CN107337737A

CN107337737A - 一种嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN107337737A
Application number: CN201710586786.3A
Authority: CN
Inventors: 李昱琛; 张政维
Original assignee: Shenzhen Institute Of Immune Gene Therapy
Current assignee: Shenzhen Institute Of Immune Gene Therapy
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2017-11-10
Anticipated expiration: 2037-07-18
Also published as: CN107337737B

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD20为基础的嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD20。本发明的嵌合抗原受体通过对所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原‑抗体结合力更强，不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR‑T细胞的免疫效果增强，增强了CAR‑T细胞的治疗效果。

Description

一种嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD20为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法 (Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T 细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。

大多数患有B细胞恶性肿瘤(包括B细胞急性淋巴细胞性白血病(B cell acutelymphocytic leukemia,leukemia,B-ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocytic leukemia,CLL))的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是经设计以人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。

CD19分子是治疗B淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是CAR研究中的热点， CD19的表达局限于正常和恶性B细胞，是广泛接受的用来安全测试的CAR靶标。靶向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(CD19CAR-T)在治疗多发性、难治性的急性B淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治性、复发性慢性B淋巴细胞白血病和B淋巴细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较差。

CN 104788573 A公开了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ 及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区 (hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成，该专利中的CD19在进行一次CAR-T细胞回输后，CD19 的表达量会降低，容易逃过免疫机制。

因此，制备一种嵌合抗原受体能够解决CD19存在的易突变和表达量降低的问题显得尤为重要。

发明内容

针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响 CAR-T技术治疗效果的情况，本发明提供一种嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体通过将CD20靶点进行基因改造，从而提高了靶点的免疫效果，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；

其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD20。

本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原CD20，再通过对抗原结合结构域即针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体进行特定的人源基因码优化改造，从而使得肿瘤表面抗原CD20能够特异的结合在本申请的嵌合抗原受体上，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR-T细胞的免疫效果增强。

根据本发明，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体 (scFv)，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

GDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS.

本发明中，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体进行了特异性改造，使得改造后的序列表达出来的抗体的抗原-抗体结合力更强。

根据本发明，所述抗原结合结构域还包括针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体，所述针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体的氨基酸序列与 SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

根据本发明，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域或CD137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、 IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域的组合，所述CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD127信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请优选采用 CD28-CD127-IL-15Ra-CD137的顺序组合。

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述胱天蛋白酶9 结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)如下：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFF KTSAS.

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联，所述2A序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽可以为任何一个分泌蛋白基因的信号肽，本发明所述信号肽为Secretory信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-6 所示。

优选地，所述Secretory信号肽为CD8a基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列如下：MALPVTALLLPLALLLHAARP。

优选地，所述Secretory信号肽为GMCSFR基因的信号肽，所述Secretory 信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列如下：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。

本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD20抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：

Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9。

根据本发明，所述嵌合抗原受体 Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPGDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQSRGGGGSGGGGSTSGGGGSGGGGSKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLGGGGSGGGGSTSGGGGSGGGGSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPG CFNFLRKKLFFKTSAS.

