CN110092826A

CN110092826A - CTLA-4类似物CFN13及CFN13-Fc基因和蛋白

Info

Publication number: CN110092826A
Application number: CN201910153053.XA
Authority: CN
Inventors: 孙剑; 刘芳; 姚利; 苏丽丽; 陈子腾
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN110092826B

Abstract

本发明公开了一种CTLA‑4类似物CFN13及CFN13‑Fc基因和蛋白，基于FN3的结构，将结合CD80的受体CTLA‑4关键区域1的8个氨基酸序列替换FN3的BC环的8个氨基酸，CTLA‑4关键区域2的10个氨基酸序列替换FN3的FG环的10个氨基酸而得到的抗体类似物CFN13蛋白。该蛋白性质具有稳定，分子量小等特点。进一步，将CFN13与人IgG1Fc融合，构建CFN13‑Fc基因及融合蛋白，通过生物实验验证了CFN13蛋白的功能活性。为开发有临床应用前景的新药先导药物奠定了实验研究基础。

Description

CTLA-4类似物CFN13及CFN13-Fc基因和蛋白

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种CTLA-4类似物CFN13基因和蛋白及其与人IgG1Fc融合基因及融合蛋白。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)是共刺激分子CD28家族成员，作为抑制性受体，它与CD28竞争结合共享配体B7分子,抑制CD28的功能(1)。在免疫反应过程中，T细胞通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)识别病原微生物、肿瘤等抗原,在共刺激分子CD28提供的第二信号共同作用下而活化，产生免疫效应，清除病原微生物和肿瘤细胞，发挥细胞免疫的抗感染、抗肿瘤功能。然而，除协同刺激信号外，T细胞的作用还受到抑制信号的负向调节，以防止过度免疫反应造成的组织损伤。这些负抑制信号也被称为免疫检查点(2)。CTLA-4作为重要的免疫检测点分子，抑制CD28分子的正向调节作用，从而下调T细胞应答。因此，免疫检查点抑制剂就是通过阻断这些免疫抑制信号的传递，提高T细胞的抗肿瘤免疫反应。目前,肿瘤免疫检查点抑制剂是肿瘤免疫治疗(Immuno-oncology,I/O)药物治疗的最主要方面，通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身免疫系统功能消除肿瘤(3)。2011年，FDA批准了CTLA-4抗体Yervoy(ipilimumab，易普利姆玛)用于治疗转移的黑色素瘤患者，标志着癌症免疫治疗革命的开端，为众多癌症患者带来了新的希望(4)。

抗体分子是B淋巴细胞产生的一类大分子蛋白，它由两条重链和两条轻链组成，由于抗体具有高度的亲和性和特异性等特点。利用抗体分子作为药物治疗疾病已经在临床上广泛应用，其销售额每年都快速递增。2000-2010年，抗体药物在全球生物制药中的市场份额从10.5％上升到56.4％，成为生物制药行业中占比最大的子行业，被认为是未来生物医药领域发展的主旋律。全球抗体类药物销售额从2011年的不到500亿美元增加到2017年的1060亿美元。因此，抗体是重要的生物药物。尽管抗体分子有着较强的结合能力和选择性，但是由于抗体本身的一些性质，如相对分子质量大(约为1.5x10⁵)、结构复杂、依赖二硫键的连结等，也导致了抗体分子的热稳定性差、制备过程复杂、进入实体瘤效率低等问题。因此，抗体的临床应用仍然具有较大的局限性。抗体类似物是新一代的生物药物，它具有与抗体类似的高亲和力和特异性强等特点，又有着一些抗体所没有的优点：相对分子质量小、折叠速率快、结构稳定、选择性和亲和力高.以及可以经受化学修饰等。目前，以纤粘蛋白Ⅲ型结构域(Fibronectin 3，FN3)为骨架的抗体类似物的研究较多(5，6)。FN3是由94个氨基酸所组成的-折叠片层分子，具有结构稳定，在大肠杆菌中高效、可溶性表达等特点。FN3的BC、DE和FG三个环(loop)类似于抗体分子中结合抗原的互补决定区(complementarydetermine region，CDR)(见图1)，可以被替换或突变,展示配体结合肽，从而形成新的配体结合分子，又称为Adnectin或monobody。其中一些Adnectin分子已进入临床试验如拮抗血管生长因子(VEGF)的Adnectin分子，CT-322(7)。因此，基于FN3骨架蛋白设计的新型抗体类药物有望成为新一代生物药物。

我们在分析CTLA-4结合配体的模式后，截取结合的关键区域和氨基酸，嫁接到FN3的BC和FG环，构建了CFN13。

参考文献：

1.Krummel MF,Allison JP.CD28and CTLA-4have opposing effects on theresponse of T cells to stimulation.The journal of experimentalmedicine.1995.182:459-465.

