JP6712268B2 - Coronavirus - Google Patents

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Description

本発明は、ウイルスの病原性を低減させる変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる弱毒化コロナウイルスに関する。本発明はまた、疾患を予防および/または治療するためのワクチンにおけるそのようなコロナウイルスの使用に関する。 The present invention relates to an attenuated coronavirus comprising a mutant replicase gene that reduces the pathogenicity of the virus. The invention also relates to the use of such a coronavirus in a vaccine for preventing and/or treating disease.

伝染性気管支炎(infectious bronchitis)(IB)の病原体であるトリ伝染性気管支炎ウイルス(infectious bronchitis virus)(IBV)は、主に気道で複製するが消化管、腎臓および卵管の上皮細胞でも複製する家禽の感染性の高い伝染性の病原体である。IBVは、ニドウイルス目(Nidovirales)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、コロナウイルス亜科(Coronavirinae)およびガンマコロナウイルス属(Gammacoronavirus)のメンバーである;遺伝的に非常によく似たコロナウイルスは、シチメンチョウ、ホロホロチョウおよびキジの疾患を引き起こす。 Avian infectious bronchitis virus (IBV), a pathogen of infectious bronchitis (IB), replicates mainly in the respiratory tract but also in epithelial cells of the digestive tract, kidney and oviduct. It is a highly contagious pathogen of poultry. IBV is a member of the orders Nidovirales, Coronaviridae, Coronavirinae and Gammacoronavirus; genetically very similar coronaviruses are turkeys. , Causes the disease of guinea fowl and pheasant.

IBの臨床徴候には、くしゃみ、気管ラ音、鼻汁および喘鳴音が含まれる。肉用鳥類は体重増加の減少があり、一方、産卵鳥類は産卵数が少なくなり、低品質の卵を生産する。呼吸器感染症は、ヒヨコには致命的になる可能性がある二次的細菌感染症にニワトリを罹患しやすくする。このウイルスはまた、卵管(特に、ヒヨコでは、卵の生産および品質の低下につながる);および腎臓(致命的になる可能性がある腎臓疾患につながることがある)への恒久的な損傷をもたらし得る。 Clinical signs of IB include sneezing, trachea, nasal discharge and wheezing. Meat birds have a reduced weight gain, while laying birds produce fewer eggs and produce lower quality eggs. Respiratory infections predispose chickens to secondary bacterial infections that can be fatal to chicks. The virus also causes permanent damage to the fallopian tubes (especially in chicks, which leads to poor egg production and quality) and to the kidneys (which can lead to potentially fatal kidney disease). Can bring.

IBVは、他の感染症よりも多くの、家禽産業にとっての経済的損失に関与することが報告されている。弱毒化生ワクチンおよび不活化ワクチンはIBVの制御に広く使用されているが、ワクチン接種の使用によって得られる保護は、ワクチンの破壊または使用したワクチンに関連していない新たなIBV血清型の導入のいずれかによって失われる可能性があり、家禽産業に対するリスクとなる。 IBV has been reported to be responsible for more economic loss to the poultry industry than other infectious diseases. Although live attenuated and inactivated vaccines are widely used in the control of IBV, the protection afforded by the use of vaccination is the destruction of the vaccine or the introduction of new IBV serotypes that are not related to the vaccine used. It can be lost by either and poses a risk to the poultry industry.

さらに、当業界では、ワクチン接種プログラムの効率および費用効果を改善するために、卵内での使用に好適なワクチンを開発する必要がある。卵内ワクチン接種に関連する主要な課題は、ウイルスが、胚に対して病原性を示さずに、ウイルスに対する母体由来抗体の存在下で複製可能でなければならないことである。現在のIBVワクチンは、発育卵で複数回継代した後に得られ、これは、ニワトリに対する病原性が低減しているウイルスを生じ、弱毒化生ワクチンとしてそれらを使用することができるようになっている。しかしながら、このようなウイルスは、ほとんどの場合、胚に対する病原性の増強を示し、従って、それらは孵化率を減少させることから、卵内ワクチン接種に使用することができない。孵化率の70%減少は一部の場合に見られる。 Furthermore, there is a need in the art to develop vaccines suitable for use in ovo in order to improve the efficiency and cost effectiveness of vaccination programs. The major challenge associated with in ovo vaccination is that the virus must be able to replicate in the presence of maternally-derived antibodies to the virus without being pathogenic to the embryo. The current IBV vaccine was obtained after multiple passages in embryonated eggs, which gave rise to viruses with reduced pathogenicity to chickens, enabling them to be used as live attenuated vaccines. There is. However, such viruses most often exhibit increased pathogenicity to the embryo and therefore they reduce hatchability and therefore cannot be used for in ovo vaccination. A 70% reduction in hatchability is seen in some cases.

発育卵での複数の継代後の弱毒化にはまた他の不都合な点もある。ウイルスの弱毒化はランダムであり、ウイルスが継代されるたびに異なるので経験的な方法であり、弱毒化目的で同じウイルスを異なる一連の卵で継代すると異なる一連の突然変異をもたらして弱毒に至る。また、そのプロセスに関連する有効性の問題もある:いくつかの突然変異はウイルスの複製に影響を与え、それらの突然変異のいくつかはウイルスを弱毒化しすぎる可能性がある。突然変異はまた、免疫原性にも影響を与え得るS遺伝子でも起こり得、その結果、所望の免疫応答が影響を受け、潜在的なワクチンが必要な血清型から保護し得なくなる。加えて、ワクチンの病原性復帰および安定性に伴う問題もある。 Attenuation after multiple passages in embryonated eggs also has other disadvantages. Attenuation of the virus is random and empirical as it differs each time the virus is passaged, and passage of the same virus with different sets of eggs for attenuation purposes results in different sets of mutations, resulting in attenuating. Leading to. There are also efficacy issues associated with that process: some mutations affect the replication of the virus, and some of these mutations can over-attenuate the virus. Mutations can also occur in the S gene, which can also affect immunogenicity, so that the desired immune response is affected and the potential vaccine fails to protect against the required serotype. In addition, there are problems associated with reverting and stability of vaccines.

IBVの制御のために新しいより安全なワクチンが開発されることが重要である。従って、これらの問題点とは関連がないIBVワクチン、特に、卵内ワクチン接種に使用し得るワクチンが必要である。 It is important that new and safer vaccines be developed for the control of IBV. Therefore, there is a need for IBV vaccines that are not associated with these problems, especially vaccines that can be used for in ovo vaccination.