根据本发明，所述嵌合抗原受体 Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)如下：

ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCCGGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCCGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCAAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCATCACCTACCTGTACTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACCAGATGAGCAACCTGGTGAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCGCCCAGAACCTGGAGCTGCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCAGCGAGGGCAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCAGCTACAGCTGGATCAACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAATCTTCCCCGGCGACGGCGACACCGACTACAACGGCAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAACGTGTTCGACGGCTACTGGCTGGTGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCGCCGCCATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGAAGCAAGAGAAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGACCCGGCCCCACCAGAAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCGCCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAAGAAGAGAATCAAGCCCATCGTGTGGCCCAGCCTGCCCGACCACAAGAAGACCCTGGAGCACCTGTGCAAGAAGCCCAGAAAGAACCTGAACGTGAGCTTCAACCCCGAGAGCTTCCTGGACTGCCAGATCCACAGAGTGGACGACATCCAGGCCAGAGACGAGGTGGAGGGCTTCCTGCAGGACACCTTCCCCCAGCAGCTGGAGGAGAGCGAGAAGCAGAGACTGGGCGGCGACGTGCAGAGCCCCAACTGCCCCAGCGAGGACGTGGTGATCACCCCCGAGAGCTTCGGCAGAGACAGCAGCCTGACCTGCCTGGCCGGCAACGTGAGCGCCTGCGACGCCCCCATCCTGAGCAGCAGCAGAAGCCTGGACTGCAGAGAGAGCGGCAAGAACGGCCCCCACGTGTACCAGGACCTGCTGCTGAGCCTGGGCACCACCAACAGCACCCTGCCCCCCCCCTTCAGCCTGCAGAGCGGCATCCTGACCCTGAACCCCGTGGCCCAGGGCCAGCCCATCCTGACCAGCCTGGGCAGCAACCAGGAGGAGGCCTACGTGACCATGAGCAGCTTCTACCAGAACCAGAGCAGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAAGAGCAGACAGACCCCCCCCCTGGCCAGCGTGGAGATGGAGGCCATGGAGGCCCTGCCCGTGACCTGGGGCACCAGCAGCAGAGACGAGGACCTGGAGAACTGCAGCCACCACCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGTGGTGAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAACCAGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCCGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAGAGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCAGAGACAGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGAGGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGCCCCGACTACGCCTACGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCCCCCCACGCCACCCTGGTGTTCGACGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGCCATGGTGGGCGCCCTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGACCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGCGGCCACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGCCTGAGAACCAGAACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGAAGAAGATTCAGCAGCCTGCACTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACCGCCAAGAAGATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCAGACAGGACCACGGCGCCCTGGACTGCTGCGTGGTGGTGATCCTGAGCCACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCCGGCGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGCCCCGTGAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCAGCTGCCCCAGCCTGGGCGGCAAGCCCAAGCTGTTCTTCATCCAGGCCTGCGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCCGAGGACGAGAGCCCCGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCCACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGAGAACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGCACCTTCCCCGGCTTCGTGAGCTGGAGAGACCCCAAGAGCGGCAGCTGGTACGTGGAGACCCTGGACGACATCTTCGAGCAGTGGGCCCACAGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGAGAGTGGCCAACGCCGTGAGCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCCGGCTGCTTCAACTTCCTGAGAAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGCGCCAGC TGA.

本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为EF1a、 CMV-TAR或CMV中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到 T细胞。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病和/或实体瘤，所述肿瘤疾病选自但不限于白血病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体通过对CD20肿瘤表面抗原进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原-抗体结合力更强；

(2)本发明的嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原CD20，CD20在白血病及淋巴瘤中表达量高，且嵌合抗原受体上的针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体不容易发生突变，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果；

(3)本发明的嵌合抗原受体在进行CAR-T细胞回输后，肿瘤表面CD20 的表达量不会降低，不容易逃过免疫机制，能够更好的进行治疗。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体的合成基因序列图谱；

图2(a)为人淋巴瘤细胞Daudi细胞株流式细胞分析结果图，图2(b)B 淋巴细胞瘤BLCL1流式细胞分析结果图，图2(c)B淋巴细胞瘤BLCL2流式细胞分析结果图，其中，灰色区域为同型阴性对照；

图3(a)为人淋巴瘤细胞Daudi对照组培养2天的流式细胞分析结果图，图3(b)为人淋巴瘤细胞Daudi对照组培养4天的流式细胞分析结果图，图3 (c)人淋巴瘤细胞Daudi为对照组培养12天的流式细胞分析结果图；

图4为人淋巴瘤细胞Daudi和CD20 CAR-T细胞共培养的流式细胞分析结果图，其中图4(a)为人淋巴瘤细胞Daudi和CD20 CAR-T细胞共培养2天的流式细胞分析结果图，图4(b)为人淋巴瘤细胞Daudi和CD20 CAR-T细胞共培养4天的流式细胞分析结果图，图4(c)为人淋巴瘤细胞Daudi和CD20 CAR-T 细胞共培养12天的流式细胞分析结果图；