2.Allison JP.Checkpoints.Cell.2015Sep 10；162(6):1202-1205.

3.Wei SC,Duffy CR,Allison JP.Fundamental Mechanisms of ImmuneCheckpoint Blockade Therapy.Cancer Discov.2018；8(9):1069-1086.

4.Phan GQ,Yang JC,Sherry RM,Hwu P,Topalian SL,Schwartzentruber DJ,Restifo NP,Haworth LR,Seipp CA,Freezer LJ,Morton KE,Mavroukakis SA,Duray PH,Steinberg SM,Allison JP,Davis TA,Rosenberg SA.Cancer regression andautoimmunity induced by cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4blockadein patients with metastatic melanoma.Proc Natl Acad Sci U S A.2003Jul 8；100(14):8372-7

5.Koide A,Bailey CW,Huang X and Koide S.The fibronectin type IIIdomain as a scaffold for novel binding proteins.J Mol Biol.1998；284:1141-51.

6.Koide S,Koide A,D(2012)Target-binding proteins based on the10th human fibronectin type III domain(¹⁰Fn3).Methods Enzymol.2012；503:135-56.

7.Sachdev E,Gong J,Bobbie Rime B and Mita M.Adnectin-TargetedInhibitors:Rationale and Results.Curr Oncol Rep.2015；17:35

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种拮抗CTLA-4的抗体类似物CFN13基因。

本发明的第二个目的是提供一种拮抗CTLA-4的抗体类似物CFN13蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种拮抗CTLA-4的抗体类似物CFN13-Fc基因。

本发明的第四个目的是提供一种拮抗CTLA-4的抗体类似物CFN13-Fc蛋白。

本发明的技术方案概述如下：

一种CTLA-4类似物CFN13基因，它具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

CTLA-4类似物CFN13基因表达的蛋白，它具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

一种CTLA-4类似物CFN13-Fc基因，它具有序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

CTLA-4类似物CFN13-Fc基因表达的蛋白，它具有序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

有益效果：

本发明是基于FN3的结构，将结合CD80的受体CTLA-4关键区域1(见图2标注的BC区域)的8个氨基酸序列替换FN3的BC环的8个氨基酸(见图1.b标注的BC loop),CTLA-4关键区域2的(见图标注的FG区域)10个氨基酸序列替换FN3的FG环的10个氨基酸(见图1.b标注的FG loop)而得到的抗体类似物CFN13蛋白。该蛋白性质稳定，分子量小。为增加CFN13体内半衰期，将CFN13与人IgG1Fc通过连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)连接为CFN13-Fc。进一步通过生物实验验证了CFN13蛋白的功能活性。为开发有临床应用前景的新药先导药物奠定了实验研究基础。

附图说明

图1.FN3与抗体示意图.(A)抗体；(B)FN3(引自Koide A.et al.J Mol Biol 1998,284:1141-1151)；

图2.CTLA-4/CD80的晶体结构(自蛋白数据库Protein data bank database，1I8L)；

图3.WFN的合成合同；编码WFN的基因序列通过无锡青兰生物技术有限公司合成，合成基因经测序，完全正确；

图4.CFN13的合成合同；编码CFN13的基因序列通过北京擎科生物技术有限公司合成，合成基因经测序，完全正确；

图5.WFN菌落PCR筛选；1，Marker；5，6，7，8，9，阳性菌落；

公司合成含WFN基因的载体经过限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ酶切之后与同样经过NdeⅠ和HindⅢ酶切的载体pET30a连接、转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；从转化平板中挑取菌落进行PCR鉴定，以含有重组质粒的菌落作为模板，WFN前后引物作为上下游引物，1％琼脂糖凝胶电泳；能够看到297bp左右的目的条带；

