CN107082809A - 靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及其筛选方法 - Google Patents

靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体，所述的单克隆抗体为特异性结合血小板膜蛋白GPIbα的单克隆抗体。本发明还涉及一种用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，分为五部分：第一部分是利用酶联免疫吸附测定建立的初步筛选模型，第二部分是利用免疫印迹法建立的二次筛选模型，第三、四、五部分是利用流式细胞仪及连续光谱荧光仪建立的功能检测模型。本发明中建立的筛选模型可显著减少在获得靶向血小板膜糖蛋白GPIbα抑制剂过程中对人源血小板的需求，并最大程度在体外实验中活化肿瘤细胞，模拟了肿瘤细胞微环境，提高了筛选准确性，所获得的抗体YQ3具有很好地临床应用前景。

Description

靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及 其筛选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及药理学，具体是指一种靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及其筛选方法。
背景技术
血小板能够促进肿瘤转移，其促进肿瘤转移的第一步及关键点是肿瘤细胞激活血小板形成瘤栓。血小板表面的多种粘附分子例如糖蛋白(Glycoprotein,GP)Ib-IX-V、GPIIb-IIIa等相互作用从而介导肿瘤细胞与血小板的粘附。其中GPIbα是GPIb-IX-V复合物中最大也是最重要的组成部分。有研究表明，敲除GPIbα基因或替换GPIbα胞外区的小鼠模型可显著减少小鼠肺癌的肺部转移，但会并发血小板减少症(Jain S,Zuka M,Liu J,etal.Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(21))。另有研究表明，抗GPIIb/IIIa单克隆抗体可以有效阻断血小板与肿瘤细胞的粘附和聚集，但存在潜在的出血并发症也限制了这类单克隆抗体的应用(Amirkhosravi A,Mousa SA,Amaya M,et al.Thromb Haemost,2003,90(3):549-554))。因此，确立以GPIbα为靶点，筛选出靶向GPIbα抑制肿瘤转移而不影响血小板数量及功能的抗体药物，可能为肿瘤转移带来新的治疗方法。
靶向血小板膜蛋白肿瘤转移抑制剂的筛选模型是利用药理学实验技术：酶联免疫吸附测定(ELISA)，流式细胞术(FCM)等，建立筛选模型，以筛选出抑制肿瘤转移而不影响血小板数量和功能的靶向血小板膜蛋白肿瘤转移抑制剂。在对靶向血小板膜蛋白肿瘤转移抑制剂的研究过程中至关重要。
在以往的的研究中，已有部分模型建立并应用，但大部分模型是应用于已明确其肿瘤转移抑制功能的抑制剂的功能检测，并不适用于在抑制剂筛选过程中的应用。例如：在靶向血小板膜糖蛋白GPIbα胞外区抗体A11(Zhang W,Dang S,Hong T,et al.Journal ofThrombosis&Haemostasis,2012,120(14))的研究中，利用荧光标记肿瘤细胞建立检测模型来检测抗体作用下对血小板与肿瘤细胞粘附的影响。然而此模型未建立肿瘤细胞的乏氧-复氧模型来激活肿瘤细胞，模拟肿瘤细胞微环境，无法真实的模拟血小板与肿瘤细胞在体内的粘附情况。另外，此模型是应用于已确定抑制作用的抑制剂的功能检测，未能应用于待确定抑制作用抑制剂的筛选，需要进行优化，以建立筛选模型。另外，在靶向血小板膜糖蛋白GPIbα胞外区抗体5G6(Liang X,Russell S R,Estelle S,et al.Journal ofThrombosis&Haemostasis,2013,11(10))的研究中，已经利用ELISA建立了筛选模型以筛选特异性结合GPIbα的抑制剂。然而此模型只适用于可以获得大量人源血小板从而可以制备出纯化GPIbα的前提下，针对目前国内的研究环境，大量人源血小板难以获得，从而无法得到纯化的血小板膜蛋白，因此此模型需要改进。