图5为GFP染色图结果，其中，绿色荧光表示人淋巴瘤细胞的存活细胞，第一列为对照组Daudi细胞未加T细胞毒杀的GFP染色图，第二列为经加入 CD20 CAR-T细胞毒杀后的人淋巴瘤细胞的GFP染色图；

图6(a)为白血病靶细胞未加CAR T对照组的流式细胞分析结果图，图6 (b)为白血病靶细胞的自动细胞凋亡结果

图7(a)为CD20 CAR-T细胞与白血病靶细胞共培养18小时的流式细胞分析结果图，图7(b)为CD20 CAR-T细胞与白血病靶细胞共培养18小时的细胞凋亡结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成Secretory信号肽、CD20抗原结合结构域，CD8α和/ 或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra 信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域，如图1所示，即

Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

所述嵌合抗原受体的核苷酸序列SEQ ID NO.3如下：

实施例2：慢病毒包装

(1)用六孔板分别培养293T细胞，1×10⁶个细胞/孔，培养17-18小时；

(2)加入600μL/孔的新鲜的DMEM，内含10％的FBS；

(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取75μL的DMEM的上清液，2.7μg 的helperDNA mix(1.8μg pNHP，0.5μg pHEF-VSV-G，0.2μg pHEFeGFP)以及 0.8μg的pTY DNA载体，漩涡振荡；

(4)从每孔板中央吸取7μL的Superfect加至离心管中吹打5次，室温静置7-10分钟；

(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入至每个培养孔中，漩涡打匀；

(6)37℃3％CO₂培养箱里培养4-5小时；

(7)吸走培养基的培养液，用1.5mL AIM-V冲洗培养基，并加入1.5mL 的AIM-V继续培养；

(8)将培养基放回3％CO₂培养箱中培养过夜，第二天早上用荧光显微镜观察转染效率。

实施例3：慢病毒的纯化和浓缩

1)病毒纯化

通过离心(1000g，5分钟)除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45 微米的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；

通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生10⁶到10⁷转导单位滴定的慢病毒载体。

2)用Centricon过滤器浓缩慢病毒载体

(1)在生物安全柜中，取Centricon管，用70％酒精消毒1次，然后用无菌PBS清洗3次；

(2)每个Centricon P-20过滤管中加入18ml的病毒上清液，然后在2500g 下离心30分钟或者直到病毒体积减小到0.5ml；

(3)震荡过滤管，然后在400g下，离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。

实施例4：CAR-T细胞的转染

将活化后的T细胞以5×10⁶接种到24孔板，加入50μl的浓缩目标基因的慢病毒，以100g离心力的速度，室温离心100分钟后，置于37℃培养24h，加入1ml的含有2％人血清，1％青霉素或链霉素与细胞培养因子的AIM-V基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，以1×10⁷接种到12孔板，培养2-3天，用慢病毒载体携带GFP感染靶细胞并用annexinV/PI染色法观察细胞毒杀效果，结果如图2所示。

从图2(a)-图2(c)可以看出，Daudi细胞(人淋巴瘤细胞)、BLCL1细胞和BLCL2细胞表面都有CD20的表达，本发明选用的CD20 CAR能够用于治疗Daudi、BLCL1和BLCL2。

实施例5CAR-T细胞的Daudi体外肿瘤杀伤

(1)将非专一性的4GS-meso CART细胞和本申请制备的专一性的 4GS-CD20 CAR-T细胞与Daudi肿瘤靶细胞共培养，置于37度5％CO₂培养箱共培养18h、2天、4天、9天和12天；

