BR112017001310B1 - Coronavírus - Google Patents

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Abstract

CORONAVÍRUS. A presente invenção fornece um coronavírus atenuado vivo compreendendo um gene replicase variante que codifica poliproteínas compreendendo uma mutação em uma ou mais das proteínas não estruturais (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 ou nsp-16. O coronavírus pode ser utilizado como uma vacina para tratar e / ou prevenir uma doença, tal como a bronquite infecciosa, em um indivíduo.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO
[0001] A presenteinvenção se referea um coronavírusatenuadocompreendendo um gene replicase variante, o que faz com que ovírustenhapatogenicidadereduzida. A presenteinvençãotambém se relaciona com a utilização de talcoronavírusemumavacina para prevenir e / outratarumadoença.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Vírus da bronquiteinfecciosa (IBV), o agenteetiológico da bronquiteinfecciosa (IB), é um agentepatogênicoinfecciosoaltamentecontagioso de avesdomésticas que replica principalmente no tratorespiratório, mas tambémemcélulasepiteliais do intestino, rim e oviduto. IBV é um membro da OrdemNidovirales, FamíliaCoronaviridae, subfamília Coronavirinae e gêneroGammacoronavirus; geneticamentecoronavírusmuitosemelhante causa doençasemperus, galinha-de-angola e faisões.
[0003] Ossinaisclínicos de IB incluemespirros, estertorestraqueais, secreção nasal e respiraçãoofegante. As aves para cRNAetemreduzidoganho de peso, enquanto que avespoedeiraspõemmenosovos e produzemovos de máqualidade. Ainfecçãorespiratóriapredispõegalinhas para infecçõesbacterianassecundárias que podem ser fataisem pintos. O vírustambémpodecausardanospermanentes no oviduto, especialmente, emfilhotes, levando à produção e qualidadereduzida de ovos; e rim, algumasvezeslevando a doença renal, que pode ser fatal.
[0004] IBV temsidorelatado para ser responsável pela perdamaiseconômica para aindústria de aves de capoeira que qualqueroutradoençainfecciosa. Embora as vacinasvivasatenuadas e as vacinasinativadassejamuniversalmenteusadas no controle de IBV, a proteçãoobtida pela utilização de vacinaçãopode ser perdida, querdevido à vacinaaviáriaouaintrodução de um novo sorotipo de IBV que nãoestárelacionada com a vacinautilizada, o que representa um risco para a indústriaavícola.
[0005] Alémdisso, existeumanecessidadenaindústria para desenvolvervacinas que sejamadequadas para utilização in ovo, de modo a melhoraraeficiência e eficácia de custos dos programas de vacinação. Um desafioimportanteassociado com vacinação in ovo é que ovírus deva ser capaz de se replicarnapresença de anticorposmaternosderivadas contra o vírus, sem ser patogênico para o embrião. As vacinas de IBV correntessãoobtidas, de acordo com múltiplospassagememovosembrionados, issoresultaemvírus com patogenicidadereduzida para galinhas, de modo que elespodem ser utilizadoscomovacinasvivasatenuadas. No entanto tais vírusquase sempre mostram um aumento da virulênciaaosembriões, e, portanto, nãopode ser utilizado para vacinação in ovoem que causemeclosãoreduzida. Uma redução de 70% na taxa de eclosão é visto emalgunscasos.
[0006] Atenuaçãoseguinte a múltiplapassagememovosembrionadostambémsofre de outrasdesvantagens. É um métodoempírico, comoaatenuação dos vírus é aleatória e irãodiferir de cadavez que ovírussejapassado, de modo que a passagem do mesmovírusatravés de umasériediferente de ovos para fins de atenuaçãoiráconduzir a um conjunto diferente de mutações que conduzem a atenuação. Existemtambémproblemasassociados com aeficácia do processo: algumasmutaçõesirãoafetar a replicação do vírus e algumas das mutaçõespodemtambémtornar o vírusatenuado. As mutaçõestambémpodemocorrer no gene S, que tambémpodemafetaraimunogenicidade, de modo a que a respostaimunedesejadasejaafetada e o potencialvacinalnãopodeproteger contra o sorotiponecessário. Alémdisso, existemproblemasassociados com a reversão à virulência e aestabilidade das vacinas.
[0007] É importante que novas e maissegurasvacinassejamdesenvolvidas para o controle de IBV. Assim, existeumanecessidade de vacinas de IBV, que nãoestejamassociadasaestesproblemas, em particular, vacinas que podem ser utilizadas para vacinação in ovo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] Ospresentesinventoresutilizaramumaabordagemgenéticareversa de forma aatenuarracionalmente o IBV. Estaabordagem é muitomaiscontrolável do que aatenuaçãonasequênciaaleatória de múltiplaspassagensemovosembrionados, porque a posição de cadamutação é conhecida e o seuefeitosobre o vírus, isto é, a razão de atenuação, pode ser derivada.
[0009] Utilizando a abordagemgenéticareversa, ospresentesinventoresidentificaramváriasmutações que causam o vírusterníveisreduzidos de patogenicidade. Osníveis de patogenicidadepodem ser reduzidos, de tal modo que, quando o vírus é administradoa um ovoembrionado, é capaz de se replicarsem ser patogênico para o embrião. Tais víruspodem ser adequados para a vacinação in ovo, o que é umavantagemsignificativa e temmelhoriasobre as vacinas IBV vivasatenuadasproduzidasapósmúltiplaspassagememovosembrionados.
[0010] Assim, em um primeiroaspecto, a presenteinvençãoproporciona um coronavírus vivo atenuadocompreendendo um gene da replicase variantecodificandopoliproteínas que compreendemumamutaçãoemumaoumais das proteínasnãoestruturais (s) (nsp)-10, nsp-14, nsp-15 ou nsp-16.
[0011] A variante do gene da replicase podecodificarumaproteína que compreendeumaoumaismutações de aminoácidosselecionadas a partir da lista de: Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6, Val para Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu para Ile naposição 183 da SEQ ID NO: 8; Val para Ile naposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[0012] O gene da replicase podecodificarumaproteínacompreendendo a mutação de aminoácidos Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6.