建立靶向血小板膜蛋白GPIbα肿瘤转移抑制剂的筛选模型，可以在抑制剂的研发过程中，将无效样品及早发现去除，增加研发效率，减少研发工作量。为了更好地建立筛选模型，更准确的模拟血小板与肿瘤细胞作用微环境，以更方便精准的筛选出抑制剂，需要对现有模型进行优化，克服其需要大量人源血小板，以及无法准确模拟肿瘤微环境等缺点。另外需要从初步筛选，二次筛选，到功能验证，建立一系列完整的筛选模型，使筛选过程更加系统规范。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述缺陷和不足，提供了一种可显著减少在获得靶向血小板膜糖蛋白GPIbα抑制剂过程中对人源血小板的需求、并最大程度在体外实验中活化肿瘤细胞模拟肿瘤细胞微环境、提高筛选准确性、具有很好地临床应用前景的靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及其筛选方法。
为了实现上述目的，在本发明一方面提供了一种靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体，其特点是，所述的单克隆抗体为特异性结合血小板膜蛋白GPIbα的单克隆抗体。
较佳的，所述的单克隆抗体抑制肿瘤转移且不影响血小板功能。
本发明另一方面提供了一种用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，其主要特点是，所述的方法包括：
第一筛选模型，利用酶联免疫吸附技术初步筛选出靶向GPIb-IX复合物的样品；
第二筛选模型，利用免疫印迹法，在筛选所述的第一筛选模型的基础上进一步筛选出靶向GPIbα的样品；
第三筛选模型，利用连续光谱荧光仪测定样品对血小板与肿瘤细胞粘附作用的影响，筛选出对两者粘附具有抑制作用的抑制剂；
第四筛选模型，利用流式细胞术检测样品对肿瘤细胞诱导血小板活化的影响，以筛选出具有抑制作用的抑制剂；
第五筛选模型，利用流式细胞术检测血小板活性蛋白表达，以筛选出不影响血小板数量及功能的抑制剂。
较佳的，所述的第一筛选模型具体包括：
采用ELISA技术，依照双抗体夹心法原理，首先将靶向血小板膜糖蛋白GPIX的单克隆抗体吸附于酶标板上，加入微量血小板裂解液，使其抓取其中的GPIb-IX复合物，之后加入待筛选样品，使其中的靶向GPIb-IX复合物的样品结合，最后加入酶标记抗体后显色，最终通过酶标仪读取OD值，选取目标孔，即初步筛选出靶向GPIb-IX复合物的样品。
较佳的，所述的第二筛选模型中通过最终条带位置确定待筛选样品与血小板裂解液的结合位置，筛选出靶向GPIbα的样品。
较佳的，所述的第三筛选模型中的肿瘤细胞为结肠癌细胞HCT116、乳腺癌细胞系MDA-MB-231及肺癌细胞系A549，并且所述的肿瘤细胞经缺氧24小时复氧2小时培养活化后与荧光染料标记的血小板共孵育。
较佳的，所述的第四筛选模型中的血小板活化包括血小板活性蛋白P-selectin及PAC-1的表达。
较佳的，所述的第五筛选模型中的血小板活性蛋白为血小板活性蛋白P-selectin及PAC-1。
本发明的有益效果具体在于：
1)、靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂(YQ3)可以有效抑制肿瘤细胞与血小板在体外的粘附，具有潜在的抑制肿瘤转移的作用，且YQ3不影响血小板的正常状态下的活化。
2)、第一筛选模型解决了对人源血小板大量需求的问题，在本发明提供的第一筛选模型中，单次筛选(筛选样品数量为96个)的人全血用量基本控制在3ml以内，并且结合第二筛选模型，仅两个实验就可准确筛选出靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的样品。
3)、第三筛选模型中肿瘤细胞在体外通过缺氧-复氧处理，模拟体内的缺血-再灌注损伤。缺氧会导致肿瘤细胞活化及肿瘤血管生成，复氧过程会继发细胞活化，产生自由基，生长因子，细胞因子以及基质金属蛋白酶等产物，肿瘤细胞通过缺氧-复氧处理后，与血小板发生粘附作用更符合其体内作用过程。
4)、第三筛选模型中将以往的通过荧光显微镜成像技术观察荧光，更改为通过连续光谱荧光仪扫描读数，使结果更加直观，减少实验误差，也避免了由于曝光时间过长而造成的荧光猝灭现象。
