JP2021516256A - Ｃｄ１９に基づくキメラ抗原受容体及びその利用 - Google Patents

Abstract

本出願は、ＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体及びその応用に関し、具体的には、腫瘍特異的標的ＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞技術を構築するためのレンチウイルスベクター材料及び方法、並びに抗腫瘍療法におけるその利用に関する。抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域と、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、誘導性自殺融合ドメインとをタンデム配置で含むキメラ抗原受容体であって、抗原結合ドメインは腫瘍表面抗原に結合し、腫瘍表面抗原がＣＤ１９である。本願のキメラ抗原受容体は、Ｔ細胞刺激シグナルの特異的な遺伝子改変により、他のキメラ抗原受容体よりも優れた殺傷効果と安全性を有しているため、副作用が少なくＣＡＲ-Ｔ細胞の免疫効果を高め、ＣＡＲ-Ｔ細胞の治療効果及び安全性を高めることができる。

Description

本出願は、腫瘍のための細胞性免疫療法の分野に関し、特に、ＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体及びその利用、具体的には、腫瘍特異的標的ＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞技術を構築する方法、及び抗腫瘍療法におけるその利用に関する。

Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むＢリンパ球悪性腫瘍は、成人又は小児を問わず血液疾患の大きな割合を占める。これらの患者を治療するための慣例的な方法としては、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、小分子薬及び抗体薬の使用が挙げられる。一部の患者はこれらの療法によって治癒し得るが、多くの患者は化学療法及び放射線療法に対する有害反応、薬物への耐性、無効な移植、再発の繰り返し及び遺伝的突然変異から生じる難治性疾患のため死亡した。

腫瘍免疫学理論及び臨床技術の発展により、キメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲ−Ｔ）は、最も有望な腫瘍免疫療法の１つとなった。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、典型的には、腫瘍関連抗原結合領域と、細胞外ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達領域とからなる。一般的に、ＣＡＲは、ヒンジ領域及び膜貫通領域を介してＴ細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメインに結合された、腫瘍関連表面抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）領域又は結合ドメインを含む。最も一般的なリンパ球活性化部には、Ｔ細胞エフェクター機能誘発部（例えばＣＤ３ζ）とタンデムに連結されたＴ細胞共刺激ドメインが含まれる。ＣＡＲを媒介する養子免疫療法により、ＣＡＲ移植Ｔ細胞は、ＨＬＡに制限されずに標的腫瘍細胞上のＴＡＡを直接認識することが可能となる。Ｔ細胞が、ＣＡＲの発現によって腫瘍細胞上に発現した抗原を標的とするように遺伝子改変されており、ＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞を使用してこれらの種類の患者を治療する試みは有望な成功を収めている。

ＣＤ１９分子はＢリンパ球における血液悪性腫瘍の治療のための潜在的な標的であり、ＣＡＲ研究における焦点でもある。ＣＤ１９の発現は正常Ｂ細胞及び悪性Ｂ細胞に限定されているため、安全性試験のために広く受け入れられているＣＡＲ標的である。ＣＤ１９分子を標的とするキメラ抗原受容体遺伝子が改変されたＴ細胞（ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ）は、多くの難治性急性Ｂリンパ性白血病の治療において大きな成功を収めている。

特許文献１は、キメラ抗原受容体ｈＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ８α−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ及びその使用を開示している。該キメラ抗原受容体は、抗ヒトＣＤ１９モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域（ｈＣＤ１９ｓｃＦｖ）と、ヒトＣＤ８αヒンジ領域と、ヒトＣＤ２８膜貫通及び細胞内領域と、ヒトＣＤ３ζ細胞内領域とからタンデム配置で構成されている。しかしながら、従来技術においてＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体に起因する免疫因子ストームは、比較的強い毒性及び強い副作用を有する。

中国特許出願公開第１０４７８８５７３号

したがって、副作用が少なく、殺傷効果に優れ、免疫因子ストームを簡単には引き起こさないキメラ抗原受容体を見出すことが特に重要である。

本出願は、ＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体及びその利用を提供する。本出願で作製されるキメラ抗原受容体は、ＣＡＲ刺激シグナルに対するＴ細胞の免疫効果を増強し、Ｔ細胞シグナルを遺伝子改変することによりＣＡＲ−Ｔ細胞の治療効果を増強する。