[0013] O gene da replicase podecodificarumaproteínacompreendendo as mutações de aminoácidos Val a Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu e lie naposição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val para Ilenaposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[0014] O gene da replicase podecodificaumaproteínacompreendendo as mutações de aminoácidos Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6; Val para Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu para Ile naposição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val para Ile naposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[0015] O gene da replicase podecompreenderumaoumaissubstituições de nucleotídeosselecionada a partir da lista de: C para Tnaposição de nucleotídeo 12137; G para C naposição de nucleotídeo 18114; T para A naposição de nucleotídeo 19047; e G para A naposição de nucleotídeo 20139; emcomparação com a sequênciaapresentadacomo SEQ ID NO: 1.
[0016] O coronavíruspode ser um vírus da bronquiteinfecciosa (IBV).
[0017] O coronavíruspode ser M41 do IBV.
[0018] O coronavíruspodecompreenderumaproteína S, pelomenos, parte dos quais é de um sorotipo de IBV que nãoseja M41.
[0019] Por exemplo, a subunidade S1 outoda a proteína S pode ser a partir de um sorotipodiferente do IBV M41.
[0020] O coronavírus, de acordo com o primeiroaspecto da invençãoreduziu a patogenicidadeemcomparação com um coronavírus que expressauma replicase correspondente do tiposelvagem, de tal modo que quando o vírus é administradoa um ovoembrionado, sejacapaz de se replicarsem ser patogênico para o embrião.
[0021] Em um segundoaspecto, a presenteinvençãoproporciona um gene da replicase variante, talcomodefinidosemligação com o primeiroaspecto da invenção.
[0022] Em um terceiroaspecto, a presenteinvençãoproporcionaumaproteínacodificadapor um gene da replicase de coronavírusvariante de acordo com o segundoaspecto da invenção.
[0023] Em um quarto aspecto, a presenteinvençãofornece um plasmídeo que compreende um gene da replicase de acordo com o segundoaspecto da invenção.
[0024] Em um quinto aspecto, a presenteinvençãoproporciona um método para fazer o coronavírus de acordo com o primeiroaspecto da invenção que compreende as seguintesetapas: (i) transfectar um plasmídeo de acordo com o quarto aspecto da invençãoemumacélulahospedeira; (ii) infectar a célulahospedeira com um vírus de recombinação que compreende o genoma de uma cepa de coronavírus com um gene da replicase; (iii) permitir que a recombinaçãohomólogaocorra entre as sequências de genes de replicase do plasmídeo e as sequênciascorrespondentes no genoma do vírus de recombinação para produzir um gene da replicase modificada; e (iv) selecionar para a recombinação de víruscompreendendo o gene da replicase modificada.
[0025] O vírus de recombinaçãopode ser um vírus de vaccinia.
[0026] O métodopodetambémincluiraetapa de: (v) recuperar o coronavírusrecombinante que compreende o gene da replicase modificada a partir do DNA do vírus de recombinação a partir da etapa (iv).
[0027] Em um sexto aspecto, a presenteinvençãoproporcionaumacélulacapaz de produzir um coronavírus de acordo com o primeiroaspecto da invenção.
[0028] Em um sétimoaspecto, o presenteinvençãoproporcionaumavacinacompreendendo um coronavírus de acordo com o primeiroaspecto da invenção e um veículofarmaceuticamenteaceitável.
[0029] Em um oitavoaspecto, a presenteinvençãoproporciona um método para o tratamento e / ouprevenção de umadoençaem um sujeito que compreende o passo de administração de umavacina de acordo com o sétimoaspecto da invençãoaosujeito.
[0030] Outros aspectos da invençãoproporcionam: • a vacina de acordo com o sétimoaspecto da invenção para utilização no tratamento e / ouprevenção de umadoençaem um sujeito. • Utilização de um coronavírus de acordo com o primeiroaspecto da invençãonafabricação de umavacina para o tratamento e / ouprevenção de umadoençaem um sujeito.
[0031] A doençapode ser a bronquiteinfecciosa (IB).
[0032] O modo de administração da vacinapode ser selecionado a partir do grupo que consisteem; administração de colírio, administração intranasal, administraçãoatravés de ingestão de água, injeção de pós- eclosão e injeção in ovo.
[0033] A vacinaçãopode ser realizadaporvacinação in ovo.
[0034] A presenteinvençãotambémfornece um método para produzirumavacina, de acordo com o sétimoaspecto da invenção, que compreendeaetapa de infectarumacélula de acordo com o sexto aspecto da invenção com um coronavírus de acordo com o primeiroaspecto da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0035] A Figura 1 mostra a cinética do crescimento de M41-R-6 e M41-R-12 emcomparação com M41-CK (EP4 M41) emcélulas CK
[0036] A Figura 2 mostraossinaisclínicos, snicking e chiado no peito, associado com M41 -R-6 e M41 - R-12 emcomparação com M41 -CK (M41 EP4) e Beau-R (barras mostramsimulada, Beau-R, M41-R 6, M41-R 12, M41-CK EP4 da esquerda para a direita de cadaponto de tempo).
[0037] A Figura 3 mostraaatividadeciliar do vírusemanéistraqueaisisolados de traqueiasretiradas de pintos infectados. atividadeciliar 100% indica que nãoháefeitopelovírus; apatogênica, 0% de atividade indica a perdacompleta da atividadeciliar, ciliostasecompleto, indicando que ovíruspatogênico é (barras mostramsimulada, Beau-R, M41-R 6, -R 12 M41, M41 -CK EP4 da esquerda para a direita de cadapontotemporal ).
[0038] A Figura 4 mostraossinaisclínicos, snicking, associado com M41 R-nsp10rep e M41 R- nsp14,15,16rep comparação com M41 -R-12 e M41 -CK (M41 EP5) (barras mostramsimulada, M41-R12; M41 R- nsp10rep; M41 R- nsp14,15,16rep e M41 -CK EP5 a partir da esquerda para a direita de cadaponto de tempo).
[0039] A figura 5 mostraaatividadeciliar do M41 R-nsp10rep e M41 R-nsp14,15,16rep comparação com M41-R-12 e M41-CK emanéistraqueaisisolados de traqueiasretiradas de pintos infectados (barras mostramsimulada; M41-R12; M41 R-nsp10rep; M41 R-nsp14,15,16rep e M41 -CK EP5 da esquerda para a direita de cadaponto de tempo).