本発明の態様の概要
本発明者らは、IBVを合理的に弱毒化するために、逆遺伝学アプローチを使用している。このアプローチは、発育卵での複数の継代後のランダムな弱毒化よりもはるかに制御可能であり、それは、各突然変異の位置がわかっており、ウイルスに及ぼすその効果、すなわち、弱毒化の理由を導出することができるためである。
Summary of Aspects of the Invention We are using a reverse genetics approach to reasonably attenuate IBV. This approach is much more controllable than random attenuation after multiple passages in embryonated eggs, where the position of each mutation is known and its effect on the virus, namely its attenuation. This is because the reason can be derived.

その逆遺伝学アプローチを用いて、本発明者らは、ウイルスの病原性レベルを低減させる様々な突然変異を同定した。病原性レベルは、ウイルスが発育卵に投与されたときに、その胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、低減され得る。このようなウイルスは、卵内ワクチン接種に好適であり得、これは重要な利点であり、発育卵での複数の継代後に産生された弱毒化IBVワクチンに比べて改善されている。 Using its reverse genetics approach, we have identified various mutations that reduce the virulence level of the virus. The virulence level can be reduced such that when the virus is administered to embryonated eggs, it is able to replicate without pathogenicity to its embryo. Such viruses may be suitable for in ovo vaccination, an important advantage, an improvement over the attenuated IBV vaccine produced after multiple passages in embryonated eggs.

従って、第1の態様では、本発明は、非構造タンパク質(non-structural protein)(nsp)−10、nsp−14、nsp−15またはnsp−16の1以上に突然変異を含んでなるポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる弱毒化生コロナウイルスを提供する。 Accordingly, in a first aspect, the invention provides a polyprotein comprising a mutation in one or more of non-structural protein (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 or nsp-16. There is provided a live attenuated coronavirus comprising a mutant replicase gene encoding

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、
配列番号6の85位でのProからLeu、
配列番号7の393位でのValからLeu、
配列番号8の183位でのLeuからIle、
配列番号9の209位でのValからIle
のリストから選択される1以上のアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。
The mutant replicase gene,
Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO: 6,
Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO: 7,
Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO: 8,
Val to Ile at the 209th position of SEQ ID NO: 9
Can encode a protein comprising one or more amino acid mutations selected from the list

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号6の85位でのProからLeuへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。 The replicase gene may encode a protein comprising a Pro to Leu amino acid mutation at position 85 of SEQ ID NO:6.

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号7の393位でのValからLeu、配列番号8の183位でのLeuからIle、および配列番号9の209位でのValからIleへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。 The replicase gene comprises an amino acid mutation from Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO:7, Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO:8, and Val to Ile at position 209 of SEQ ID NO:9. It may encode a protein.

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号6の85位でのProからLeu、配列番号7の393位でのValからLeu、配列番号8の183位でのLeuからIle、および配列番号9の209位でのValからIleへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。 The replicase gene comprises Pro to Leu at position 85 of SEQ ID NO:6, Val to Leu at position 393 of SEQ ID NO:7, Leu to Ile at position 183 of SEQ ID NO:8, and position 209 of SEQ ID NO:9. It may encode a protein comprising an amino acid mutation Val to Ile.

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号1として示される配列と比較して、
ヌクレオチド12137位でのCからT、
ヌクレオチド18114位でのGからC、
ヌクレオチド19047位でのTからA、および
ヌクレオチド20139位でのGからA
のリストから選択される1以上のヌクレオチド置換を含んでなり得る。
The replicase gene is compared to the sequence shown as SEQ ID NO:1,
C to T at nucleotide 12137,
G to C at nucleotide position 18114,
T to A at nucleotide position 19047 and G to A at nucleotide position 20139
May comprise one or more nucleotide substitutions selected from the list

前記コロナウイルスは伝染性気管支炎ウイルス(IBV)であり得る。 The coronavirus may be infectious bronchitis virus (IBV).

前記コロナウイルスはIBV M41であり得る。 The coronavirus may be IBV M41.

前記コロナウイルスは、その少なくとも一部はM41以外のIBV血清型のものであるSタンパク質を含んでなり得る。 The coronavirus may comprise an S protein, at least a portion of which is of the IBV serotype other than M41.

例えば、S1サブユニットまたはSタンパク質全体はM41以外のIBV血清型のものであり得る。 For example, the S1 subunit or the entire S protein can be of the IBV serotype other than M41.

本発明の第1の態様によるコロナウイルスは、ウイルスが発育卵に投与された際に、その胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、対応する野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスと比較して病原性が低減されている。 The coronavirus according to the first aspect of the invention expresses the corresponding wild-type replicase such that when the virus is administered to embryonated eggs it is able to replicate without pathogenicity to its embryo. The pathogenicity is reduced as compared with that of the coronavirus.

第2の態様では、本発明は、本発明の第1の態様に関連して定義されている変異型レプリカーゼ遺伝子を提供する。 In a second aspect, the invention provides a mutant replicase gene as defined in relation to the first aspect of the invention.

第3の態様では、本発明は、本発明の第2の態様による変異型コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。 In a third aspect, the invention provides a protein encoded by a mutant coronavirus replicase gene according to the second aspect of the invention.

第4の態様では、本発明は、本発明の第2の態様によるレプリカーゼ遺伝子を含んでなるプラスミドを提供する。 In a fourth aspect, the invention provides a plasmid comprising a replicase gene according to the second aspect of the invention.

第5の態様では、本発明は、本発明の第1の態様によるコロナウイルスを作製するための方法であって、次の工程:
(i)本発明の第4の態様によるプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトする工程、
(ii)前記宿主細胞にレプリカーゼ遺伝子を有するコロナウイルス株のゲノムを含んでなる組換えウイルスを感染させる工程、
(iii)改変レプリカーゼ遺伝子を生成するために、前記プラスミド中のレプリカーゼ遺伝子配列と前記組換えウイルスゲノム中の対応する配列との間で相同組換えを起こさせる工程、および
(iv)前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えウイルスについて選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
In a fifth aspect, the invention is a method for producing a coronavirus according to the first aspect of the invention, comprising the steps of:
(I) transfecting a plasmid according to the fourth aspect of the invention into a host cell,
(Ii) infecting the host cell with a recombinant virus comprising the genome of a coronavirus strain having a replicase gene,
(Iii) causing homologous recombination between the replicase gene sequence in the plasmid and the corresponding sequence in the recombinant viral genome to produce a modified replicase gene; and (iv) the modified replicase gene There is provided a method comprising the step of selecting for a recombinant virus comprising

前記組換えウイルスはワクシニアウイルスであり得る。 The recombinant virus can be vaccinia virus.

