阻害、（２）　１３−酢酸（ＰＭＡ）活性化Ｃｏｎ　Ａ芽細胞ホルボー ル１２−　Ｅリスチン酸の凝集の阻害、および（３）ウサギでの白面細胞の端数 の誘発か見られた。　ハイブリドーマ２２８３Ｂおよび２２Ｊ４Ａによって産生 されたＩｇＧ１抗体の接着の阻害能力は、未だ決定されておらず：モノクローナ ル抗体２２Ｊ４Ａは凝集の阻害はできたか、モノクローナル抗体２２８３Ｂはで きず：双方の抗体は端数を誘発したか、その程度は他の抗体あるいはモノクロ− アル抗体６０，３よりも小さかった。　上記したスクリーニングの結果に基つい て、Ｉ（ｕｔ　７８細胞に関するモノクローナル抗体６０．３のＬＦＡ−１への 結合を拮抗する能力にもかかわらず、モノクロ−六ル抗体２２８３Ｂおよび２２ Ｊ４Ａは、ＬＦＡ−１０′）ＣＤ１１ａ構成部分に存在するエピトープ、あるい はＣＤ１８のエピトープよりもむしろ、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８異種二量体に関連 するエピトープに特異的であると考えられる。 インターナショナル　ビジネス　コミュニケーションズ（サウス　ナティック、 マサチューセッツ州）によって組織されたＣｅ１ｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌｅｓ　Ｉｎ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”と称する会議でのポスターに て、１９９２年５月２６〜２７日に、カリフォルニア州、サンフランシスコで、 Ｌ、　Ｈａｒｒｉｓ氏によって提唱されたモノクローナル抗体６０．３の可変領 域のアミノ酸配列と、モノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇの可変領域のアミノ酸配列 との比較を行った。 ２３Ｆ２Ｇが、モノクローナル抗体６０．３のＨｕｔ７８細胞への結合を拮抗し たにもかかわらず、両者には大きな相違が認められた。 これら相違は、抗体がＣＤ１８の近接する、または異なるエピトープに結合する 可能性を示唆するものであるが、この可能性の確認は、エピトープマツプの研究 の完了を待たねばならない。 実施例５ ハイブリドーマ２３Ｆ２Ｇを腹水法により増幅し、そして、抗体を発熱源を含ま ない条件下でのプロティンＡに関するアフィニティータロマドグラフィーによっ てＭ製した。　２５ｍ１の腹水から、１２０ｍｇの抗体調製物を単離した。　こ の調製物は、わずか約４単位／ｍｇのエンドトキシンしか含んでいなかった。 二匹のＭａｃａｃａ　ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓザルを、モノクローナル抗体２３ Ｆ２ＧのＥＡＥ症状を緩和する能力を予備的に決定するための研究に加えた。　 εＡεを誘発するための手段は、実質的に実施例１と同様である。　Ｎｏ、　８ ９１６１および８９１６８の二匹の動物は、精製したサル塩基性タンパク質の１ ．０ｍｇで感受性化し、感受性化して１８および２０日目間それぞれ、超急性出 血に至った。８９１６１の動物は、開始後１２時間以内で、デキサメタシンによ る治療を開始する前に死亡した。　８９１６８の動物は、デキサメタシンで１週 間（４ｍｇ／ｋｇで３日間；２ｍｇ／ｋｇで２日間、およびｌ　ｍｇ／ｋｇで２ 日間）、そしてモノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇ（２ｍｇ／ｋｇで７日間、静脈注 射）の双方で処置した。　治療を開始して３日後には、療を終えて４日後には、 ＭＲＩで検出された病変か解消し、動物の麻痺か完全に解消するなど劇的な効果 が得られた。　治療を終えて８日後に、動物は症状を再発し、そして屠殺された 。 血液学的分析は、モノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇか、白血球の一定した端数を引 起し、それか治療の最終日にピークを迎えていたことを示していた。　臨床評価 を開始した時の白面細胞数は、２２、７ｘ　ｔｏ’から、治療最終日には８２Ｘ 　１０３／ｍｍ３にまで上昇した。 抗体は、投与した用量にて白血球の飽和に至ったことを示した。 実施例６ ２３Ｆ２Ｇ抗体可変領域のヒト型化 Ａ、可変領域配列の決定 ハイブリドーマ細胞系２３Ｆ２Ｇ　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＨＢ　１１０８１）から 全ＲＮＡを単離し、全ＲＮＡを鋳型として用いて第一鎖状ｃＤＮＡを合成した。 　この第一鎖状ｃＤＮＡは、モノクローナル抗体２３Ｆ２ＧのＨ鎖およびＬ鎖双 方の可変領域をコードする二本鎖ＤＮＡ断片を得るためのＰＣＲ反応の鋳型とし ても用いた。 Ｈ鎖可変領域をクローニングするために用いた正プライマーは、プライマーＨＦ ＲＩ−４であり、その配列をＩＵＰＡＣ命名法によって配列番号、１として下記 した。 プライマーの３′ヌクレオチドは、成熟マウスイムノグロブリンＨ鎖の最初の７ つのアミノ酸をコードする領域に対応し、プライマーの下線を付したヌクレオチ ドは、生成したＰＣＲ断片のクローニングを促進する一ＥｃｏＲ１部位をコード する。　Ｈ鎖可変領域配列をクローニングするために用いた逆プライマーは、プ ライマーＨＧ２Ａ−１であり、その配列をＩＵＰＡＣ命名法によって配列番号： ２として下記した。 プライｖ　−）ＩＧ２Ａ−１の３゛端は、マウスＩｇＧｔＡ定を領域〔Ｋａｂａ ｔｅＬ　ａｌ、、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ＩｎｔｅｒｅｓＬ″。 Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　 ５ｅｒｖｉｃｅｓ、　ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　９１−３２４２ 　（１９９１）の番号付方法に従った〕の１２７〜１３６位のコドンの補体をコ ードし、プライマーの下線を付したヌクレオチドはＢａｍ旧部位をコードした。 Ｌ鎖可変領域をコードするＰＣＲ断片を生成するために用いた正プライマーは、 プライマーＬＦＲＩ−３であり、その配列をＩＵＰＡＣプライマーＬＦＲＩ−３ の３′端は、マウスイムノグロブリンＬ鎖の成熟アミノ末端領域（残基１−８） に対応し、下線を付したヌクレオチドは、クローニングを促進する一ＥｃｏＲ１ 部位をコードする。　Ｌ鎖可変領域配列のための逆プライマーは、プライマーＬ ＫＣ−１であり、その配列をＩＵＰＡＣ命名法によって配列番号　４として下記 した。 プライマーＬＫＣ−１の３゛端は、マウス・カッパＬ鎖遺伝子の定常領域〔前出 のＫａｂａｔ　ｅＬ　ａｌ、、の文献の番号付方法に従った〕の１１６〜１２２ 位のコドンに相補的である。　プライマーの下線を付したヌクレオチドは」堕旧 部位をコードした。 