5)、本发明建立了一系列的筛选模型，可以将其整体应用于之后所有的靶向血小板膜糖蛋白GPIbα肿瘤转移抑制剂的研究，其中五个独立的筛选模型也可以分别应用于筛选；第一筛选模型为利用酶联免疫吸附测定建立的初步筛选模型，可独立应用于筛选出结合于血小板膜受体上的样品，第二筛选模型为利用免疫印迹法建立的二次筛选模型，可独立应用于确定筛选样品的靶向性，第三、第四筛选模型是利用流式细胞仪及连续光谱荧光仪建立的功能检测模型，可联合应用于筛选出在体外实验中抑制肿瘤转移的样品，第五筛选模型是利用流式细胞仪建立的功能检测模型，可以独立应用于对不影响血小板正常活化的样品的筛选。
附图说明
图1为本发明的筛选方法流程图。
图2为本发明的YQ3与人血小板膜糖蛋白GPIb-IX复合物的结合示意图。
图3为本发明的YQ3与人血小板膜糖蛋白GPIbα的结合示意图。
图4为本发明的YQ3对血小板与肿瘤细胞粘附的抑制作用示意图。
图5为本发明的YQ3对肿瘤细胞诱导血小板活化的抑制作用示意图。
图6a和图6b为本发明的YQ3对血小板正常活化的影响示意图。
图7为本发明的YQ3抗体纯度示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
为了能够更清楚的理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
经建立的靶向血小板膜蛋白GPIbα肿瘤转移抑制剂筛选模型筛选，对分泌不同抗体的杂交瘤细胞上清进行检测，最终筛选出靶向GPIbα抗肿瘤转移但不影响血小板正常功能的抗体YQ3，抗体纯化后纯度如图7所示，纯度较高，具体方法包括：
第一筛选模型(初次筛选)：以酶联免疫吸附(ELISA)法为基础，检测样品对血小板GPIb-IX复合物的结合能力。以小鼠抗人血小板膜糖蛋白GPIbα单克隆抗体VM16d为阳性对照，以血小板膜糖蛋白CD42a(GPIX)单克隆抗体抓取血小板裂解液中GPIb复合物作为抗原，以分泌不同抗体的杂交瘤细胞上清作为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，A450波长下检测吸光度。如图2结果显示，空白对照组为RPMI-1640 10％FBS培养基，阳性对照组为小鼠抗人血小板膜糖蛋白GPIbα抗体VM16d单克隆抗体，PBS组作为VM16d组的空白对照。从图2中可以看出，YQ3与GPIb-IX结合能力较强，其他待筛选抗体的结合能力均较弱，故数据未给出。
具体模型创建步骤为：
(1)、碳酸盐缓冲液稀释CD42c抗体至2μg/ml，4℃以下过夜(50μl/孔)；
(2)、用封闭缓冲液在室温中封闭2h(200μl/孔)；
(3)、用洗涤缓冲液洗涤封闭板3次，200μl/孔，每次静置3min；
(4)、加入100μl血小板裂解物，室温下孵育2h；
(5)、洗涤缓冲液洗涤3次200μl/孔，每次静置3min；
(6)、加入不同待筛选样品，室温孵育1小时；
(7)、洗涤缓冲液洗涤3次，200μl/孔，每次静置3min；
(8)、用HRP-羊抗小鼠的lgG(1:5000，PBS稀释，50μL/孔)在室温下孵育1h；
(9)、洗涤缓冲液洗涤2次，200μl/孔，每次静置3min；
(10)、加入底物TMB 50μl，反应15min；
(11)、加入30μL 1M稀硫酸终止反应，在450nm波长下读取荧光，选取OD值高的样品为结合于GPIb-IX复合物的样品。OD值越高，结合力越大。
第二筛选模型(二次筛选)：以Western blot实验检测不同杂交瘤细胞上清中的抗体在血小板膜上的具体结合位置。以人血小板膜糖蛋白GPIbα抗体VM16d单克隆抗体为阳性对照，β-actin为阴性对照，如图3结果显示YQ3与VM16d的结合位置相近，为特异性结合于血小板膜糖蛋白GPIbα。
具体模型创建步骤为：
(1)、准备血小板裂解液，分别加入non-reducing和reducing loading buffer，95℃煮10min；
(2)、配置8％的分离胶，上样量为60g，70v条件下至样品跑至分离胶后转为120v，120v条件下至样品跑至结束；
(3)、300mA条件下转膜2.5h，封闭后一抗(不同杂交瘤细胞上清)过夜；
(4)、二抗孵育2h后显色。non-reducing条件下，结合位置为150kd左右，同时reducing条件下，结合位置为100kd左右的样品为结合位点为GPIbα的样品。