前記方法はまた、
(v)工程(iv)からの組換えウイルスのDNAから前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えコロナウイルスを回収する工程
も含み得る。
The method also includes
(V) It may also include the step of recovering a recombinant coronavirus comprising the modified replicase gene from the DNA of the recombinant virus from step (iv).

第6の態様では、本発明は、本発明の第1の態様によるコロナウイルスを産生可能な細胞を提供する。 In a sixth aspect, the invention provides a cell capable of producing a coronavirus according to the first aspect of the invention.

第7の態様では、本発明は、本発明の第1の態様によるコロナウイルスおよび薬学上許容可能な担体を含んでなるワクチンを提供する。 In a seventh aspect, the invention provides a vaccine comprising a coronavirus according to the first aspect of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

第8の態様では、本発明は、対象における疾患を治療および/または予防するための方法であって、本発明の第7の態様によるワクチンをその対象に投与する工程を含んでなる方法を提供する。 In an eighth aspect, the invention provides a method for treating and/or preventing a disease in a subject, comprising the step of administering to the subject a vaccine according to the seventh aspect of the invention. To do.

本発明のさらなる態様は、
・対象における疾患の治療および/または予防における使用のための、本発明の第7の態様によるワクチン
・対象における疾患を治療および/または予防するためのワクチンの製造における、本発明の第1の態様によるコロナウイルスの使用
を提供する。
A further aspect of the invention is
A vaccine according to the seventh aspect of the invention for use in the treatment and/or prophylaxis of a disease in a subject a first aspect of the invention in the manufacture of a vaccine for the treatment and/or prevention of a disease in a subject. The use of coronavirus by

前記疾患は伝染性気管支炎(IB)であり得る。 The disease can be infectious bronchitis (IB).

前記ワクチンの投与方法は、点眼投与、鼻腔内投与、飲水投与、孵化後注射および卵内注射からなる群から選択され得る。 The administration method of the vaccine may be selected from the group consisting of eye drop administration, intranasal administration, drinking water administration, post-hatching injection and in ovo injection.

ワクチン接種は卵内ワクチン接種のよるものであり得る。 Vaccination may be by in ovo vaccination.

本発明はまた、本発明の第7の態様によるワクチンを生産するための方法であって、本発明の第6の態様による細胞に本発明の第1の態様によるコロナウイルスを感染させる工程を含んでなる方法を提供する。 The invention also provides a method for producing a vaccine according to the seventh aspect of the invention, comprising the step of infecting cells according to the sixth aspect of the invention with a coronavirus according to the first aspect of the invention. To provide a method.

