CN110592024A - 以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用 - Google Patents

以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗领域，具体涉及一种以tEGFR与CD19为双靶点的CAR‑NK细胞制备方法及其应用。本发明提供的以tEGFR与CD19为双靶点的CAR‑NK细胞制备方法，包括将tEFGR的单链抗体核苷酸序列、抗CD19的嵌合抗原受体核苷酸序列导入慢病毒载体，然后转染到NK细胞，得到表达抗tEGFR抗体与抗CD19的NK细胞，即CAR‑NK细胞。本发明所制备的肿瘤免疫细胞CAR‑NK细胞能够引起相关肿瘤疾病病人的免疫应答，可用于患者本人肿瘤疾病的治疗及异体肿瘤病人注射。本发明制备的以tEGFR与CD19双靶点的CAR‑NK细胞与CAR‑T细胞相比，具有广谱抗肿瘤效果，使用范围更广。

Description

以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤细胞免疫治疗领域，具体涉及一种以tEGFR(runcated EGFR,tEGFR)与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用。
背景技术
自然杀伤(Nature killer,NK)细胞是机体固有免疫系统的一部分，外周血单个核细胞10％，细胞表面表达CD3-CD16+CD56+大颗粒淋巴细胞，非MHC分子限制性，无需预先治敏，而通过抑制性和激活性信号的动态平衡实现。在机体清除致病微生物、病毒的生理活动中起到十分重要的作用，无需治敏，释放穿孔素与颗粒酶，迅速杀伤或摧毁被病毒或细菌感染的细胞。除此之外，NK细胞还可释放多种细胞因子调节获得性免疫应答，从而把固有性免疫与获得性免疫应答建立联系。
NK细胞需要靠两种受体保持“沉默”状态：抑制性受体KIRs和NKG2A，与细胞表面MHC I结合并传递抑制信号。NK细胞活化状态，通过激活性受体NCRs、NKp46、NKp30、NKp44和NKG2D，与细胞表面特异性配体结合，通过释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒直接杀伤靶细胞；同时释放TNF家族成员(如FasL)和TNF相关凋亡诱导配体TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡。NK细胞使用抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，通过Fc受体CD16，可触发NK细胞对被抗体结合的靶细胞的脱粒作用。NK细胞能靶向MHC-I分子缺失的肿瘤细胞，通过释放细胞毒性穿孔素和颗粒酶，从而诱发肿瘤细胞凋亡。通过分泌一系列细胞因子，如干扰素(IFN)及肿瘤坏死因子(TNF)等，调节免疫反应而间接杀伤肿瘤细胞。NK细胞过继性免疫疗法：向肿瘤患者回输经体外诱导培养的NK细胞，在机体中直接或间接杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
近年来，嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞(CAR-T)逐渐引起科学家及临床医生的密切关注。肿瘤病人经过修饰过后的CAR-T细胞治疗后，生存期得到显著延长，有些病人逐渐康复。但是，在治疗过程中也发现不可避免的问题，如CAR-T细胞会在病人体内释放大量的细胞因子，也就是所谓的“风暴因子”，引起病人严重的免疫反应如心脏毒性、肝脏毒性。除此之外，CAR-T细胞还会引起病人神经毒性。NK细胞因其独特的识别靶细胞能力及抗肿瘤能力，有望取代CAR-T细胞。
已经被FDA批准治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的CAR-T细胞，该CAR-T细胞就是以B细胞上的CD19为靶标。CD19高表达在B细胞上，更加有利于Car-T识别B细胞。
EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR突变或过表达一般会引发肿瘤，它是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，跨细胞膜，分子量170KDa。研究表明，在多种肿瘤细胞中存在EGFR的高表达或异常表达，它的高表达或异常表达与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。
中国专利申请CN109923212A公开了一种用于表达乙肝病毒(HBV)抗原的慢病毒载体，所述载体编码至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白，至少一种基因型A和/或C抗原的HBV共有核心，以及至少一种基因型A和/或C抗原的HBV共有核心MHCI和MHCII表位，可以用于向人给药以诱导针对HBV抗原的免疫应答，但是，这种载体需要极高的准确率，故不适宜大规模生产，且操作过程复杂，容易被其他基因干扰试验结果。
综上可知，现有技术普遍存在检测结果准确率低，操作复杂，对特定细胞杀伤力低等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺点，提供一种以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用。本发明提供的CAR-NK细胞，以tEGFR及CD19为双靶点，可以有效检测肿瘤细胞的异常表达，准确率高，适用于大规模生产，而且操作简单，有效提高了对白血病、淋巴瘤细胞的杀伤能力。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK序列信息如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述CAR-NK序列包括tEGFR的单链抗体核苷酸序列和CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
优选地，所述tEGFR的单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括编码前导肽的序列，核苷酸信息如SEQ ID NO.2第1-57位核苷酸所示；抗tEGFR单链抗体的的轻链可变区，核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2第60-324位氨基酸所示；抗tEGFR单链抗体的重链可变区，核苷酸序列如SEQ ID NO.2第444-804位核苷酸所示；编码人tEGFR跨膜区氨基酸的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.2第816-954位核苷酸所示；人tEGFR铰链区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.2第957-1026位核苷酸所示；人4-1BB共刺激分子区的核苷酸，序列信息如SEQID NO.2第1029-1164位核苷酸所示；人CD3ζ胞内区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.2第1167-1494位核苷酸所示；tEGFR-SCFV片段，序列信息如SEQ ID NO.2第792-1782位核苷酸所示。