この目的を達成するために、本出願は以下の技術的な解決手段を採用する。

１つの態様において、本出願は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域と、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、誘導性自殺融合ドメイン（inducible suicide fusion domain）とをタンデム配置で含むＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体であって、
前記抗原結合ドメインは腫瘍表面抗原に結合し、前記抗原結合ドメインは腫瘍表面抗原ＣＤ１９に対する一本鎖抗体であり、前記共刺激シグナル伝達領域はＣＤ２７シグナル伝達ドメインを含み、かつ前記誘導性自殺融合ドメインはｉＣａｓｐ９である、キメラ抗原受容体を提供する。

本出願では、抗原結合ドメインが腫瘍表面抗原ＣＤ１９に結合することと、その後のＴ細胞受容体の細胞内シグナル、すなわちＣＤ２７シグナル伝達ドメインに対する特定の遺伝子改変とによって、腫瘍表面抗原は、本出願のキメラ抗原受容体に特異的に結合して、より効果的なＴ細胞刺激シグナルを伝達することが可能となり、ｈキメラ抗原受容体及び他の腫瘍抗原より優れた効果を発揮し、標的が高度に発現されることで、ＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫効果も高められる。

さらに、本発明者らは、Ｔ細胞シグナル、すなわちＣＤ２７シグナル伝達ドメインの誘導性自殺融合ドメインへの結合と最適化及び再編成とによって、本出願のキメラ抗原受容体がより優れた殺傷効果を発揮し、免疫因子ストームを簡単には引き起こさず、安全な除去メカニズムを伴うことを見出した。これらの改変により、キメラ抗原受容体ＣＤ１９細胞のより効果的で幅広い安全な利用が可能となる。

本出願によれば、遺伝子改変されたＴ細胞キメラ受容体（ＣＡＲ）及びＣＤ１９抗原結合ドメインに対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を以下に例示する。

本出願では、Ｔ細胞受容体シグナル遺伝子は特別に改変されているので、改変された配列によって発現されるＴ細胞受容体のシグナルはより持続可能であり、免疫因子をゆっくり放出するため、ｉｎ ｖｉｖｏでの反応の安全性が向上する。

本出願によれば、腫瘍表面抗原ＣＤ１９に対する一本鎖抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して９０％を超えるホモロジーを有するアミノ酸配列を有する。配列番号１に示されるアミノ酸配列は以下の通りである：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ

本出願によれば、９０％を超えるホモロジーを有するアミノ酸配列は、他の一本鎖抗体又はヒト化ＣＤ１９一本鎖抗体によって置き換えることができる。９０％を超えるホモロジーを有するアミノ酸突然変異体は、依然としてＣＤ１９一本鎖抗体として機能する。

本出願によれば、ＣＤ２７シグナル伝達ドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は以下の通りである：
ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ

本出願によれば、誘導性自殺融合ドメインｉＣａｓｐ９は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は以下の通りである：
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ

本出願によれば、誘導性自殺融合ドメインは、２Ａ配列を介してＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとタンデムに連結されている。２Ａ配列は、誘導性自殺融合ドメインにより発現されたタンパク質をキメラ抗原受容体タンパク質から切断させ、それによりキメラ抗原受容体がその機能を発揮することを可能にする。自殺融合ドメインは、アクチベーターを注入することによって活性化することができ、それによりキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は死滅してそれらの機能を失う。

本出願によれば、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及び／又はＣＤ８α膜貫通ドメインである。幾つかの特定の実施形態では、膜貫通ドメインは選択されるか、又はアミノ酸置換によって改変され得る。

本出願によれば、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを更に含む。当業者は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２７シグナル伝達ドメインの配置を必要に応じて調整することができる。ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２７シグナル伝達ドメインの異なる配置によっても、キメラ抗原受容体に影響は及ぼされない。本出願では、ＣＤ２８−ＣＤ２７の遺伝子改変された配列の組合せが使用される。

ＣＤ２８細胞外シグナル伝達ドメインは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は、以下の通りである：
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ

ＣＤ２８膜貫通領域誘導ドメイン（transmembrane region conduction domain）は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は、以下の通りである：
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ

ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は、以下の通りである：
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳ

本出願によれば、キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体の膜貫通輸送を指揮することができるシグナルペプチドであるシグナルペプチドを更に含む。当業者は、当該技術分野で慣用のシグナルペプチドを必要に応じて選択することができる。シグナルペプチドは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する分泌シグナルペプチドであり、該配列は以下の通りである：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ

さらに、分泌シグナルペプチドは、ＣＤ８ａ遺伝子のためのシグナルペプチドであり、該分泌シグナルペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は以下の通りである：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ

代替的には、分泌シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦＲ遺伝子のためのシグナルペプチドであり、該分泌シグナルペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は以下の通りである：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ

本出願のキメラ抗原受容体は、実際の状況に応じて当業者により選択され得るヒンジ領域を更に含み得るが、該ヒンジ領域は本明細書では特に限定されない。ヒンジ領域の存在は、本出願のキメラ抗原受容体の性能に影響を及ぼさない。

本出願によれば、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドと、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、２Ａ配列と、誘導性自殺融合ドメインとをタンデム配置で含む。

好ましい技術的な解決手段として、前記キメラ抗原受容体は、タンデム配置での、分泌シグナルペプチド、ＣＤ１９抗原結合ドメイン、ＣＤ８α及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞外シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにｉＣａｓｐ９ドメインであり、以下の特定の配置を有する：
分泌−ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ２７−ＣＤ３ζ−２Ａ−ｉＣａｓｐ９

本出願によれば、分泌−ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ２７−ＣＤ３ζ−２Ａ−ｉＣａｓｐ９（４Ｓ−ＣＡＲ１９）のキメラ抗原受容体は、配列番号４に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して８０％を超えるホモロジーを有するアミノ酸配列を有する。配列番号４に示されるアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＴＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ、又は本出願によれば、分泌−ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ２７−ＣＤ３ζ−２Ａ−ｉＣａｓｐ９（４Ｓ−ＣＡＲ１９）のキメラ抗原受容体は、配列番号５に示される核酸配列又は該核酸配列に対して８０％を超えるホモロジーを有する核酸配列を有する。配列番号５に示される核酸配列は以下の通りである：
ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＡＣＣＣＧＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＧＴ

本出願において、キメラ抗原受容体は、ＥＦ１ａ若しくはＣＭＶ又はこれらのいずれか若しくはこれらの少なくとも２つであるプロモーターを更に含む。

本出願によれば、キメラ抗原受容体は、該キメラ抗原受容体をコードする核酸配列による発現のためにＴ細胞へとトランスフェクションされる。

本出願によれば、トランスフェクションは、ウイルスベクター、真核性発現プラスミド若しくはｍＲＮＡ配列のいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せを介して行われて、Ｔ細胞へとトランスフェクションされ、好ましくはウイルスベクターを介してＴ細胞へとトランスフェクションされる。

さらに、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター若しくはレトロウイルスベクターのいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せ、好ましくはレンチウイルスベクターである。

第２の態様において、本出願は、哺乳動物細胞を、第１の態様のキメラ抗原受容体を含むウイルスベクターとパッケージングヘルパープラスミドｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ−ＶＳＶＧとで同時トランスフェクションすることによって得られる、組換えレンチウイルスを提供する。

本出願では、組換えレンチウイルスは、Ｔ細胞を含む細胞を効果的に免疫化することができ、標的化Ｔ細胞を作製することができる。

本出願によれば、前記哺乳動物細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞若しくはＴＥ６７１細胞のいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せである。

第３の態様において、本出願は、第１の態様に記載のキメラ抗原受容体及び／又は第２の態様に記載の組換えレンチウイルスを含むＴ細胞を提供する。

本出願では、Ｔ細胞は優れた標的化効果を有し、低用量の免疫因子を放出することができ、低毒性反応の特性を有する。

第４の態様において、本出願は、第１の態様に記載のキメラ抗原受容体、第２の態様に記載の組換えレンチウイルス、又は第３の態様に記載のＴ細胞のいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せを含む組成物を提供する。

