JP2017522907A - コロナウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５またはｎｓｐ−１６の１以上に突然変異を含んでなるポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる弱毒化生コロナウイルスを提供する。このコロナウイルスは、対象において、伝染性気管支炎などの疾患を治療および／または予防するためのワクチンとして使用し得る。【選択図】なし

Description

本発明は、ウイルスの病原性を低減させる変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる弱毒化コロナウイルスに関する。本発明はまた、疾患を予防および／または治療するためのワクチンにおけるそのようなコロナウイルスの使用に関する。

伝染性気管支炎(infectious bronchitis)（ＩＢ）の病原体であるトリ伝染性気管支炎ウイルス(infectious bronchitis virus)（ＩＢＶ）は、主に気道で複製するが消化管、腎臓および卵管の上皮細胞でも複製する家禽の感染性の高い伝染性の病原体である。ＩＢＶは、ニドウイルス目(Nidovirales)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、コロナウイルス亜科(Coronavirinae)およびガンマコロナウイルス属(Gammacoronavirus)のメンバーである；遺伝的に非常によく似たコロナウイルスは、シチメンチョウ、ホロホロチョウおよびキジの疾患を引き起こす。

ＩＢの臨床徴候には、くしゃみ、気管ラ音、鼻汁および喘鳴音が含まれる。肉用鳥類は体重増加の減少があり、一方、産卵鳥類は産卵数が少なくなり、低品質の卵を生産する。呼吸器感染症は、ヒヨコには致命的になる可能性がある二次的細菌感染症にニワトリを罹患しやすくする。このウイルスはまた、卵管（特に、ヒヨコでは、卵の生産および品質の低下につながる）；および腎臓（致命的になる可能性がある腎臓疾患につながることがある）への恒久的な損傷をもたらし得る。

ＩＢＶは、他の感染症よりも多くの、家禽産業にとっての経済的損失に関与することが報告されている。弱毒化生ワクチンおよび不活化ワクチンはＩＢＶの制御に広く使用されているが、ワクチン接種の使用によって得られる保護は、ワクチンの破壊または使用したワクチンに関連していない新たなＩＢＶ血清型の導入のいずれかによって失われる可能性があり、家禽産業に対するリスクとなる。

さらに、当業界では、ワクチン接種プログラムの効率および費用効果を改善するために、卵内での使用に好適なワクチンを開発する必要がある。卵内ワクチン接種に関連する主要な課題は、ウイルスが、胚に対して病原性を示さずに、ウイルスに対する母体由来抗体の存在下で複製可能でなければならないことである。現在のＩＢＶワクチンは、発育卵で複数回継代した後に得られ、これは、ニワトリに対する病原性が低減しているウイルスを生じ、弱毒化生ワクチンとしてそれらを使用することができるようになっている。しかしながら、このようなウイルスは、ほとんどの場合、胚に対する病原性の増強を示し、従って、それらは孵化率を減少させることから、卵内ワクチン接種に使用することができない。孵化率の７０％減少は一部の場合に見られる。

発育卵での複数の継代後の弱毒化にはまた他の不都合な点もある。ウイルスの弱毒化はランダムであり、ウイルスが継代されるたびに異なるので経験的な方法であり、弱毒化目的で同じウイルスを異なる一連の卵で継代すると異なる一連の突然変異をもたらして弱毒に至る。また、そのプロセスに関連する有効性の問題もある：いくつかの突然変異はウイルスの複製に影響を与え、それらの突然変異のいくつかはウイルスを弱毒化しすぎる可能性がある。突然変異はまた、免疫原性にも影響を与え得るＳ遺伝子でも起こり得、その結果、所望の免疫応答が影響を受け、潜在的なワクチンが必要な血清型から保護し得なくなる。加えて、ワクチンの病原性復帰および安定性に伴う問題もある。

ＩＢＶの制御のために新しいより安全なワクチンが開発されることが重要である。従って、これらの問題点とは関連がないＩＢＶワクチン、特に、卵内ワクチン接種に使用し得るワクチンが必要である。

本発明の態様の概要
本発明者らは、ＩＢＶを合理的に弱毒化するために、逆遺伝学アプローチを使用している。このアプローチは、発育卵での複数の継代後のランダムな弱毒化よりもはるかに制御可能であり、それは、各突然変異の位置がわかっており、ウイルスに及ぼすその効果、すなわち、弱毒化の理由を導出することができるためである。

その逆遺伝学アプローチを用いて、本発明者らは、ウイルスの病原性レベルを低減させる様々な突然変異を同定した。病原性レベルは、ウイルスが発育卵に投与されたときに、その胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、低減され得る。このようなウイルスは、卵内ワクチン接種に好適であり得、これは重要な利点であり、発育卵での複数の継代後に産生された弱毒化ＩＢＶワクチンに比べて改善されている。

従って、第１の態様では、本発明は、非構造タンパク質(non-structural protein)（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５またはｎｓｐ−１６の１以上に突然変異を含んでなるポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる弱毒化生コロナウイルスを提供する。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、
配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、
配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、
配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅ、
配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅ
のリストから選択される１以上のアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅ、および配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅ、および配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記レプリカーゼ遺伝子は、配列番号１として示される配列と比較して、
ヌクレオチド１２１３７位でのＣからＴ、
ヌクレオチド１８１１４位でのＧからＣ、
ヌクレオチド１９０４７位でのＴからＡ、および
ヌクレオチド２０１３９位でのＧからＡ
のリストから選択される１以上のヌクレオチド置換を含んでなり得る。

前記コロナウイルスは伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）であり得る。

前記コロナウイルスはＩＢＶ Ｍ４１であり得る。

前記コロナウイルスは、その少なくとも一部はＭ４１以外のＩＢＶ血清型のものであるＳタンパク質を含んでなり得る。

例えば、Ｓ１サブユニットまたはＳタンパク質全体はＭ４１以外のＩＢＶ血清型のものであり得る。

本発明の第１の態様によるコロナウイルスは、ウイルスが発育卵に投与された際に、その胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、対応する野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスと比較して病原性が低減されている。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に関連して定義されている変異型レプリカーゼ遺伝子を提供する。

第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による変異型コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。

第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるレプリカーゼ遺伝子を含んでなるプラスミドを提供する。

第５の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコロナウイルスを作製するための方法であって、次の工程：
（ｉ）本発明の第４の態様によるプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトする工程、
（ｉｉ）前記宿主細胞にレプリカーゼ遺伝子を有するコロナウイルス株のゲノムを含んでなる組換えウイルスを感染させる工程、
（ｉｉｉ）改変レプリカーゼ遺伝子を生成するために、前記プラスミド中のレプリカーゼ遺伝子配列と前記組換えウイルスゲノム中の対応する配列との間で相同組換えを起こさせる工程、および
（ｉｖ）前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えウイルスについて選択する工程
を含んでなる方法を提供する。

前記組換えウイルスはワクシニアウイルスであり得る。

前記方法はまた、
（ｖ）工程（ｉｖ）からの組換えウイルスのＤＮＡから前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えコロナウイルスを回収する工程
も含み得る。

第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコロナウイルスを産生可能な細胞を提供する。

第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコロナウイルスおよび薬学上許容可能な担体を含んでなるワクチンを提供する。

第８の態様では、本発明は、対象における疾患を治療および／または予防するための方法であって、本発明の第７の態様によるワクチンをその対象に投与する工程を含んでなる方法を提供する。

本発明のさらなる態様は、
・対象における疾患の治療および／または予防における使用のための、本発明の第７の態様によるワクチン
・対象における疾患を治療および／または予防するためのワクチンの製造における、本発明の第１の態様によるコロナウイルスの使用
を提供する。

前記疾患は伝染性気管支炎（ＩＢ）であり得る。

前記ワクチンの投与方法は、点眼投与、鼻腔内投与、飲水投与、孵化後注射および卵内注射からなる群から選択され得る。

ワクチン接種は卵内ワクチン接種のよるものであり得る。

本発明はまた、本発明の第７の態様によるワクチンを生産するための方法であって、本発明の第６の態様による細胞に本発明の第１の態様によるコロナウイルスを感染させる工程を含んでなる方法を提供する。