优选地，所述CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示，包括前导肽的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第1-69位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的轻链可变区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第78-426位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的重链可变区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第483-1857位核苷酸所示；人CD28跨膜区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第1962-2424位核苷酸所示；人CD8铰链区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第2538-2856位核苷酸所示；人4-1BB共刺激分子区的核苷酸，序列信息如SEQID NO.3第2964-3582位核苷酸所示；人CD3ζ胞内区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第3660-4017位核苷酸所示；抗CD19的SCFV片段含有264-594位核苷酸序列；抗CD19-SCFV片段，序列信息如SEQ ID NO.3第792-1782位核苷酸所示。
本发明还提供了一种所述的CAR-NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、人工构建CAR-NK序列：按照tEGFR—CD19的顺序排列，于公司合成人工序列，得人工合成的CAR-NK序列；
S2、将步骤S1所得人工合成的CAR-NK序列通过酶切的方法整合到慢病毒质粒载体pWCDX1中，得重组质粒载体；
S3、将步骤S2所得重组质粒载体转染入NK细胞，即得。
优选地，所述步骤S2中的酶切方法指利用EcoRI/HindIII双酶切载体与CAR-NK碱基序列，得相同的酶切末端，然后用T4连接酶连接。
一种所述的CAR-NK细胞在制备治疗CD19介导的疾病相关药物中的应用。
优选地，所述应用指在肿瘤疾病中的应用。
优选地，所述肿瘤主要指白血病、淋巴瘤。
与现有技术相比，本发明提供的CAR-NK细胞具有以下优点：
(1)本发明提供的CAR-NK细胞是将tEGFR的单链抗体与靶向CD19的CAR分子侵染来自正常人NK细胞株并经过流式筛选获得单一克隆细胞，将性状稳定杀伤活性高的CAR-NK单克隆细胞株培养并扩增获得，制备方法简单，适用于大规模生产；
(2)本发明提供的CAR-NK细胞，不会使病人出现免疫排斥反应，制备效率高，杀伤力强，可以有效缩短病人治疗时间，肿瘤治疗效果明显；
(3)本发明提供的CAR-NK细胞，与正常的NK细胞相比，能够显著杀伤过表达CD19分子的食管癌细胞。
附图说明
图1为pWCDX2质粒结构示意图；
图2为通过transwell实验显示的双靶标tEGFR-CD19的Car-NK细胞杀伤急性髓性白血病细胞KG-1a示意图；
图3为通过transwell实验显示的双靶标tEGFR-CD19的Car-NK细胞杀伤早幼性白血病细胞HL60示意图；
图4为通过transwell实验显示的双靶标tEGFR-CD19的Car-NK细胞杀伤淋巴瘤细胞U973示意图；
图5为通过transwell实验显示的双靶标tEGFR-CD19的Car-NK细胞杀伤食管癌细胞Eca109示意图；
图6为tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞分泌细胞因子IFN-γ检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
实施例1靶向tEGFR与CD19的CAR-NK细胞
一种靶向tEGFR与CD19的CAR-NK细胞制备方法，包括以下步骤：
S1：人工构建CAR-NK序列：tEGFR—CD19的顺序排列，该序列如SEQ ID NO.1所示，于生工生物进行人工合成，得CAR-NK序列；
S2：将步骤S1所得CAR序列碱基序列通过酶切的方法整合到慢病毒质粒载体pWCDX1，方法为：EcoRI/HindIII双酶切载体与Car碱基序列，T4连接酶链接，得到目的质粒，为pWCDX2；
S3：将步骤S2所得重组质粒载体转染入NK细胞，即得。
具体转染过程为：
A：
(1)将500μL三蒸水加入1.5mL灭菌EP管，分别加入目的质粒pWCDX215μg、包装质粒pTDM 8μg、包膜质粒pCMS 6.0μg；
(2)轻轻加入100mM CaCl2溶液100mL，轻轻混匀，得混合液；
(3)然后上述混合液加入到800μL PBS缓冲液中，轻轻混匀，室温静置25分钟；
(4)取对数生长期293T细胞8×106个接种于T75细胞培养皿中，24小时后待细胞融合度达80％时，更换为10mL新鲜的DMEM完全培养基；
(5)将步骤(3)中所得的混合液加入到步骤(4)，所得物接种有293T细胞的DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养；
(6)24h后细胞融合度达85％时，更换10mL新鲜培养基，继续培养；
(7)48h后收集第一批病毒液，并补充10mL新鲜培养基继续培养；
(8)72h后收集第二批病毒液；
(9)将收集的病毒液置于超滤管中，8000转/分钟、4℃浓缩离心30分钟，收集病毒浓缩液，液氮罐保存备用；
(10)稀释法检测浓缩病毒的滴度，得到目的质粒的病毒浓缩液；
B：
(1)收取健康人外周血，收集分离液上层血浆(即自体血浆)并56℃灭活30min，加入淋巴细胞分离液离心，1500转/分钟、4℃离心，小心吸取中间云雾层细胞即分离外周血单个核细胞PBMC，用生理盐水洗涤1次；细胞计数后用1640培养基调整细胞密度为2×106个/mL，然后进行细胞培养9天；
(2)增殖细胞培养基培养细胞，待细胞密度为1.5×107个/mL；
(3)培养完毕后，流式细胞仪检测NK细胞表型，CD3-CD16+CD56+细胞比例达90％以上时，无需分选，直接用于CAR-NK的制备；
C：
取步骤4中培养完毕后的NK细胞，分别加入步骤S3中所得到的目的病毒质粒pWCDX2，病毒浓缩液的MOI为20IU/mL，感染4个小时，弃病毒液，PBS洗涤2次后，1640培养基重悬细胞，得到CAR-NK细胞；
增殖细胞培养基为，在1640培养基基础上补充以下物质，IL-2(20-30ng/mL)、TNF-α(20-30ng/mL)、转铁蛋白(10-20ng/mL)、胰岛素(20-30ng/mL)、抗坏血酸(200U/mL)、bFGF(15-30ng/mL)、SCF(20-40ng/mL)；
实施例2：tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外杀白血病细胞KG-1a
利用CCK-8方法检测tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞对过表达CD19分子的KG-1a细胞的杀伤效果。
实验操作方法如下：
(1)在96孔板接种KG-1a细胞悬液(2×104个/孔)。将培养板在培养箱预培养24小时，37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)轻轻弃去培养上清，每孔加入200μL效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例为4：1。培养基对照孔只加200μL培养基，空白对照空，每个实验置三个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育4小时；
(3)每孔加入100μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h；
(4)用酶标仪测定在570nm处的吸光度；
(5)杀伤率＝(As-Ab)/(Ac-Ab)X100％；
As：试验孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8、CAR-NK)；
Ac：对照孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8)；
Ab：空白对照(不含细胞和CAR-NK的培养基、CCK-8)；
tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图2所示。如图2所示实验结果显示，与NK对照组比较，本发明所制备的tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞能够显著杀伤过表达CD19分子的KG-1a细胞。
本发明的靶向tEGFR与CD19的CAR-NK是将tEGFR-SCFV与靶向CD19的CAR分子侵染来自正常人NK细胞株并经过流式筛选获得单一克隆细胞，将性状稳定杀伤活性高的CAR-NK单克隆细胞株培养并扩增获得。该制备方法适用于大规模生产制备，同时不同病人且不会产生排斥。经该方法制备的CAR-NK细胞与CAR-T细胞相比，制备效率高，不需要个性定制且能用于多个病人，缩短了时间。
实施例3：tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外杀早幼性白血病细胞HL60
利用CCK-8方法检测靶向tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞对过表达CD19分子的HL60细胞的杀伤效果。
实验操作方法如下：
(1)在transwell板接种HL60细胞悬液(4×104个/孔)。将培养板在培养箱预培养24小时，37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)轻轻弃去培养上清，每孔加入1×104个效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例为1：4。培养基对照孔只加200μL培养基，空白对照空，每个实验置三个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育4小时；
(3)每孔加入100ul CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h；
(4)用酶标仪测定在570nm处的吸光度；
(5)杀伤率＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％；
As：试验孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8、CAR-NK)；
Ac：对照孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8)；
Ab：空白对照(不含细胞和CAR-NK的培养基、CCK-8)；
tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图3所示。如图3所示实验结果显示，与NK对照组比较，本发明所制备的tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞能够显著杀伤过表达CD19分子的HL60细胞。
实施例4：tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外杀淋巴瘤细胞U973
利用CCK-8方法检测tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞对过表达CD19分子的U973细胞的杀伤效果。
实验操作方法如下：
(1)在transwell板接种U973细胞悬液(3×104个/孔)。将培养板在培养箱预培养24小时，37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)轻轻弃去培养上清，每孔加入效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例为2：1。培养基对照孔只加200μL培养基，空白对照空，每个实验置三个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育4小时；
(3)每孔加入100μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h；
(4)用酶标仪测定在570nm处的吸光度；
(5)杀伤率＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％；
As：试验孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8、CAR-NK)；
Ac：对照孔(含有肿瘤细胞的培养基、CCK-8)；
Ab：空白对照(不含细胞和CAR-NK的培养基、CCK-8)；
tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图4所示。如图4所示实验结果显示，与NK对照组比较，本发明制备的tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞能够显著杀伤过表达CD19分子的U973细胞。
通过该方法制备的CAR-NK细胞可以大批量制备培养，病人即来即用；另一方面，常分选出的CAR-NK细胞来源于同一个单克隆，性状和活性均一且稳定，便于大规模生产和质控；另外，其杀伤活性特异，肿瘤治疗效果更加明显。
实施例5：tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外杀伤实体瘤细胞，食管癌细胞Eca109
(1)分别收集对数生长期的食管癌细胞，待细胞充分贴壁后，弃去培养基上清，加入收集的CAR-NK细胞培养基上清，以及新鲜的培养CAR-NK细胞培养基，各药物浓度设3个复孔，放于培养箱孵育24h、48h和72h后，加入CCK-8溶液，继续培养1-4h，加入荧光染料BMQC(2,3,6,7-tetrahydro-9-bromomethyl-1H,5Hquinolizino(9,1-gh)coumarin)至终浓度为5μM；
(2)混匀，24小时后胰酶消化收集细胞，加入荧光染料CFSE(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester)至终浓度为1μM，37℃孵育30分钟。
(3)孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的胎牛血清，室温孵育5分钟以终止标记反应。
(4)在所有的实验中，感染了tEGFR-CD19CAR的NK细胞的细胞毒性和未感染的阴性对照NK细胞的细胞毒性做比较，并且这些NK细胞来自同一个健康人。
(5)酶标仪测定各孔450nm处的OD值(光密度值)，测得吸光度A值。
生长抑制率的计算公式为：生长抑制率(％)＝(1-OD实验组/OD对照组)×100％。
以tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图5所示。如图5所示实验结果显示，与NK对照组比较，本发明所制备的以tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞能够显著杀伤过表达CD19分子的食管癌细胞。
实施例6：tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞分泌细胞因子IFN-γ检测
使用1640培养基培养tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞，确定培养基不含有IFN-γ，收集tEGFR-CD19双靶标CAR-NK细胞对数期培养基上清，
(1)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
(2)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
(3)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(4)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
(5)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(7)显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