第５の態様において、本出願は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞の作製における、第１の態様に記載のキメラ抗原受容体、第２の態様に記載の組換えレンチウイルス、又は第３の態様に記載の組成物の使用、及び腫瘍治療薬におけるその利用を提供する。

さらに、腫瘍は血液関連腫瘍性疾患及び／又は固形腫瘍である。腫瘍性疾患は、限定されるものではないが、白血病から選択される。

従来技術と比較して、本出願は、以下の有益な効果を有する：
（１）Ｔ細胞キメラ受容体遺伝子の特定の改変とＴ細胞シグナル伝達領域の最適化及び改変とによって、本出願のキメラ抗原受容体はより優れた殺傷効果を発揮することができ、免疫因子ストームを簡単には引き起こさず、安全な除去メカニズムを伴う。これらの改変により、キメラ抗原受容体ＣＤ１９細胞のより効果的で幅広い安全な利用が可能となる。
（２）白血病及びリンパ腫において高度に発現されるＣＤ１９を標的とする本出願のキメラ抗原受容体は、腫瘍表面抗原を特異的に認識することができる。さらに、該キメラ抗原受容体は、腫瘍表面抗原ＣＤ１９を認識した後に、穏やかで効果的な応答を引き起こすため、該キメラ抗原受容体は他のキメラ抗原受容体よりも安全な効果を有し、こうしてＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫効果だけでなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性も高められる。

本出願のキメラ抗原受容体の合成遺伝子配列マップを示す図である。 ＣＤ１９抗体を使用した初代Ｂ−ＡＬＬ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すヒストグラムを示す図であり、その際、試料は３人のＢ−ＡＬＬ（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）患者の骨髄から得られ、灰色の領域は同じ型のネガティブコントロールを表す。 ＣＤ１９抗体で染色された初代Ｂ−ＡＬＬ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すドットプロットを示す図であり、その際、試料は３人のＢ−ＡＬＬ患者の骨髄から得られる。 ＣＡＲ−Ｔ細胞による白血病細胞系統のｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＤ１９特異的殺傷試験の結果を示す図である。 異なるシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞間でのｉｎ ｖｉｔｒｏの殺傷能力の動的比較を示す図である。 異なるシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞間での、ｉｎ ｖｉｔｒｏで殺傷に際して免疫因子を放出する能力の比較を示す図である。 ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した臨床試験のフローチャートを示す図である。 本出願のキメラ抗原受容体の効果と他のキメラ抗原の効果との間の比較を示す図である。

本発明により採用された技術的手段及びその効果を更に説明するために、本発明の技術的な解決手段を、添付の図面及び具体的な実施形態を参照して以下で更に説明するが、本発明はこれらの実施形態の範囲に限定されない。

実施例において、具体的に示されていない技術又は条件は、当該技術分野の文献に記載される技術若しくは条件に従って又は製品の使用説明書に従って行われる。製造業者により示されていない使用される試薬又は機器は、多くの供給元から市販されている慣例的な製品である。

実施例１ キメラ抗原受容体の構築
（１）図１に示される、分泌シグナルペプチド、ＣＤ１９抗原結合ドメイン、ＣＤ８α及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにカスパーゼ９ドメイン、すなわち、分泌−ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ２７−ＣＤ３ζ−２Ａ−ｉＣａｓｐ９を、遺伝子合成によって化学的に合成した。

実施例２ レンチウイルスのパッケージング
（１）２９３Ｔ細胞を使用して、１７時間〜１８時間培養した。
（２）１０％ＦＢＳを含有する新たなＤＭＥＭを添加した。
（３）滅菌遠心チューブに以下の試薬を添加した：各ウェルにＤＭＥＭを取り、ヘルパーＤＮＡミックス（ｐＮＨＰ、ｐＨＥＦ−ＶＳＶ−Ｇ）及びｐＴＹＦ ＤＮＡベクターを添加し、ボルテックスして、振盪した。
（４）Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ又は任意のトランスジェニック材料を遠心チューブに添加し、室温で７分間〜１０分間放置した。
（５）各培養細胞に、遠心チューブ内のＤＮＡ−Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ混合物を添加し、ボルテックスして、混合した。
（６）３％のＣＯ_２インキュベーター内にて３７℃で４時間〜５時間培養した。
（７）培養培地から上清を抜き取り、培養物を２９３細胞培地ですすぎ、更なる培養のために培地を添加した。
（８）培養物を５％のＣＯ_２インキュベーターに戻して、一晩培養した。翌朝及び翌日に、妥当であれば蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクション効率を観察した。