(2)体外评估CAR-T细胞对靶细胞的识别杀伤功能，靶细胞为钙黄绿素标记或感染LV-GFP，结果如图3-7所示；

从图3(a)-图3(c)可以看出，Daudi肿瘤靶细胞培养2天后的肿瘤细胞数比例为98.4％，培养4天后的肿瘤细胞数比例为98.8％，培养12天后的肿瘤细胞数比例为99％，从图4(a)-图4(c)可以看出，当CD20 CAR-T细胞与 Daudi肿瘤靶细胞培养2天后，Daudi肿瘤靶细胞数的比例为38.3％，培养4天后，Daudi肿瘤靶细胞数的比例为13.6％，培养12天后，Daudi肿瘤靶细胞数的比例为3.8％，可见，CD20 CAR-T细胞共培养的存活细胞比例迅速减少，由此可得CD20 CAR-T细胞对Daudi肿瘤靶细胞的毒杀效果好。

从图5可以看出，第一列一般的T细胞与Daudi肿瘤靶细胞共培养后，绿色荧光基本没发生变化，第二列的CD20 CAR-T细胞与Daudi肿瘤靶细胞共培养后绿色荧光基本消失，即Daudi肿瘤靶细胞基本死亡，说明CD20 CAR-T细胞对Daudi肿瘤靶细胞的毒杀效果好。

从图6-图7可以看出，从图6(a)和图7(a)对比可以看出，荧光强度为 10³以上的细胞为Daudi肿瘤靶细胞，挑选图6(a)和图7(a)中荧光强度为 10³以上的细胞做进一步分析，从图6(b)可以看出，23.3％的靶细胞濒临自然凋亡，5.3％的靶细胞自然凋亡，从图7(b)加入CAR T后可以看出，80.6％的靶细胞濒临凋亡，17.1％的靶细胞凋亡，可见，CD20 CAR-T细胞的靶细胞濒临凋亡以及靶细胞凋亡数明显高于对照组，因此CD20 CAR-T细胞对Daudi肿瘤靶细胞有较好的毒杀作用。

综上所述，本发明的嵌合抗原受体的针对CD20肿瘤表面抗原的单链抗体不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市免疫基因治疗研究院