[0040] A Figura 6 mostrasinaisclínicos, snicking, associado com M41-R nsp10, 15rep, M41-R nsp10, 14, 15rep, M41-R nsp10, 14, 16rep, M41-R nsp10, 15, 16rep M41 e M41 emcomparação com -K -CK (barras mostramsimulada, M41 R- nsp10,15rep1; M41 R-nsp10,14,16rep4; M41 R-nsp10,15,16rep8; M41 R-nsp10,14,15rep10; M41 -K6 e M41 -CK EP4 de esquerda para a direita de cadaponto de tempo).
[0041] A Figura 7 mostraossinaisclínicos, pieira, associado com M41 R-nsp10, 15rep, M41 R-nsp10, 14, 15rep, M41 R-nsp10, 14, 16rep, M41 R-nsp10, 15, 16rep e M41-K emcomparação com M41 -CK (barras mostramsimulada, M41 R-nsp10,15rep1; M41 R-nsp10,14,16rep4; M41 R-NSPL 0,15,16rep8; M41 R-nsp10,14,15rep10; M41 -K6 e M41 -CK EP4 da esquerda para a direita de cadaponto de tempo).
[0042] A Figura 8 mostra a atividadeciliar do M41 R-nsp10, 15rep, M41 R-nsp10, 14, 15rep, M41 R-nsp10, 14, 16rep, M41 R-nsp10, 15, 16rep e M41 K emcomparação com M41-CK emanéistraqueaisisolados de traqueiasretiradas de pintos infectados (barras mostramsimulada, M41 R- nsp10,15rep1; M41-R nsp10,14,16rep4; M41-R nsp10,15,16rep8; M41-R nsp10,14,15rep10; M41-K6 e M41-CK EP4 da esquerda para a direita de cadaponto de tempo).
[0043] A Figura 9 mostra a cinética do crescimentoemcomparação com rIBVs M41 -CK emcélulas CK. Figura 9A mostraosresultados de M41 e M41-R -K. Fig 9B mostraosresultados para M41 -nspl 0 representante; M41-R nsp14, 15, 16 rep; M41 R-nsp10, 15 rep; M41 R-nsp10, 15, 16 rep; M41 R-nsp10, 14, 15 rep; e M41 R-nsp10, 14, 16.
[0044] A Figura 10 mostra a Posição de mutações de aminoácidosemmutado nsp10, nsp14, nsp15 e nsp16 sequências.
[0045] A Figura 11 - A) Snicking; B) Ossintomasrespiratórios (respiraçãoasmática e estertorescombinado) e C) atividadeciliar do rIBV M41 R-NSP 10,14 representante e rIBV M41 R-NSP 10,16 representantecomparação com M41 -CK (barras mostramsimulada, M41 R-nsp10, 14rep; M41 R- nsp10,16rep e M41 K da esquerda para a direita de cadaponto de tempo).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0046] A presenteinvençãoproporciona um coronavírus que compreende um gene da replicase variante que, quando expresso nacoronavírus, faz com que ovírustenhareduzidapatogenicidadeemcomparação com um coronavíruscorrespondente, que compreende o gene da replicase do tiposelvagem. CORONAVIRUS
[0047] Gammacoronavirus é um gênero de vírus animal pertencente à famíliaCoronaviridae. Oscoronavírussãovírus com envelope com um genoma de RNA de cadeia simples de sentidopositivo e umasimetria helicoidal.
[0048] O tamanhognômico de coronavírus varia de aproximadamente 27 a 32 quilobases, que é o tamanhomaislongo para qualquervírus de RNA conhecido.
[0049] Oscoronavírusinfectamprincipalmente o tratorespiratórioou gastrointestinal superior dos mamíferos e aves. Cinco a seis diferentesestirpesatualmenteconhecidas de coronavírusinfectamossereshumanos. O coronavírushumanomaisdivulgado, SARS-CoV, que causa a síndromerespiratóriaaguda grave (SARS), temumapatogêneseúnicoporqueelefaz com que ambos superior e infecções do tratorespiratório inferior e tambémpodecausargastroenterite. MédiocoronavírusSíndromeRespiratóriaLeste (MERS-CoV) tambémprovocaumainfecção do tratorespiratório inferior emsereshumanos. Oscoronavírussãoacreditados para causarumapercentagemsignificativa de todososresfriadoscomunsemadultoshumanos.
[0050] Oscoronavírustambémcausamumasérie de doençasemanimais de gado e animaisdomesticados, alguns dos quaispodem ser graves e sãoumaameaça para o sector agrícola. Oscoronavíruseconomicamentesignificativas de animais de gadoincluemvírus da bronquiteinfecciosa (IBV), que provocaprincipalmentedoençarespiratóriaemgalinhas e afetaseriamenteaindústriaavícolaemtodo o mundo; Coronavirus suíno (gastroenteritetransmissível, TGE) e bovina coronavírus, que tanto resultaremdiarreiaemanimaisjovens. Coronavírusfelinotemduasformas, coronavírusentéricofelino é um agentepatogênico de significadoclínicomenor, mas estamutaçãoespontânea de víruspoderesultaremperitoniteinfecciosafelina (PIF), umadoençaassociada com aelevada taxa de mortalidade.
[0051] Hátambémdoistipos de coronavíruscanino (CCoV), uma que causa doençaleve gastrointestinal e que temsidoencontrado para causardoençarespiratória. Ratovírus da hepatite (MHV) é um coronavírus que provocaumadoençamurinoepidemia com altamortalidade, principalmenteemcolônias de ratos de laboratório.
[0052] Oscoronavírussãodivididosemquatrogrupos, conformemostradoabaixo: Alfa • coronavíruscanino (Famílias) • Feline coronavírus (FeCoV) • Human coronavírus 229E (HCoV-229E) • vírus da diarreiaepidêmicaporcina (PEDV) • vírus da gastroenteritetransmissível (TGEV) • Coronavirus Humano NL63 (NL ou New Haven) Beta • Coronavírusbovino (BCoV) • coronavírusrespiratório Canine (CRCoV) - Comum no sudeste da Ásia e Micronesia • coronavírushumano OC43 (HCoV-OC43) • vírus da hepatite de ratos (MHV) vírushemaglutinanteencefalomielite de porcos (HEV) • coronavírus de Rato (VN). Coronavirus de ratos é bastanteprevalentenaAustrália Oriental, onde, a partir de Março / Abril de 2008, verificou-se entre as colônias de roedoresnativas e selvagens. • (Sem nomecomumcomo de ainda) (HCoV-HKU1)
[0053] Respiratóriaaguda grave síndrome de coronavírus (SARS-CoV) • Médio Oriente respiratóriasíndrome de coronavírus (MERS-CoV) Gama • vírus da bronquiteinfecciosa(IBV) • Turquiacoronavírus (Bluecombvírus da doença) coronavírusFaisãocoronavíruspintadas Delta
[0054] Bulbul coronavírus (Bucova)
[0055] Thrush coronavírus (ThCoV)
[0056] Munia coronavírus (MuCoV)
[0057] coronavirus suíno (carve) HKU15
[0058] O gene variante de replicase do coronavírus da presenteinvençãopode ser derivado de um alphacoronavirus, tais como TGEV; um betacoronavirus, tais como MHV; ou um gammacoronavirus, tais como VBI.