CK細胞における、M41−CK(M41 EP4)と比較した、M41−R−6およびM41−R−12の増殖動態。Proliferation kinetics of M41-R-6 and M41-R-12 in CK cells compared to M41-CK (M41 EP4). M41−CK(M41 EP4)およびBeau−Rと比較した、M41−R−6およびM41−R−12に関連する臨床徴候、スニッキング(snicking)および喘鳴音(Wheezing)(バーは、各時点の左から右に、モック、Beau−R、M41−R 6、M41−R 12、M41−CK EP4を示している)。Clinical signs, snicking and wheezing associated with M41-R-6 and M41-R-12 compared to M41-CK (M41 EP4) and Beau-R (bars are left at each time point). To the right shows mock, Beau-R, M41-R6, M41-R12, M41-CK EP4). 感染したヒヨコから採取された気管から単離された気管輪におけるウイルスの線毛運動。100%線毛運動はウイルスによる影響がないことを示す;非病原性。0%運動は線毛運動の完全消失、すなわち、完全な線毛運動静止を示し、ウイルスが病原性であることを示す(バーは、各時点の左から右に、モック、Beau−R、M41−R 6、M41−R 12、M41−CK EP4を示している)。Ciliary movement of the virus in the tracheal ring isolated from the trachea collected from infected chicks. 100% fimbriae movement is shown to be unaffected by the virus; nonpathogenic. 0% movement indicates complete loss of ciliary movement, i.e. complete ciliated movement stasis, indicating that the virus is pathogenic (bars, from left to right at each time point, mock, Beau-R, M41. -R6, M41-R12, M41-CK EP4). M41−R−12およびM41−CK(M41 EP5)と比較した、M41R−nsp10repおよびM41R−nsp14,15,16repに関連する臨床徴候、スニッキング(バーは、各時点の左から右に、モック、M41−R12;M41R−nsp10rep;M41R−nsp14,15,16repおよびM41−CK EP5を示している)。Clinical signs associated with M41R-nsp10rep and M41R-nsp14,15,16rep compared to M41-R-12 and M41-CK (M41 EP5), snicking (bars from left to right at each time point, mock, M41. -R12; M41R-nsp10rep; M41R-nsp14, 15, 16rep and M41-CK EP5). 感染したヒヨコから採取された気管から単離された気管輪における、M41−R−12およびM41−CKと比較した、M41R−nsp10repおよびM41R−nsp14,15,16repの線毛運動(バーは、各時点の左から右に、モック;M41−R12;M41R−nsp10rep;M41R−nsp14,15,16repおよびM41−CK EP5を示している)。Ciliary movements of M41R-nsp10rep and M41R-nsp14,15,16rep compared to M41-R-12 and M41-CK in tracheal rings isolated from trachea collected from infected chicks (bars indicate Mock; M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R-nsp14, 15, 16rep and M41-CK EP5 are shown from left to right of time points). M41−CKと比較した、M41R−nsp10,15rep、M41R−nsp10,14,15rep、M41R−nsp10,14,16rep、M41R−nsp10,15,16repおよびM41−Kに関連する臨床徴候、スニッキング(バーは、各時点の左から右に、モック、M41R−nsp10,15rep1;M41R−nsp10,14,16rep4;M41R−nsp10,15,16rep8;M41R−nsp10,14,15rep10;M41−K6およびM41−CK EP4を示している)。Clinical signs associated with M41R-nsp10,15rep, M41R-nsp10,14,15rep, M41R-nsp10,14,16rep, M41R-nsp10,15,16rep and M41-K, snicking (bars are compared to M41-CK. , M41R-nsp10,15,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 and M41-CK EP4 from left to right at each time point. Shown). M41−CKと比較した、M41R−nsp10,15rep、M41R−nsp10,14,15rep、M41R−nsp10,14,16rep、M41R−nsp10,15,16repおよびM41−Kに関連する臨床徴候、喘鳴音(バーは、各時点の左から右に、モック、M41R−nsp10,15rep1;M41R−nsp10,14,16rep4;M41R−nsp10,15,16rep8;M41R−nsp10,14,15rep10;M41−K6およびM41−CK EP4を示している)。M41R-nsp10,15rep, M41R-nsp10,14,15rep, M41R-nsp10,14,16rep, M41R-nsp10,15,16rep and clinical signs associated with M41-K, wheezing (bar) compared to M41-CK. From the left to the right at each time point, mock, M41R-nsp10,15,rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 and M41-CK EP4. Is shown). 感染したヒヨコから採取された気管から単離された気管輪における、M41−CKと比較した、M41R−nsp10,15rep、M41R−nsp10,14,15rep、M41R−nsp10,14,16rep、M41R−nsp10,15,16repおよびM41−Kの線毛運動(バーは、各時点の左から右に、モック、M41R−nsp10,15rep1;M41R−nsp10,14,16rep4;M41R−nsp10,15,16rep8;M41R−nsp10,14,15rep10;M41−K6およびM41−CK EP4を示している)。M41R-nsp10,15rep, M41R-nsp10,14,15rep, M41R-nsp10,14,16rep, M41R-nsp10, compared to M41-CK in tracheal rings isolated from trachea collected from infected chicks. Ciliary movement of 15,16 rep and M41-K (bars, from left to right at each time point, mock, M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10. , 14,15 rep10; M41-K6 and M41-CK EP4 are shown). CK細胞における、M41−CKと比較した、rIBVの増殖動態。図9Aは、M41−RおよびM41−Kについての結果を示している。図9Bは、M41−nsp10rep;M41R−nsp14,15,16rep;M41R−nsp10,15rep;M41R−nsp10,15,16rep;M41R−nsp10,14,15rep;およびM41R−nsp10,14,16についての結果を示している。Growth kinetics of rIBV in CK cells compared to M41-CK. FIG. 9A shows the results for M41-R and M41-K. FIG. 9B shows the results for M41-nsp10rep; M41R-nsp14,15,16rep; M41R-nsp10,15rep; M41R-nsp10,15,16rep; M41R-nsp10,14,15rep; and M41R-nsp10,14,16. Shows. nsp10およびnsp14の変異配列におけるアミノ酸突然変異の位置。Position of amino acid mutations in the mutated sequences of nsp10 and nsp14. nsp15およびnsp16の変異配列におけるアミノ酸突然変異の位置。Location of amino acid mutations in the mutated sequences of nsp15 and nsp16. M41−CKと比較した、rIBV M41R−nsp10,14repおよびrIBV M41R−nsp10,16repのA)スニッキングおよびB)呼吸器症状(喘鳴音およびラ音の組合せ)(バーは、各時点の左から右に、モック、M41R−nsp10,14rep;M41R−nsp10,16repおよびM41−Kを示している)。R) IBV M41R-nsp10,14 rep and rIBV M41R-nsp10,16 rep compared to M41-CK. , Mock, M41R-nsp10,14rep; M41R-nsp10,16rep and M41-K). M41−CKと比較した、rIBV M41R−nsp10,14repおよびrIBV M41R−nsp10,16repのC)線毛運動(バーは、各時点の左から右に、モック、M41R−nsp10,14rep;M41R−nsp10,16repおよびM41−Kを示している)。RIBV M41R-nsp10,14rep and rIBV M41R-nsp10,16rep C) pili movements (bars from left to right at each time point, mock, M41R-nsp10,14rep; M41R-nsp10, M41R-nsp10,14rep, compared to M41-CK. 16 rep and M41-K are shown).

詳細な説明
本発明は、コロナウイルスで発現された場合に、その野生型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる対応するコロナウイルスと比較して該ウイルスの病原性を低減させる変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなるコロナウイルスを提供する。
DETAILED DESCRIPTION The present invention relates to a corona comprising a mutant replicase gene which, when expressed in a coronavirus, reduces the virulence of the wild-type replicase gene as compared to the corresponding coronavirus. Provide the virus.

コロナウイルス
ガンマコロナウイルス属は、コロナウイルス科に属する動物ウイルスの属である。コロナウイルスは、ポジティブセンス一本鎖RNAゲノムおよびらせん対称性を有するエンベロープウイルスである
Coronavirus The gamma coronavirus genus is a genus of animal viruses belonging to the coronavirus family. Coronavirus is an enveloped virus with a positive-sense single-stranded RNA genome and helical symmetry

コロナウイルスのゲノムサイズはおよそ27〜32キロベースの範囲であり、これは既知RNAウイルスの最長サイズである。 The genome size of coronavirus ranges from approximately 27-32 kilobases, which is the longest size of known RNA viruses.

コロナウイルスは、主に、哺乳類および鳥類の上気道または消化管に感染する。5〜6の異なる現在知られているコロナウイルス株はヒトに感染する。最も多く報道されているヒトコロナウイルスである、重症急性呼吸器症候群(severe acute respiratory syndrome)(SARS)を引き起こすSARS−CoVは、上気道および下気道両方の感染症を引き起こし、胃腸炎も引き起こし得ることから、独自の病因を有している。中東呼吸器症候群コロナウイルス(Middle East respiratory syndrome coronavirus)(MERS−CoV)もまた、ヒトにおいて下気道感染症を引き起こし得る。コロナウイルスは、ヒト成人における全風邪のかなりの割合の原因であると考えられている。 Coronaviruses primarily infect the upper respiratory tract or gastrointestinal tract of mammals and birds. Five to six different currently known coronavirus strains infect humans. SARS-CoV, the most widely reported human coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS), can cause infections in both the upper and lower respiratory tract and can also cause gastroenteritis. Therefore, it has its own etiology. Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) can also cause lower respiratory tract infections in humans. Coronaviruses are believed to be responsible for a significant proportion of all colds in human adults.