ＣＫ細胞における、Ｍ４１−ＣＫ（Ｍ４１ ＥＰ４）と比較した、Ｍ４１−Ｒ−６およびＭ４１−Ｒ−１２の増殖動態。 Ｍ４１−ＣＫ（Ｍ４１ ＥＰ４）およびＢｅａｕ−Ｒと比較した、Ｍ４１−Ｒ−６およびＭ４１−Ｒ−１２に関連する臨床徴候、スニッキング(snicking)および喘鳴音(Wheezing)（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｂｅａｕ−Ｒ、Ｍ４１−Ｒ ６、Ｍ４１−Ｒ １２、Ｍ４１−ＣＫ ＥＰ４を示している）。 感染したヒヨコから採取された気管から単離された気管輪におけるウイルスの線毛運動。１００％線毛運動はウイルスによる影響がないことを示す；非病原性。０％運動は線毛運動の完全消失、すなわち、完全な線毛運動静止を示し、ウイルスが病原性であることを示す（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｂｅａｕ−Ｒ、Ｍ４１−Ｒ ６、Ｍ４１−Ｒ １２、Ｍ４１−ＣＫ ＥＰ４を示している）。 Ｍ４１−Ｒ−１２およびＭ４１−ＣＫ（Ｍ４１ ＥＰ５）と比較した、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０ｒｅｐおよびＭ４１Ｒ−ｎｓｐ１４，１５，１６ｒｅｐに関連する臨床徴候、スニッキング（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｍ４１−Ｒ１２；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１４，１５，１６ｒｅｐおよびＭ４１−ＣＫ ＥＰ５を示している）。 感染したヒヨコから採取された気管から単離された気管輪における、Ｍ４１−Ｒ−１２およびＭ４１−ＣＫと比較した、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０ｒｅｐおよびＭ４１Ｒ−ｎｓｐ１４，１５，１６ｒｅｐの線毛運動（バーは、各時点の左から右に、モック；Ｍ４１−Ｒ１２；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１４，１５，１６ｒｅｐおよびＭ４１−ＣＫ ＥＰ５を示している）。 Ｍ４１−ＣＫと比較した、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐおよびＭ４１−Ｋに関連する臨床徴候、スニッキング（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ１；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６ｒｅｐ４；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐ８；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ１０；Ｍ４１−Ｋ６およびＭ４１−ＣＫ ＥＰ４を示している）。 Ｍ４１−ＣＫと比較した、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐおよびＭ４１−Ｋに関連する臨床徴候、喘鳴音（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ１；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６ｒｅｐ４；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐ８；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ１０；Ｍ４１−Ｋ６およびＭ４１−ＣＫ ＥＰ４を示している）。 感染したヒヨコから採取された気管から単離された気管輪における、Ｍ４１−ＣＫと比較した、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６ｒｅｐ、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐおよびＭ４１−Ｋの線毛運動（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ１；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６ｒｅｐ４；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐ８；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ１０；Ｍ４１−Ｋ６およびＭ４１−ＣＫ ＥＰ４を示している）。 ＣＫ細胞における、Ｍ４１−ＣＫと比較した、ｒＩＢＶの増殖動態。図９Ａは、Ｍ４１−ＲおよびＭ４１−Ｋについての結果を示している。図９Ｂは、Ｍ４１−ｎｓｐ１０ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１４，１５，１６ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ；およびＭ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６についての結果を示している。 ｎｓｐ１０およびｎｓｐ１４の変異配列におけるアミノ酸突然変異の位置。 ｎｓｐ１５およびｎｓｐ１６の変異配列におけるアミノ酸突然変異の位置。 Ｍ４１−ＣＫと比較した、ｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４ｒｅｐおよびｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１６ｒｅｐのＡ）スニッキングおよびＢ）呼吸器症状（喘鳴音およびラ音の組合せ）（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１６ｒｅｐおよびＭ４１−Ｋを示している）。 Ｍ４１−ＣＫと比較した、ｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４ｒｅｐおよびｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１６ｒｅｐのＣ）線毛運動（バーは、各時点の左から右に、モック、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４ｒｅｐ；Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１６ｒｅｐおよびＭ４１−Ｋを示している）。

詳細な説明
本発明は、コロナウイルスで発現された場合に、その野生型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる対応するコロナウイルスと比較して該ウイルスの病原性を低減させる変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなるコロナウイルスを提供する。

コロナウイルス
ガンマコロナウイルス属は、コロナウイルス科に属する動物ウイルスの属である。コロナウイルスは、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムおよびらせん対称性を有するエンベロープウイルスである

コロナウイルスのゲノムサイズはおよそ２７〜３２キロベースの範囲であり、これは既知ＲＮＡウイルスの最長サイズである。

コロナウイルスは、主に、哺乳類および鳥類の上気道または消化管に感染する。５〜６の異なる現在知られているコロナウイルス株はヒトに感染する。最も多く報道されているヒトコロナウイルスである、重症急性呼吸器症候群(severe acute respiratory syndrome)（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳ−ＣｏＶは、上気道および下気道両方の感染症を引き起こし、胃腸炎も引き起こし得ることから、独自の病因を有している。中東呼吸器症候群コロナウイルス(Middle East respiratory syndrome coronavirus)（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）もまた、ヒトにおいて下気道感染症を引き起こし得る。コロナウイルスは、ヒト成人における全風邪のかなりの割合の原因であると考えられている。

コロナウイルスはまた、家畜動物および飼いならされたペットにおいて種々の疾患を引き起こし、その一部は重篤であることがあり、飼育産業にとっての脅威である。家畜動物の経済的に重要なコロナウイルスとしては、主にニワトリにおいて呼吸器疾患を引き起こし、世界的に家禽産業に深刻な影響を与える伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）；ブタコロナウイルス（伝染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis)、ＴＧＥ）およびウシコロナウイルス（両ウイルスにより幼若動物において下痢を生じる）が挙げられる。ネココロナウイルスは２つの形態を有し、ネコ腸コロナウイルスは臨床上の重要性が低い病原体であるが、このウイルスの自然突然変異によりネコ感染性腹膜炎(feline infectious peritonitis)（ＦＩＰ）、すなわち、高い死亡率と関連する疾患となり得る。

イヌコロナウイルス(canine coronavirus)（ＣＣｏＶ）には２種類あり、１つは軽度消化器疾患を引き起こし、１つは呼吸器疾患を引き起こすことが見出されている。マウス肝炎ウイルス(Mouse hepatitis virus)（ＭＨＶ）は、特に実験用マウスのコロニーの間で、高死亡率の流行性のネズミの病気を引き起こすコロナウイルスである。

コロナウイルスは、以下に示すように４つのグループに分かれる。
アルファ
・イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）
・ネココロナウイルス(Feline coronavirus)（ＦｅＣｏＶ）
・ヒトコロナウイルス２２９Ｅ(Human coronavirus 229E)（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）
・ブタ流行性下痢ウイルス(Porcine epidemic diarrhoea virus)（ＰＥＤＶ）
・伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）
・ヒトコロナウイルスＮＬ６３(Human Coronavirus NL63)（ＮＬまたはＮｅｗ Ｈａｖｅｎ）
ベータ
・ウシコロナウイルス(Bovine coronavirus)（ＢＣｏＶ）
・イヌ呼吸器コロナウイルス(Canine respiratory coronavirus)（ＣＲＣｏＶ）−東南アジアおよびミクロネシアでよく見られる
・ヒトコロナウイルスＯＣ４３(Human coronavirus OC43)（ＨＣｏＶ−ＯＣ４３）
・マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）
・ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（Porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus）（ＨＥＶ）
・ラットコロナウイルス(Rat coronavirus)（ＲＣＶ）。ラットコロナウイルスはオーストラリア東部でかなり流行しており、２００８年３月／４月の時点で、それはネイティブおよび野生の齧歯類コロニーの間で発見された。
・（現在時点で一般名はない）（ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１）
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）
・中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）
ガンマ
・伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）
・シチメンチョウコロナウイルス(Turkey coronavirus)（紫藍病ウイルス）
・キジコロナウイルス
・ホロホロチョウコロナウイルス
デルタ
・ヒヨドリコロナウイルス(Bulbul coronavirus)（ＢｕＣｏＶ）
・ツグミコロナウイルス(Thrush coronavirus)（ＴｈＣｏＶ）
・キンパラコロナウイルス(Munia coronavirus)（ＭｕＣｏＶ）
・ブタコロナウイルス(Porcine coronavirus)（ＰｏｒＣｏｖ）ＨＫＵ１５

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、ＴＧＥＶなどのアルファコロナウイルス属(alphacoronavirus)；ＭＨＶなどのベータコロナウイルス属(betacoronavirus)；またはＩＢＶなどのガンマコロナウイルス属(Gammaコロナウイルス)に由来し得る。

本明細書で使用する場合、用語「由来する」とは、レプリカーゼ遺伝子が関連コロナウイルスの野生型レプリカーゼ遺伝子と実質的に同じヌクレオチド配列を含んでなることを意味する。例えば、本発明の変異型レプリカーゼ遺伝子は、野生型レプリカーゼ配列と最大８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し得る。この変異型コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子は、該非構造タンパク質の野生型配列と比較した際に非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５またはｎｓｐ−１６の１以上に突然変異を含んでなるタンパク質をコードする。