图6.FN3、TFN3质粒PCR；1，Marker；2，3，WFN；

选取菌落PCR阳性的菌株，提取质粒，以质粒为模板，WFN前后引物作为两端引物，1％琼脂糖凝胶电泳；结果能够看到目的条带，大小正确；

图7.小样诱导WFN和CFN13；a.WFN小样诱导.目的条带用箭头标注；b.CFN13小样诱导.目的条带用箭头标注；小样诱导结果显示，WFN和CFN13都能在大肠杆菌中表达；

图8.WFN3、CFN13蛋白SDS-PAGE电泳图；1，WFN3；2，marker：各条带分子量见左侧标注；3，CFN13；

WFN3、CFN13蛋白纯化使用金属Ni螯合琼脂糖凝胶亲和层析，用PBS过夜透析之后，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白大小及纯度；

图9.CFN13显著结合CD80；

ELISA实验结果表明：CFN13明显结合CD80，结合作用与融合蛋白的浓度呈正相关；

图10.为CFN13-Fc融合蛋白SDS-PAGE电泳图；

图11.CFN13-Fc显著结合CD80；

图12.CFN13-Fc显著竞争抑制CTLA-4-Fc结合。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

本发明所采用的Fc基因和蛋白：吴真.BCMA-Fc作为潜在药物的研究[D].天津大学,2012SEQ ID NO.5所示。

其它制备原料均为商品获得。

1.计算机分析CTLA-4与CD80结合模式，确定植入FN3的肽序列

我们基于CTLA-4/CD80的晶体结构(自蛋白数据库Protein data bank database，1I8L)分析CTLA-4结合CD80的模式(图2)。复合物由CTLA-4和CD80组成。基于这个3D结构，进一步通过分子对接(Molecular docking)、分子动力学模拟(Molecular dynamics(MD)simulations)、自由能计算和丙氨酸突变等一系列方法分析CTLA-4结合CD80的模式。CTLA-4结合CD80的关键区域1(见图2标注的BC区域)中的8个氨基酸ASPGKATE作为替换FN3BC环的8个氨基酸DAPAVTVR(见图1.b标注的BC loop区域)序列，考虑FN3的FG环可突变的大小是10个左右氨基酸，我们选定CTLA-4结合CD80的关键区域2(见图2标注的FG区域)中的10个氨基酸ELMYPPPYYL作为替换FN3FG环的10个氨基酸GRGDSPASSK(见图1.B标注的FG loop区域)序列。构建能够结合CD80新的FN3分子CFN13。

2.CFN13基因的构建和表达

2.1 CFN13重组质粒的构建

依据骨架蛋白FN3序列和BC、FG环(loop)的位置，确定FN3的BC环的8个氨基酸DAPAVTVR替换为CTLA-4结合CD80的关键区域1中的8个氨基酸ASPGKATE，将FN3的FG环的10个氨基酸序列GRGDSPASSK替换为CTLA-4结合CD80关键序列2的10个氨基酸ELMYPPPYYL，构建新的CD80结合蛋白CFN13。其氨基酸序列(SEQ ID No.2)为：TDLEVVAATPTSLLISWASPGKAT EYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVCELMYPPPYYLCISINYRTEQKLISEEDLEQKLISEEDLKL。

下划线标注的区域为CTLA-4结合CD80的关键区域1(见图2标注的BC区域)和2(见图2标注的FG区域)序列。

核苷酸序列(SEQ ID No.1)为:

5’-ACCGATCTGGAAGTGGTGGCGGCGACCCCGACCAGCCTGCTGATTAGCTGGGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGTATTATCGCATTACCTATGGCGAAACCGGCGGCAACAGCCCGGTGCAGGAATTTACCGTGCCGGGCAGCAAAAGCACCGCGACCATTAGCGGCCTGAAACCGGGCGTGGATTATACCATTACCGTGTATGCGGTGTGTGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGTGTATTAGCATTAACTATCGCACC-3’。

野生型FN3-WFN作为阴性对照。其氨基酸序列为：

QVSDVPTDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTKL。下划线标注的区域为将被替换的BC环(见图1.B标注的BC loop区域)的8个氨基酸DAPAVTVR和FG环(见图1.B标注的FG loop区域)的10个氨基酸序列GRGDSPASSK。