コロナウイルスはまた、家畜動物および飼いならされたペットにおいて種々の疾患を引き起こし、その一部は重篤であることがあり、飼育産業にとっての脅威である。家畜動物の経済的に重要なコロナウイルスとしては、主にニワトリにおいて呼吸器疾患を引き起こし、世界的に家禽産業に深刻な影響を与える伝染性気管支炎ウイルス(IBV);ブタコロナウイルス(伝染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis)、TGE)およびウシコロナウイルス(両ウイルスにより幼若動物において下痢を生じる)が挙げられる。ネココロナウイルスは2つの形態を有し、ネコ腸コロナウイルスは臨床上の重要性が低い病原体であるが、このウイルスの自然突然変異によりネコ感染性腹膜炎(feline infectious peritonitis)(FIP)、すなわち、高い死亡率と関連する疾患となり得る。 Coronaviruses also cause various diseases in livestock animals and domesticated pets, some of which can be severe and are a threat to the breeding industry. Economically important coronaviruses for livestock animals include infectious bronchitis virus (IBV), which causes respiratory diseases mainly in chickens and seriously affects the poultry industry worldwide; porcine coronavirus (infectious gastrointestinal Transmissible gastroenteritis, TGE) and bovine coronavirus (both viruses cause diarrhea in juveniles). Feline coronavirus has two forms, feline intestinal coronavirus is a clinically insignificant pathogen, but spontaneous mutation of this virus causes feline infectious peritonitis (FIP), or It can be a disease associated with high mortality.

イヌコロナウイルス(canine coronavirus)(CCoV)には2種類あり、1つは軽度消化器疾患を引き起こし、1つは呼吸器疾患を引き起こすことが見出されている。マウス肝炎ウイルス(Mouse hepatitis virus)(MHV)は、特に実験用マウスのコロニーの間で、高死亡率の流行性のネズミの病気を引き起こすコロナウイルスである。 It has been found that there are two types of canine coronavirus (CCoV), one causing mild gastrointestinal disease and one causing respiratory disease. Mouse hepatitis virus (MHV) is a coronavirus that causes a high mortality epidemic murine illness, especially among experimental mouse colonies.

コロナウイルスは、以下に示すように4つのグループに分かれる。
アルファ
・イヌコロナウイルス(CCoV)
・ネココロナウイルス(Feline coronavirus)(FeCoV)
・ヒトコロナウイルス229E(Human coronavirus 229E)(HCoV−229E)
・ブタ流行性下痢ウイルス(Porcine epidemic diarrhoea virus)(PEDV)
・伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)
・ヒトコロナウイルスNL63(Human Coronavirus NL63)(NLまたはNew Haven)
ベータ
・ウシコロナウイルス(Bovine coronavirus)(BCoV)
・イヌ呼吸器コロナウイルス(Canine respiratory coronavirus)(CRCoV)−東南アジアおよびミクロネシアでよく見られる
・ヒトコロナウイルスOC43(Human coronavirus OC43)(HCoV−OC43)
・マウス肝炎ウイルス(MHV)
・ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス(Porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus)(HEV)
・ラットコロナウイルス(Rat coronavirus)(RCV)。ラットコロナウイルスはオーストラリア東部でかなり流行しており、2008年3月/4月の時点で、それはネイティブおよび野生の齧歯類コロニーの間で発見された。
・(現在時点で一般名はない)(HCoV−HKU1)
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)(SARS−CoV)
・中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)
ガンマ
・伝染性気管支炎ウイルス(IBV)
・シチメンチョウコロナウイルス(Turkey coronavirus)(紫藍病ウイルス)
・キジコロナウイルス
・ホロホロチョウコロナウイルス
デルタ
・ヒヨドリコロナウイルス(Bulbul coronavirus)(BuCoV)
・ツグミコロナウイルス(Thrush coronavirus)(ThCoV)
・キンパラコロナウイルス(Munia coronavirus)(MuCoV)
・ブタコロナウイルス(Porcine coronavirus)(PorCov)HKU15
Coronaviruses are divided into four groups as shown below.
Alpha-canine coronavirus (CCoV)
・Feline coronavirus (FeCoV)
・Human coronavirus 229E (HCoV-229E)
・Porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV)
・Infectious gastroenteritis virus (TGEV)
-Human Coronavirus NL63 (NL or New Haven)
Beta-Bovine coronavirus (BCoV)
-Canine respiratory coronavirus (CRCoV)-common in Southeast Asia and Micronesia-Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43)
・Mouse hepatitis virus (MHV)
・Porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV)
-Rat coronavirus (RCV). The rat coronavirus is highly endemic in eastern Australia, and as of March/April 2008, it was found between native and wild rodent colonies.
・(No generic name at present) (HCoV-HKU1)
Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV)
・Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)
Gamma-infectious bronchitis virus (IBV)
・Turkey coronavirus
・Pheasant coronavirus ・Guinea coronavirus Delta ・Bulbul coronavirus (Bulbul coronavirus) (BuCoV)
・Thrush coronavirus (ThCoV)
・Munia coronavirus (MuCoV)
・Porcine coronavirus (PorCov) HKU15

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、TGEVなどのアルファコロナウイルス属(alphacoronavirus);MHVなどのベータコロナウイルス属(betacoronavirus);またはIBVなどのガンマコロナウイルス属(Gammaコロナウイルス)に由来し得る。 The mutant replicase gene of the coronavirus of the present invention is derived from the alpha coronavirus genus such as TGEV; the beta coronavirus genus such as MHV; or the gamma coronavirus genus such as IBV (Gamma coronavirus). obtain.

本明細書で使用する場合、用語「由来する」とは、レプリカーゼ遺伝子が関連コロナウイルスの野生型レプリカーゼ遺伝子と実質的に同じヌクレオチド配列を含んでなることを意味する。例えば、本発明の変異型レプリカーゼ遺伝子は、野生型レプリカーゼ配列と最大80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性を有し得る。この変異型コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子は、該非構造タンパク質の野生型配列と比較した際に非構造タンパク質(nsp)−10、nsp−14、nsp−15またはnsp−16の1以上に突然変異を含んでなるタンパク質をコードする。 As used herein, the term "derived from" means that the replicase gene comprises substantially the same nucleotide sequence as the wild-type replicase gene of the associated coronavirus. For example, a mutant replicase gene of the invention may have up to 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99% identity to a wild type replicase sequence. This mutant coronavirus replicase gene contains a mutation in one or more of the nonstructural proteins (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 or nsp-16 when compared to the wild type sequence of the nonstructural protein. Code for

IBV
トリ伝染性気管支炎(IB)は、重要な経済的損失を引き起こすニワトリの伝染性の高い急性呼吸器疾患である。この疾患は、あえぎ呼吸、咳、くしゃみ、気管ラ音、および鼻汁を含む呼吸徴候を特徴とする。幼若なニワトリでは、重篤な呼吸困難が起こり得る。産卵系鶏では、呼吸困難、腎炎、卵生産の減少、ならびに卵内部の質および卵殻の質の低下がよく見られる。
IBV
Avian infectious bronchitis (IB) is a highly contagious acute respiratory disease of chickens that causes significant economic loss. The disease is characterized by respiratory signs including gasping breathing, coughing, sneezing, trachea, and nasal discharge. Severe dyspnea can occur in young chickens. Breathing difficulties, nephritis, reduced egg production, and reduced egg internal and shell quality are common in laying hens.