ＩＢＶ
トリ伝染性気管支炎（ＩＢ）は、重要な経済的損失を引き起こすニワトリの伝染性の高い急性呼吸器疾患である。この疾患は、あえぎ呼吸、咳、くしゃみ、気管ラ音、および鼻汁を含む呼吸徴候を特徴とする。幼若なニワトリでは、重篤な呼吸困難が起こり得る。産卵系鶏では、呼吸困難、腎炎、卵生産の減少、ならびに卵内部の質および卵殻の質の低下がよく見られる。

ブロイラーでは、咳およびのど鳴りがよく見られる臨床徴候であり、敷地内の総ての鳥に急速に広がる。罹患率は、非ワクチン接種群では１００％である。死亡率は、齢、ウイルス株、および二次的感染症に依存して変化するが、非ワクチン接種群では最大６０％であり得る。

同定されるべき最初のＩＢＶ血清型はマサチューセッツであったが、米国ではアーカンソーおよびデラウェアを含むいくつかの血清型が、最初に同定されるマサチューセッツ型に加えて、現在循環している。

ＩＢＶ株Ｂｅａｕｄｅｔｔｅはニワトリ胚での少なくとも１５０代継代後に誘導された。ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅは、孵化したニワトリに対してもはや病原性はないが胚を急速に殺す。

Ｈ１２０は、有胚鶏卵でのおよそ１２０代継代により弱毒化した市販の弱毒化生ＩＢＶマサチューセッツ血清型ワクチン株である。Ｈ５２は、別のマサチューセッツワクチンであり、Ｈ１２０の開発中のより早い段階のわずかに病原性を示す継代ウイルス（５２代継代）を表す。Ｈ１２０に基づくワクチンが一般的に使用される。

ＩＢ ＱＸは、ＩＢＶの毒性の強い野外分離株である。１９９０年代半ばに中国の青島地域で病気が発生した後に最初に単離されたことから、これは「Ｃｈｉｎｅｓｅ ＱＸ」としても知られている。その時以来、ウイルスはヨーロッパに向かって広がっていった。２００４年からは、非常によく似たウイルスに関して重大な卵の生産問題が西ヨーロッパの一部で、主にオランダで確認され、ドイツ、フランス、ベルギー、デンマークからも、英国でも報告されている。

オランダの症例から単離されたウイルスは、デーフェンテルのオランダ研究所(the Dutch Research Institute)によって、Ｄ３８８と呼ばれる新たな株として同定された。 中国とのつながりは、このウイルスがＣｈｉｎｅｓｅ ＱＸウイルスと９９％類似していることを示すさらなる試験からきた。弱毒化生ＱＸ様ＩＢＶワクチン株は現在開発されている。

ＩＢＶは、細胞質内で複製し、非分離型の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルスである。ＩＢＶは、２７．６ｋｂのＲＮＡゲノムを有し、総てのコロナウイルスと同様に、４つの構造タンパク質；スパイク糖タンパク質（Ｓ）、小型膜タンパク質（Ｅ）、内在性膜タンパク質（Ｍ）およびゲノムＲＮＡと相互作用するヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）を含む。

ゲノムは以下のように構成されている：５’ＵＴＲ−ポリメラーゼ（レプリカーゼ）遺伝子−構造タンパク質遺伝子（Ｓ−Ｅ−Ｍ−Ｎ）−ＵＴＲ ３’；ここで、ＵＴＲは非翻訳領域である（それぞれＩＢＶ中約５００ヌクレオチド）。

脂質エンベロープは、３つの膜タンパク質：Ｓ、ＭおよびＥを含む。ＩＢＶ Ｓタンパク質は、小胞体内でオリゴマー化し、膜貫通ドメインを介してビリオン膜に挿入されるホモトリマーに組み立てられ、Ｍタンパク質と非共有結合性相互作用により会合されるＩ型糖タンパク質である。コロナウイルス粒子に組み込まれた後、Ｓタンパク質は標的細胞受容体との結合ならびにウイルス膜と細胞膜との融合に関与する。Ｓ糖タンパク質は４つのドメインからなる：合成中に切断されるシグナル配列；ビリオン粒子の外側に存在するエクトドメイン；ビリオン粒子の脂質二重層中にＳタンパク質を固定する役割を果たす膜貫通領域；および細胞質尾部。

総てのコロナウイルスはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製に必要ではないが病因において役割を果たし得る機能不明のアクセサリータンパク質遺伝子セットをコードする。ＩＢＶは、２つのアクセサリー遺伝子、遺伝子３および５をコードし、これらはそれぞれ２つのアクセサリータンパク質３ａ、３ｂおよび５ａ、５ｂを発現する。

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、ＩＢＶに由来し得る。例えば、ＩＢＶはＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、Ｈ１２０、Ｈ５２、ＩＢ ＱＸ、Ｄ３８８またはＭ４１であり得る。

ＩＢＶはＩＢＶ Ｍ４１であり得る。Ｍ４１は、１９４１年にＵＳＡで単離されたプロトタイプのマサチューセッツ血清型である。これは、病原性の実験室株(a pathogenic lab stain)として世界中の多くの研究室で使用されている分離株であり、ＡＴＣＣから得ることができる（ＶＲ−２１（商標））。弱毒化変異体はまた、この分野で問題を引き起こすマサチューセッツ血清型に対するＩＢＶワクチンとしていくつかのワクチン生産者によって使用されている。本発明者らは、何年もこのウイルスに取り組んできたため、完全ウイルスゲノムの配列が入手可能であることから、この株を使用することを選択した。本発明者らが使用したＭ４１分離株、Ｍ４１−ＣＫは、初代ニワトリ腎臓(chick kidney)（ＣＫ）細胞で増殖するように適合されており、そのため、完全ゲノムのｃＤＮＡからの感染性ウイルスとしての回収に適していると考えられた。それは病原性ＩＢＶの代表であり、従って、病原性の喪失または低減のいずれかを引き起こす突然変異について解析することができる。

ＩＢＶ Ｍ４１−ＣＫのゲノム配列は配列番号１として示される。

配列番号１ ＩＢＶ Ｍ４１−ＣＫ配列

レプリカーゼ
構造遺伝子およびアクセサリー遺伝子に加えて、コロナウイルスゲノムの３分の２は、２つのポリタンパク質、ｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂとして発現されるレプリカーゼ遺伝子を（ゲノムの５’末端に）含んでなり、ここで、ｐｐ１ａｂは−１リボゾームシフト機構の結果としてのｐｐ１ａの伸長産物である。２つのポリタンパク質は２種のウイルスコード化プロテイナーゼによって切断され、通常、１６種類の非構造タンパク質（Ｎｓｐ１〜１６）を生じる；ＩＢＶはＮｓｐ１を欠き、それによりＮｓｐ２〜１６をコードする。

従って、ＩＢＶ中の遺伝子１は、ＲＮＡ複製および転写に関連する１５種類の非構造タンパク質（他のコロナウイルスでは１６種類）（ｎｓｐ２〜１６）をコードする。

用語「レプリカーゼタンパク質」は、本明細書では、ポリタンパク質ｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂまたは個々のｎｓｐサブユニットを意味するために使用される。

用語「レプリカーゼ遺伝子」は、本明細書では、レプリカーゼタンパク質をコードする核酸配列を意味するために使用される。

コロナウイルスｎｓｐタンパク質の機能の概要を表１に示す。

本発明のコロナウイルスによってコードされる変異型レプリカーゼ遺伝子は、ｎｓｐ−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５またはｎｓｐ−１６をコードする配列の部分の１以上に突然変異を含んでなる。

Ｎｓｐ１０は、ＲＮＡ結合活性を有し、ｐｐ１ａ／ｐｐ１ａｂ領域の他のｎｓｐ内での同型および／または異型相互作用に関与すると思われる。これは、５つのα−ヘリックス、１つの３_１０−ヘリックスおよび３つのβ鎖から構成されるα／β折りたたみ構造をとる。保存されたシステイン残基および１つのヒスチジン残基により形成される２つの亜鉛結合部位が同定されている（Ｃｙｓ−７４／Ｃｙｓ−７７／Ｈｉｓ−８３／Ｃｙｓ−９０；Ｃｙｓ−１１７／Ｃｙｓ−１２０／Ｃｙｓ−１２８／Ｃｙｓ−１３０）。このタンパク質は、明らかな特異性なく一本鎖および二本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡに結合することが確認されている。Ｎｓｐ−１０はｎｓｐ−９と架橋することができ、ｎｓｐ−７、−８、−９および−１０を含むタンパク質−タンパク質相互作用の複雑なネットワークの存在を示唆している。加えて、ｎｓｐ−１０は、ｎｓｐ−１４およびｎｓｐ−１６と相互作用することが知られている。