(8)终止：每孔加终止液50μL，终止反应。
(9)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
最后应当说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东食品药品职业学院
<120> 以tEGFR与CD19为双靶点的CAR-NK细胞制备方法及其应用
<130> 2019.8.26
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6679
<212> DNA
<213> CAR-NK序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagga cggggggggg ctggtgcagc cgggaggaag cctgaggctg 60
agctgcgcgg cgagcggatt cacgctgagc ggagactgga tacactgggt gaggcaggcg 120
ccgggaaagg gactggagtg gctgggagag ataagcgcgg cgggaggata cacggactac 180
gcggacagcg tgaagggaag gttcacgata agcgcggaca cgagcaagaa cacggcgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggcggaggac acggcggtgt actactgcgc gagggagagc 300
agggtgagct tcgaggcggc gatggactac tggggacagg gaacgctggt gacggtgagc 360
agcgcgagca cgaagggacc gagcgtgttc ccgctggcgc cgagcagcaa gagcacgagc 420
ggaggaacgg cggcgctggg atgcctggtg aaggacgtgt tcccggagcc ggtgacggtg 480
agctggaaca gcggagcgct gacgagcgga gtgcacacgt tcccggcggt gctgcagagc 540
agcggactgg tgagcctgag cagcgtggtg acggtgccga gcagcagcct gggaacgcag 600
acggtgatat gcaacgtgaa ccacaagccg agcaacacga aggtggacaa gaaggtggag 660
ccgaagagct gcgacaagac gcacgaggtg cagctggtgg aggacggggg ggggctggtg 720
cagccgggag gaagcctgag gctgagctgc gcggcgagcg gattcacgct gagcggagac 780
tggatacact gggtgaggca ggcgccggga aagggactgg agtggctggg agagataagc 840
gcggcgggag gatacacgga ctacgcggac agcgtgaagg gaaggttcac gataagcgcg 900
gacacgagca agaacacggc gtacctgcag atgaacagcc tgagggcgga ggacacggcg 960
gtgtactact gcgcgaggga gagcagggtg agcttcgagg cggcgatgga ctactgggga 1020
cagggaacgc tggtgacggt gagcagcgcg agcacgaagg gaccgagcgt gttcccgctg 1080
gcgccgagca gcaagagcac gagcggagga acggcggcgc tgggatgcct ggtgaaggac 1140
gtgttcccgg agccggtgac ggtgagctgg aacagcggag cgctgacgag cggagtgcac 1200
acgttcccgg cggtgctgca gagcagcgga ctggtgagcc tgagcagcgt ggtgacggtg 1260
ccgagcagca gcctgggaac gcagacggtg atatgcaacg tgaaccacaa gccgagcaac 1320
acgaaggtgg acaagaaggt ggagccgaag agctgcgaca agacgcacga catacagatg 1380
acgcagagcc cgagcagcct gagcgcgagc gtgggagaca gggtgacgat aacgtgcagg 1440
gcgagccagg acctggcgac ggacgtggcg tgggtgcagc agaagccggg aaaggcgccg 1500
aagctgctga tagtgagcgc gagcttcctg gtgagcggag tgccgagcag gttcagcgga 1560
agcggaagcg gaacggactt cacgctgacg ataagcagcc tgcagccgga ggacttcgcg 1620
acggtggtgt gccagcagag cgagccggag ccggtgacgt tcggacaggg aacgaaggtg 1680
gagataaaga ggacggtggc ggcgccgagc gtgttgatat tgccgccgag cgacgagcag 1740
ctgaagagcg gaacggcgag cgtggtgtgc ctgctgaaca acttcgtgcc gagggaggcg 1800
aagctgcagt ggaagctgga caacgcgctg cagagcggaa acagccagga gagcctgacg 1860
gagcagctga gcaagctgag cacggtgagc ctgagcagca cgctgacgct gagcaaggcg 1920
ctggtggaga agcacaagct ggtggcgtgc gagctgacgc accagggact gagcagcccg 1980
ctgacgaaga gcttgaacag gggagagtgc gacatacaga tgacgcagag cccgagcagc 2040
ctgagcgcga gcgtgggaga cagggtgacg ataacgtgca gggcgagcca ggacctggcg 2100
acggacgtgg cgtgggtgca gcagaagccg ggaaaggcgc cgaagctgct gatagtgagc 2160
gcgagcttcc tggtgagcgg agtgccgagc aggttcagcg gaagcggaag cggaacggac 2220
ttcacgctga cgataagcag cctgcagccg gaggacttcg cgacggtggt gtgccagcag 2280
agcgagccgg agccggtgac gttcggacag ggaacgaagg tggagataaa gaggacggtg 2340
gcggcgccga gcgtgttgat attgccgccg agcgacgagc agctgaagag cggaacggcg 2400
agcgtggtgt gcctgctgaa caacttcgtg ccgagggagg cgaagctgca gtggaagctg 2460
gacaacgcgc tgcagagcgg aaacagccag gagagcctga cggagcagct gagcaagctg 2520
agcacggtga gcctgagcag cacgctgacg ctgagcaagg cgctggtgga gaagcacaag 2580
ctggtggcgt gcgagctgac gcaccaggga ctgagcagcc cgctgacgaa gagcttgaac 2640
aggggagagt gccaggcagc gtggtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca 2700