[0059] Tal comoaquiutilizado o termo "derivado de" significa que o gene da replicase compreendesubstancialmente a mesmasequência de nucleotídeos, talcomo o gene da replicase do tiposelvagem do coronavírusrelevante. Por exemplo, o gene da replicase variante da presenteinvençãopodeteraté 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de tiposelvagem replicase. O gene variante de coronavírus replicase codificaumaproteínacompreendendoumamutaçãoemumaoumais das proteínasnãoestruturais (nsp) -10, NSP-14, NSP- 15 ou NSP-16 quandocomparada com a sequência do tiposelvagem do não-estruturalproteína. IBV
[0060] Bronquiteinfecciosaaviária (IB) é umadoençarespiratóriaaguda e altamentecontagiosa das aves que provocaperdaseconômicassignificativas. A doença é caracterizadaporsinaisrespiratórios, incluindoofegante, tosse, espirros, estertorestraqueais, e corrimento nasal. Emfrangosjovens, podeocorrerinsuficiênciarespiratória grave. Emcamadas, dificuldadesrespiratórias, nefrite, diminuiçãonaprodução de ovos, e perda de qualidade interna dos ovos e qualidade da casca do ovosãocomuns.
[0061] Emfrangos de corte, tosse e sacudindosãosinaisclínicoscomuns, que se espalharapidamenteemtodas as aves do local. Morbidade é de 100% embandosnãovacinados. A mortalidade varia dependendo da idade, aestirpe de vírus e infecçõessecundárias, mas podem ser de até 60% embandosnãovacinados.
[0062] O primeirosorotipo IBV a ser identificadofoi Massachusetts, mas nos Estados Unidos váriossorotipos, incluindo Arkansas e Delaware, estãocirculando, além do tipo de Massachusetts originalmenteidentificado.
[0063] A cepa de IBV Beaudette foiobtida de acordo com pelomenos 150 passagensemembriões de galinha. IBV Beaudette não é maispatogénica para galinhaschocadas, mas matarapidamenteembriões.
[0064] H120 é umalinhagemcomercial de IBV atenuado Massachusetts vacinaserotipo vivo, atenuadoporaproximadamente 120 passagensemovos de galinhaembrionados. H52 é outravacina de Massachusetts, e representa um vírusanteriormente e ligeiramentemaispatogénicapassagem (passagem 52), durante o desenvolvimento de H120. As vacinasbaseadasem H120 são comumenteusados.
[0065] IB QX é um isolado de campo virulento de IBV. Àsvezes, é conhecidocomo "QX chinesa", como era originalmenteisoladonasequência de focos da doençanaregião de Qingdao na China emmeados de 1990. Desdeentão, o vírustem se arrastado para a Europa. A partir de 2004, as questões de produção de ovos graves foramidentificados com um vírusmuitosemelhanteempartes da Europa Ocidental, principalmente, na Holanda, mas tambémrelataram da Alemanha, França, Bélgica, Dinamarca e no Reino Unido.
[0066] O vírusisolado a partir dos casosholandesesfoiidentificadopelo Instituto de Pesquisa holandesaem Deventer comouma nova estirpe que eleschamaram D388. A ligaçãochinêsveio de novosensaios que mostraram que ovírusfoi de 99% semelhantes a vírus QX chinês. Aatenuada QX-like IBV estirpe da vacina viva foi agora desenvolvido.
[0067] IBV é um vírus com envelope que se replica no citoplasma da célula e que contémum,, o genoma de RNA de sentidopositivo de cadeia simples nãosegmentado. IBV tem um RNA genoma 27,6 kb e comotodososcoronavíruscontémosquatroproteínasestruturais; spike glicoproteína (S), a proteína de membranapequena (E), proteínaintegrante da membrana (M) e a proteína do nucleocapsídeo (N) que interage com o RNA genômico.
[0068] O genoma é organizado da seguintemaneira: 5 'UTR - os genes da polimerase (replicase) do gene da proteína-estruturais (SEMN) - UTR 3'; onde a UTR sãoregiõesnãotraduzidas (cada ~ 500 nucleotídeos de IBV).
[0069] O envelope lipídicocontémtrêsproteínas de membrana: S, M e E. O IBV S proteína é umaglicoproteína de tipo I que oligomeriza no retículoendoplasmático e é montadaemhomotrímeroinseridonamembrana virion através do domíniotransmembranar e estáassociadopormeio de não- covalenteinterações com a proteína M. Apósincorporaçãoempartículas de coronavírus, a proteína S é responsável pela ligaçãoao receptor da célulaalvo e a fusão das membranasvirals e celulares. A glicoproteína S consisteemquatrodomínios: umasequência de sinal que é clivadodurante a síntese; o ectodomínio, que estápresente no lado de fora da partícula de virion; a regiãotransmembranarresponsávelporancorar a proteína S nabicamadalipídica da partícula de virion; e a cauda citoplasmática.
[0070] Todos oscoronavírustambémcodificam um conjunto de genes de proteínasacessórias de funçãodesconhecida que nãosãonecessários para a replicação in vitro, mas podedesempenhar um papelnapatogênese. IBV codificadois genes acessórios, genes 3 e 5, que ambos expressamdoisacessóriosproteínas 3A, 3B e 5a, 5b, respectivamente.
[0071] O gene variante de replicase do coronavírus da presenteinvençãopode ser derivado de um IBV. Por exemplo, o IBV pode ser Beaudette do IBV, H120, H52, IB QX, D388 ou M41.