得られたＬ鎖およびＨ鎖ＰＣＲ断片を、異なるベクターに連結し、８〜１２個の 独立したクローンが両方の鎖に関して配列決定された。　２３Ｆ２ＧのＨ鎖可変 領域に対応するＤＮＡおよびアミノ酸配列を、配列番号；５に示した。　Ｈ鎖配 列の７つのアミン末端残基は、ＰＣＲ反応で用いた正プライマーに対応している ので同一であった。　配列番号：５の１〜１５．３１〜４５．５３〜８４および ９４〜１０３のアミノ酸残基は、マウス２３Ｆ２Ｇ　Ｈ鎖可変領域の枠組領域を 含み、一方で、配列番号：５の１６〜３０．４６〜５２および３５〜９３のアミ ノ酸残基は、ＣＤＲ領域を含んでいた。　翻訳されたＨ鎖可変配列とマウスＨ鎖 の可変領域の異なるサブグループ〔前出のＫａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、、　）との 比較は、２３Ｆ２ＧのＨ鎖可変領域は、マウスサブグループ■に属することを示 した。２３Ｆ２ＧのＬ鎖可変領域のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を、配列番号 　６に示した。　Ｌ鎖の８個のアミノ末端残基は、Ｌ鎖タンパク質のアミン末端 配列を明らかにした。　配列番号、６の１〜３０．３６〜４９．６７〜９８およ び１１０〜１２０のアミノ酸残基は、マウス２３Ｆ２Ｇ　Ｌ鎖可変領域の枠組領 域を含み、一方で、配列番号二６の３１〜３５．５０〜６６および９９〜１０９ のアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域を含んでいた。　２３Ｆ２ＧのＬ鎖可変領域は、 サブグループ■マウスＬ鎖可変領域〔前出のＫａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、、　）と 最も類似していた。 Ｂ、ヒト型化ＨおよびＬ鎖可変領域のデザインヒトの枠組の選択において、（１ ）　ＣＤＲ領域か適切な配座と、抗原への親和性を保持できる可能性を高めるた めに〔前出のＫａｂａｔ、　ｅｔ　ａｌ、、およびＫｉｒｋｈａｍ　ｅｔ　ａｌ 、、　ＥＭＢＯＪ、、　１１：６０３−６０９（１９９２）を参照のこと〕、選 択されるヒトの枠組は２３Ｆ２Ｇのそれと可能な限り相同となるようにし、そし て（２）選択されるヒトの枠組は、ヒトにおいて抗体に対する免疫反応を惹起す ることができる普段用いない配列の最小数を含んでいること、の二つの一般的な 規準を用いた。 モノクローナル抗体２３Ｆ２ＧのＨ鎖が、マウスサブグループ■配列にあるため 、ヒトサブグループ■にある配列と最も相同的である。　それ故、Ｈ鎖可変配列 のヒトサブグループ■からの枠組は、モノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇのヒト型化 のために用いるために選抜された。　切り出した配列決定したヒト抗体から特定 の枠組を選ぶよりもむしろ、特定の枠組によく見られる普段用いない残基を避け るために、ヒトサブグループエ可変領域枠組〔前出のＫａｂａＬ　ｅｔ　ａｌ、 、　］の定常領域を用いることにした。 アミン末端の７つのアミノ酸を除いた２３Ｆ２ＧのＨ鎖の組み合わせた枠組領域 は、ヒトサブグループ■定常配列と７０％の配列同一性を有していた。　これと 比較して、組み合わせた２３Ｆ２Ｇ　Ｈ鎖枠組領域と、ヒトサブグループ■およ び■定常配列との同一性は小さかった（それぞれ、５２％および５８％）。 誓歯動物抗体枠組領域とヒト枠組配列との交換は、結合親和性が著しく低下した 抗体を生しる結果を招く。　このような場合、特定のヒト枠組残基と起源の誓歯 動物抗体の枠組残基とをＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ、　２：１２４−１３４　（１９ ９１）：　Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　４（７）ニア７３−７８３　（１ ９９１）：　Ｔｅｍｐｓｅｔ　ｅｔ　ａｌ、。 ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、　艶２６６−２７１　（１９９１）：　Ｇｏｒ ｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。（ＵＳＡ）、旦４１８１−４１８５　（１ ９９１）：　Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ８８：２８６９−２８７３　（１９９１）を含む 発行された抗体ヒト型化の研究の分析に基ついて、ヒトサブグループエ残基のヒ ト型化Ｈ鎖での後述する位置での使用よりもむしろ、配列番号−５のアミノ酸位 置６０．６１および９０に対応する〔前出のＫａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、、の文献 の番号付方法に従った〕６６．６７および９３の位置のマウス２３Ｆ２Ｇの枠組 残基を保持することにした。 同様の原理を、２３Ｆ２Ｇ　Ｌ鎖可変領域のヒト型化にも適用した。 ２３Ｆ２Ｇのし鎖の可変領域枠組配列は、ヒトサブグループエ、■、および■カ ッパ定常配列の７１％、６９％および７２％とそれぞれ同一であった。　２３Ｆ ２Ｇとの相同性か高く、またサブグループ■枠組はＬ鎖可変領域をヒト型化する ために汎用されていたので、ヒトカッパサブグループＩ定常枠組配列を用いるこ とにした。 Ｌ鎖ヒト枠組領域に、マウス特異的残基を置換しなかった。 ２３Ｐ２Ｇ　Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域のヒト型化体のために設計した配列は、上 述したヒト可変領域枠組配列およびマウスモノクローナル抗体２３Ｆ２ＧのＣＤ Ｒ領域から構成されていた。　これらヒト型化Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域のＤＮＡ および推定アミノ酸配列を、配列番号、７および８にそれぞれ記した。　配列番 号７の１〜３０．３６〜４９．６７〜９８および１１０〜１２０のアミノ酸残基 は、ヒト型化Ｈ鎖可変領域の枠組領域を含み、一方で、配列番号、７の３１〜３ ５．５０〜６６および９９〜１０９のアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域を含んでいた 。　配列番号：８の１〜２３．３９〜５３．６１〜９２および１０１〜１１１の アミノ酸残基は、ヒト型化り鎖可変領域の枠組領域を含み、一方で、配列番号・ ８の２４〜３８．５４〜６０および９３〜１００のアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域 を含んでいた。 Ｃ，ヒト型化２３Ｆ２Ｇ可変領域の作製２３Ｆ２ＧのＨ鎖可変領域のヒト型化体 をもコードする二つの断片を、５０〜６０ヌクレオチドの長さの相補的な合成オ リゴヌクレオチドから作製した。　