実施例３ レンチウイルスの精製及び濃縮
１）ウイルスの精製
細胞片を１０００ｇで５分間の遠心分離により除去して、ウイルス上清を得た。ウイルス上清を０．４５μｍ低タンパク質結合フィルターで濾過し、ウイルスを小分けにして、−８０℃で貯蔵した。

典型的には、培地１ｍｌ当たり１０^７超の形質導入単位のレンチウイルスベクターが、トランスフェクションされた細胞によって産生され得る。

２）Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを用いたレンチウイルスの濃縮
（１）ウイルス上清をＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターチューブに添加した後に、２５００ｇで３０分間遠心分離した。

（２）フィルターチューブを振盪した後に、４００ｇで２分間遠心分離し、濃縮されたウイルスを収集カップに収集した。最後に、ウイルスを全てのチューブから単一の遠心チューブに収集した。

実施例４ ＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入
活性化させたＴ細胞を培養皿に播種し、標的抗原に対する特異性を有する濃縮されたレンチウイルスを添加し、１００ｇの遠心力速度で１００分間遠心分離（スピノキュレーション）し、３７℃で２４時間培養し、そして細胞培養因子を含むＡＩＭ−Ｖ培地を添加し、２日間〜３日間の培養の後に、細胞を採取し、計数することで、利用可能なＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞を得た。

実施例５ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＡＲ−Ｔ細胞による白血病細胞系統の殺傷
（１）図２（ａ）及び図２（ｂ）から、ＣＤ１９が初代骨髄Ｂ−ＡＬＬ細胞の表面上で高度に発現され、Ｂ−ＡＬＬ患者において広く発現されたことが分かり、本出願で使用するために選択されたＣＤ１９キメラ抗原受容体をＢ−ＡＬＬの治療に使用することができることが示唆される。

（２）ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的細胞に対する認識及び殺傷効果のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価：非特異的Ｔ細胞、ＧＤ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞及び本出願で作製された特定の４Ｓ−ＣＤ１９ ＣＡＲＴ（４Ｓ−ＣＡＲ１９）細胞を、ＧＤ２ではなくＣＤ１９を発現する標的細胞、すなわちＧＦＰを発現するＲＳ４−１１（ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞系統）と一緒に（Ｔ細胞：ＲＳ４−１１＝３：１）５％のＣＯ_２インキュベーター内にて３７℃で２４時間共培養した。

（３）共培養の後の異なる時点で、細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ここで、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞は、特異的な殺傷の結果としてアポトーシス寸前（初期アポトーシス）の細胞であり、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩの二重陽性細胞は、特異的な殺傷の結果としてアポトーシス細胞であり、ＰＩ陽性細胞は一般的に死細胞であった。

これらの結果を図３に示した。ＧＦＰ蛍光強度を示すフローサイトメトリーグラフから、１０^３以上の蛍光強度を有する細胞が標的ＲＳ４−１１腫瘍細胞（ＧＦＰ標識）であることが分かり、こうして更なる分析のためにゲーティングされた。ＲＳ４−１１細胞をＴ細胞なしで共培養した場合に、バックグラウンドにおいて、９％の標的細胞はアポトーシス寸前であり、６％の標的細胞はアポトーシス細胞であることが示された。ＲＳ４−１１細胞を改変されていない一般的なＴ細胞と共培養した場合に、１８．０％の標的細胞がアポトーシス寸前であり、２６．４％の標的細胞はアポトーシス細胞であり、これは非特異的殺傷バックグラウンド値として解釈した。ＲＳ４−１１細胞をＧＤ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養した場合に、１７．３％の標的細胞がアポトーシス寸前であり、２９．９％の標的細胞はアポトーシス細胞であり、これも非特異的殺傷バックグラウンド値として解釈した。ＲＳ４−１１細胞を特定のＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養した場合に、２２．３％の標的細胞がアポトーシス寸前であり、５２．８％の標的細胞はアポトーシス細胞であり、これは特異的殺傷の効果であった。アポトーシス寸前の標的細胞及びアポトーシス標的細胞の数は、ＣＤ１９キメラ抗原受容体を有するＴ細胞の場合に他のコントロール群よりも有意に大きかったため、ＣＤ１９キメラ抗原受容体は、標的ＲＳ４−１１細胞に対する高い殺傷効果を有することが示された。