Ｎｓｐ−１４は、アミノ末端領域に３’→５’エキソリボヌクレアーゼ（エキソン）活性ドメインを含んでなる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶエキソンは、ＤＮＡではなく、一本鎖および二本鎖ＲＮＡの両方に作用する金属イオン依存性の３’→５’エキソリボヌクレアーゼ活性を有することが実証されている。Ｎｓｐ−１４は、プルーフリーディング活性を有することが示されている。このｎｓｐはまた、カルボキシル末端領域にＮ７−メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）活性を有することも示されている。

Ｎｓｐ−１５関連ＮｅｎｄｏＵ（Ｕに特異的なニドウイルスエンドリボヌクレアーゼ）ＲＮアーゼ活性は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＨＶおよびＩＢＶを含む複数のコロナウイルスで報告されている。これらの活性は、Ｍｎ^２＋イオンによって著しく増強されることが一貫して報告され、Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋の存在下ではほとんど活性がなかった。ＮｅｎｄｏＵは、一本鎖および二本鎖ＲＮＡの両方のウリジル酸残基の３’側で切断する。コロナウイルスＮｅｎｄｏＵの生物学的に関連する基質はまだ同定されていない。

Ｎｓｐ−１６は、リボース−２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（２’−Ｏ−ＭＴアーゼ）活性を媒介すると推定されており、逆遺伝学実験によって、２’−Ｏ−ＭＴアーゼドメインがＨＣｏＶ−２２９ＥおよびＳＡＲＳ−ＣｏＶにおけるウイルスＲＮＡ合成に不可欠であることが示されている。この酵素は、コロナウイルスＲＮＡのｃａｐ１構造の生成に関与している可能性があり、また、他のＲＮＡプロセシング経路においてＮｅｎｄｏＵおよびエキソンと共働することもある。２’−Ｏ−Ｍｔアーゼはまた、ＮｅｎｄｏＵを介した切断から保護するために、特異的なＲＮＡをメチル化し得る。

ｎｓｐ−１０、−１４、−１５および−１６のゲノムおよびタンパク質の配列はそれぞれ配列番号２〜５および６〜９として提供される。

配列番号２（ｎｓｐ−１０ヌクレオチド配列−配列番号１のヌクレオチド１１８８４〜１２３１８）

配列番号３（ｎｓｐ−１４ヌクレオチド配列−配列番号１のヌクレオチド１６９３８〜１８５００）

配列番号４（ｎｓｐ−１５ヌクレオチド配列−配列番号１のヌクレオチド１８５０１〜１９５１４）

配列番号５（ｎｓｐ−１６ヌクレオチド配列−配列番号１のヌクレオチド１９５１５〜２０４２３）

配列番号６（ｎｓｐ−１０アミノ酸配列）

配列番号７（ｎｓｐ−１４アミノ酸配列）

配列番号８（ｎｓｐ−１５アミノ酸配列）

配列番号９（ｎｓｐ−１６アミノ酸配列）

病原性の低減
本発明の弱毒化生コロナウイルスは、対応する野生型遺伝子を発現するコロナウイルスと比較して該ウイルスの病原性を低減させる変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる。

本明細書で使用される「弱毒化」という用語は、前記病原性低減を示し、非毒性として分類され得るウイルスを意味する。弱毒化生ウイルスは、実際の病気を引き起こさないが免疫応答を刺激し、免疫をもたらすことがまだ可能である弱められた複製ウイルスである。

用語「病原性」は、本明細書において、その通常の意味に従って、対象において疾患を引き起こすウイルスの可能性を意味するために使用される。典型的には、コロナウイルスの病原性は、疾患に関連する症状、例えば、くしゃみ、スニッキングおよび気管線毛運動低下をアッセイすることによって決定される。

用語「病原性の低減」は、コロナウイルスの病原性のレベルが対応する野生型コロナウイルスと比較して低下することを記載するために使用される。

１つの実施形態では、本発明のコロナウイルスは、それが由来する親Ｍ４１−ＣＫウイルスまたは対照コロナウイルスと比較して病原性が低減されている。対照コロナウイルスは、既知の病原性を有するコロナウイルス、例えば、野生型レプリカーゼタンパク質を発現するコロナウイルスであり得る。

コロナウイルスの病原性は、当技術分野で周知の方法を利用して評価し得る。典型的には、病原性は、ウイルスを投与した対象、例えば、ニワトリにおいて臨床症状をアッセイすることによって評価される。

例として、ニワトリは、８〜２４日齢で鼻腔または眼接種によりウイルス投与をすることができる。ＩＢＶ感染に関連する臨床症状は、感染３〜１０日後に評価し得る。コロナウイルス、例えば、ＩＢＶの病原性を決定するために一般的に評価される臨床症状には、あえぎ呼吸、咳、くしゃみ、スニッキング、抑鬱、羽の逆立ておよび気管線毛運動低下が含まれる。

本発明の変異型レプリカーゼは、コロナウイルスで発現された場合に、野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスと比較して臨床症状のレベルを低減させ得る。

例えば、変異型レプリカーゼを発現するコロナウイルスは、野生型レプリカーゼを発現するウイルスによって引き起こされるスニックの数の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満の、１羽当たり１分間当たりのスニック数を引き起こし得る。

本発明による変異型レプリカーゼを発現するコロナウイルスは、野生型レプリカーゼを発現するウイルスに感染した群の鳥の数の７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満に喘鳴音を引き起こし得る。

本発明による変異型レプリカーゼを発現するコロナウイルスは、感染していない鳥での気管線毛運動のレベルの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である気管線毛運動をもたらし得る。

本発明による変異型レプリカーゼを発現するコロナウイルスは、野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスよりも低いレベルで、表２に定義される臨床症状を引き起こし得る。

本発明の変異型レプリカーゼは、コロナウイルスで発現された場合に、ウイルスを卵内で非病原レベルで複製させ得る。

卵内のニワトリ胚に投与するワクチンを開発する際には、ワクチンに対する母体抗体の影響と胚に対するワクチンの影響の２点に注意を払わなければならない。母体抗体は能動免疫に干渉することが知られている。例えば、弱毒系統を用いたワクチンは、母体抗体とともにブロイラー種のニワトリに投与すると、これらの株は母体抗体プールにより中和されるので、防護的抗体レベルを誘導しない。

従って、ウイルス粒子は、それがウイルスに対する母体由来抗体のより中和されないように、複製および増殖において十分に効率的でなければならない。母体由来抗体は有効抗体の有限プールであり、それはニワトリの齢とともに減少し、この様式でのウイルスの中和は、胚／ニワトリの長期免疫の確立には釣り合わない。ウイルスに対する長期免疫を発達させるためには、胚および孵化したニワトリは、母体由来抗体の効果とは異なる適切な防御免疫応答を発達させなければならない。

卵内ワクチン接種に有用であるためには、ウイルスは、それを胚に対して病原性とするレベルで複製および増殖してはならない。

胚に対する病原性の低減は、そのコロナウイルスが、対応する野生型対照コロナウイルスと比較して孵化率の低下を少なくすることを意味する。よって、「胚に対して病原性を示さずに」という用語は、本発明に関して、対照コロナウイルスと比較した場合に「孵化率の低下を生じずに」を意味し得る。

好適な変異型レプリカーゼは、当技術分野で公知の方法を用いて同定され得る。例えば、母体由来抗体を伴ったまたは伴わない胚の卵内ワクチン接種の後に比較ウイルス投与試験を行ってもよい（すなわち、この場合、産卵鶏をＩＢＶに対してワクチン接種したか、またはしなかった）。

変異型レプリカーゼが、高すぎるレベルでウイルスの増殖を可能とすれば、胚は孵化しないか、または孵化後に存続しない（すなわち、ウイルスは胚に対して病原性を示す）。胚に対して病原性を示すウイルスは胚を殺す場合がある。

変異型レプリカーゼがウイルス複製および増殖に大きすぎる低減を生じれば、そのウイルスは母体由来抗体により中和される。従って、ウイルスに対して効果的な免疫が惹起できなかったために、その後のニワトリのＩＢＶ投与の結果、臨床症状（例えば、喘鳴音、スニッキング、線毛運動の低下）が生じ、ウイルスを投与した鶏に疾患が発症する。

変異体
本明細書で使用する場合、用語「変異体」は、「突然変異体」と同義であり、対応する野生型配列と比較して異なる核酸配列またはアミノ酸配列を意味する。

変異型／突然変異型配列は、天然に生じ得るか、または人為的に作出され得る（例えば、部位特異的突然変異誘発による）。突然変異体は、野生型配列の対応する部分と少なくとも７０、８０、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を持ち得る。突然変異体は、野生型配列の対応する部分に２０未満、１０、５、４、３、２または１つの突然変異を持ち得る。