[0072] O IBV pode ser M41 do IBV. M41 é um serotipo Massachusetts prototípico que foiisoladonos EUA em 1941. É um isoladoutilizadoemmuitoslaboratórios de todo o mundocomoumamancha laboratorial patogênica e podem ser obtidas a partir de ATCC (VR-21 ™). variantesatenuadastambémsãoutilizadosporváriosfabricantes de vacinascomovacinas IBV contra sorotipos Massachusetts causandoproblemas no campo. Ospresentesinventoresescolheram usar estaestirpecomohaviamtrabalhadopormuitosanossobreestevírus, e porque a sequência do genoma do víruscompletoestádisponível. O M41 isolar, M41-CK, usadopelospresentesinventoresfoiadaptado para cresceremcélulas de rim de pintainhoprimário (CK) e, porconseguinte, foiconsideradofavorável para a recuperação de um vírusinfeccioso a partir de um cDNA dogenomacompleto. É representativo de um IBV patogénicas e, portanto, podem ser analisadas para mutações que causam a perdaoureduçãonapatogenicidade.
[0073] A sequência do genoma de IBV M41 -CK sãofornecidascomo SEQ ID NO: 1.
[0074] SEQ ID NO: 1 Sequência de IBV M41 -CK ACTTAAGATAGATATTAATATATATCTATCACACTAGCCTTGCGCTAGATTTCCAACTA ACAAAACGGACTTAAATACCTACAGCTGGTCCTCATAGGTGTTCCATTGCAGTGCACTT AGTGCCCTGGATGGCACCTGGCCACCTGTCAGGTTTTTGTTATTAAAATCTTATTGTTC TGGTATCACTGCTTGTTTTGCCGTGTCTCACTTTATACATCCGTTGCTTGGGCTACCTG TATCCAGCGTCCTACGGGCGCCGTGGCTGGTTCGAGTGCGAAGAACCTCTGGTTCATCA GCGGTAGGCGGGTGTGTGGAAGTAGCACTTCAGACGTACCGGTTCTGTTGTGTGAAATC GGGGTCACCTCCCCCCACATACCTCTAAGGGCTTTTGAGCCTAGCGTTGGGCTACGTTT CGCATAAGGTCGGCTATACGACGTTTGTAGGGGGTAGTGCCAAACAACCCCTGAGGTGC AGGTTCTGGTGGTGTTTAGTGAGCAGACATACAATAGACAGTGACAACATGGCTTCAAC CTAAAACAGGGAGTATCTCCCAAACTAAGGGATGTCATTCTTGTATCCAAAGACATTCT GAACAACTTTGTGACGCTTTGTTTTTCTATACGTCACACAACCCTAAGGATTACGCTGT GCTTTTGCAGTTAGGCAGAAGTTTGATCGTAATCTGCAGACTGGGAAACAGTTCAAATT GAAACTGTGTGTGGTCTCTTCCTCTTGAAGGGAGTTGACAAAATAACACCTGGCGTCCA GCAAAAGTCTTAAAAGCCACTTCTAAGTTGGCAGATTTAGAAGACATCTTTGGTGTCTT CCCTTTGCAAGAAAATATCGTGAACTTTTGAAGACAGCATGCCAGTGGTCTCTTACTGA GAAACACTGGATGCTCGTGCACAAACTCTTGATGAAATTTTTGACCCTACTGAAATACT TGGCTTCAGGTGGCAGCAAAAATCCAAGTTTCGGCTATGGCGATGCGCAGGCTTGTTGA GAAGTAACTGCAAAAGTCATGGATGCTTTGGGCTCAAATATGAGTGCTCTTTTCCAGAT TTTAAACAACAAATAGTCAGAATTTTTCAAAAAGCGCTGGCTATTTTTGAGAATGTGAT GAATTACCACAGCGTATTGCAGCACTTAAGATGGCTTTTGCTAAGTGTGCCAAGTCCAT ACTGTTGTGGTTATGGAGAGGACTCTAGTTGTTAGAGAGTTCGCAGGAACTTGTCTTGA AGCATTAATGGTGCTGTTGCAAAATTCTTTGAAGAACTCCCAAATGGTTTCATGGGTGT AAAATTTTCACTACACTTGCCTTCTTTAGGGAGGCTGCAGTGAAAATTGTGGATAACAA CCAAATGCACCGAGAGGCACTAAAGGGTTTGAAGTCGTTGGTAATGCCAAAGGTACACA GTTGTTGTGCGTGGCATGCGAAATGACTTAACACTGCTTGACCAAAAAGCTGAAATTCT GTGGAGTCAGAAGGTTGGTCTGCAATTTTGGGTGGACATCTTTGCTATGTCTTTAAGAT GGTGATCGCTTTTACGCGGCACCTCTTTCAGGAAATTTTGCATTGCATGATGTGCATTT TGTGAGCGTGTTGTCTGTCTTTCTGATGGTGTAACACCGGAGATAAATGATGGACTTAT CTTGCAGCAATCTACTCTTCTTTTAGTGTCGCAGAACTTGTGGCAGCCATTAAAAGGGT GAACCATTTAAGTTTCTGGGTCATAAATTTGTGTATGCAAAGGATGCAGCAGTTTCTTT ACATTAGCGAAGGCTGCTACTATTGCAGATGTTTTGAAGCTGTTTCAATCAGCGCGTGG AAAGTAGAAGATGTTTGGTCTTCACTTACTGAAAAGTCTTTTGAATTCTGGAGGCTTGA TATGGAAAAGTGCGTAATCTCGAAGAATTTGTTAAGACTTGTTTTTGTAAGGCTCAAAG GCGATTGTGATTTTAGCGACAGTGCTTGGAGAGGGCATTTGGCATCTTGTTTCGCAAGC ATCTATAAAGTAGGTGGTCTTTTTACTAAAGTTGTTGACTTTTGTGAAAAATATTGGAA GGTTTTTGTGCACAGTTGAAAAGAGCTAAGCTCATTGTCACTGAAACCCTCTGTGTTTG AAAGGAGTTGCACAGCATTGTTTTCAACTATTGCTGGATGCAATACAGTTTATGTATAA AGTTTTAAGAAGTGTGCACTTGGTAGAATCCATGGAGACTTGCTCTTCTGGAAAGGAGT GTGCACAAAATTATTCAAGAGGGCGATGAAATTTGGTTTGACGCCATTGATAGTATTGT GTTGAAGATCTGGGTGTTGTTCAAGAAAAATTGATTGATTTTGATGTTTGTGATAATGG ACACTTCCAGAGAACCAACCCGGTCATATGGTTCAAATCGAGGATGACGGAAAGAACTC ATGTTCTTCCGCTTCAAAAAGGATGAGAACATTTATTATACACCAATGTCACAGCTTGT