実施例６ ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺傷の動的比較及び安全性試験
（１）４１ＢＢ ＣＡＲ１９、２８−２７ ＣＡＲ１９及び本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９（４Ｓ−ＣＡＲ１９）を含む、異なるシグナル伝達ドメインを備えた非特異的Ｔ細胞又はＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＲＳ４−１１と一緒に５％のＣＯ_２インキュベーター内にて３７℃で２４時間共培養した。培養の２時間後、６時間後及び２４時間後に、生きているＲＳ４−１１細胞のパーセンテージを記録し、これらの結果を図４（ａ）に示した。４１ＢＢ ＣＡＲ１９、２８−２７ ＣＡＲ１９及び本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９は、コントロール群のＴ細胞と比較してＲＳ４−１１細胞に対して有意な殺傷効果を有した。培養の２時間後及び６時間後に得られたデータから分かるように、本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９は、培養の２４時間後に比較的遅い殺傷動態を有したが、４１ＢＢ ＣＡＲ１９及び２８−２７ ＣＡＲ１９と同じ殺傷効果が達成された。本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９によって引き起こされる白血病細胞の除去により、臨床用途において重篤な毒性応答（サイトカイン放出症候群、ＣＲＳ）が誘発されないことが示された。

（２）４１ＢＢ ＣＡＲ１９、２８−２７ ＣＡＲ１９及び本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９を含む、異なるシグナル伝達ドメインを備えた非特異的Ｔ細胞又はＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＲＳ４−１１と一緒に５％のＣＯ_２インキュベーター内にて３７℃で共培養した。６時間後に、異なるＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞によって産生される免疫因子の量及び脱顆粒効果を細胞内因子染色法によって検出し、これらの結果を図４（ｂ）に示した。４１ＢＢ ＣＡＲ１９、２８−２７ ＣＡＲ１９及び本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９は、コントロール群のＴ細胞と比較してより強力な（ＣＤ１０７ａ）脱顆粒能を示し、より多くのインターフェロン及びインターロイキン−２を産生した。インターフェロンを産生する細胞のパーセンテージは、コントロール群のＴ細胞では０．６％であり、４１ＢＢ ＣＡＲ１９では６．９％であり、２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９では４．３％であり、２８−２７ ＣＡＲ１９では６．３％であった。インターロイキン−２を産生する細胞のパーセンテージは、コントロール群のＴ細胞では２．５％であり、４１ＢＢ ＣＡＲ１９では８．９％であり、２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９では８．８％であり、２８−２７ ＣＡＲ１９では１０．２％であった。共培養の６時間後に、本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９は、他の種類のシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞よりも少量の免疫因子を放出したことが分かる。本出願の２８−２７ Ｃａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ１９（４ＳＣＡＲ１９）は、臨床用途で使用した場合に、重篤な免疫因子ストーム（ＣＲＳ）を引き起こさず、治療の安全性が高められると推論することができる。

実施例７ ＣＡＲ−Ｔ細胞の臨床用途
本研究所は、２０１３年７月から２０１６年７月まで２２の臨床医療センター及び病院と協力して研究し、登録基準を満たすＣＤ１９陽性で化学療法耐性のＢ−ＡＬＬ患者１０２人を治療し、注意深く追跡した。合計５５人の小児及び４７人の成人がおり、そのうち２７人が同種造血幹細胞移植を受けていた。これらの患者は、ＣＡＲ−Ｔを投与した時点で骨髄中の初期白血病芽細胞の中央値パーセンテージ１４．５％（０％〜９８％の範囲）を有していた。これらの患者のうち、６９人の患者は、５０％未満の骨髄中の初期白血病芽球を有し、他の３３人の患者は５０％超の骨髄中の白血病芽球を有していた。初期診断からＣＡＲ−Ｔ細胞療法までの中央値期間は１７ヶ月（２ヶ月〜１６４ヶ月）であった。