用語「野生型」は、それぞれ天然遺伝子またはタンパク質（すなわち、ウイルス遺伝子またはタンパク質）と同一のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する遺伝子またはタンパク質を意味するために使用される。

同一性の比較は目により、またはより通常には容易に入手可能な配列比較プログラムの助けで行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２以上の配列間の同一性％を計算することができる。このようなアラインメントを実行するため好適なコンピュータープログラムとしては、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウイスコンシン大学、Ｕ．Ｓ．Ａ．；Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を実行することができる他のソフトウエアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)および比較ツールＣｌｕｓｔａｌＸのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスーツ（Larkin et al. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948参照）が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはいずれもオフラインおよびオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al., 1999同書, 7-58〜7-60頁参照）。しかしながら、適用によっては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新ツールもまたタンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。

配列はまた、サイレント変異を作出して機能的に同等の分子が得られるアミノ酸残基の1以上の欠失、挿入、または置換を有してもよい。活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正電荷アミノ酸にはリジンおよびアルギンが含まれ、類似の親水性値を有する非荷電極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。

保存的置換は、例えば、下記の表に従って行える。第２列の同じブロック内の、好ましくは、第３列の同列のアミノ酸は互いに置換可能である。

本発明のコロナウイルスは、コロナウイルスで発現された場合に、対応する野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスと比較して該ウイルスの病原性を低減させる、配列番号６、７、８または９のいずれかと比較して突然変異を含んでなるタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなり得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、ｎｓｐ−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５およびｎｓｐ−１６の任意の組合せに少なくとも１以上のアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、図１０に示されたＭ４１ ｍｏｄ配列に定義されている突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、
配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、
配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、
配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅ、
配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅ、
のリストから選択される１以上のアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、ｎｓｐ−２、ｎｓｐ−３、ｎｓｐ−６またはｎｓｐ−１３に突然変異を含まないタンパク質をコードし得る。

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、Ａｍｍａｙａｐｐａｎら (Arch Virol (2009) 154:495-499)により報告されている遺伝子のヌクレオチド１２，００８位での突然変異によって引き起されるトレオニンからイソロイシンへの突然変異に相当するｎｓｐ１０での突然変異を含まないタンパク質をコードし得る。

Ａｍｍａｙａｐｐａｎら（上記）は、ＢＶ株アーカンソーＤＰＩの弱毒化に寄与する配列変化の同定を報告している。この研究では、発育卵でのウイルスの多回、およそ１００回の継代の後の、様々なＩＢＶタンパク質において１７のアミノ酸変化が同定された。弱毒化ウイルス（Ａｒｋ ＤＰＩ １０１）が卵内で、胚に対して病原性を示さずに、ウイルスに対する母体由来抗体の存在下で複製可能であるかどうかは検討されなかった。このウイルスが古典的ＩＢＶワクチンの方法論と同様にＳＰＦ発育卵での多回継代により生産されたことを考えれば、このウイルスは胚に対して病原性を示す可能性がある。このウイルスはまた、雌鳥が同じ血清型で接種を受けていれば、母体由来抗体に対して感受性であり得る。

本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、上記のリストに提供される１以上のアミノ酸突然変異の任意の組合せを含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、および配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ 配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕおよび配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕおよび配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕおよび配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅおよび配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕおよび配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅおよび配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕおよび配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅおよび配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅおよび配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。

前記変異型レプリカーゼ遺伝子はまた、ヌクレオチドレベルで定義し得る。

例えば、本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１の１１８８４〜１２３１８、１６９３８〜１８５００、１８５０１〜１９５１４および１９５１５〜２０４２３のリストから選択される領域内に１以上のヌクレオチド置換を含んでなり得る。

例えば、本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１として示される配列と比較して、
ヌクレオチド１２１３７位でのＣからＴ、
ヌクレオチド１８１１４位でのＧからＣ、
ヌクレオチド１９０４７位でのＴからＡ、および
ヌクレオチド２０１３９位でのＧからＡ
のリストから選択される１以上のヌクレオチド置換を含んでなり得る。

本明細書で使用する場合、用語「置換」は、用語突然変異と同義であり、特定された位置のヌクレオチドが野生型ヌクレオチド配列のものと異なることを意味する。

前記ヌクレオチド配列は、配列番号１として示される配列と比較して．
ヌクレオチド１２１３７位でのＣからＴ、
ヌクレオチド１８１１４位でのＧからＣ、
ヌクレオチド１９０４７位でのＴからＡ、および
ヌクレオチド２０１３９位でのＧからＡ
のリストから選択されるヌクレオチド置換の任意の組合せを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７Ｔを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｇ１８１１４Ｃを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｔ１９０４７Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｇ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７ＴおよびＧ１８１１４Ｃを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７ＴおよびＴ１９０４７Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７ＴおよびＧ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｇ１８１１４ＣおよびＴ１９０４７Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｇ１８１１４ＣおよびＧ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｔ１９０４７ＡおよびＧ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７Ｔ、Ｇ１８１１４ＣおよびＴ１９０４７Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７Ｔ、Ｔ１９０４７ＡおよびＧ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７Ｔ、Ｇ１８１１４ＣおよびＧ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｇ１８１１４Ｃ、Ｔ１９０４７ＡおよびＧ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、置換Ｃ１２１３７Ｔ、Ｇ１８１１４Ｃ、Ｔ１９０４７ＡおよびＧ２０１３９Ａを含んでなり得る。

前記ヌクレオチド配列は、Ａｍｍａｙａｐｐａｎら（上記）により報告されているＣ１２００８Ｔ置換に相当する置換を含まなくてよい。

ヌクレオチド配列は、天然、合成または組換えであり得る。ヌクレオチド配列は、二本酸または一本鎖であり得、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの組合せであり得る。ヌクレオチド配列は、例えば、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ゲノム配列またはｍＲＮＡであり得る。

ヌクレオチド配列は、選択された宿主／宿主細胞での生産に関してコドンが最適化されていてもよい。

ヌクレオチド配列は、単離されてもよいし、またはプラスミド、ウイルスまたは宿主細胞の一部であってもよい。

プラスミド
プラスミドは、染色体ＤＮＡとは別の染色体外ＤＮＡ分子であり、染色体ＤＮＡとは独立に複製することができる。プラスミドは通常、環状で二本鎖である。

プラスミド、またはベクター（それらが時に既知である場合）は、宿主細胞でタンパク質を発現させるために使用され得る。例えば、特定のタンパク質を発現させるために、細菌宿主細胞を、特定のタンパク質をコードし得るプラスミドでトランスフェクトすればよい。この用語にはまた、より長いＤＮＡ部分を収容することができる酵母人工染色体および細菌人工染色体も含まれる。

本発明のプラスミドは、レプリカーゼタンパク質の定義された領域をコードし得るヌクレオチド配列を含んでなる。本プラスミドはまた、１以上の付加的コロナウイルスヌクレオチド配列、または１以上の他のコロナウイルスタンパク質、例えば、Ｓ遺伝子および／または遺伝子３をコードし得るヌクレオチド配列も含んでなり得る。

本プラスミドはまた、キサンチンおよびヒポキサンチンの存在下でミコフェノール酸（ＭＰＡ）耐性を付与し、かつ、ワクシニアウイルスＰ７．５前期／後期プロモーターによって制御される、大腸菌(Escherichia coli)由来グアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）などの耐性マーカーも含んでなる。

組換えワクシニアウイルス
本発明はまた、本明細書で定義される変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）に関する。

組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）は、逆遺伝学系に基づきワクシニアウイルスを用いて作製してもよい。

この点に関して、本発明はまた、
（ｉ）前の項に記載のプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトする工程、
（ｉｉ）前記宿主細胞にレプリカーゼ遺伝子を有するコロナウイルス株のゲノムを含んでなる組換えウイルスを感染させる工程、
（ｉｉｉ）改変レプリカーゼ遺伝子を生成するために、前記プラスミド中のレプリカーゼ遺伝子配列と前記組換えウイルスゲノム中の対応する配列との間で相同組換えを起こさせる工程、および
（ｉｖ）前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えウイルスについて選択する工程
によりウイルス粒子を作製するための方法を提供する。

用語「改変レプリカーゼ遺伝子」は、本発明の第１の態様に関して記載されているように変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなるレプリカーゼ遺伝子を意味する。具体的には、この用語は、野生型レプリカーゼ遺伝子に由来するが、それに本明細書で定義される変異型レプリカーゼタンパク質をコードさせるヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子を意味する。

組換えは、レプリカーゼ遺伝子の全部を含んでも、または一部を含んでもよい。例えば、組換えは、ｎｓｐ−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５および／またはｎｓｐ−１６の任意の組合せをコードするヌクレオチド配列を含み得る。組換えは、上記で定義されるように、アミノ酸突然変異をコードするかまたはヌクレオチド置換を含んでなるヌクレオチド配列を含んでもよい。