GCTATTAATGTGGTTTGCAAAGCAGGCGGTAAAACTGTCACCTTTGGAGAAACTACTGG CAAGAAATACCACCACCTGATGTTGTGTTTATTAAGGTTAGCATTGAGTGTTGTGGTGA CCATGGAATACAATCTTCAAAAAGGCTTATAAGGAGCCCATTGAAGTAGAGACAGACCC ACAGTTGAACAATTGCTCTCTGTGGTCTATGAGAAAATGTGTGATGATCTCAAGCTGTT CCGGAGGCTCCAGAACCACCACCATTTGAGAATGTCACACTTGTTGATAAGAATGGTAA GATTTGGATTGCATAAAATCATGCCATCTGATCTATCGTGATTATGAGAGCGATGATGC ATCGAGGAAGAAGATGCAGAAGAATGTGACACGGATTCAGGTGATGCTGAGGAGTGTGC ACTAATTCAGAATGTGAAGAAGAAGATGAGGATACTAAAGTGTTGGCTCTTATACAAGC CCGGCAAGTAACAAATATCCTCTGCCTCTTGATGATGATTATAGCGTCTACAATGGATT ATTGTTCATAAGGACGCTCTCGATGTTGTGAATTTACCATCTGGTGAAGAAACCTTTTG TCAATAACTGCTTTGAAGGGGCTGTTAAAGCTCTTCCGCAGAAAGTTATTGATGTTCAG GTGACTGGGGTGAGGCTGTTGATGCGCAAGAACAATTGTGTCAACAAGAATCAACTCGG GTCATATCTGAGAAATCAGTTGAGGGTTTTACTGGTAGTTGTGATGCAATGGCTGAACA GCTATTGTTGAAGAGCAGGAAATAGTACCTGTTGTTGAACAAAGTCAGGATGTAGTTGT TTTACACCTGCAGACCTAGAAGTTGTTAAAGAAACAGCAGAAGAGGTTGATGAGTTTAT CTCATTTCTGCTGTCCCTAAAGAAGAAGTTGTGTCTCAGGAGAAAGAGGAGCCACAGGT GAGCAAGAGCCTACCCTAGTTGTTAAAGCACAACGTGAGAAGAAGGCTAAAAAGTTCAA GTTAAACCAGCTACATGTGAAAAACCCAAATTTTTGGAGTACAAAACATGTGTGGGTGT TTGGCTGTTGTAATTGCCAAAGCATTGGATGAGTTTAAAGAGTTCTGCATTGTAAACGT GCAAATGAGCACATGTCGCATGGTGGTGGCGTTGCAAAGGCAATTGCAGACTTTTGTGA CCGGACTTTGTTGAATATTGCGCGGACTATGTTAAGAAACATGGTCCACAGCAAAAACT 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TGTGGTCATTTAACCCAGAATCTAATGCCGTAGGTTCAATACTCCTAACTAATGGTCAA CAATGTAATTTTGCTATAGAGAGTGTGCCAATGGTGCTTTCTCCAATTATAAAGAATGG TGTTCTTTATTGTGAGGGTCAGTGGCTTGCTAAGTGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAG ATATATTTGTTTGTACACCGGATAGACGTAATATCTACCGTATGGTGCAGAAATATACG GTGACCAAAGCGGAAATAAGAAACGGTTTGCTACGTTTGTCTATGCAAAGCAGTCAGTA GATACTGGCGAGCTAGAAAGTGTAGCAACAGGAGGGAGTAGTCTTTACACCTAAATGTG TGTGTGTAGAGAGTATTTAAAATTATTCTTTAATAGTGCCTCTATTTTAAGAGCGCATA ATAGTATTATTTTTGAGGATATTAATATAAATCCTCTCTGTTTTATACTCTCTTTTCAA GAGCTATTATTTAAAAAACAGTTTTTCCACTCTTTTGTGCCAAAAACTATTGTTGTTAA TGGTGTAACCTTTCAAGTAGATAATGGAAAAGTCTACTACGAAGGAAAACCAATTTTTA GAAAGGTTGTTGTAGGTTGTGGTTGAGTTATAAAAAAGATTAAACTACCTACTACACTT ATTTTTATAAGAGGCGTTTTATCTTACAAGCGCTTAATAAATACGGACGATGAAATGGC TGACTAGTTTTGTAAGGGCAGTTATTTCATGTTATAAACCCCTATTATTAACTCAATTA AGAGTATTAGATAGGTTAATCTTAGATCATGGACCAAAACACATCTTAACGTGTGTTAG GTGCGTGATTTTGTTTCAATTAGATTTAGTTTATAGGTTGGCGTATACGCCTACTCAAT CGCTGGTATGAATAATAGTAAAGATAATCCTTTTTGCGGAGCAATAGCAAGAAAAGCGC GAATTTATCTGAGAGAAGGATTAGATTGTGTTTACTTTCTTAACAAAGCAGGACAAGCG AGTCTTGTCCCGCGTGTACCTCTCTAGTATTCCAGGGGAAAACTTGTGAGGAACACAAA TATAATAATAATCTTTTGTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGGAAAGACAGATGCCCCA GCTCCAGTCATCAAACTAGGAGGACCAAAGCCACCTAAAGTTGGTTCTTCTGGAAATGA TCTTGGTTTCAAGCAATAAAAGCCAAGAAGTTAAATTCACCTCCGCCTAAGTTTGAAGG TAGCGGTGTTCCTGATAATGAAAATCTAAAACCAAGTCAGCAGCATGGATATTGGAGAC GCCAAGCTAGGTTTAAGCCAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAGATGCTTGGTAT TTTTACTATACTGGAACAGGACCAGCCGCTAACCTGAATTGGGGTGATAGCCAAGATGG TATAGTGTGGGTTGCTGGTAAGGGTGCTGATACTAAATTTAGATCTAATCAGGGTACTC GTGACTCTGACAAGTTTGACCAATATCCGCTACGGTTTTCAGACGGAGGACCTGATGGT AATTTCCGTTGGGATTTCATTCCTCTGAATCGTGGCAGGAGTGGGAGATCAACAGCAGC TTCATCAGCAGCATCTAGTAGAGCACCATCACGTGAAGTTTCGCGTGGTCGCAGGAGTG GTTCTGAAGATGATCTTATTGCTCGTGCAGCAAGGATAATTCAGGATCAGCAGAAGAAG GGTTCTCGCATTACAAAGGCTAAGGCTGATGAAATGGCTCACCGCCGGTATTGCAAGCG CACTATTCCACCTAATTATAAGGTTGATCAAGTGTTTGGTCCCCGTACTAAAGGTAAGG AGGGAAATTTTGGTGATGACAAGATGAATGAGGAAGGTATTAAGGATGGGCGCGTTACG CAATGCTCAACCTAGTTCCTAGCAGCCATGCTTGTCTTTTCGGAAGTAGAGTGACGCCC AGACTTCAACCAGATGGGCTGCACTTGAAATTTGAATTTACTACTGTGGTCCCACGTGA TGATCCGCAGTTTGATAATTATGTAAAAATTTGTGATCAGTGTGTTGATGGTGTAGGAA