臨床試験のフローチャートを図５に示した。患者を最初に病院及び研究所によって評価し、登録条件が満たされたら、自己白血球又はドナーの白血球を収集した。次に、標準的なプロトコルに従って、ＣＤ３陽性Ｔ細胞をＰＢＭＣからスクリーニングし、活性化し、４ＳＣＡＲ１９でトランスフェクションすることで、ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した。患者を、注入前にシクロホスファミド及び／又はフルダラビンで前処置した。注入されるべき細胞の平均数は、体重１キログラム当たり１．０５×１０^６個の細胞であった。白血球及びＣＡＲ−Ｔ細胞の品質、遺伝子トランスフェクション率、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖及び注入されたＣＡＲ−Ｔ細胞の有効数を評価し、記録した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を患者に注入した後に、免疫因子ストーム及びＣＡＲコピー数を、１ヶ月以内で注意深く監視した。治療毒性の結論及び最終的な治療成果は、長期の臨床的評価及び研究所評価によって得られる。毒性評価は、米国国立癌研究所の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ ｖ４．０３）に基づいて行った。コックス比例ハザードモデルを使用してカテゴリー変数及び連続変数を分析し、生存分析のためにカプラン−マイヤー曲線を使用した。これらの結果を表１〜表３に示した。

表１は患者の寛解率及び生存日数を示した。

ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を４年間受け、完全なデータを収集した患者は合計１１０人いた。５１人の小児及び４５人の成人を含む９６人の患者において完全寛解が達成された。再発を伴わない平均日数は１００日を超え、全生存日数は２００日を超えた。これらの結果は、本出願の４ＳＣＡＲ１９ Ｔ細胞の良好な治療効果を示した。

表２はＣＡＲ−Ｔ細胞の注入後の患者の免疫因子ストーム状況を示した。

５０％未満の骨髄悪性細胞を有する患者のうち、グレード０〜１の免疫因子ストーム応答しか有しない患者は５５人おり、１７人の患者はグレード２〜４の応答を有していた。５０％以上の骨髄悪性細胞を有する患者のうち、グレード０〜１のグレードの免疫因子ストーム応答を有する患者は１７人おり、２１人の患者はグレード２〜４のグレードの応答を有していた。全体として、６５％の患者はグレード０〜１の免疫因子ストーム応答しか有しておらず、再注入前の応答強度と悪性細胞負荷との間に統計的相関はなかった。これらの結果は、本出願のＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性を裏付けた。

表３はＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を示す。

ＣＡＲのコピー数は、患者にＣＡＲ−Ｔ細胞を注入した後３週間以内に末梢血中で検出することができた。データを収集した１０１人の患者のうち、コピー数が検出されなかった患者は１人だけおり、更に、検出されたコピー数が１％未満であった患者は６０人おり、３２人の患者は１％〜５％のコピー数を有し、そして依然として８人の患者は５％超の検出されたコピー数を有していた。末梢血細胞の基準数が多いため、ＣＡＲコピー数の１％の検出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の有意な増幅を表した。この表から、本出願のＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで十分に増殖し、癌細胞を殺傷する機能を十分に発揮し得ることを理解することができる。

まとめると、ＣＤ１９腫瘍表面抗原に対する本出願のキメラ抗原受容体の一本鎖抗体は変異エスケープの傾向がない。図６から、本出願のキメラ抗原受容体は他のキメラ抗原受容体よりも優れた効果を発揮したことが分かる。Ｔ細胞シグナル伝達領域の最適化及び改変によって、本出願のキメラ抗原受容体はより優れた殺傷効果を発揮することができ、重篤な免疫因子ストーム（ＣＲＳ）を誘発せず、安全設計された除去メカニズムを伴うため、ＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫効果が増強されるとともに、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療効果及び安全性効果が向上する。