cccccgcgat gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctgctg cgcagccact 2760
accgcgaggt gctgccgctg gccacgttcg tgcggcgcct ggggccccag ggctggcggc 2820
tggtgcagcg cggggacccg gcggctttcc gcgcgctggt ggcccagtgc ctggtgtgcg 2880
tgccctggga cgcacggccg ccccccgccg ccccctcctt ccgccaggtg tcctgcctga 2940
aggagctggt ggcccgagtg ctgcagaggc tgtgcgagcg cggcgcgaag aacgtgctgg 3000
ccttcggctt cgcgctgctg gacggggccc gcgggggccc ccccgaggcc ttcaccacca 3060
gcgtgcgcag ctacctgccc aacacggtga ccgacgcact gcgggggagc ggggcgtggg 3120
ggctgctgtt gcgccgcgtg ggcgacgacg tgctggttca cctgctggca cgctgcgcgc 3180
tctttgtgct ggtggctccc agctgcgcct accaggtgtg cgggccgccg ctgtaccagc 3240
tcggcgctgc cactcaggcc cggcccccgc cacacgctag tggaccccga aggcgtctgg 3300
gatgcgaacg ggcctggaac catagcgtca gggaggccgg ggtccccctg ggcctgccag 3360
ccccgggtgc gaggaggcgc gggggcagtg ccagccgaag tctgccgttg cccaagaggc 3420
ccaggcgtgg cgctgcccct gagccggagc ggacgcccgt tgggcagggg tcctgggccc 3480
acccgggcag gacgcgtgga ccgagtgacc gtggtttctg tgtggtgtca cctgccagac 3540
ccgccgaaga agccacctct ttggagggtg cgctctctgg cacgcgccac tcccacccat 3600
ccgtgggccg ccagcaccac gcgggccccc catccacatc gcggccacca cgtccctggg 3660
acacgccttg tcccccggtg tacgccgaga ccaagcactt cctctactcc tcaggcgaca 3720
aggagcagct gcggccctcc ttcctactca gctctctgag gcccagcctg actggcgctc 3780
ggaggctcgt ggagaccatc tttctgggtt ccaggccctg gatgccaggg actccccgca 3840
ggttgccccg cctgccccag cgctactggc aaatgcggcc cctgtttctg gagctgcttg 3900
ggaaccacgc gcagtgcccc tacggggtgc tcctcaagac gcactgcccg ctgcgagctg 3960
cggtcacccc agcagccggt gtctgtgccc gggagaagcc ccagggctct gtggcggccc 4020
ccgaggagga ggacacagac ccccgtcgcc tggtgcagct gctccgccag cacagcagcc 4080
cctggcaggt gtacggcttc gtgcgggcct gcctgcgccg gctggtgccc ccaggcctct 4140
ggggctccag gcacaacgaa cgccgcttcc tcaggaacac caagaagttc atctccctgg 4200
ggaagcatgc caagctctcg ctgcaggagc tgacgtggaa gatgagcgtg cggggctgcg 4260
cttggctgcg caggagccca ggggttggct gtgttccggc cgcagagcac cgtctgcgtg 4320
aggagatcct ggccaagttc ctgcactggc tgatgagtgt gtacgtcgtc gagctgctca 4380
ggtctttctt ttatgtcacg gagaccacgt ttcaaaagaa caggctcttt ttctaccgga 4440
agagtgtctg gagcaagttg caaagcattg gaatcagaca gcacttgaag agggtgcagc 4500
tgcgggagct gtcggaagca gaggtcaggc agcatcggga agccaggccc gccctgctga 4560
cgtccagact ccgcttcatc cccaagcctg acgggctgcg gccgattgtg aacatggact 4620
acgtcgtggg agccagaacg ttccgcagag aaaagagggc cgagcgtctc acctcgaggg 4680
tgaaggcact gttcagcgtg ctcaactacg agcgggcgcg gcgccccggc ctcctgggcg 4740
cctctgtgct gggcctggac gatatccaca gggcctggcg caccttcgtg ctgcgtgtgc 4800
gggcccagga cccgccgcct gagctgtact ttgtcaaggt ggatgtgacg ggcgcgtacg 4860
acaccatccc ccaggacagg ctcacggagg tcatcgccag catcatcaaa ccccagaaca 4920
cgtactgcgt gcgtcggtat gccgtggtcc agaaggccgc ccatgggcac gtccgcaagg 4980
ccttcaagag ccacgtctct accttgacag acctccagcc gtacatgcga cagttcgtgg 5040
ctcacctgca ggagaccagc ccgctgaggg atgccgtcgt catcgagcag agctcctccc 5100
tgaatgaggc cagcagtggc ctcttcgacg tcttcctacg cttcatgtgc caccacgccg 5160
tgcgcatcag gggcaagtcc tacgtccagt gccaggggat cccgcagggc tccatcctct 5220
ccacgctgct ctgcagcctg tgctacggcg acatggagaa caagctgttt gcggggattc 5280
ggcgggacgg gctgctcctg cgtttggtgg atgatttctt gttggtgaca cctcacctca 5340
cccacgcgaa aaccttcctc aggaccctgg tccgaggtgt ccctgagtat ggctgcgtgg 5400
tgaacttgcg gaagacagtg gtgaacttcc ctgtagaaga cgaggccctg ggtggcacgg 5460
cttttgttca gatgccggcc cacggcctat tcccctggtg cggcctgctg ctggataccc 5520
ggaccctgga ggtgcagagc gactactcca gctatgcccg gacctccatc agagccagtc 5580
tcaccttcaa ccgcggcttc aaggctggga ggaacatgcg tcgcaaactc tttggggtct 5640