CACGTCCAAAAGATGATGAACCAAGACCAAGTCACGCTCAAGTTCAAGACCTGCAACAA GAGGAAATTCTCCAGCGCCAAGACAGCAGCCCCTAAGAAGGAGAAAAAGCCAAAGAAGC AGGATGATGAAGTGGATAAAGCATTGACCTCAGATGAGGAGAGGAACAATGCACAGCTG GAATTTGATGATGAACCCAAGGTAATTAACTGGGGGGATTCAGCCCTAGGAGAGAATGA ACTTTGAGTAAAATTCAATAGTAAGAGTTAAGGAAGATAGGCATGTAGCTTGATTACCT ACATGTCTATCGCCAGGGAAATGTCTAATTTGTCTACTTAGTAGCCTGGAAACGAACGG TAGACCCTTAGATTTTAATTTAGTTTAATTTTTAGTTTAGTTTAAGTTAGTTTAGAGTA GGTATAAAGATGCCAGTGCCGGGGCCACGCGGAGTACGACCGAGGGTACAGCACTAGGA CGCCCATTAGGGGAAGAGCTAAATTTTAGTTTAAGTTAAGTTTAATTGGCTATGTATAG TTAAAATTTATAGGCTAGTATAGAGTTAGAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA REPLICASE
[0075] Para além dos genes estruturais e acessórios, doisterços de um genoma de coronavíruscompreende o gene da replicase (naextremidade 5' do genoma), que é expressacomoduaspoliproteínas, PPLA e ppl AB, em que pplab é um produto de extensão de PPLA como um resultado de um mecanismo de mudança -1 ribossomal. Osdoispoliproteínassãoclivadospordoistipos de proteases codificadasporvírusgeralmenteresultandoem 16 proteínasnão-estruturais (NSP1 -16); IBV carece NSP1 codificandoassim Nsp2-16.
[0076] Assim, o gene 1 em IBV codifica 15 (16 em outros coronavírus) proteínasnão-estruturais (nsp2-16), que estãoassociados com a replicação e transcrição de RNA.
[0077] O termo 'proteína replicase "é aquiutilizado para se referir a uma e a ppl poliproteínaspplabousubunidades NSP individuais.
[0078] O termo "gene da replicase" é aquiutilizado para se referir a umasequência de ácidonucleico que codifica para as proteínas de replicase.
[0079] Um resumo das funções das proteínasnsp do coronavírus é fornecidanaTabela 1. Tabela 1
Figure img0001
Figure img0002
[0080] A variante do gene da replicase codificadapelocoronavírus da presenteinvençãocompreendeumamutaçãoemumaoumais das secções de sequência que codifica nsp-10, nsp-14, nsp-15 ou nsp-16.
[0081] Nsp10 tematividade de ligaçãoa RNA e pareceestarenvolvidoeminterações homo e / ouheterotípicasdentro de outros PTS da região de pp1a / pplab. Adotauma dobra α / β composta de cinco a-hélices, um 310-hélice e três beta-fios. Dois locais de ligaçãoaozincoforamidentificados que sãoformadosporresíduos de cisteínaconservados e um resíduo de histidina (Cys-74 / Cis-77 / A-83 / Cis-90; Cis-117 / Cis-120 / Cis-128 / Cys- 130). A proteínafoiconfirmada para se ligarem RNA de cadeia simples e de cadeiadupla e DNA semespecificidadeóbvia. NSP-10 pode ser reticulado com NSP-9, sugerindo que o vigor de uma rede complexa de interaçõesproteína- proteínaenvolvendo NSP-7, -8, -9 e -10. Alémdisso, NSP-10 é conhecidoporinteragir com NSP-14 e NSP-16.
[0082] nsp-14 compreende um domínioativo exoribonuclease 3'-para-5' (éxon) naregião do terminal amino. SARS-CoVéxontemsidodemonstradoteratividade exoribonuclease de metal dependente de íons de 3'-para-5' que atua em ambos os RNA de cadeia simples e de cadeiadupla, mas não no DNA. NSP-14 temsidodemonstradoteratividade à prova de leitura. Este NSP tambémtemsidodemonstrado que possuemumaatividade N7-metiltransferase (MT) naregião do terminal carboxila.
[0083] nsp-15 associadaNendoU (endorribonucleasenidoviral, específicopara L) atividade de RNAasefoiavaliado para um número de coronavírus, incluindo SARS-CoV, MHV e IBV. As atividadesforamconsistentementerelatado para ser significativamentemelhoradapor Mn2 + e iõeshouvepoucaatividadenapresença de Mg2 + e Ca2 +. NendoUcliva no lado 3 'de resíduosem ambos uridilato de RNA de cadeia simples e de cadeiadupla. O substratobiologicamenterelevante (s) de coronavírusNendoUs continua a ser identificado.