本出願人は、本出願の詳細な方法が上記実施例を通して説明されたと言明するが、本出願は上記の詳細な方法に限定されない。すなわち、本出願の実施が上記の詳細な方法によるものでなければならないことを意味するものではない。当業者は、原材料の同等物による置き換え又は本出願の生成物への補助成分の追加及び特定の方法の選択等を含む本出願のあらゆる改善が、本出願の保護範囲及び開示範囲に含まれるものと理解すべきである。

Claims (15)

1. 抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域と、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、誘導性自殺融合ドメインとをタンデム配置で含むＣＤ１９に基づくキメラ抗原受容体であって、
   前記抗原結合ドメインは腫瘍表面抗原に結合し、前記抗原結合ドメインは腫瘍表面抗原ＣＤ１９に対する一本鎖抗体であり、前記共刺激シグナル伝達領域はＣＤ２７シグナル伝達ドメインを含み、かつ前記誘導性自殺融合ドメインはｉＣａｓｐ９である、キメラ抗原受容体。
2. 前記腫瘍表面抗原ＣＤ１９に対する一本鎖抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して９０％を超えるホモロジーを有するアミノ酸配列を有し、
   前記ＣＤ２７シグナル伝達ドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、かつ、
   前記誘導性自殺融合ドメインｉＣａｓｐ９は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
3. 前記誘導性自殺融合ドメインは、２Ａ配列を介してＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとタンデムに連結されている、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
4. 前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及び／又はＣＤ８α膜貫通ドメインである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
5. 前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
6. 前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドと、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、２Ａ配列と、誘導性自殺融合ドメインとをタンデム配置で含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
7. 前記キメラ抗原受容体は、タンデム配置での、分泌シグナルペプチド、ＣＤ１９抗原結合ドメイン、ＣＤ８α及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞外シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにｉＣａｓｐ９ドメインである、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
8. 前記キメラ抗原受容体は、分泌−ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ２７−ＣＤ３ζ−２Ａ−ｉＣａｓｐ９であり、かつ、
   分泌−ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ２７−ＣＤ３ζ−２Ａ−ｉＣａｓｐ９の前記キメラ抗原受容体は、配列番号４に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して８０％を超えるホモロジーを有するアミノ酸配列を有する、又は、
   分泌−ＣＤ１９−ＣＤ２８−ＣＤ２７−ＣＤ３ζ−２Ａ−ｉＣａｓｐ９の前記キメラ抗原受容体は、配列番号５に示される核酸配列又は該核酸配列に対して８０％を超えるホモロジーを有する核酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
9. 前記キメラ抗原受容体は、該キメラ抗原受容体をコードする核酸配列による発現のためにＴ細胞へと形質導入され、
   好ましくは、前記形質導入は、ウイルスベクター、真核性発現プラスミド若しくはｍＲＮＡ配列のいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せを介して行われて、Ｔ細胞へとトランスフェクションされ、好ましくはウイルスベクターを介してＴ細胞へとトランスフェクションされ、
   好ましくは、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター若しくはレトロウイルスベクターのいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せ、好ましくはレンチウイルスベクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
10. 哺乳動物細胞を、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含むウイルスベクターとパッケージングヘルパープラスミドｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ−ＶＳＶＧとで同時トランスフェクションすることによって得られる、組換えレンチウイルス。
11. 前記哺乳動物細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞若しくはＴＥ６７１細胞のいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せである、請求項１０に記載の組換えレンチウイルス。
12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体及び／又は請求項１０若しくは１１に記載の組換えレンチウイルスを含むＴ細胞。
13. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０若しくは１１に記載の組換えレンチウイルス、又は請求項１２に記載のＴ細胞のいずれか１つ、又はこれらの少なくとも２つの組合せを含む組成物。
14. キメラ抗原受容体Ｔ細胞の作製における、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０若しくは１１に記載の組換えレンチウイルス、又は請求項１２に記載の組成物の使用、及び腫瘍治療薬におけるその利用。
15. 前記腫瘍は、血液関連腫瘍性疾患であり、
    好ましくは、前記血液関連腫瘍性疾患は、白血病又はリンパ腫から選択される、請求項１４に記載の使用。

Images