可変領域をコードする配列に加えて、その配 列は、（１）プロモーター配列への結合を促進する５゛端での旧ｎｄｌｌｌ制限 部位、（２）開始メチオニンの上流側近傍にある至適翻訳開始配列、（３）シグ ナルペプチドをコードするＤＮＡ、（４）可変領域の３゛側近傍にある接合ドナ 一部位、および（５）定常領域ＤＮＡ部分への結合を促進する３°端でのＥｃｏ ＲＩ制腰部位をも含む。　シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、いくつ かのヒトＨ鎖すブグループＩ配列〔前出のＫａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、、　〕に関 連するシグナルペプチドをコードする配列と同しになるようにデザインした。　 ヒト型化り鎖可変領域ＤＮＡ部分をもコードする二つの断片も、相補的な合成オ リゴヌクレオチドから作製した。　作製されたＨ鎖およびＬ鎖可変領域ＤＮＡ断 片を、ｐＳＫ＋（ＳｔｒａＬａｇｅｎｅ、ラヨラ、カリフォルニア州）へクロー ニングし、そして、配列を確認した。 Ｄ、ヒト型化２３Ｐ２Ｇ　Ｈ鎖発現ベクターの構築２３Ｆ２Ｇのヒト型化Ｈ鎖の 発現のためのプラスミドを、ヒト型化Ｈ鎮可変領域配列を含んだ二つのＤＮＡ断 片、〔ヒトＴ細胞系（Ｈｕｔ　７８）からクローニングした〕ヒトＩｇＧ＜遺伝 子の定常領域、および発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） を共に結合することで構築した。　発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶは、サイトメガ ロウィルス（ＣＭＶ）からの即時初期プロモーター、プロモーターの下流のポリ リンカー領域、およびネオマイシン耐性カセットを含んでイル。　特に、下記４ つの断片、（１）　ｐＲｃ／ＣＭＶ　カラ（７）５．５ｋｂ旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ ／Ｘｂａ　ｌ断片、（２）　＋ｇｃ、配列を含んだ６　ｋｂ　ＥｃｏＲ１／Ｘｂ ａｌｌ断片、（３）ヒト型化ｌ］鎖可変領域配列の５°側半分を含んだ２００ｂ ｐまでのＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｈｏｌ断片、および（４）Ｈ鎖可変領域配列の３′ 側半分を含んだ３００ｂｐまでのＸｈｏ　Ｉ／ＥｃｏＲｌ断片、を単離して連結 した。 連結体を大腸菌の形質転換のために用い、制限消化により適切なりローンを確認 し、そして、ｐＲｃ／ＨＦ２Ｇ１１．２と命名した。 ｐＲｃ／ＨＦ２Ｇ０．２の環状マツプを図５に示した。　ｐＲｃ／ＨＦ２ＧＨ， ２の大規模プラスミド調製を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されたアル カリ溶解法を用いて行い、プラスミドを塩化セシウム−臭化エチジウム勾配にて ２回バンド形成した。 Ｅ、ヒト型化２３Ｆ２Ｇ　Ｌ鎖発現ベクターの構築ヒト型化し鎖の発現のための プラスミドを、ヒト型化り鎖可変領域配列を含んだ二つのＤＮＡ断片、ヒトカッ パ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）遺伝子発現カセット、および ＣＭＶからの強力なプロモーターを含んだｐＲｃ／ＣＭＶベクターの一部を共に 結合することで構築した。 ２３Ｆ２ＧおよびＤＨＰＲ配列のヒト型化り鎖遺伝子を含んだプラスミドの構築 において、数個の中間プラスミドを最初に構築した。 最初に構築した中間プラスミド、ｐＲｃ／ＨＦ２ＧＬ、　ｌは、可変および定常 領域コード配列がｐＲＣ／ＣＭＶの旧ｎｄ［ＩおよびＸｂａ　１部位の間にクロ ーニングされたＨ鎖遺伝子の発現のために作製されたプラスミドと類似していた 。　ｐＲｃ／ＨＦ２ＧＬ、　ｌを作製するために、下記５つの断片、（１）　Ｉ ）Ｒｃ／ＣＭＶと称された旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｘｂａ　ｌ断片、（２）ヒト型 化り鎖可変領域配列の５°側半分を含んだ２００ｂｐまでの旧ｎｄ　ｌ　Ｉ　ｌ ／Ａｓｐ７１８断片、（３）可変領域配列の３′側半分を含んだ２００ｂｐまで のＡＳｐ７１８／ＥｃｏＲｌ断片、（４）〔ヒトアノミックＤＮＡライブラリー からクローニングした〕カッパ遺伝子断片の５′側半分を含んだ４００ｂｐまで のＥｃｏＲＩ／５ａｃｌ断片、および（５）〔ヒトアノミックＤＮＡライブラリ ーからクローニングした〕カッパ遺伝子断片の３゛側半を含んだ３５０ｂｐまで の５ａｃｌ／Ｘｂａｌ断片、を連結した。 第二ノ中間フラスミト、ｐｓＩ１１９０−ｄｈｆｒｌ；ｉ、ｐＳＶ−ｄｈｆｒ（ ＡＴＣＣ３７１４６）からの１．７ｋｂ　５ｐｈｌ／Ｂａｍ旧断片を、配列決定 用ベクターｐｓＬ１１９０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ビス力タウエイ、ニューシ ャーシー州）のポリリンカー中の対応部位へ挿入して作製した。　ｐＳｌ１１９ ０−ｄｈｆｒ中の５Ｖ４０−ＤＨＰＲ配列を完全に配列決定し、先に発行された これら要素とはわずかにしか相違しないことを知見するに至った。　特に、Ｉ） ＳＬ１１９０−ｄｈｆｒ中ｃ７）ＤＩ（ＦＲコート配列カ、先ニ開示すれたマウ スＤ　ＨＰ　Ｒの配列［：Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０：２４９５−２４９９　（１９８３）　 〕と同しポリペプチドをコードすることが判明した。 ヒト型化２３Ｐ２Ｇ　Ｌ鎖の発現のための最終プラスミド（ｐＤ／ＨＦ２ＧＬ、 　１）を作製するために、下記４つの断片、（１）ｐＲＣ／ＣＭｖカラの３．　 ｌｋｂ　Ｂａｍ旧ハ（ｉｎｄｌｌｌ断片、（２）　ｐＲｃ／ＣＭＶからの０．７ ５３ｂｐＸｂａｌ／Ａｓｐ７１８断片、（３）〔完全なヒト型化り鎖遺伝子を含 む〕ｐＲｃ／ＨＦ２ＧＬ、　］からの１．２ｋｂ断片、および（４）　ｐｓＬ１ １９０−ｄｈｆｒからの［ＳＶ４０プロモーターＤＨＰＲ配列を含む）　１．７ ｋｂ　Ａｓｐ７１８／Ｉｌａｍ旧断片、を連結した。　ｐＤ／１ｌＦ２　ＧＬ、 　１の環状マツプを図６に示した。 これらプラスミドの大量調製および精製は、上記したＨ鎖発現プラスミドの場合 と同様に行った。 Ｆ、　Ｃｌｌ０細胞系ＤＸＢＩＩの形質変換および遺伝子増幅ｄｈｆｒ　ＣＨＯ 細胞系ＤＸＢＩＩへＩ４鎖およびＬ鎖双方の発現プラスミ］・を導入するために リポフエクションを用いた。　同様のｄｈｆｒＣｌ（０細胞系か、Ｕｒｌａｕｂ 旦ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。 ７７：４２１６−４２２０　（１９８０）に記載されている。　