コロナウイルス株のゲノムは、プラスミドにより提供される部分に相当するレプリカーゼタンパク質の部分を欠いていてもよく、これにより、プラスミドにより提供されるヌクレオチド配列の挿入を介して改変タンパク質が形成される。

組換えウイルスは、そのゲノムとプラスミドの間の相同組換えを可能とするのに好適なものである。ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスゲノムの配列の挿入および欠失に相同組換えが通常用いられるので、特に好適である。

上記方法は、所望により、
（ｖ）工程（ｉｖ）からの組換えウイルスのＤＮＡから前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えコロナウイルスを回収する工程を含む。

組換えＩＢＶなどの組換えコロナウイルスを回収するための方法は当技術分野で公知である（Britton et al (2005)24頁参照；およびＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１２９３参照）。

例えば、工程（ｉｖ）からの組換えウイルスに由来するＤＮＡをプラスミドに挿入し、細胞質Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞をトランスフェクトするために使用することができる。これらの細胞に、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する鶏痘ウイルスを予め感染させてもよい。次に、組換えコロナウイルスは、例えば増殖培地から単離され得る。

プラスミドがワクシニアウイルスゲノムに挿入される場合には、不安定な中間体が形成される。プラスミドを含んでなる組換え体は、例えばプラスミド上の耐性マーカーを用いて選択され得る。

次に、陽性組換え体は、例えばＰＣＲおよびシーケンシングにより改変レプリカーゼ遺伝子を含有することが確認され得る。

工程（ｖ）を行うために、改変レプリカーゼ遺伝子を含む組換えウイルス（例えば、組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ））の多量の原株を増殖させ、ＤＮＡを抽出することができる。

好適な逆遺伝学系は当技術分野で公知である(Casais et al (2001) J. Virol 75:12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77:9084-9089; Britton et al (2005) J. Virological Methods 123:203-211; Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454:255-273)。

細胞
コロナウイルスは、細胞に感染させるために使用可能である。

コロナウイルス粒子は、例えば、上清から、当技術分野で公知の方法により採取し、場合により精製することができる。

この細胞をコロナウイルス粒子を生産するために使用することができる。

よって、本発明はまた、次の工程：
（ｉ）細胞に本発明によるコロナウイルスを感染させる工程、
（ｉｉ）前記細胞での前記ウイルスの複製を可能にする工程、および
（ｉｉｉ）後代ウイルスを採取する工程
を含んでなる、コロナウイルスの生産方法を提供する。

本発明はまた、逆遺伝学系を用いて本発明によるコロナウイルスを産生可能な細胞を提供する。例えば、これらの細胞は、本発明のレプリカーゼ遺伝子をコードし得るヌクレオチド配列を含んでなる組換えウイルスゲノムを含んでなり得る。

この細胞は、レプリカーゼ遺伝子を含有する組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）を産生可能であり得る。

あるいは、この細胞は、逆遺伝学系により組換えコロナウイルスを産生可能であり得る。この細胞は、組換えウイルス粒子を救済するためにＴ７ポリメラーゼを発現し得るか、または発現が誘導され得る。

ワクチン
コロナウイルスは、ワクチンを生産するために使用可能である。ワクチンは、本発明のコロナウイルスの生きた弱毒化型であり得、薬学上許容可能な担体をさらに含んでなり得る。本明細書で定義される本発明での使用に好適な「薬学上許容可能な担体」は当業者に周知である。このような担体としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸バッファー、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液が含まれる。他の慣用されている希釈剤および賦形剤は、従来の技術に従って添加可能である。このような担体としては、エタノール、ポリオール、およびそれらの好適な混合物、植物油、ならびに注射可能な有機エステルを含み得る。バッファーおよびｐＨ調整剤もまた使用可能である。バッファーとしては、限定されるものではないが、有機酸または塩基から調製される塩が含まれる。代表的なバッファーとしては、限定されるものではないが、有機酸塩、例えば、クエン酸の塩、例えば、クエン酸バッファー、アスコルビン酸バッファー、グルコン酸バッファー、ヒスチジン−Ｈｅｌバッファー、炭酸バッファー、酒石酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファー、またはフタル酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、塩酸トリメタンミン(trimethanmine)バッファー、またはリン酸バッファーが含まれる。非経口担体としては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、デキストロース、トレハロース、スクロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または硬化油を含み得る。静脈内担体としては、体液および栄養補給液、電解質補給液、例えば、ブドウ糖加リンゲル液に基づくものなどを含み得る。保存剤およびその他の添加剤、例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、不活性ガスなども医薬担体中に提供され得る。本発明は、担体の選択により限定されない。上記成分からの、適当なｐＨ、等張性(appropriate pH isotonicity)、安定性および他の慣例の特徴を有する、これらの薬学上許容可能な組成物の調製は当技術分野の技術の範囲内である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000; and The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第4版, R. C. Rowe et al編, APhA Publications, 2003などの教本を参照。

本発明のワクチンは、「治療上有効な量」で投与され、これは、対象または患者に投与された際に有益なまたは所望の結果を果たすのに十分な有効成分、例えば、本発明による薬剤の量を意味する。有効量は、１回以上の投与、適用または用量で投与され得る。本発明による組成物の治療上有効な量は、当業者により容易に決定され得る。本発明に関して「治療上有効な量」は、伝染性気管支炎の病態に関連する１以上のパラメーターにおいて、客観的に測定される有益なまたは所望の結果を果たすのに十分な変化を生じる量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。本発明の目的では、有効量の薬物、化合物、または医薬組成物は、伝染性気管支炎の罹患率を低減するのに十分な量である。本明細書で使用する場合、用語「治療上」とは、疾患、病態または障害に対する処置の全域を包含する。本発明の「治療」薬は、リスクがあると特定され得る動物を標的とするように設計された手順（薬理遺伝学）を組み込んだものを含む、防止または予防的な様式で；または本質的に改善的もしくは治癒的である様式で働き得るか、あるいは処置される疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状の進行の速度もしくは程度緩徐化するために働き得る。

本発明はまた、細胞、例えば、Ｖｅｒｏ細胞に、本発明の第１の態様に関連して定義されているレプリカーゼタンパク質を含んでなるウイルス粒子を感染させる工程を含んでなる、このようなワクチンの生産方法に関する。

ワクチン接種法
本発明のコロナウイルスは、疾患を治療および／または予防するために使用され得る。

「治療する」ことは、疾患に関連する少なくとも１つの症状を減らす、軽減するもしくは改善するため、および／または疾患の進行を緩徐化、低減もしくは遮断するために、既存の疾患を有する対象にワクチンを投与することを意味する。

「予防する」ことは、まだ疾患に罹っていない対象および／または疾患のいずれの症状も示していない対象に、疾患の過程（例えば感染）を予防するもしくは傷害するため、または疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を軽減もしくは予防するためんびワクチンを投与することを意味する。

疾患は、コロナウイルスにより引き起こされる任意の疾患、例えば、ヒトにおける呼吸器疾患および／または胃腸炎、ならびに他の動物における肝炎、胃腸炎、脳炎、もしくは呼吸器疾患であり得る。

疾患は、伝染性気管支炎（ＩＢ）；ブタ伝染性下痢症；伝染性胃腸炎；マウス肝炎ウイルス；ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）；または紫藍病であり得る。

疾患は伝染性気管支炎であり得る。

ワクチンは、孵化したヒヨコまたは親鳥に、例えば、点眼剤または鼻腔内投与に投与され得る。厳密ではあるが、これらの方法は、例えば大きなブロイラー群にはコストがかかり得る。別法としては、飲料水への噴霧接種投与を含むが、このような方法を用いて均一なワクチン適用を保証するのは困難であり得る。

ワクチンは、眼内用の点眼剤などのその投与に好適な形態で提供してもよい。

ワクチンは、卵内接種、例えば、発育卵への注射によって投与してもよい。卵内ワクチン接種は、疾患に早期耐性を提供するという利点を持つ。卵内接種はまた、噴霧接種および飲料水を介した投与とは異なり、各対象に均一な用量の投与を助長する。

ワクチンは、尿膜腔液、卵黄嚢、羊膜、気室または胚を含む、卵の任意の好適な区画に投与してよい。ワクチンは卵殻（気室）膜下および漿尿膜下に投与してよい。

通常、ワクチンは、胚発生の後期、一般に、孵卵期間の最後の４分の１の間、例えば、孵化前３〜４日に発育卵に注入する。ニワトリでは、ワクチンは、２１日の孵卵期間の１５〜１９日の間、例えば、１７日目または１８日目に投与され得る。