tgcggctgaa gtgtcacagc ctgtttctgg atttgcaggt gaacagcctc cagacggtgt 5700
gcaccaacat ctacaagatc ctcctgctgc aggcgtacag gtttcacgca tgtgtgctgc 5760
agctcccatt tcatcagcaa gtttggaaga accccacatt tttcctgcgc gtcatctctg 5820
acacggcctc cctctgctac tccatcctga aagccaagaa cgcagggatg tcgctggggg 5880
ccaagggcgc cgccggccct ctgccctccg aggccgtgca gtggctgtgc caccaagcat 5940
tcctgctcaa gctgactcga caccgtgtca cctacgtgcc actcctgggg tcactcagga 6000
cagcccagac gcagctgagt cggaagctcc cggggacgac gctgactgcc ctggaggccg 6060
cagccaaccc ggcactgccc tcagacttca agaccatcct ggactgatgg ccacccgccc 6120
acagccaggc cgagagcaga caccagcagc cctgtcacgc cgggctctac gtcccaggga 6180
gggaggggcg gcccacaccc aggcccgcac cgctgggagt ctgaggcctg agtgagtgtt 6240
tggccgaggc ctgcatgtcc ggctgaaggc tgagtgtccg gctgaggcct gagcgagtgt 6300
ccagccaagg gctgagtgtc cagcacacct gccgtcttca cttccccaca ggctggcgct 6360
cggctccacc ccagggccag cttttcctca ccaggagccc ggcttccact ccccacatag 6420
gaatagtcca tccccagatt cgccattgtt cacccctcgc cctgccctcc tttgccttcc 6480
acccccacca tccaggtgga gaccctgaga aggaccctgg gagctctggg aatttggagt 6540
gaccaaaggt gtgccctgta cacaggcgag gaccctgcac ctggatgggg gtccctgtgg 6600
gtcaaattgg ggggaggtgc tgtgggagta aaatactgaa tatatgagtt tttcagtttt 6660
gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 6679
<210> 2
<211> 2652
<212> DNA
<213> 抗tEGFR的单链抗体序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgcagc tggtggagga cggggggggg ctggtgcagc cgggaggaag cctgaggctg 60
agctgcgcgg cgagcggatt cacgctgagc ggagactgga tacactgggt gaggcaggcg 120
ccgggaaagg gactggagtg gctgggagag ataagcgcgg cgggaggata cacggactac 180
gcggacagcg tgaagggaag gttcacgata agcgcggaca cgagcaagaa cacggcgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggcggaggac acggcggtgt actactgcgc gagggagagc 300
agggtgagct tcgaggcggc gatggactac tggggacagg gaacgctggt gacggtgagc 360
agcgcgagca cgaagggacc gagcgtgttc ccgctggcgc cgagcagcaa gagcacgagc 420
ggaggaacgg cggcgctggg atgcctggtg aaggacgtgt tcccggagcc ggtgacggtg 480
agctggaaca gcggagcgct gacgagcgga gtgcacacgt tcccggcggt gctgcagagc 540
agcggactgg tgagcctgag cagcgtggtg acggtgccga gcagcagcct gggaacgcag 600
acggtgatat gcaacgtgaa ccacaagccg agcaacacga aggtggacaa gaaggtggag 660
ccgaagagct gcgacaagac gcacgaggtg cagctggtgg aggacggggg ggggctggtg 720
cagccgggag gaagcctgag gctgagctgc gcggcgagcg gattcacgct gagcggagac 780
tggatacact gggtgaggca ggcgccggga aagggactgg agtggctggg agagataagc 840
gcggcgggag gatacacgga ctacgcggac agcgtgaagg gaaggttcac gataagcgcg 900
gacacgagca agaacacggc gtacctgcag atgaacagcc tgagggcgga ggacacggcg 960
gtgtactact gcgcgaggga gagcagggtg agcttcgagg cggcgatgga ctactgggga 1020
cagggaacgc tggtgacggt gagcagcgcg agcacgaagg gaccgagcgt gttcccgctg 1080
gcgccgagca gcaagagcac gagcggagga acggcggcgc tgggatgcct ggtgaaggac 1140
gtgttcccgg agccggtgac ggtgagctgg aacagcggag cgctgacgag cggagtgcac 1200
acgttcccgg cggtgctgca gagcagcgga ctggtgagcc tgagcagcgt ggtgacggtg 1260
ccgagcagca gcctgggaac gcagacggtg atatgcaacg tgaaccacaa gccgagcaac 1320
acgaaggtgg acaagaaggt ggagccgaag agctgcgaca agacgcacga catacagatg 1380
acgcagagcc cgagcagcct gagcgcgagc gtgggagaca gggtgacgat aacgtgcagg 1440
gcgagccagg acctggcgac ggacgtggcg tgggtgcagc agaagccggg aaaggcgccg 1500
aagctgctga tagtgagcgc gagcttcctg gtgagcggag tgccgagcag gttcagcgga 1560
agcggaagcg gaacggactt cacgctgacg ataagcagcc tgcagccgga ggacttcgcg 1620
acggtggtgt gccagcagag cgagccggag ccggtgacgt tcggacaggg aacgaaggtg 1680
gagataaaga ggacggtggc ggcgccgagc gtgttgatat tgccgccgag cgacgagcag 1740
ctgaagagcg gaacggcgag cgtggtgtgc ctgctgaaca acttcgtgcc gagggaggcg 1800
aagctgcagt ggaagctgga caacgcgctg cagagcggaa acagccagga gagcctgacg 1860