第三筛选模型(功能检测)：采用易发生肝转移的肺癌细胞系A549作为研究的细胞模型。肿瘤细胞分别与荧光染料标记的经过不同激动剂及抗体处理后的血小板共孵育，通过连续光谱荧光仪检测血小板与肿瘤细胞的粘附。同样以VM16d为阳性对照，PBS为VM16d组的空白对照；RPMI-1640 10％FBS培养基为样品的空白对照。图4结果显示，YQ3对血小板与肿瘤细胞的粘附具有较强抑制作用，其他待筛选样品抑制能力均弱于YQ3，故数据未给出。具体模型创建步骤为：
(1)、提前一天将HCT116、A549或MD231细胞以3*104/孔铺板，乏氧箱培养24h，正常培养箱培养2-4h。
(2)、纯化后的血小板悬浮于苔氏液中，计数2*108/ml。
(3)、以大约5μmol/LBCECF溶液与血小板37℃孵育1h，DMEM基础培养基洗1次，悬于DMEM无血清培养基中。
(4)、以大约2*107血小板每孔加入到96孔板中，100μl每孔。
(5)、荧光染料标记的血小板在与肿瘤细胞结合前分别与不同杂交瘤细胞上清在室温下共培养20min。
(6)、将处理过的血小板分别加入已有肿瘤细胞的96孔板中，培养4h。
(7)、DMEM基础培养液洗3次，洗去未粘附血小板，最后每孔加入100mlPBS。
(8)、连续光谱荧光仪检测荧光，激发波长484，发射波长535。最终选取荧光值低的样品为对血小板与肿瘤细胞粘附具有抑制作用的样品。荧光值越低，抑制作用越强。
第四筛选模型(功能检测)：以流式细胞仪检测血小板活性蛋白(PAC-1及P-selectin)的表达以筛选出对肿瘤细胞诱导的血小板活化有抑制作用的样品。同样以RPMI-164010％FBS培养基为空白对照，图5结果显示，P-selectin的阳性率从空白组的33.38％减少到22.1％，PAC-1的阳性率从空白组的9.25％减少到4.049％，说明YQ3对肿瘤细胞诱导的血小板活化的抑制作用。之前作为阳性对照的VM16d对于肿瘤细胞诱导的血小板活化没有明显的抑制作用，故数据未给出。
具体模型创建步骤为：
(1)、分别在96孔板对应孔加入含有不同抗体的细胞上清，分别加入1μl 50XCaCl2/孔；
(2)、提取血小板，分别加入4～6*105血小板/孔，每孔50μl，室温反应20min；
(3)、胰酶消化肿瘤细胞，苔氏液调整密度至1～3*104个/100μl，每孔加入100μl，37℃反应4h；
(4)、加入20μl标记抗体(APC-P-selectin＝1μl，FITC-PAC-1＝1μl，buffer＝18μl)，室温反应10min，加入220μl预冷的4％多聚甲醛到体系中，所有反应被终止；
(5)、440μl的反应体系加入流式管中，最终体系为400μl。流式细胞仪上检测相关蛋白表达。样品组的蛋白表达量与正常血小板蛋白表达量相比差异越大，说明样品对肿瘤细胞对血小板活化的抑制作用越大。
第五筛选模型(功能检测)：以流式细胞仪检测血小板活性蛋白(PAC-1及P-selectin)的表达以检测抗体对血小板正常活性及功能的影响。图6a和6b结果显示thrombin作用下血小板活化明显，而YQ3荧光与NC组比较没有明显改变，说明YQ3在体外对血小板正常活化没有明显影响。
具体模型创建步骤为：
(1)、分别在96孔板对应孔加入含有不同待筛选抗体的细胞上清及0.25U/mlthrombin，分别加入1μl 50X CaCl2/孔
(2)、提取血小板，分别加入4～6*105血小板/孔，每孔50μl，室温反应20min
(3)、加入20μl标记抗体(APC-P-selectin＝1μl，FITC-PAC-1＝1μl，buffer＝18μl)，室温反应10min，加入120μl预冷的4％多聚甲醛到50μl体系中，所有反应被终止
(4)、在流式管中加入160μl预冷的PBS，将240μl的反应体系加入流式管中，最终体系为400μl。流式细胞仪上检测相关蛋白表达。样品组结果与正常血小板蛋白表达相比，选取两者差异小的样品。样品组的蛋白表达量与正常血小板蛋白表达量相比差异越小，说明样品对血小板活性及功能影响越小。
本发明的有益效果具体在于：
1)、靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂(YQ3)可以有效抑制肿瘤细胞与血小板在体外的粘附，具有潜在的抑制肿瘤转移的作用，且YQ3不影响血小板的正常状态下的活化。
2)、第一筛选模型解决了对人源血小板大量需求的问题，在本发明提供的第一筛选模型中，单次筛选(筛选样品数量为96个)的人全血用量基本控制在3ml以内，并且结合第二筛选模型，仅两个实验就可准确筛选出靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的样品。