ブロイラーでは、咳およびのど鳴りがよく見られる臨床徴候であり、敷地内の総ての鳥に急速に広がる。罹患率は、非ワクチン接種群では100%である。死亡率は、齢、ウイルス株、および二次的感染症に依存して変化するが、非ワクチン接種群では最大60%であり得る。 In broilers, coughing and snoring are common clinical signs and spread rapidly to all birds on site. The prevalence is 100% in the non-vaccinated group. Mortality varies depending on age, viral strain, and secondary infection, but can be up to 60% in the non-vaccinated group.

同定されるべき最初のIBV血清型はマサチューセッツであったが、米国ではアーカンソーおよびデラウェアを含むいくつかの血清型が、最初に同定されるマサチューセッツ型に加えて、現在循環している。 The first IBV serotype to be identified was Massachusetts, but in the United States several serotypes, including Arkansas and Delaware, are currently circulating in addition to the first identified Massachusetts type.

IBV株Beaudetteはニワトリ胚での少なくとも150代継代後に誘導された。IBV Beaudetteは、孵化したニワトリに対してもはや病原性はないが胚を急速に殺す。 The IBV strain Beaudette was induced after at least 150 passages in chicken embryos. IBV Beaudette is no longer pathogenic to hatched chickens but rapidly kills embryos.

H120は、有胚鶏卵でのおよそ120代継代により弱毒化した市販の弱毒化生IBVマサチューセッツ血清型ワクチン株である。H52は、別のマサチューセッツワクチンであり、H120の開発中のより早い段階のわずかに病原性を示す継代ウイルス(52代継代)を表す。H120に基づくワクチンが一般的に使用される。 H120 is a commercially available live attenuated IBV Massachusetts serotype vaccine strain that has been attenuated by passage approximately 120 in embryonated chicken eggs. H52 is another Massachusetts vaccine and represents a slightly pathogenic passage virus at early stages in development of H120 (passage 52). H120-based vaccines are commonly used.

IB QXは、IBVの毒性の強い野外分離株である。1990年代半ばに中国の青島地域で病気が発生した後に最初に単離されたことから、これは「Chinese QX」としても知られている。その時以来、ウイルスはヨーロッパに向かって広がっていった。2004年からは、非常によく似たウイルスに関して重大な卵の生産問題が西ヨーロッパの一部で、主にオランダで確認され、ドイツ、フランス、ベルギー、デンマークからも、英国でも報告されている。 IB QX is a highly virulent field isolate of IBV. It is also known as "Chinese QX" because it was first isolated after the disease occurred in the Qingdao area of China in the mid-1990s. Since then, the virus has spread to Europe. Since 2004, significant egg production problems have been identified in parts of Western Europe for very similar viruses, mainly in the Netherlands, and have also been reported from Germany, France, Belgium, Denmark, and the UK.

オランダの症例から単離されたウイルスは、デーフェンテルのオランダ研究所(the Dutch Research Institute)によって、D388と呼ばれる新たな株として同定された。 中国とのつながりは、このウイルスがChinese QXウイルスと99%類似していることを示すさらなる試験からきた。弱毒化生QX様IBVワクチン株は現在開発されている。 The virus isolated from the Dutch case was identified by the Dutch Research Institute in Deventer as a new strain called D388. The connection with China came from further studies showing that this virus is 99% similar to the Chinese QX virus. Attenuated live QX-like IBV vaccine strains are currently being developed.

IBVは、細胞質内で複製し、非分離型の一本鎖ポジティブセンスRNAゲノムを含むエンベロープウイルスである。IBVは、27.6kbのRNAゲノムを有し、総てのコロナウイルスと同様に、4つの構造タンパク質;スパイク糖タンパク質(S)、小型膜タンパク質(E)、内在性膜タンパク質(M)およびゲノムRNAと相互作用するヌクレオキャプシドタンパク質(N)を含む。 IBV is an enveloped virus that replicates in the cytoplasm and contains an unseparated single-stranded positive-sense RNA genome. IBV has an RNA genome of 27.6 kb and, like all coronaviruses, has four structural proteins; spike glycoprotein (S), small membrane protein (E), integral membrane protein (M) and genome. It contains a nucleocapsid protein (N) that interacts with RNA.

ゲノムは以下のように構成されている:5’UTR−ポリメラーゼ(レプリカーゼ)遺伝子−構造タンパク質遺伝子(S−E−M−N)−UTR 3’;ここで、UTRは非翻訳領域である(それぞれIBV中約500ヌクレオチド)。 The genome is organized as follows: 5'UTR-polymerase (replicase) gene-structural protein gene (S-E-M-N)-UTR 3'; where UTR is the untranslated region (respectively (About 500 nucleotides in IBV).

脂質エンベロープは、3つの膜タンパク質:S、MおよびEを含む。IBV Sタンパク質は、小胞体内でオリゴマー化し、膜貫通ドメインを介してビリオン膜に挿入されるホモトリマーに組み立てられ、Mタンパク質と非共有結合性相互作用により会合されるI型糖タンパク質である。コロナウイルス粒子に組み込まれた後、Sタンパク質は標的細胞受容体との結合ならびにウイルス膜と細胞膜との融合に関与する。S糖タンパク質は4つのドメインからなる:合成中に切断されるシグナル配列;ビリオン粒子の外側に存在するエクトドメイン;ビリオン粒子の脂質二重層中にSタンパク質を固定する役割を果たす膜貫通領域;および細胞質尾部。 The lipid envelope contains three membrane proteins: S, M and E. The IBV S protein is a type I glycoprotein that oligomerizes in the endoplasmic reticulum, assembles into a homotrimer that is inserted into the virion membrane through the transmembrane domain, and associates with the M protein by noncovalent interactions. After being incorporated into coronavirus particles, the S protein is involved in binding to the target cell receptor as well as fusion of the viral and cell membranes. The S-glycoprotein consists of four domains: a signal sequence that is cleaved during synthesis; an ectodomain that resides outside the virion particle; a transmembrane region that serves to anchor the S protein in the lipid bilayer of the virion particle; and Cytoplasmic tail.