ヌクレオシド（ ＤＨＰＲの選択のための）か欠落している状況下で成長し、そして形質変換体か 双方のプラスミドを含むことが確実であるＧ４１８　（ネオマイシン）耐性であ る細胞を選択した。 三つの形質転換体のプールを、増幅を行ったＤＨＰＲ遺伝子を有する細胞を選択 するために、まず２５ｎＭ、次いでｌｏｏｎＭメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ、 セントルイス、モンタナ州）に適用した。 クローニングしたものを限定希釈した後、６Ｅ６（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ１１ ３９８）と称する細胞系か、ヒト型化２３Ｆ２Ｇを約１　ｎｇ／細胞／日の割合 で生成し、成長培地ＩＬ当たり５〜１０ｍｇの抗体を蓄積すの細胞系か、細胞系 ６Ｅ６および６Ｅ６に対する方法と同様にして単離し、Ｂ１３−２４　（Ａ、Ｔ 、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ　１１３９７）と命名した。　２００ｍＭメトトレキセート耐 性である細胞系Ｂ１３−２４は、約２５ｐｇ／細胞／日の割合で、１００ｍｇ／ Ｉを超える抗体を産生じた。 ６Ｅ６およびＢ１３−２４細胞系を、５％不活性化胎児ウシ血清、３７°Ｃ１６ ％二酸化炭素、オヨヒ１００％湿度、２　ｘｌＯＳカラ６　ｘｌＯ’細胞／　ｍ 　ｌの間の密度にて、ダルベツコの修飾アールズ培地／ハムＦ−１２（１：ｌ混 合）で培養した。　６Ｅ６細胞系の培地は１００ｍＭメトトレキセートを含み、 Ｂ１３−２４細胞系の培地は２００ｍＭメトトレキセートを含んでいた。 ヒト型化２３Ｆ２Ｇ抗体は、６Ｅ６およびＢＩ３−２４細胞系から以下のように して精製した。　細胞を収穫した液体を、まずＩｇＧｓを結合するプロティンＡ カラムに通した。　カラムを、３５ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１％Ｔｗｅｅｎ −２０、ｐＨ７，８５で洗浄し、次いで、５０ｍＭクエン酸、ｌ］Ｈ５，ｏで洗 浄した。　抗体を、５０ｍＭクエン酸、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３， ０で溶出し、そして、酸性条件下で、室温にて１５分分間−た。　溶出物を、２ 〜８℃まで冷却し、ＩＭの冷Ｔｒｉｓ緩衝液で中和した。　プロティンＡ溶出物 を、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ８，０にて調整 し、そして、フェニルセファロースカラムに適用した。　次に、カラムを載置緩 衝液（０，５Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＸｐＨ８，０）で洗浄 し、そして、Ｏ，１Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨｓ、ｏ で溶出した。　溶出物を、次工程に供するために、精製水で１／１ｏにまで希釈 した。　希釈したフェニルセファロース溶出物を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐ Ｈ７，５で平衡化したＤＥＡＥセファロース・ファースト・フロー・カラムに適 用した。　適用後、］ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５で、次いて、１０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ　、　５０ｍＭ　ＮａＣｌ　、ｐＨ７，５によってカラムを洗浄した 。ｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　２００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５で抗体を溶出した 。　ＤＥＡＥ溶出物をセファデックスＧ−２５超微細カラムに適用腰最終調製緩 衝液（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭ　ＮａＣｌ、　０．０２％Ｔｗ ｅｅｎ　２０　、ｐＨ５，６）に通すことで洗浄した。　溶出した抗体を、所望 の濃度になるように希釈した。 Ｇ、細胞系６Ｅ６およびＢ１３−２４から誘導したＨ娘細胞系６Ｅ６から誘導し たｍＲＮＡの分析過程にて、ヒト型化２３Ｆ２ＧＩ］鎖をコードするＲＮＡのほ とんど（全部ではない）が、予想していたよりも長いことがわかった。　Ｈ鎖を コードする数個のｃＤＮＡｓの後続するクローニングと配列決定は、　ＩｇＧ＜ 　Ｈ鎖のＣ末端に典型的に見られるＧｌｙ−Ｌｙｓ配列をコードする配列が無く 、また、Ａｓｐ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ　（配列番号　９） をコードする配列によって置換されるように、Ｃ末端をコードする領域の近傍の ＤＮＡ中の領域が組み換えられていることを示した。 細胞系Ｂ１３−２４から誘導したＨ鎖ｍＲＮＡは予想された大きさであり、それ 故、細胞系Ｂ１３−２４によって産生じたＨ鎖のＣ末端コード領域は無傷のよう であった。 Ｈ，ヒト型化２３Ｆ２Ｇ抗体の親和性 ヒト型化２３Ｐ２Ｇ抗体は、細胞結合分析での蛍光性マウス２３Ｆ２Ｇ抗体と効 果的に拮抗した。０．４μｇ／ｍ　ｌでの蛍光性マウス２３Ｆ２Ｇ抗体を、増量 したヒト型化２３Ｆ２Ｇ抗体と混合した。　これら抗体混合物を、ＬＦＡ−］陽 性細胞系０ＵＴ−７８でインキュベートした。 洗浄後、平均蛍光強度に関して、血球計測によって検定した。 この分析において、ヒト型化２３Ｆ２Ｇ抗体（１，０１μｇ／ｍ　ｌの）は、マ ウス２３Ｆ２Ｇ抗体と同様の効率でＬＰＡ−１陽性細胞に結合した。 実施例７ マウスモノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇ　（以下、この実施例ではｒＭ２３Ｆ２Ｇ Ｊと称する）と実施例６のＣＨＯ６Ｅ６から得たヒト型化抗体（以下、この実施 例ではｒ　ＨｕＭ２３Ｆ２ＧＪと称する）の効果をさらに特徴付けるために、０ ．１〜０．４ｍｇのサル、塩基性タンパク質と０．５ｍｇの熱殺菌したＭ、　ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含んだＯ，１ｍｌの新たに調製した、やや強度が増し たエマルジョンを用いた実施例るように腹水から精製し、５．２単位／ｍｇのエ ンドトキシンを含んでいた。　ＨｕＭ２３Ｆ２Ｇを、発熱原を含まない条件下で のプロティン八に関するアフィニティークロマトグラフィーによって、ＣＨＯ細 胞６Ｅ６　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ　１１３９８）培養上清から精製し、１． ２単位／ｍｇのエンドトキシンを含んでいた。 治療は、疾患を発生させた日から開始した。　