CN103777021A - 狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法，其特点是采用ELISA夹心法检测狂犬病毒抗原含量，首先在96孔酶标板上包被狂犬病毒多克隆抗体。加入待检测样品，37℃孵育1.5小时；清洗酶标板5次；后加入鼠抗狂犬病毒单克隆抗体。37℃孵育1.5小时；清洗酶标板5次，加抗小鼠的酶结合物。37℃孵育1小时；清洗酶标板6次.加底物显色后。酶标仪检测，读取OD值。计算样品的狂犬病毒糖蛋白含量。本发明可用于狂犬疫苗产业中的质量控制，并能够快速鉴别狂犬疫苗真伪。

Description

狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种生物制剂的检测方法，特别是涉及一种用于狂犬疫苗产业中的质量控制，并能够快速鉴别狂犬疫苗真伪的狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
狂犬病毒具有较强的神经组织嗜性，狂犬病是致死性传染病。狂犬疫苗在预防狂犬病起着重要作用。狂犬病毒糖蛋白是狂犬病毒表面抗原的最主要成分，并且是狂犬病毒的主要免疫抗原。其含量和活性对疫苗质量起到至关重要的作用。检测狂犬病毒的糖蛋白含量间接起到评价疫苗效力的作用，是对疫苗效力实验有利补充。相对效力实验而言，更节省时间，减少实验动物使用量、对生产流程可控性强等。在现有技术中，国内并没有公开狂犬病毒抗原含量检测的方法，也查不到国外企业的相关报道。根据生产企业实际的生产情况，迫切需要能有一种检测狂犬病毒糖蛋白含量的方法，以便有效的预知成品疫苗的抗原含量，为疫苗成品生产提供可靠的定量数值依据，并用于狂犬疫苗真伪快速鉴别。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的上述不足，公开一种狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法。本发明采用ELISA夹心法检测狂犬病毒抗原含量，首先在96孔酶标板上包被狂犬病毒多克隆抗体，加入待检测样品，37℃孵育1.5小时；清洗酶标板5次；后加入鼠抗狂犬病毒单克隆抗体，37℃孵育1.5小时；清洗酶标板5次，加抗小鼠的酶结合物，37℃孵育1小时；清洗酶标板6次.加底物显色后。酶标仪检测，读取OD值。计算样品的狂犬病毒糖蛋白含量。本发明可用于狂犬疫苗产业中的质量控制，并能够快速鉴别狂犬疫苗真伪。
本发明给出的技术方案是：这种狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法，其特征在于有以下步骤：
(1)将人抗狂犬病毒免疫球蛋白适宜稀释度配制成包被液，每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于湿盒中37℃至少3小时，然后4℃过夜，取出倒空板，加300μl/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37℃至少1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；
(2)每个样品以2倍法稀释多个稀释度(当糖蛋白含量较高时可增大稀释度)，参考疫苗：以2倍法稀释8个稀释度，将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，用洗板机清洗至少4次，洗液300μl/孔，倒空板，加样200μl/孔，第1列加稀释液作为空白，不加样品；第2列加参考疫苗，由低稀释度往高稀释度加，第4～12列为样品，加入不同样品时应更换枪头，将加完样的酶标板用封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育至少90min；
(3)将板取出，用洗板机清洗至少5次，洗液300μl/孔，将适宜稀释度的小鼠抗狂犬病毒单克隆抗体25ml，用多道加样枪加到酶标板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育至少90min；
(4)将板取出，用洗板机清洗至少5次，洗液300μl/孔，将适宜稀释度的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物25ml，用多道加样枪加到酶标板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育至少60min。
(5)将板取出，用洗板机清洗至少6次，洗液300μl/孔。加现配制好的显色液，200μl/孔，室温下避光反应至少30min，同时打开酶标仪预热，加50μl/孔4.5mol/L H2SO4终止反应，使用酶标仪，设定相应的空白，并在492nm测定。
(6)结果计算：将所有测定的OD值，逐一输入计算模板中，按照参考疫苗糖蛋白含量和所对应的OD值做一次回归方程Y＝aX+b，将同一样品不同稀释倍数下所对应的OD值代入方程，计算各稀释度的糖蛋白含量，并乘以相对应的稀释倍数，得到多个结果后，选择结果相近数值的平均数作为检验的最终结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
在现有技术中，国内并没有公开狂犬病毒抗原含量检测的方法，也查不到国外企业的相关报道。建立此方法可以根据生产企业实际的生产情况，有效的预知成品疫苗的抗原含量，为疫苗成品生产提供可靠的定量数值依据，并用于快速鉴别疫苗真伪。
附图说明
图1为参考疫苗标准曲线。
具体实施方式：
实施例1
这种狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法，有以下步骤：
1.将人抗狂犬病毒免疫球蛋白适宜稀释度配制成包被液。每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜。取出倒空板，加300μl/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37℃ 1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存。
2.每个样品以2倍法稀释若干个稀释度(当糖蛋白含量较高时可增大稀释度)。参考疫苗：以2倍法稀释8个稀释度。将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，用洗板机清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板。加样200μl/孔，第1列加稀释液作为空白，不加样品；第2列加参考疫苗，由低稀释度往高稀释度加。第4～12列为样品，加入不同样品时应更换枪头；将加完样的酶标板用封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育90min。
3.将板取出，用洗板机清洗5次，洗液300μl/孔。将适宜稀释度的小鼠抗狂犬病毒单克隆抗体25ml，用多道加样枪加到酶标板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育90min。
4.将板取出，用洗板机清洗5次，洗液300μl/孔。将适宜稀释度的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物25ml，用多道加样枪加到酶标板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育60min。
5.将板取出，用洗板机清洗6次，洗液300μl/孔。加现配制好的显色液，200μl/孔，室温下避光反应30min。同时打开酶标仪预热。
加50μl/孔4.5mol/L H2SO4终止反应。
使用酶标仪，设定相应的空白，并在492nm测定。
6.结果计算：将所有测定的OD值，按照参考疫苗糖蛋白含量和所对应的OD值做一次回归方程Y＝aX+b，将同一样品不同稀释倍数下所对应的OD值代入方程，计算各稀释度的糖蛋白含量，并乘以相对应的稀释倍数，得到多个结果后，选择结果相近数值的平均数作为检验的最终结果。
数据计算说明：
表1参考疫苗浓度及OD值
Figure BDA00002271087200041
由表1参考疫苗浓度及OD值(直接输入至excel表格中)制作直线回归方程，见图1参考疫苗标准曲线。
表2：样品稀释倍数及对应的OD值，计算结果
Figure BDA00002271087200051
如以样品A的4倍稀释后所测OD值为例：
(1.906-0.0476)/0.0040×4/1000＝1.9IU/ml
取4个稀释度计算结果的平均值作为最终结果。