総てのコロナウイルスはまた、in vitroでの複製に必要ではないが病因において役割を果たし得る機能不明のアクセサリータンパク質遺伝子セットをコードする。IBVは、2つのアクセサリー遺伝子、遺伝子3および5をコードし、これらはそれぞれ2つのアクセサリータンパク質3a、3bおよび5a、5bを発現する。 All coronaviruses also encode sets of accessory protein genes of unknown function that are not required for replication in vitro but may play a role in pathogenesis. IBV encodes two accessory genes, genes 3 and 5, which express two accessory proteins 3a, 3b and 5a, 5b, respectively.

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、IBVに由来し得る。例えば、IBVはIBV Beaudette、H120、H52、IB QX、D388またはM41であり得る。 The mutant replicase gene of the coronavirus of the present invention may be derived from IBV. For example, the IBV can be IBV Beaudette, H120, H52, IB QX, D388 or M41.

IBVはIBV M41であり得る。M41は、1941年にUSAで単離されたプロトタイプのマサチューセッツ血清型である。これは、病原性の実験室株(a pathogenic lab stain)として世界中の多くの研究室で使用されている分離株であり、ATCCから得ることができる(VR−21(商標))。弱毒化変異体はまた、この分野で問題を引き起こすマサチューセッツ血清型に対するIBVワクチンとしていくつかのワクチン生産者によって使用されている。本発明者らは、何年もこのウイルスに取り組んできたため、完全ウイルスゲノムの配列が入手可能であることから、この株を使用することを選択した。本発明者らが使用したM41分離株、M41−CKは、初代ニワトリ腎臓(chick kidney)(CK)細胞で増殖するように適合されており、そのため、完全ゲノムのcDNAからの感染性ウイルスとしての回収に適していると考えられた。それは病原性IBVの代表であり、従って、病原性の喪失または低減のいずれかを引き起こす突然変異について解析することができる。 The IBV can be IBV M41. M41 is a prototype Massachusetts serotype isolated in 1941 by the USA. It is an isolate used in many laboratories around the world as a pathogenic lab stain and can be obtained from the ATCC (VR-21™). Attenuated mutants have also been used by some vaccine producers as IBV vaccines against the Massachusetts serotype causing problems in this field. We have been working on this virus for many years and chose to use this strain as the sequence of the complete viral genome is available. The M41 isolate used by the inventors, M41-CK, has been adapted to grow in primary chicken kidney (CK) cells, and thus was designated as an infectious virus from a complete genomic cDNA. It was considered suitable for recovery. It is representative of pathogenic IBV and can therefore be analyzed for mutations that cause either loss or reduction of pathogenicity.

IBV M41−CKのゲノム配列は配列番号1として示される。 The genomic sequence of IBV M41-CK is shown as SEQ ID NO:1.

配列番号1 IBV M41−CK配列
SEQ ID NO: 1 IBV M41-CK sequence

レプリカーゼ
構造遺伝子およびアクセサリー遺伝子に加えて、コロナウイルスゲノムの3分の2は、2つのポリタンパク質、pp1aおよびpp1abとして発現されるレプリカーゼ遺伝子を(ゲノムの5’末端に)含んでなり、ここで、pp1abは−1リボゾームシフト機構の結果としてのpp1aの伸長産物である。2つのポリタンパク質は2種のウイルスコード化プロテイナーゼによって切断され、通常、16種類の非構造タンパク質(Nsp1〜16)を生じる;IBVはNsp1を欠き、それによりNsp2〜16をコードする。
In addition to the replicase structural and accessory genes, two-thirds of the coronavirus genome comprises (at the 5'end of the genome) the replicase genes expressed as two polyproteins, pp1a and pp1ab, where: pp1ab is an extension product of pp1a as a result of the -1 ribosome shift mechanism. The two polyproteins are cleaved by two virus-encoded proteinases, usually yielding 16 nonstructural proteins (Nsp1-16); IBV lacks Nsp1 and thereby encodes Nsp2-16.

従って、IBV中の遺伝子1は、RNA複製および転写に関連する15種類の非構造タンパク質(他のコロナウイルスでは16種類)(nsp2〜16)をコードする。 Thus, gene 1 in IBV encodes 15 nonstructural proteins (16 in other coronaviruses) (nsp2-16) that are involved in RNA replication and transcription.

用語「レプリカーゼタンパク質」は、本明細書では、ポリタンパク質pp1aおよびpp1abまたは個々のnspサブユニットを意味するために使用される。 The term "replicase protein" is used herein to mean the polyproteins pp1a and pp1ab or individual nsp subunits.

用語「レプリカーゼ遺伝子」は、本明細書では、レプリカーゼタンパク質をコードする核酸配列を意味するために使用される。 The term "replicase gene" is used herein to mean a nucleic acid sequence encoding a replicase protein.

コロナウイルスnspタンパク質の機能の概要を表1に示す。 Table 1 shows an outline of the function of the coronavirus nsp protein.

本発明のコロナウイルスによってコードされる変異型レプリカーゼ遺伝子は、nsp−10、nsp−14、nsp−15またはnsp−16をコードする配列の部分の1以上に突然変異を含んでなる。 The mutated replicase gene encoded by the coronavirus of the invention comprises a mutation in one or more of the portions of the sequence encoding nsp-10, nsp-14, nsp-15 or nsp-16.