治療グループは、デキサメタシン （４ｍｇ／ｋｇ／日を３日間）のみ、デキサメタシンとＭ２３Ｆ２Ｇ　（２ｍｇ ／ｋｇ／日を７日間）、あるいはデキサメタシンとＨｕＭ２３Ｆ２Ｇ　（２ｍｇ ／ｋｇ／日を７日間）のグループから構成されていた。　臨床疾患の発生に先駆 けて、動物の治療グループ分けを行った。　７匹の動物がデキサメタシンで、５ 匹の動物がＭ２３Ｆ２Ｇで、そして、４匹の動物がＨｕＭ２３Ｆ２Ｇでそれぞれ 処置されｔこ。 治療の効果を評価するために用いた終点は、疾患の発生から４２日後の生存、治 療後の臨床評価、および治療後の（ＭＲ＋によって決定した）病変の大きさであ った。　臨床評価は、死亡あるいは屠殺の時まで毎日行われた。　動物を、週− 回、ＭＨＩによって走査した。　改良した臨床評価システム（表１の先の相対評 価システム）を、疾患の程度を反映するために用い、下記表６に示した。　前処 置ＭＨＩ走査データを、臨床疾患の発生時（±３日間）に得、治療後の走査デー タを、臨床疾患の発生時（±３日間）から１０日後に得た。　異常領域を定量す るために、ＭＨＩ走査データを、スフトウエアパッケージ・　ＮＩＨイメージ・ バージョン１．４４（ヘセスダ、メリーランド州）によって解析した。　これら ＭＲＩ病変は、ＢＡＥによって引き起こされた脳浮腫および細胞性炎症を示し、 そして、脳炎症の治療効果有する非侵入的方法を許容するものである。 評価　症状 １　食欲不振、体重減少 ３　無感動、流況 ４　眼振、一過性の震頼 ５　運動低下、不器用 ６　失調、瞳孔異常、眼瞼下垂斜視、盲目７　傾頭、震頗 ８　発作、身体の捻じれ、不全麻痺 ９　全身不随、半身不随、四肢麻痺、嗜眠、半昏睡１０　死亡 生存データを下記表７に示した。　デキサメタシングループの平均生存時間は２ ３．４日であるのに対し、Ｍ２３Ｆ２Ｇグループは３４．８日、そしてＨｕＭ２ ３Ｐ２Ｇグループは２５．５日であった。　塩基性タンパク質調製物の強度によ るものと思われる、デキサメタシン処置した動物と比較した、抗体処置した動物 の生存評価には統計学的有意は認められなかった。 Ｔ８９２４１　２４　Ｔ８９３４１　４２　９１３３９　ｌｌ９１４４４　８　 ９１４２４　４２　Ｆ９１３０７　４２９１４４９　４２　９１４２５　６　Ｍ ９１３５３　４２Ｆ９１３３７　３ Ｆ９１３０４　４２ 臨床評価および病変領域は、開始して３日後に死亡したデキサメタシングループ の二匹（９２１５２およびＦ９１３３７）を除いて、疾患の発生時（±３日間） と疾患の発生時から１ｏ日後（±３日間）に決定し、そして、死亡した日に走査 を行った。　三つの各処置グループに関する数値を、表８に示した。　表８に示 した臨床評価は、走査を行った日に得たものである。　三つの処置グループ間に おける疾患の発生時の臨床評価には、有意の差は無かったが、治療後の臨床評価 および病変領域双方において、統計学的に有意な相違か認められた。　〔開始時 と終了後の臨床評価に関するｔ−ｐ値：デキサメタシン＝　０．７３、Ｍ２３Ｐ ２Ｇ　＝０．００４　、ｔ（ｕＭ２３Ｆ２Ｇ＝ｏ、ｏｏｏｌ　；開始時と終了後 の病変領域に関するｌ−ｐ値：デキサメタシン−０１２７、Ｍ２３Ｆ２Ｇ　＝　 ０．００７、ＨｕＭ２３Ｐ２Ｇ　＝　０．０７］。 Ｔ８９３４１　７　０　−１００　１８５３　０　−１００９１４２４　６　５ 　−１６．７　１０９９８　０　−１００９１３３１　６　０−引１０　６２３ ７　２６９　−９６−平均　５．４　１．８　−６３．３％　５３３９　２５３ 　−９０．８％標準偏差　上１゜３４　上２゜４９　±４２２９　±３５０（Ｈ ｕＭ２３Ｆ２Ｇ） Ｆ９１３０７　９　２　−７７．８　６８５５　２３０　−９７Ｍ９１３５３　 ６　０　−１００　１４８７０　４２１９　−７２９２１３６　−ニー−１−」 艶−」匹聾」剋り二Ｍ−平均　６．５　１．７５　−７１．９５％　１２４４１ ．５３５９１　−７７％標準偏差　上１゜７３　上１゜２６　±７５１７　±４ ２４０要約すると、Ｍ２３Ｆ２ＧおよびＨｕＭ２３Ｆ２Ｇは、サルＥＡＲに関し て、抗体６０．３の生存期間と同様の有益な効果を有しているのである。 臨床的強度およびＭＲ＋終点の分析も、デキサメタシンのみと比較した、サルＥ ＡＥにおけるＭ２３Ｐ２ＧおよびＨｕＭ２３Ｆ２Ｇの有益な効果を支持している 。 先の実施例は、炎症部位への白血球の接着および移動を阻害する抗体のような試 薬を投与することによって、炎症プロセスを阻害し、および炎症免疫疾患と関連 した症状を緩和するための治療方法を記載した。　本発明を特異的な方法と組成 物に関して説明してきたが、当業者であれば、本願発明の開示を考慮すれば様々 な修正と変更を想到することを理解すべきである。 一つの例として、６０．３および２３Ｐ２Ｇの二つの抗ＣＤ１８モノクローナル 抗体か、本発明の方法の実用面にて有用であることを実証してきたか、モノクロ ーナル抗体６０．３および／または２３Ｆ２ＧとＬＦＡ−１への結合を拮抗する 抗体も、当該抗体のＣＤ１８に存在するエピトープの認識の有無にかかわらず、 有用であることが期待される。　従って、請求した発明の範囲内におけるかよう な等価の態様すべてが、添付した請求の範囲に包含されることを意図するもので ある。 配　列　表 （１）一般情報 （ｉ）出願人二ローズ、リン、エム （ｉｉ）発明の名称：炎症性疾患状態に関連する症状の緩和（ｉｉｉ）配列の数 、９ （ｉｖ）連絡先住所。 （Ａ）名宛人・マーシャル、オドウール、ジエーステイン、マレ−アンドボーラ ン （Ｂ）番地・６３００シアーズ　タワー、　巌すウス　ワラカー　ドライブ（Ｃ ）都市名ニジカゴ （Ｄ）州名　イリノイ （Ｅ）国名、米国 （Ｆ）郵便番号　６０６０６−６４０２（ｖ）コンピューター読取形式： （Ａ）媒体：フロッピー　ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３ ／１１１Ｓ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：パテント　イン　リリース肘、０、バ ージョン＃１．２５（ｖｌ）現出願データ （Ａ）出願番号。 （Ｂ）出願日。 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願データ （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０８１０６０．６９９（Ｂ）出願日　ｌｏ−６月−１ ９９３ （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番ｑ　：　ＵＳ　０７／９１５．０６８（Ｂ）出願日・　１６−７月 −１９９２（ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：ボーラン、マイケル　エフ（Ｂ）登録番号：　２５．