<120> 一种嵌合抗原受体及其应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His

20 25 30

Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln

85 90 95

Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

130 135 140

Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

145 150 155 160

Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn

180 185 190

Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

195 200 205

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 2

<211> 1270

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu

20 25 30

Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser

35 40 45

Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr

50 55 60

Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser

65 70 75 80

Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

115 120 125

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser

145 150 155 160

Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys

165 170 175

Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln

180 185 190

Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp

195 200 205

Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr

210 215 220

Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg

225 230 235 240

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly

245 250 255

Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265 270

Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu

275 280 285

Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro

290 295 300

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val

305 310 315 320

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe

325 330 335

Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

340 345 350

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

355 360 365

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Arg Ile Lys Pro

385 390 395 400

Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu

405 410 415

Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser

420 425 430

Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp

435 440 445

Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu

450 455 460

Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro

465 470 475 480

Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser

485 490 495

Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu

500 505 510

Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro

515 520 525

His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr

530 535 540

Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro

545 550 555 560

Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu

565 570 575

Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln Ser Arg Gly

580 585 590

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser

595 600 605

Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val

610 615 620

Glu Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser

625 630 635 640

Arg Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu Gly Gly Gly Gly

645 650 655

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

660 665 670

Gly Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

675 680 685

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

690 695 700

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly

705 710 715 720

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys

725 730 735

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

740 745 750

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

755 760 765

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

770 775 780

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

785 790 795 800

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

805 810 815

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

820 825 830

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Gly

835 840 845

Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu

850 855 860

Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly

865 870 875 880

Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr

885 890 895

Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg

900 905 910

Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly

915 920 925

Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu

930 935 940

Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile

945 950 955 960

Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu

965 970 975

Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val Gly

980 985 990

Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser

995 1000 1005

Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe

1010 1015 1020

Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp

1025 1030 1035

Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val

1040 1045 1050

Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu

1055 1060 1065

Leu Glu Leu Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val

1070 1075 1080

Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe

1085 1090 1095

Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu

1100 1105 1110

Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly

1115 1120 1125

Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln

1130 1135 1140

Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu

1145 1150 1155

Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu

1160 1165 1170

Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro

1175 1180 1185

Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe

1190 1195 1200

Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr

1205 1210 1215

Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln

1220 1225 1230

Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile

1235 1240 1245

Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu

1250 1255 1260

Phe Phe Lys Thr Ser Ala Ser

1265 1270

<210> 3

<211> 3813

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60

atccccggcg acatcgtgat gacccagacc cccctgagcc tgcccgtgac ccccggcgag 120

cccgccagca tcagctgcag aagcagcaag agcctgctgc acagcaacgg catcacctac 180

ctgtactggt acctgcagaa gcccggccag agcccccagc tgctgatcta ccagatgagc 240

aacctggtga gcggcgtgcc cgacagattc agcggcagcg gcagcggcac cgacttcacc 300

ctgaagatca gcagagtgga ggccgaggac gtgggcgtgt actactgcgc ccagaacctg 360

gagctgccct acaccttcgg cggcggcacc aaggtggaga tcaagggcag caccagcggc 420

agcggcaagc ccggcagcag cgagggcagc accaagggcc aggtgcagct ggtgcagagc 480

ggcgccgagg tgaagaagcc cggcagcagc gtgaaggtga gctgcaaggc cagcggctac 540

gccttcagct acagctggat caactgggtg agacaggccc ccggccaggg cctggagtgg 600

atgggcagaa tcttccccgg cgacggcgac accgactaca acggcaagtt caagggcaga 660

gtgaccatca ccgccgacaa gagcaccagc accgcctaca tggagctgag cagcctgaga 720

agcgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc agaaacgtgt tcgacggcta ctggctggtg 780

tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg agcagcgccg ccgccatcga ggtgatgtac 840

ccccccccct acctggacaa cgagaagagc aacggcacca tcatccacgt gaagggcaag 900

cacctgtgcc ccagccccct gttccccggc cccagcaagc ccttctgggt gctggtggtg 960

gtgggcggcg tgctggcctg ctacagcctg ctggtgaccg tggccttcat catcttctgg 1020

gtgagaagca agagaagcag actgctgcac agcgactaca tgaacatgac ccccagaaga 1080

cccggcccca ccagaaagca ctaccagccc tacgcccccc ccagagactt cgccgcctac 1140

agaagcgcca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcaagaagag aatcaagccc 1200

atcgtgtggc ccagcctgcc cgaccacaag aagaccctgg agcacctgtg caagaagccc 1260

agaaagaacc tgaacgtgag cttcaacccc gagagcttcc tggactgcca gatccacaga 1320

gtggacgaca tccaggccag agacgaggtg gagggcttcc tgcaggacac cttcccccag 1380

cagctggagg agagcgagaa gcagagactg ggcggcgacg tgcagagccc caactgcccc 1440

agcgaggacg tggtgatcac ccccgagagc ttcggcagag acagcagcct gacctgcctg 1500

gccggcaacg tgagcgcctg cgacgccccc atcctgagca gcagcagaag cctggactgc 1560

agagagagcg gcaagaacgg cccccacgtg taccaggacc tgctgctgag cctgggcacc 1620

accaacagca ccctgccccc ccccttcagc ctgcagagcg gcatcctgac cctgaacccc 1680

gtggcccagg gccagcccat cctgaccagc ctgggcagca accaggagga ggcctacgtg 1740

accatgagca gcttctacca gaaccagagc agaggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 1800

agcaccagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagca agagcagaca gacccccccc 1860

ctggccagcg tggagatgga ggccatggag gccctgcccg tgacctgggg caccagcagc 1920

agagacgagg acctggagaa ctgcagccac cacctgggcg gcggcggcag cggcggcggc 1980

ggcagcacca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcgtggtgaa gagaggcaga 2040

aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgagac ccgtgcagac cacccaggag 2100

gaggacggct gcagctgcag attccccgag gaggaggagg gcggctgcga gctgggcggc 2160

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagca gagtgaagtt cagcagaagc 2220

gccgacgccc ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 2280

agaagagagg agtacgacgt gctggacaag agaagaggca gagaccccga gatgggcggc 2340

aagcccagaa gaaagaaccc ccaggagggc ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg 2400

gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagagaa gaagaggcaa gggccacgac 2460

ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag 2520

gccctgcccc ccagaaccag cggcagcggc gccaccaact tcagcctgct gaagcaggcc 2580

ggcgacgtgg aggagaaccc cggccccatg ggcgtgcagg tggagaccat cagccccggc 2640

gacggcagaa ccttccccaa gagaggccag acctgcgtgg tgcactacac cggcatgctg 2700

gaggacggca agaaggtgga cagcagcaga gacagaaaca agcccttcaa gttcatgctg 2760

ggcaagcagg aggtgatcag aggctgggag gagggcgtgg cccagatgag cgtgggccag 2820

agagccaagc tgaccatcag ccccgactac gcctacggcg ccaccggcca ccccggcatc 2880

atcccccccc acgccaccct ggtgttcgac gtggagctgc tgaagctgga gggcggcggc 2940

ggcagcggcg gcggcggcag cggcgccatg gtgggcgccc tggagagcct gagaggcaac 3000

gccgacctgg cctacatcct gagcatggag ccctgcggcc actgcctgat catcaacaac 3060

gtgaacttct gcagagagag cggcctgaga accagaaccg gcagcaacat cgactgcgag 3120

aagctgagaa gaagattcag cagcctgcac ttcatggtgg aggtgaaggg cgacctgacc 3180

gccaagaaga tggtgctggc cctgctggag ctggccagac aggaccacgg cgccctggac 3240

tgctgcgtgg tggtgatcct gagccacggc tgccaggcca gccacctgca gttccccggc 3300

gccgtgtacg gcaccgacgg ctgccccgtg agcgtggaga agatcgtgaa catcttcaac 3360

ggcaccagct gccccagcct gggcggcaag cccaagctgt tcttcatcca ggcctgcggc 3420

ggcgagcaga aggaccacgg cttcgaggtg gccagcacca gccccgagga cgagagcccc 3480

ggcagcaacc ccgagcccga cgccaccccc ttccaggagg gcctgagaac cttcgaccag 3540

ctggacgcca tcagcagcct gcccaccccc agcgacatct tcgtgagcta cagcaccttc 3600

cccggcttcg tgagctggag agaccccaag agcggcagct ggtacgtgga gaccctggac 3660

gacatcttcg agcagtgggc ccacagcgag gacctgcaga gcctgctgct gagagtggcc 3720

aacgccgtga gcgtgaaggg catctacaag cagatgcccg gctgcttcaa cttcctgaga 3780

aagaagctgt tcttcaagac cagcgccagc tga 3813

<210> 4

<211> 423

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro

20 25 30

Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His

35 40 45

Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp

50 55 60

Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg

65 70 75 80

Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly

100 105 110

Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys

115 120 125

Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val

130 135 140

Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe

165 170 175

Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys

180 185 190

Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val

195 200 205

Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu

210 215 220

Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu

225 230 235 240

Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr

245 250 255

Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe

260 265 270

Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe

275 280 285

Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala

290 295 300

Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp

305 310 315 320

Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala

325 330 335

Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr

340 345 350

Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr

355 360 365

Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp

370 375 380

Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly

385 390 395 400

Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu

405 410 415

Phe Phe Lys Thr Ser Ala Ser

420

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体，所述针对肿瘤表面抗原CD20的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

优选地，所述抗原结合结构域还包括针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体；

优选地，所述针对肿瘤表面抗原CD20的突变体的单链抗体的氨基酸序列与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；

优选地，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域或CD137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域的组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域；

优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成；

优选地，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD20抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD127信号传导结构域、IL-15Ra信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

优选地，所述嵌合抗原受体Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述嵌合抗原受体Secretory-CD20-CD28-CD127-IL-15Ra-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达；

优选地，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞；

8.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；

优选地，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求8所述的重组慢病毒。

10.如权利要求1-7中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求8所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病；

优选地，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病和/或淋巴瘤。