Nsp10は、RNA結合活性を有し、pp1a/pp1ab領域の他のnsp内での同型および/または異型相互作用に関与すると思われる。これは、5つのα−ヘリックス、1つの310−ヘリックスおよび3つのβ鎖から構成されるα/β折りたたみ構造をとる。保存されたシステイン残基および1つのヒスチジン残基により形成される2つの亜鉛結合部位が同定されている(Cys−74/Cys−77/His−83/Cys−90;Cys−117/Cys−120/Cys−128/Cys−130)。このタンパク質は、明らかな特異性なく一本鎖および二本鎖のRNAおよびDNAに結合することが確認されている。Nsp−10はnsp−9と架橋することができ、nsp−7、−8、−9および−10を含むタンパク質−タンパク質相互作用の複雑なネットワークの存在を示唆している。加えて、nsp−10は、nsp−14およびnsp−16と相互作用することが知られている。 Nsp10 has RNA binding activity and appears to be involved in homotypic and/or heterotypic interactions within other nsps of the pp1a/pp1ab region. This five α- helices, one 3 10 - take helix and alpha / beta fold structure consists of three beta strands. Two zinc binding sites formed by a conserved cysteine residue and one histidine residue have been identified (Cys-74/Cys-77/His-83/Cys-90; Cys-117/Cys-120). /Cys-128/Cys-130). This protein has been confirmed to bind single-stranded and double-stranded RNA and DNA with no apparent specificity. Nsp-10 can crosslink with nsp-9, suggesting the existence of a complex network of protein-protein interactions including nsp-7, -8, -9 and -10. In addition, nsp-10 is known to interact with nsp-14 and nsp-16.

Nsp−14は、アミノ末端領域に3’→5’エキソリボヌクレアーゼ(エキソン)活性ドメインを含んでなる。SARS−CoVエキソンは、DNAではなく、一本鎖および二本鎖RNAの両方に作用する金属イオン依存性の3’→5’エキソリボヌクレアーゼ活性を有することが実証されている。Nsp−14は、プルーフリーディング活性を有することが示されている。このnspはまた、カルボキシル末端領域にN7−メチルトランスフェラーゼ(MT)活性を有することも示されている。 Nsp-14 comprises a 3'→5' exoribonuclease (exon) active domain in the amino terminal region. The SARS-CoV exon has been demonstrated to have metal ion-dependent 3'→5' exoribonuclease activity that acts on both single-stranded and double-stranded RNA but not on DNA. Nsp-14 has been shown to have proofreading activity. This nsp has also been shown to have N7-methyltransferase (MT) activity in the carboxyl terminal region.

Nsp−15関連NendoU(Uに特異的なニドウイルスエンドリボヌクレアーゼ)RNアーゼ活性は、SARS−CoV、MHVおよびIBVを含む複数のコロナウイルスで報告されている。これらの活性は、Mn2+イオンによって著しく増強されることが一貫して報告され、Mg2+およびCa2+の存在下ではほとんど活性がなかった。NendoUは、一本鎖および二本鎖RNAの両方のウリジル酸残基の3’側で切断する。コロナウイルスNendoUの生物学的に関連する基質はまだ同定されていない。 Nsp-15-related NendoU (U-specific Nidovirus endoribonuclease) RNase activity has been reported in multiple coronaviruses including SARS-CoV, MHV and IBV. These activities were consistently reported to be significantly enhanced by Mn 2+ ions, with little activity in the presence of Mg 2+ and Ca 2+ . NendoU cleaves on the 3'side of the uridylic acid residue of both single-stranded and double-stranded RNA. No biologically relevant substrate of the coronavirus NendoU has yet been identified.

Nsp−16は、リボース−2’−O−メチルトランスフェラーゼ(2’−O−MTアーゼ)活性を媒介すると推定されており、逆遺伝学実験によって、2’−O−MTアーゼドメインがHCoV−229EおよびSARS−CoVにおけるウイルスRNA合成に不可欠であることが示されている。この酵素は、コロナウイルスRNAのcap1構造の生成に関与している可能性があり、また、他のRNAプロセシング経路においてNendoUおよびエキソンと共働することもある。2’−O−Mtアーゼはまた、NendoUを介した切断から保護するために、特異的なRNAをメチル化し得る。 Nsp-16 has been postulated to mediate ribose-2′-O-methyltransferase (2′-O-MTase) activity, and reverse genetics experiments have shown that the 2′-O-MTase domain contains HCoV-229E. And SARS-CoV have been shown to be essential for viral RNA synthesis. This enzyme may be involved in the generation of the cap1 structure of coronavirus RNA and may also cooperate with NendoU and exons in other RNA processing pathways. 2'-O-Mtase can also methylate specific RNAs to protect against NendoU-mediated cleavage.

nsp−10、−14、−15および−16のゲノムおよびタンパク質の配列はそれぞれ配列番号2〜5および6〜9として提供される。 The genomic and protein sequences of nsp-10, -14, -15 and -16 are provided as SEQ ID NOS: 2-5 and 6-9, respectively.

配列番号2(nsp−10ヌクレオチド配列−配列番号1のヌクレオチド11884〜12318)
SEQ ID NO: 2 (nsp-10 nucleotide sequence-nucleotides 11884 to 12318 of SEQ ID NO: 1)

配列番号3(nsp−14ヌクレオチド配列−配列番号1のヌクレオチド16938〜18500)
SEQ ID NO: 3 (nsp-14 nucleotide sequence-nucleotides 16938-18500 of SEQ ID NO: 1)

配列番号4(nsp−15ヌクレオチド配列−配列番号1のヌクレオチド18501〜19514)
SEQ ID NO: 4 (nsp-15 nucleotide sequence-nucleotides 18501 to 19514 of SEQ ID NO: 1)

配列番号5(nsp−16ヌクレオチド配列−配列番号1のヌクレオチド19515〜20423)
SEQ ID NO:5 (nsp-16 nucleotide sequence-nucleotides 19515-20423 of SEQ ID NO:1)

配列番号6(nsp−10アミノ酸配列)
SEQ ID NO: 6 (nsp-10 amino acid sequence)

配列番号7(nsp−14アミノ酸配列)
SEQ ID NO: 7 (nsp-14 amino acid sequence)

配列番号8(nsp−15アミノ酸配列)
SEQ ID NO: 8 (nsp-15 amino acid sequence)

配列番号9(nsp−16アミノ酸配列)
SEQ ID NO: 9 (nsp-16 amino acid sequence)

病原性の低減
本発明の弱毒化生コロナウイルスは、対応する野生型遺伝子を発現するコロナウイルスと比較して該ウイルスの病原性を低減させる変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる。
Reduction of Pathogenicity The live, attenuated coronavirus of the present invention comprises a mutant replicase gene that reduces the pathogenicity of the corresponding wild-type gene-expressing coronavirus.

本明細書で使用される「弱毒化」という用語は、前記病原性低減を示し、非毒性として分類され得るウイルスを意味する。弱毒化生ウイルスは、実際の病気を引き起こさないが免疫応