この工程は、ＷＯ２００４／０７８２０３に記載されているものなどのロボット注入法を用いて自動化することができる。

ワクチンは、１以上の他のワクチン、例えば、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）などの他の疾患のワクチンとともに投与してよい。本発明はまた、本発明によるワクチンを１以上の他のワクチンとともに含んでなるワクチン組成物を提供する。本発明はまた、本発明によるワクチンを、個別、逐次または同時投与のための１以上の他のワクチンとともに含んでなるキットも提供する。

本発明のワクチンまたはワクチン組成物は、ヒト、動物または鳥類対象を処置するために使用可能である。例えば、対象はヒヨコ、ニワトリまたはマウス（例えば、実験用マウス、例えば、トランスジェニックマウス）であり得る。

一般に、医師または獣医は、個々の対象または対象群に最も好適な実際の用量を決定し、特定の対象の齢、体重および応答によって変更する。

本組成物は、場合により、薬学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含んでなり得る。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択肢は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として（またはそれに加えて）、任意の好適な結合剤、滑沢剤、沈殿防止剤、着色剤、可溶化剤、およびウイルスの送達または免疫原性を補助または増強し得るその他の担体薬剤を含んでなってよい。

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、本発明を実施する上で当業者を補助するために役立てることを意図し、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

実施例１−Ｍ４１−ＣＫに基づくＩＢＶ逆遺伝学系の作出
Ｍ４１−ＣＫ全長ｃＤＮＡは、ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１２９３（引用することにより本明細書の一部とする）に従前に記載されているワクシニアウイルス逆遺伝学系におけるＢｅａｕｄｅｔｔｅ ｃＤＮＡをＭ４１コンセンサス配列から誘導された合成ｃＤＮＡで置換することによって作製した。

ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株由来のレプリカーゼと構造遺伝子およびアクセサリー遺伝子とＩＢＶ Ｍ４１−ＣＫ由来の３’ ＵＴＲからなった、Armesto, Cavanagh and Britton (2009). PLoS ONE 4(10): e7384. doi:10.1371/journal.pone.0007384に記載の組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）内のＩＢＶ ｃＤＮＡ、ｒＶＶ−ＢｅａｕＲ−Ｒｅｐ−Ｍ４１構造を、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ ５’ ＵＴＲ−Ｎｓｐ２−Ｎｓｐ３配列をＩＢＶ Ｍ４１−ＣＫ由来の対応する配列で置換することによりさらに改変した。得られたＩＢＶ ｃＤＮＡは、Ｍ４１由来の５’ ＵＴＲ−Ｎｓｐ２−Ｎｓｐ３と、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ由来のＮｓｐ４−Ｎｓｐ１６と、構造遺伝子とアクセサリー遺伝子と、Ｍ４１由来の３’ ＵＴＲからなった。このｃＤＮＡを、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ Ｎｓｐ４−Ｎｓｐ１６ 配列の欠失によりさらに改変した。得られた、Ｎｓｐ４−１６を欠くｃＤＮＡを、欠失したＮｓｐをＭ４１−ＣＫ由来の対応する配列で順次置換するというさらに４段階で改変し、これらの置換ｃＤＮＡは、Ｍ４１−ＣＫ Ｎｓｐ４−８、Ｎｓｐ９−１２、Ｎｓｐ１２−１４および最後にＮｓｐ１５−１６を示した。各置換ｃＤＮＡは、５’末端に、先に挿入された３’のほとんどのＭ４１配列に相当するおよそ５００ヌクレオチドと、３’末端に、Ｍ４１ Ｓ遺伝子配列に相当するおよそ５００ヌクレオチドを含んでいた。これは、相同組換えによるＭ４１ ｃＤＮＡ配列の挿入および続いての連続するＭ４１レプリカーゼ遺伝子配列の付加を可能とした。Ｍ４１由来Ｎｓｐ配列を含有する合成ｃＤＮＡは、発明者が従前に記載したトランジェントドミナントセレクション（ＴＤＳ）系（ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１２９３参照）を用いた相同組換えにより付加した。Ｍ４１ Ｎｓｐｓ−１０、−１４、−１５および−１６に相当する配列を含有するＭ４１由来ｃＤＮＡは、図１０に示されるように、それぞれ８５、３９３、１８３および２０９位に改変アミノ酸を含んでいた。

Ｍ４１−ＣＫのゲノムを提示する全長ｃＤＮＡは、これらの合成配列を提示するワクシニアウイルスで作製された。Ｍ４１−Ｒ−６およびＭ４１−Ｒ−１２の２つのｒＩＢＶが救済され、Ｍ４１−ＣＫと同様の方法で増殖することが示された（図１）。

実施例２−救済されたＭ４１ウイルスの病原性の決定
実施例１で救済されたウイルスを用い、８日齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）鶏に眼および鼻腔接種により感染させ、感染後３〜７日の毎日の臨床徴候および感染後４日および６日の線毛運動により観察されるようなそれらの病原性を試験した。線毛運動の低下は、ＩＢＶの病原性を決定するために十分に確立された方法である。これら２つのＭ４１−Ｒ ウイルスは、非感染対照鶏と比較していくつかの臨床徴候（図２）と、一貫したものではないがいくらかの線毛運動低下（図３）を示したとしても、Ｍ４１−ＣＫと比較した場合には非病原性であることが判明した。

よって、Ｍ４１−ＣＫのＭ４１−Ｒ分子クローンは、親ウイルスＭ４１−ＣＫと比較した場合に病原性は無かった。

本発明者らは、Ｍ４１−ＣＫ配列と比較してＭ４１−Ｒにいくつかのヌクレオチド差異を同定した。これらの大部分は、そのヌクレオチド変化は、その配列に関連するタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えなかったことから、同義的突然変異であった。しかしながら、ＩＢＶレプリカーゼ遺伝子に、レプリカーゼ遺伝子のＮｓｐ−１０、Ｎｓｐ−１４、Ｎｓｐ−１５およびＮｓｐ−１６成分に特異的な４つの非同義的突然変異が同定され、これらの突然変異はアミノ酸変化を生じた（表３）。

実施例３−Ｍ４１−Ｒ ｒＩＢＶの修復
同定された突然変異がＭ４１−Ｒに関連する病原性の低下に寄与したかどうかを決定するために、Ｎｓｐ１０突然変異を修復し、Ｎｓｐ−１４、−１５および−１６の突然変異を修復したところ、Ｍ４１−ＣＫと同様の方法で増殖することが示された（図９）。よって、発明者らは、発明者らが従前に記載した（ＴＤＳ）系（ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１２９３参照）を用い、補正ヌクレオチドを含有する合成ｃＤＮＡを用いてｒＩＢＶであるＭ４１Ｒ−ｎｓｐ１０ｒｅｐおよびＭ４１Ｒ−ｎｓｐ１４，１５，１６ｒｅｐを作製した。

これらのｒＩＢＶを、従前に記載したようにニワトリで病原性を評価した。両ｒＩＢＶとも、Ｍ４１−ＣＫで見られたレベルと比較した場合にはそうではなかったが、Ｍ４１−Ｒと比較した場合には病原性の増大を示した（図４および５）。Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１４，１５，１６ｒｅｐは、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０ｒｅｐよりも多い臨床徴候および線毛運動の低下を示し、これらの結果は全体として、これら４つのＮｓｐに関連する変化が病原性に影響を与えると見られることを示した。

病原性におけるこれらのＮｓｐの役割を決定するために、Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０ｒｅｐに相当する全長ｃＤＮＡを使用し、ＴＤＳ系を用い、補正ヌクレオチドを含有する合成ｃＤＮＡを用いてＮｓｐｓ１４、１５および１６の突然変異を修復した。

以下のｒＩＢＶを作製した：
Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５ｒｅｐ− Ｎｓｐ−１０およびＮｓｐ−１５の突然変異が修復されたＭ４１−Ｒ
Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１５ｒｅｐ− Ｎｓｐ−１０、−１４および−１５の突然変異が修復されたＭ４１−Ｒ
Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１４，１６ｒｅｐ− Ｎｓｐ−１０、−１４および−１６の突然変異が修復されたＭ４１−Ｒ
Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐ− Ｎｓｐ−１０、−１５および−１６の突然変異が修復されたＭ４１−Ｒ
Ｍ４１−Ｋ− Ｍ４１−Ｒにおいて４つの突然変異Ｎｓｐ−１０、−１４、−１５および−１６の総てが修復されたもの。