Claims (1)

1.一种种狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法，其特征在于有以下步骤：
(1)将人抗狂犬病毒免疫球蛋白适宜稀释度配制成包被液，每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于湿盒中37℃至少3小时，然后4℃过夜，取出倒空板，加300μl/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37℃至少1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70℃保存；
(2)每个样品以2倍法稀释多个稀释度(当糖蛋白含量较高时可增大稀释度)，参考疫苗：以2倍法稀释8个稀释度，将预先包被好的酶标板从-70℃冰箱中取出，用洗板机清洗至少4次，洗液300μl/孔，倒空板，加样200μl/孔，第1列加稀释液作为空白，不加样品；第2列加参考疫苗，由低稀释度往高稀释度加，第4～12列为样品，加入不同样品时应更换枪头，将加完样的酶标板用封口膜封好，置于37±℃湿盒中孵育至少90min；
(3)将板取出，用洗板机清洗至少5次，洗液300μl/孔，将适宜稀释度的小鼠抗狂犬病毒单克隆抗体25ml，用多道加样枪加到酶标板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育至少90min；
(4)将板取出，用洗板机清洗至少5次，洗液300μl/孔，将适宜稀释度的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物25ml，用多道加样枪加到酶标板上，200μl/孔，然后封口膜封好，置于37℃湿盒中孵育至少60min；
(5)将板取出，用洗板机清洗至少6次，洗液300μl/孔。加现配制好的显色液，200μl/孔，室温下避光反应至少30min，同时打开酶标仪预热，加50μl/孔4.5mol/L H2SO4终止反应，使用酶标仪，设定相应的空白，并在492nm测定；
(6)结果计算：将所有测定的OD值，逐一输入计算模板中，按照参考疫苗糖蛋白含量和所对应的OD值做一次回归方程Y＝aX+b，将同一样品不同稀释倍数下所对应的OD值代入方程，计算各稀释度的糖蛋白含量，并乘以相对应的稀释倍数，得到多个结果后，选择结果相近数值的平均数作为检验的最终结果。
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