核苷酸序列为：

5’-CAGGTGAGCGATGTGCCGACCGATCTGGAAGTGGTGGCGGCGACCCCGACCAGCCTGCTGATTAGCTGGGATGCGCCGGCGGTGACCGTGCGCTATTATCGCATTACCTATGGCGAAACCGGCGGCAACAGCCCGGTGCAGGAATTTACCGTGCCGGGCAGCAAAAGCACCGCGACCATTAGCGGCCTGAAACCGGGCGTGGATTATACCATTACCGTGTATGCGGTGACCGGCCGCGGCGATAGCCCGGCGAGCAGCAAACCGATTAGCATTAACTATCGCACC-3’

WFN、CFN13基因分别由无锡青兰和北京擎科公司全基因合成(图3、4)。含WFN3、TFN3基因的载体经过限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ酶切之后与同样经过NdeⅠ和HindⅢ酶切的载体pET30a连接。在无菌状态下，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。菌液均匀涂于含Kana固体培养基平板上，37℃培养12—20个小时，观察菌落生长情况并4℃保存平板。Kana固体培养基平板生长的克隆分别使用菌落PCR鉴定和质粒PCR鉴定(附图5、6)。阳性克隆送公司测序鉴定。

2.2 WFN和CFN13蛋白的诱导和表达

首先小样诱导筛选高表达的WFN3和CFN13蛋白克隆。将测序正确的重组质粒pET30a-WFN和pET30a-CFN13转化表达宿主菌BL21。挑取转化平板的六个克隆，分别接种于2mL LB+Kana培养基中，37℃振荡过夜。按700μL菌液和300μL 50％甘油的比例保存菌种，剩余菌液按l：1000加入IPTG，37℃振荡诱导过夜。SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达，挑选高表达克隆(附图7)。

表达和纯化WFN和CFN13蛋白是按照以下步骤进行的。取高表达菌种20μL接种于2mL LB+Kana培养基中，37℃培养过夜，转接于2000mL LB+Kana培养基中，37℃振荡培养至OD＝0.5,加0.5mM IPTG，37℃振荡诱导过夜。菌液8000rpm，4℃离心10min，得菌体用1×PBS洗涤一次，然后用80mL 1×PBS重悬，冷冻。反复冻融三次，冰浴中超声破菌。将破碎后的细胞12000rpm，4℃离心10min。得到的上清用4.5mm滤膜过滤，调pH为7.4。上清过Ni亲和层析柱，分别使用10、20、50、100、200和500mM的咪唑洗脱液洗脱结合蛋白。分别取各浓度梯度的洗脱液400μL，各加1mL无水酒精于-20℃浓缩2h，4℃，12000rpm离心，去上清，加40μL PBS缓冲溶液重悬，加10μL 5×loading buffer混合均匀，沸水浴10min，冰浴2min，SDS-PAGE电泳观察并分析蛋白纯化结果(图8)。

3.ELISA实验验证CFN13的功能活性

按常规ELISA方法做CFN13与配体CD80蛋白结合的ELISA。其操作步骤如下：

a)包被：150μg/ml的CD80与包被液按1:2稀释，制备50μg/ml的CD80底物包被液。将稀释的CD80按50μL/孔包被96孔板。只加包被液包被的孔做空白对照。4℃放置18h。

b)PBST洗板三次后，每孔加入150μL 5％的奶粉，室温封闭2h。

c)PBST洗板三次，将CFN13稀释至不同浓度(0、10、50、100、和200μg/mL)，每孔加入50μL。37℃，温育1h。

d)PBST洗板三次，加入用5％奶粉稀释的HRP标记羊抗人2抗(比例按说明书稀释)，每孔加入50μL。37℃，温育1h。

e)PBST洗板三次后，显色。

f)终止反应，测450nm的OD值。

4.构建含CFN13-Fc融合蛋白基因的质粒CFN13-Fc-pET30a

4.1 CFN13-Fc重组质粒的构建

CFN13分子量小，体内半衰期短。因此我们构建CFN13与人IgG1Fc融合的CFN13-Fc基因，其核苷酸序列(SEQ ID No.3)为：

ACCGATCTGGAAGTGGTGGCGGCGACCCCGACCAGCCTGCTGATTAGCTGGGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGTATTATCGCATTACCTATGGCGAAACCGGCGGCAACAGCCCGGTGCAGGAATTTACCGTGCCGGGCAGCAAAAGCACCGCGACCATTAGCGGCCTGAAACCGGGCGTGGATTATACCATTACCGTGTATGCGGTGTGTGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGTGTATTAGCATTAACTATCGCACCGGTGGCGGTGGCAGCGGTGGTGGTGGTTC TGGTGGCGGTGGATCTCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCCCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