3)、第三筛选模型中肿瘤细胞在体外通过缺氧-复氧处理，模拟体内的缺血-再灌注损伤。缺氧会导致肿瘤细胞活化及肿瘤血管生成，复氧过程会继发细胞活化，产生自由基，生长因子，细胞因子以及基质金属蛋白酶等产物，肿瘤细胞通过缺氧-复氧处理后，与血小板发生粘附作用更符合其体内作用过程。
4)、第三筛选模型中将以往的通过荧光显微镜成像技术观察荧光，更改为通过连续光谱荧光仪扫描读数，使结果更加直观，减少实验误差，也避免了由于曝光时间过长而造成的荧光猝灭现象。
5)、本发明建立了一系列的筛选模型，可以将其整体应用于之后所有的靶向血小板膜糖蛋白GPIbα肿瘤转移抑制剂的研究，其中五个独立的筛选模型也可以分别应用于筛选；第一筛选模型为利用酶联免疫吸附测定建立的初步筛选模型，可独立应用于筛选出结合于血小板膜受体上的样品，第二筛选模型为利用免疫印迹法建立的二次筛选模型，可独立应用于确定筛选样品的靶向性，第三、第四筛选模型是利用流式细胞仪及连续光谱荧光仪建立的功能检测模型，可联合应用于筛选出在体外实验中抑制肿瘤转移的样品，第五筛选模型是利用流式细胞仪建立的功能检测模型，可以独立应用于对不影响血小板正常活化的样品的筛选。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (8)

1.一种靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体为特异性结合血小板膜蛋白GPIbα的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体抑制肿瘤转移且不影响血小板功能。
3.一种用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，其特征在于，所述的方法包括：
第一筛选模型，利用酶联免疫吸附技术初步筛选出靶向GPIb-IX复合物的样品；
第二筛选模型，利用免疫印迹法，在筛选所述的第一筛选模型的基础上进一步筛选出靶向GPIbα的样品；
第三筛选模型，利用连续光谱荧光仪测定样品对血小板与肿瘤细胞粘附作用的影响，筛选出对两者粘附具有抑制作用的抑制剂；
第四筛选模型，利用流式细胞术检测样品对肿瘤细胞诱导血小板活化的影响，以筛选出具有抑制作用的抑制剂；
第五筛选模型，利用流式细胞术检测血小板活性蛋白表达，以筛选出不影响血小板数量及功能的抑制剂。
4.根据权利要求3所述的用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，其特征在于，所述的第一筛选模型具体包括：
采用ELISA技术，依照双抗体夹心法原理，首先将靶向血小板膜糖蛋白GPIX的单克隆抗体吸附于酶标板上，加入微量血小板裂解液，使其抓取其中的GPIb-IX复合物，之后加入待筛选样品，使其中的靶向GPIb-IX复合物的样品结合，最后加入酶标记抗体后显色，最终通过酶标仪读取OD值，选取目标孔，即初步筛选出靶向GPIb-IX复合物的样品。
5.根据权利要求3所述的用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，其特征在于，所述的第二筛选模型通过最终条带位置确定待筛选样品与血小板裂解液的结合位置，筛选出靶向GPIbα的样品。
6.根据权利要求3所述的用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，其特征在于，所述的第三筛选模型中的肿瘤细胞为结肠癌细胞HCT116、乳腺癌细胞系MDA-MB-231及肺癌细胞系A549，并且所述的肿瘤细胞经缺氧24小时复氧2～4小时培养活化后与荧光染料标记的血小板共孵育。
7.根据权利要求3所述的用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，其特征在于，所述的第四筛选模型中的血小板活化检测包括对血小板活性蛋白P-selectin及PAC-1表达的检测。
8.根据权利要求3所述的用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，其特征在于，所述的第五筛选模型中的血小板活性蛋白为血小板活性蛋白P-selectin及PAC-1。
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