gagcagctga gcaagctgag cacggtgagc ctgagcagca cgctgacgct gagcaaggcg 1920
ctggtggaga agcacaagct ggtggcgtgc gagctgacgc accagggact gagcagcccg 1980
ctgacgaaga gcttgaacag gggagagtgc gacatacaga tgacgcagag cccgagcagc 2040
ctgagcgcga gcgtgggaga cagggtgacg ataacgtgca gggcgagcca ggacctggcg 2100
acggacgtgg cgtgggtgca gcagaagccg ggaaaggcgc cgaagctgct gatagtgagc 2160
gcgagcttcc tggtgagcgg agtgccgagc aggttcagcg gaagcggaag cggaacggac 2220
ttcacgctga cgataagcag cctgcagccg gaggacttcg cgacggtggt gtgccagcag 2280
agcgagccgg agccggtgac gttcggacag ggaacgaagg tggagataaa gaggacggtg 2340
gcggcgccga gcgtgttgat attgccgccg agcgacgagc agctgaagag cggaacggcg 2400
agcgtggtgt gcctgctgaa caacttcgtg ccgagggagg cgaagctgca gtggaagctg 2460
gacaacgcgc tgcagagcgg aaacagccag gagagcctga cggagcagct gagcaagctg 2520
agcacggtga gcctgagcag cacgctgacg ctgagcaagg cgctggtgga gaagcacaag 2580
ctggtggcgt gcgagctgac gcaccaggga ctgagcagcc cgctgacgaa gagcttgaac 2640
aggggagagt gc 2652
<210> 3
<211> 4027
<212> DNA
<213> 抗CD19嵌合抗原受体序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 60
cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 120
tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 180
gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 240
cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 300
cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 360
cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 420
acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 480
gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 540
tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 600
ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 660
cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 720
ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 780
ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 840
cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 900
ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 960
agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1020
ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1080
ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1140
agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1200
tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1260
agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1320
cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1380
acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1440
acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1500
acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1560
agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1620
ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1680
ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1740
atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1800
gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1860
cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1920
gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1980
ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2040
tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2100
gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2160
cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2220
aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2280
gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2340
acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2400
agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2460
gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2520
gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2580
gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2640
tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2700
ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2760
agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2820
tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2880
tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2940
gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3000
gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3060
acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3120
atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3180
tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3240
ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3300
tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3360
agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg 3420
cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg 3480
agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc 3540
ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct 3600
gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc 3660
tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc 3720
agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc 3780
cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc 3840
caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt 3900
gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg 3960
ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaa 4027

Claims (9)

1.一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK序列信息如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所示的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK序列包括tEGFR单链抗体核苷酸序列和CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述tEGFR的单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括编码前导肽的序列，核苷酸信息如SEQ ID NO.2第1-57位核苷酸所示；抗tEGFR单链抗体的的轻链可变区，核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2第60-324位氨基酸所示；抗tEGFR单链抗体的重链可变区，核苷酸序列如SEQ ID NO.2第444-804位核苷酸所示；编码人tEGFR跨膜区氨基酸的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.2第816-954位核苷酸所示；人tEGFR铰链区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.2第957-1026位核苷酸所示；人4-1BB共刺激分子区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.2第1029-1164位核苷酸所示；人CD3ζ胞内区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.2第1167-1494位核苷酸所示；tEGFR-SCFV片段，序列信息如SEQ ID NO.2第792-1782位核苷酸所示。
4.如权利要求2所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示，包括前导肽的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第1-69位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的轻链可变区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第78-426位核苷酸所示；抗CD19单链抗体的重链可变区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第483-1857位核苷酸所示；人CD28跨膜区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第1962-2424位核苷酸所示；人CD8铰链区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第2538-2856位核苷酸所示；人4-1BB共刺激分子区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第2964-3582位核苷酸所示；人CD3ζ胞内区的核苷酸，序列信息如SEQ ID NO.3第3660-4017位核苷酸所示；抗CD19的SCFV片段含有264-594位核苷酸序列；抗CD19-SCFV片段，序列信息如SEQ ID NO.3第792-1782位核苷酸所示。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、人工构建CAR-NK序列：按照tEGFR—CD19的顺序排列，于公司合成人工序列，得人工合成的CAR-NK序列；
S2、将步骤S1所得人工合成的CAR-NK序列通过酶切的方法整合到慢病毒质粒载体pWCDX1中，得重组质粒载体；
S3、将步骤S2所得重组质粒载体转染入NK细胞，即得。
6.如权利要求4所述的CAR-NK细胞制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的酶切方法指利用EcoRI/HindIII双酶切载体与CAR碱基序列，得相同的酶切末端，然后用T4连接酶连接。
7.一种如权利要求1所述的CAR-NK细胞在制备治疗CD19介导的疾病相关药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，指在肿瘤疾病中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤主要指白血病、淋巴瘤。
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