下划线为linker序列(G4S)×3(GGGGSGGGGSGGGGS)。

编码CFN13-Fc蛋白氨基酸序列(SEQ ID No.4)为：

TDLEVVAATPTSLLISWASPGKATEYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVCELMYPPPYYLCISINYRTEQKLISEEDLEQKLISEEDLKLGGGGSGGGGSGGGGSPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

下划线为linker序列(G4S)×3(GGGGSGGGGSGGGGS)。

a)CFN13和人IgG1Fc片段由PCR技术获得。依据CFN13和Fc序列，我们设计了四条DNA引物，并委托生物公司制备。CFN13、Fc片段通过重叠PCR连接成为CFN13-Fc基因片段。

b)CFN13-Fc基因片段经过限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切之后，连接在被NdeI和Hind III酶切过的载体pET30a上。

c)将连接体系转化进入JM109大肠杆菌中。菌落PCR、质粒PCR筛选阳性克隆。将阳性克隆菌种送生物公司测序，测序结果进行序列比对，正确率100％，表明CFN13-Fc-pET30a重组质粒构建成功。

4.2 CFN13-Fc融合蛋白的诱导和表达

将测序正确的重组质粒CFN13-Fc-pET30a转化表达宿主菌BL21进行高表达菌株筛选，发现在IPTG浓度0.5mM，16℃慢速振摇的条件下诱导，能够诱导出目的蛋白。选取菌株进行大量表达，经蛋白A凝胶亲和层析柱纯化，将洗脱组分在1×PBS中透析，收集，用紫外分光光度计测量计算蛋白浓度为200ng/μl。取透析后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，发现目的蛋白的大小为32KD，和CFN13-Fc预测理论值大小一致，并且具有较高纯度(见图10)。

5.ELISA实验验证CFN13-Fc融合蛋白的结合CD80活性

按常规ELISA方法做CFN13-Fc与配体CD80蛋白结合的ELISA。其操作步骤如下：

b)PBST洗板三次后，每孔加入150μL 5％的奶粉，室温封闭2h。

c)PBST洗板三次，将CFN13-Fc稀释至不同浓度(0、10、50和100μg/mL)，每孔加入50μL。37℃，温育1h。

e)PBST洗板三次后，显色。

f)终止反应，测450nm的OD值。

6.ELISA实验验证CFN13-Fc融合蛋白竞争抑制CTLA-Fc结合CD80的活性

按竞争ELISA方法做CFN13-Fc竞争抑制CTLA-Fc与配体CD80蛋白结合的ELISA。其操作步骤如下：

b)PBST洗板三次后，每孔加入150μL 5％的奶粉，室温封闭2h。

c)PBST洗板三次，将稀释成不同浓度的CFN13--Fc(终浓度分别为0、10、25、50、100、和200μg/mL)，与100μg/mL的CTLA4-Fc-myc混合制备成竞争液，每孔加入50μL。37℃，温育1h。

d)PBST洗板三次，加入用5％奶粉稀释的小鼠抗myc一抗(比例按说明书稀释)，每孔加入50μL。37℃，温育1h。

e)PBST洗板三次，加入用5％奶粉稀释的HRP标记的人抗小鼠二抗(比例按说明书稀释)，每孔加入50μL。37℃，温育1h。

f)PBST洗板三次后，显色。

g)终止反应，测450nm的OD值。

CFN13-Fc融合蛋白对CTLA-4与CD80的相互作用的抑制效果用下述公式计算：抑制率％＝(对照组OD450—实验组OD450)/对照组OD450

竞争ELISA实验结果表明：CFN13-Fc浓度在10μg/ml时能够抑制2.8％CD80与CTLA4-Fc的结合；在50μg/ml时能够抑制10.6％CD80与CTLA4-Fc的结合；在100μg/ml时能够抑制16.7％CD80与CTLA4-Fc的结合；在200μg/ml时能够抑制37.2％CD80与CTLA4-Fc的结合。抑制作用与融合蛋白的浓度呈正相关(见图12)。明显高于阴性对照Fc蛋白对CTLA-4与CD80的相互作用。证明CFN13-Fc的抑制作用是特异和有效的。