これらのｒＩＢＶは、Ｍ４１−ＣＫと同様の方法で増殖することが示され（図９）、従前に記載したように病原性を評価した。Ｍ４１−Ｋ（４つ総ての突然変異が修復された）は、感染後４日で臨床徴候および線毛運動の１００％（完全な線毛運動障害）の低下をもたらした（図６、７および８）。Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ１０，１５，１６ｒｅｐを除く他のｒＩＢＶは様々なレベルの病原性を示し、これは本質的に非病原性であった。これらの結果から、４つのＮｓｐの総ての修復がＭ４１−Ｒに対する病原性を回復させたことが確認され、この場合にも、これら４つのＮｓｐにおいて記載された突然変異がＭ４１−ＣＫの弱毒化に関連付けられるというこれまでのエビデンスを裏づける。

本発明者らはまた、ｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ １０，１４ ｒｅｐ （ｎｓｐ １０と１４が修復され、ｎｓｐ １５と１６が突然変異を含む）およびｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ １０，１６ ｒｅｐ（ｎｓｐ １０と１６が修復され、ｎｓｐ １４と１５が突然変異を含む）も作製し、これらのウイルスの病原性を評価した。

ｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ １０，１４ ｒｅｐはＭ４１−Ｋよりも病原性は低かったが、感染後４〜６日に５０％前後の線毛運動障害を生じた。ｒＩＢＶ Ｍ４１Ｒ−ｎｓｐ １０，１６ ｒｅｐはほぼ非病原性であり、線毛運動障害を生じなかった（図１１ａ〜ｃ参照）。

よって、Ｍ４１−Ｒに関連するゲノムは、合理的に弱毒化されたＩＢＶの潜在的骨格ゲノムである。

実施例４−ワクチン接種／Ｍ４１−Ｒの投与試験
候補ワクチンウイルスを、受精鶏卵が胚発生１８日目に卵内ワクチン接種されて接種卵の孵化率が決定される試験に供試した。ニワトリの臨床健康を調べ、２１日齢のニワトリに、毒性の強いＩＢ Ｍ４１投与ウイルスを１用量当たり１０^３．６５ ＥＩＤ_５０で投与した。

ワクチンによるウイルス投与保護後の臨床徴候を調べ、ウイルス投与後５日目に線毛運動障害検査を行い、線毛の運動に対する投与ウイルスの影響および線毛運動障害（線毛運動の阻害）に対するワクチンによる保護を検討した。

市販のブロイラー卵における卵内ワクチン接種
この実験の計画を表４に示し、臨床結果を表５に示す。ＩＢ Ｍ４１−Ｒを接種した卵の孵化率は良好であり、ニワトリは健康であった。ＩＢ Ｍ４１−Ｒは、ブロイラーにおおいてウイルス投与後の臨床徴候から保護し（プラセボ：１９／１９罹患、ＩＢ Ｍ４１−Ｒ：３／１８罹患および１羽の死）。線毛運動障害検査の結果を表６に示す。ＩＢ Ｍ４１−Ｒは、線毛運動障害に対して保護を生じた。

特定病原体除去（ＳＰＦ）卵における卵内ワクチン接種
ＳＰＦ卵における試験計画を表７示し、ＩＢ Ｍ４１−Ｒのワクチン接種用量が高い（１用量当たり１０^５ ＥＩＤ_５０）こと以外は、市販のブロイラーを用いた試験計画と同様である。

結果（表８）は、ＩＢ Ｍ４１−Ｒ 孵化に関する孵化率％は低く、４０のうち１９が孵化し、ニワトリは虚弱であった。８羽が死亡した。残りの１１羽にウイルス投与を行い、生理食塩水を接種した卵から孵化した１１羽にウイルス投与を行った。

ウイルス投与後の線毛運動障害検査では、ＩＢ Ｍ４１−Ｒで卵内ワクチン接種を行った総てのニワトリが保護されたが、対照には保護されたものはいなかったことが明らかである、表９参照。

結論として、ＩＢ Ｍ４１−Ｒは市販卵で安全であり、臨床徴候に対して、また、ある程度まで線毛運動障害に対しても保護を生じた。

ＩＢ Ｍ４１ Ｒでワクチン接種を行ったＳＰＦ卵では、孵化したニワトリの数は比較的少なかった。これは、１卵当たり１０^５ ＥＩＤ_５０のＩＢ Ｍ４１−Ｒを使用したことによるものであり得る。これは、より高いレベルの孵化率であった従前の試験で使用した用量の１０倍であった。他の試験で胚死亡率の程度がこれまでに見られたものよりも高かったことから、このより低い孵化率％は、このＳＰＦ卵バッチの特に高いウイルス感受性により引き起こされた可能性もある。

ウイルス投与後に、孵化後に生存していた総てのニワトリが線毛運動障害から完全に保護された。卵内投与されるワクチンとして大きな可能性を持つと結論づけられる。

上記の明細書に挙げられた総ての刊行物は引用することにより本明細書の一部とされる。記載される本発明の方法および系の様々な改変および変形が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に自明である。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求される本発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際に、分子生物学、ウイルス学または関連の分野の熟練者に自明である、本発明を実施するための記載の様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。

Claims (27)

1. 非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５またはｎｓｐ−１６の１以上に突然変異を含んでなるポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含んでなる、弱毒化生コロナウイルス。
2. 前記変異型レプリカーゼ遺伝子が、
   配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、
   配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、
   配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅ、
   配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅ
   のリストから選択される１以上のアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードする、請求項１に記載のコロナウイルス。
3. 前記レプリカーゼ遺伝子が、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードする、請求項１または２に記載のコロナウイルス。
4. 前記レプリカーゼ遺伝子が、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅ、および配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
5. 前記レプリカーゼ遺伝子が、配列番号６の８５位でのＰｒｏからＬｅｕ、配列番号７の３９３位でのＶａｌからＬｅｕ、配列番号８の１８３位でのＬｅｕからＩｌｅ、および配列番号９の２０９位でのＶａｌからＩｌｅへのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
6. 前記レプリカーゼ遺伝子が、配列番号１として示される配列と比較して、
   ヌクレオチド１２１３７位でのＣからＴ、
   ヌクレオチド１８１１４位でのＧからＣ、
   ヌクレオチド１９０４７位でのＴからＡ、および
   ヌクレオチド２０１３９位でのＧからＡ
   のリストから選択される１以上のヌクレオチド置換を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
7. 伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
8. ＩＢＶ Ｍ４１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
9. その少なくとも一部はＭ４１以外のＩＢＶ血清型由来のものであるＳタンパク質を含んでなる、請求項８に記載のコロナウイルス。
10. 前記Ｓ１サブユニットがＭ４１以外のＩＢＶ血清型由来のものである、請求項９に記載のコロナウイルス。
11. 前記Ｓタンパク質がＭ４１以外のＩＢＶ血清型由来のものである、請求項９に記載のコロナウイルス。
12. ウイルスが発育卵に投与された際に、その胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、対応する野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスと比較して病原性が低減されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
13. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異型レプリカーゼ遺伝子。
14. 請求項１３に記載の変異型コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子によってコードされる、タンパク質。
15. 請求項１３に記載のレプリカーゼ遺伝子を含んでなる、プラスミド。
16. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコロナウイルスを作製するための方法であって、次の工程：
    （ｉ）請求項１５に記載のプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトする工程、
    （ｉｉ）前記宿主細胞にレプリカーゼ遺伝子を有するコロナウイルス株のゲノムを含んでなる組換えウイルスを感染させる工程、
    （ｉｉｉ）改変レプリカーゼ遺伝子を生成するために、前記プラスミド中のレプリカーゼ遺伝子配列と前記組換えウイルスゲノム中の対応する配列との間で相同組換えを起こさせる工程、および
    （ｉｖ）前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えウイルスについて選択する工程
    を含んでなる、方法。
17. 前記組換えウイルがワクシニアウイルスである、請求項１６に記載の方法。
18. （ｖ）工程（ｉｖ）からの組換えウイルスのＤＮＡから前記改変レプリカーゼ遺伝子を含んでなる組換えコロナウイルスを回収する工程をさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコロナウイルスを産生可能な細胞。
20. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコロナウイルスおよび薬学上許容可能な担体を含んでなる、ワクチン。
21. 対象における疾患を治療および／または予防するための方法であって、請求項２０に記載のワクチンをその対象に投与する工程を含んでなる、方法。
22. 対象における疾患の治療および／または予防における使用のための、請求項２０に記載のワクチン。
23. 対象における疾患を治療および／または予防するためのワクチンの製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコロナウイルスの使用。
24. 前記疾患が伝染性気管支炎（ＩＢ）である、請求項２１、２２または２３に記載の方法、ワクチンまたは使用。
25. 前記投与方法が、点眼投与、鼻腔内投与、飲水投与、孵化後注射および卵内注射からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
26. 前記ワクチン接種が卵内ワクチン接種である、請求項２４に記載の方法。
27. 請求項２０に記載のワクチンを生産するための方法であって、
    請求項１９に記載の細胞に請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコロナウイルスを感染させる工程を含んでなる、方法。

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