４４７ （Ｃ）参照／事件番号：　３１５７４ （ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話：　（３１２）　４７４−６３００（Ｂ）ファックス：　（３１２） 　４７４−０４４８（Ｃ）テレックス：２５−３８５６ （２）配列番号　ｌの情報 （ｉ）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ；３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）翫ｊりの種類、　ＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号：Ｉ ＣＧＡＴＡＣＧＭＴ　ＴＣＡＧＧＴＳｈｔＡＲＣＴＧＣ八ＧＳへＧＴ　ＣＷＧ　 ３３（２）配列番号、２の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ＝３６塩基対 （Ｂ）配列の型；核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配ｌす：配列番号；２ Ｇ（ＴＡＴＣＧＧＡＴ　ＣＣＧＧＡＲＣＣＡＧ　ＴｒＧＴＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣ ＡＣ３６（２）配列番号　３の情報 （ｉ）配列特徴・ （Ａ）５ｉＪすの長さ　３６塩基対 （Ｂ）　ｌ５ｉＪすの型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号：３ ＣＧＡＴＡＣＧＡＡＴ　ＴＣＧＡＴＲＴＴＫＴ　ＧＡＴＧＡＣＹＣＡＲＲＣＴＳ ＣＡ　３６（２）配列番号：４の情報 （ｉ）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ　３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎮 （Ｄ）トボロノー　直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列　配列番号・４ ＧＣＴＡＴＣＧＧＡＴ　ＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧ　ＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴ　ＧＧＡ 　３３（２）配列番号、５の情報 （１）配列特徴・ （Ａ）配列の長さ：３３９塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）翫ツリの特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置・　１．　、３３９ （ｘｉ）配列、配列番号、５ ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＡＣＴ　 ＴＣＡ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　′ＩＴＧ　ＴＣＣＴＧＣＭＧ　４W Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓｌ　５　１０　１５ ＧＣＣＴＣＴ　ＧＧＣＴＡＣＡＣＣｍ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＡＴ Ｇ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　９６Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　 Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｎＡＧＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　Ｃ ＴＧ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　Ａ’ｌＴ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＡＴｒｍ　ＣＣＴ　ＧＧＡ 　ＧＡＴ　１S４ Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　ｌｌｅ　 Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＧＡＣＧＡＧ　ＡＣ Ｔ　ＡＧＡ　ＴＡＣＡＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＴＣＡＧＧ　ＧＧＣＭＧ　ＧＣ ＣＡＣＡ　ＴｒＧ　ＡＣＴ　１９２Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　 Ｌｅｕ　ＴｈｒＧＣＡ　ＧＡＴ　ＭＧ　ＴＣＣＴＣＣＭＴ　ＡＣＡ　ＧＧＴ　Ｔ ＡＣＴＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧ　ＡＣＡ　２４０Ａｌａ　Ａｓ ｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＴＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣＴＣＴ　 ＧＣＧ　ＧＴＣＴＡＴ　ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　Ａ ＡＡ　ＴＴＡ　ＣＧＡ　２W８ Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　 Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＣＣＣＴＩＴ　ＧＣ Ｔ　ＴＴＧ　ＧＡＣＴＡＣＴＧＧ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　 ＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣ３３６Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔ ｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　ｌｉｅ　Ｖ ａｌ　５ｅｒＴＣＡ　３３９ ｅｒ （２）配列番号：６の情報 （ｉ）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ　３０９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）配列の特徴。 （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　１．　