结果：

1.WFN和CFN13基因合成：编码WFN3的基因序列通过无锡青兰生物技术有限公司合成。合成基因经测序，完全正确(见图3)。CFN13的基因序列通过北京擎科生物技术有限公司合成。合成基因经测序，完全正确(见图4)。

2.WFN和CFN13表达载体的构建与表达

将WFN连接体系转化进入DH5α大肠杆菌中。WFN的菌落PCR结果显示5-9号菌种为阳性。对5号、8号菌种提取质粒做质粒PCR，结果有297bp目的条带，见图5中2,3条带，菌落PCR和质粒PCR结果显示pET30a-WFN重组质粒正确。为进一步验证序列的准确性，选取WFN的5号菌种送生物公司测序，测序结果进行序列比对，正确率100％，表明pET30a-WFN重组质粒构建成功。

从宿主菌DH5α提取重组质粒，转化到表达宿主菌BL21，进行高表达菌株筛选，发现在IPTG浓度0.5mM，16℃慢速振摇的条件下诱导，能够诱导出目的蛋白CFN13、WFN。选取菌株进行大量表达，经金属Ni螯合琼脂糖凝胶亲和层析纯化，洗脱组分做SDS-PAGE电泳，发现CFN和WFN的100mM洗脱组分有目的条带，说明这些组分中有目的蛋白。将上述组分洗脱液在1×PBS中透析，收集。取透析后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，发现，目的蛋白的大小和CFN13、WFN蛋白的理论预测值11.78kD大小一致，并且具有较高纯度。

本发明应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

<110> 天津大学

<120> CTLA-4类似物CFN13及CFN13-Fc基因和蛋白

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 339

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

catatgaccg atctggaagt ggtggcggcg accccgacca gcctgctgat tagctgggca 60

tctccaggca aagccactga gtattatcgc attacctatg gcgaaaccgg cggcaacagc 120

ccggtgcagg aatttaccgt gccgggcagc aaaagcaccg cgaccattag cggcctgaaa 180

ccgggcgtgg attataccat taccgtgtat gcggtgtgtg agctcatgta cccaccgcca 240

tactacctgt gtattagcat taactatcgc accgagcaga aactcatctc tgaagaggat 300

ctggagcaga aactcatctc tgaagaggat ctgaagctt 339

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Thr Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser

1 5 10 15

Trp Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly

20 25 30

Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser

35 40 45

Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr

50 55 60

Ile Thr Val Tyr Ala Val Cys Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr

65 70 75 80

Leu Cys Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu

85 90 95

Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Lys Leu

100 105 110

<210> 3

<211> 942

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

accgatctgg aagtggtggc ggcgaccccg accagcctgc tgattagctg ggcatctcca 60

ggcaaagcca ctgagtatta tcgcattacc tatggcgaaa ccggcggcaa cagcccggtg 120

caggaattta ccgtgccggg cagcaaaagc accgcgacca ttagcggcct gaaaccgggc 180

gtggattata ccattaccgt gtatgcggtg tgtgagctca tgtacccacc gccatactac 240

ctgtgtatta gcattaacta tcgcaccggt ggcggtggca gcggtggtgg tggttctggt 300

ggcggtggat ctccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 360

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 420

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 480

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 540

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 600

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 660

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 720

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 780

acgcctcccg tgctggactc cgacggcccc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 840

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 900

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 942

<210> 4

<211> 336

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

Thr Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser

1 5 10 15

Trp Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly

20 25 30

Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser

35 40 45

Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr

50 55 60

Ile Thr Val Tyr Ala Val Cys Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr

65 70 75 80

Leu Cys Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu

85 90 95

Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Lys Leu Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

130 135 140

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

145 150 155 160

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

165 170 175

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

180 185 190

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

195 200 205

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

210 215 220

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

225 230 235 240

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

245 250 255

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

260 265 270

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

275 280 285

Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

290 295 300

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

305 310 315 320

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330 335

Claims

1.CTLA-4类似物CFN13基因，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.CTLA-4类似物CFN13基因表达的蛋白，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.CTLA-4类似物CFN13-Fc基因，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

4.CTLA-4类似物CFN13-Fc基因表达的蛋白，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。