、３０９ （ｘｉ）配列：配列番号　６ ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＴｒＧ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　 ＡＧＧ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＡ　ＴＣＣＴＧＣＡＧＡ　４８Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅ ｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈ ｒ　ｌ　ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒ■ ｌ　５　１０　１５ ＧＣＣＡＧＴ　ＧＡＡ　ＡＧＣＧＴＴ　ＧＭ　ＡＧＴ　ＴＡＴ　ＧＧＣＭＴ　Ｍ Ｔ　ｍ　ＡＴＧ　ＴＡＣＴＧＧ　ＴＡＴ　９６Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ 　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＰｈｅＭｅｔ　 Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ２０　’　２５　３０ ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＣＣＣＡＡＡ　Ｃ ＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＴＣＣ１４４Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ｔｌｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｌ ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　５ｅ■ ＭＣＣＴＡ　ＧＭ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴＣＣＣＴ　ＧＣＣＡＧＧ　ＴＴＣＡＧ Ｔ　ＧＧＣＡＧＴ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　１９２Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＡＣＡ　ＧＡＣＴｒＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴ ｒ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣ Ａ　２４０Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ 　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　ＡｌａＡＣＣＴ ＡＴ　ＴＡＣＴＧＴ　ＣＡＣＣＡＡ　ＧＡＴ　ＭＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　 ＣＣＧ　ＡＣＧ　ＴｒＣＧＧＴ　ＧＧＡ　２８８Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙ ｓ　ｔ（ｉｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔ ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌ■ ＧＧＣＡＣＣＭＧ　ＣＴＧ　ＧＭ　ＴＴＣＡＡＡ　３０９Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙ ｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｓｌ００ （２）配列番号ニアの情報 （ｉ）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ：３６０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ （１ｘ）配列の特徴。 （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．．３６０ （ｘｉ）配列：配列番号　７ ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　Ｇ（Ｔ　 ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＭＧ　ＭＧ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　４W Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａｌ　５　１０　１５ ＡＧＣＧＴＧ　ＡＡＧ　ＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　 ＴＡＣＡＣＣＴｒＣＡＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　９６Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｖ ａｌ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐ ｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＡｓｎＴＧＧ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＣＧ Ａ　ＣＡＧ　ＧＣＣＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣＭ　ＧＧＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＴＧＧ　Ａ ＴＧ　１４S Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　ＭｅｔＧＧＡ　ＧＣＴ　Ａ ＴＴ　ｍ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＡＧ　ＡＣＴ　ＡＧＡ　ＴＡＣＡ ＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＩＴＣ１９２Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉ　ｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉ ｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈ■ ＡＧＧ　ＧＧＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＡＣＣＡＴｒ　ＡＣＣＧＣＧ　ＧＡＣＡＣＡ　 ＴＣＣＡＣＧ　ＡＧＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＡＣ２４０Ａｒｇ　Ｇｌｙ　［、ｙｓ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　ｌ　ｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔ凾■ ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＣＡＧＣＣＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡ ＣＡＣＧ　ＧＣＣＧＴＧ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＧＴ　２８８Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｌｅ ｕ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌ ａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＧＧＣＡＧＡ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　 ＴＴＡ　ＣＧＡ　ＣＣＣｍ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＣＴＡＣＴＧＧ　ＧＧＣＣＭ 　３３６Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎＧＧＡ　Ａ ＣＣＣＴＧ　ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ　３６０Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２）配列番号二８の情報 （ｉ）配列特徴。 （Ａ）翫ｙりの長さ：３３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類　ｃＤＮＡ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．．３３３ （ｘｌ）配列：配列番号：８ ＧＡＣＡＴＣＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＴＣＣＴＣＣＣ ＴＧ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　４８Ａｓｐ　ｌ　Ｉｅ　Ｇｌ ｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌ■ 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（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１３　 ＺＮＡ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０６ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｃ１２Ｎ　１５／６２ ９０５０−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＣＡ、ＪＰＩ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ （７２）発明者　ローズ、リン、エム。 アメリカ合衆国　９８１１５　ワシントン　シアトル　エフ。イー、　７０ス　 ストリート

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．抗ＣＤ１８インテグリン抗体基質の治療的有効量を投与することを含む、多 発性硬化症疾患状態に関連した炎症プロセスの阻害および症状の緩和のための方 法。
2. ２．前記抗ＣＤ１８抗体が、モノクローナル抗体６０．３である請求の範囲第１ 項に記載の方法。
3. ３．前記抗ＣＤ１８抗体が、ハイブリドーマ細胞系２３Ｆ２Ｇ，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ ．ＨＢ　１１０８１　によって産生されたモノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇ　であ る請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．前記抗ＣＤ１８抗体が、ハイブリドーマ細胞系２３Ｆ２Ｇ，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ ．ＨＢ　１１０８１　によって産生されたモノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇ　の相 補的に決定したマウスの領域を含んだ組換えヒト抗体である請求の範囲第１項に 記載の方法。
5. ５．ハイブリドーマ細胞系２３Ｆ２Ｇ，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ　１１０８１。
6. ６．ＣＨＯ細胞系６Ｅ６，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＣＲＬ　１１３９８。
7. ７．ＣＨＯ細胞系Ｂ１３−２４，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＣＲＬ　１１３９７。
8. ８．ハイブリドーマ細胞系２３Ｆ２Ｇ，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ　１１０８１によ って産生されたモノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇ。
9. ９．ＣＨＯ細胞系６Ｅ６，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＣＲＬ　１１３９８　によって産生 されたモノクローナル抗体６Ｅ６。
10. １０．ＣＨＯ細胞系Ｂ１３−２４，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＣＲＬ　１１３９７によっ て産生されたモノクローナル抗体Ｂ１３−２４。
11. １１．ＬＦＡ−１へ結合するためにモノクローナル抗体６０．３と拮抗するモノ クローナル抗体の治療的有効量を投与することを含む、多発性硬化症疾患状態に 関連した炎症プロセスの阻害および症状の緩和のための方法。