[0084] nsp-16 foiprevisto para mediaraatividade de ribose-2'-0-metiltransferase (2'-0-MTase) e inverter- genéticaexperiênciastêmdemonstrado que odomínio de 2'- 0-MTase é essencial para a síntese de RNA viral emHCoV- 229E e SARS-CoV. Aenzimapodeestarenvolvidanaprodução da tampa 1 estruturas de RNA de coronavírus e podetambémcooperar com NendoUéxon e emoutras vias de processamento de RNA. 2'-0-MTase tambémpodemetilato RNAs específicos para protegê-los da clivagemNendoUmediada.
[0085] As sequênciasgenômicas e proteínas para nsp-10, nsp-14, nsp-15 e nsp-16 sãofornecidascomo SEQ ID NO: 2 - 5 e 6 - 9, respectivamente. SEQ ID NO: 2 (sequêncianucleotídica nsp-10- nucleotídeos 1884-12318 de SEQ ID NO: 1) TCTAAAGGTCATGAGACAGAGGAAGTGGATGCTGTAGGCATTCTCTCACTTTGTTCTTT TGCAGTAGATCCTGCGGATACATATTGTAAATATGTGGCAGCAGGTAATCAACCTTTAG GTAACTGTGTTAAAATGTTGACAGTACATAATGGTAGTGGTTTTGCAATAACATCAAAG CCAAGTCCAACTCCGGATCAGGATTCTTATGGAGGAGCTTCTGTGTGTCTTTATTGTAG AGCACATATAGCACACCTTGGCGGAGCAGGAAATTTAGATGGACGCTGTCAATTTAAAG GTTCTTTTGTGCAAATACCTACTACGGAGAAAGATCCTGTTGGATTCTGTCTACGTAAA AGGTTTGCACTGTTTGTCAGTGTTGGATTGGTTATGGATGTCAGTGTGATTCACTTAGA CAACCTAAACCTTCTGTTCAG
[0086] SEQ ID NO: 3 (sequência de nucleotídeosnsp- 14 - nucleotídeos 16938-18500 de SEQ ID NO: 1) GGTACAGGCTTGTTTAAAATTTGCAACAAAGAGTTTAGTGGTGTTCACCCAGCTTATGC AGTCACAACTAAGGCTCTTGCTGCAACTTATAAAGTTAATGATGAACTTGCTGCACTTG TTAACGTGGAAGCTGGTTCAGAAATAACATATAAACATCTTATTTCTTTGTTAGGGTTT AAGATGAGTGTTAATGTTGAAGGCTGCCACAACATGTTTATAACACGTGATGAGGCTAT CCGCAACGTAAGAGGTTGGGTAGGTTTTGATGTAGAAGCAACACATGCTTGCGGTACTA ACATTGGTACTAACCTGCCTTTCCAAGTAGGTTTCTCTACTGGTGCAGACTTTGTAGTT ACGCCTGAGGGACTTGTAGATACTTCAATAGGCAATAATTTTGAGCCTGTGAATTCTAA AGCACCTCCAGGTGAACAATTTAATCACTTGAGAGCGTTATTCAAAAGTGCTAAACCTT GGCATGTTGTAAGGCCAAGGATTGTGCAAATGTTAGCGGATAACCTGTGCAACGTTTCA GATTGTGTAGTGTTTGTCACGTGGTGTCATGGCCTAGAACTAACCACTTTGCGCTATTT TGTTAAAATAGGCAAGGACCAAGTTTGTTCTTGCGGTTCTAGAGCAACAACTTTTAATT CTCATACTCAGGCTTATGCTTGTTGGAAGCATTGCTTGGGTTTTGATTTTGTTTATAAT CCACTCTTAGTGGATATTCAACAGTGGGGTTATTCTGGTAACCTACAATTTAACCATGA TTTGCATTGTAATGTGCATGGACACGCACATGTAGCTTCTGCGGATGCTATTATGACGC GTTGTCTTGCAATTAATAATGCATTTTGTCAAGATGTCAACTGGGATTTAACTTACCCT CATATAGCAAATGAGGATGAAGTCAATTCTAGCTGTAGATATTTACAACGCATGTATCT TAATGCATGTGTTGATGCTCTTAAAGTTAACGTTGTCTATGATATAGGCAACCCTAAAG GTATTAAATGTGTTAGACGTGGAGACTTAAATTTTAGATTCTATGATAAGAATCCAATA GTACCCAATGTCAAGCAGTTTGAGTATGACTATAATCAGCACAAAGATAAGTTTGCTGA TGGTCTTTGTATGTTTTGGAATTGTAATGTGGATTGTTATCCCGACAATTCCTTACTTT GTAGGTACGACACACGAAATTTGAGTGTGTTTAACCTACCTGGTTGTAATGGTGGTAGC TTGTATGTTAACAAGCATGCATTCCACACACCTAAATTTGATCGCACTAGCTTTCGTAA TTTGAAAGCTATGCCATTCTTTTTCTATGACTCATCGCCTTGCGAGACCATTCAATTGG ATGGAGTTGCGCAAGACCTTGTGTCATTAGCTACGAAAGATTGTATCACAAAATGCAAC ATAGGCGGTGCTGTTTGTAAAAAGCACGCACAAATGTATGCAGATTTTGTGACTTCTTT AATGCAGCTGTTACTGCTGGTTTTACTTTTTGGGTTACTAATAATTTTAACCCATATAT TTGTGGAAAAGTTTTTCAGCTCTCCAG
[0087] SEQ ID NO: 4 (sequência de nucleotídeosnsp- 15 - nucleotídeos 18501-19514 de SEQ ID NO: 1) TCTATCGACAATATTGCTTATAATATGTATAAGGGTGGTCATTATGATGCTATTGCAGG AGAAATGCCCACTATCGTAACTGGAGATAAAGTTTTTGTTATAGATCAAGGCGTAGAAA AAGCAGTTTTTTTTAATCAAACAATTCTGCCTACATCTGTAGCGTTTGAGCTGTATGCG AAGAGAAATATTCGCACACTGCCAAACAACCGTATTTTGAAAGGTTTGGGTGTAGATGT GACTAATGGATTTGTAATTTGGGATTACACGAACCAAACACCACTATACCGTAATACTG TTAAGGTATGTGCATATACAGACATAGAACCAAATGGCCTAATAGTGCTGTATGATGAT AGATATGGTGATTACCAGTCTTTTCTAGCTGCTGATAATGCTGTTTTAGTTTCTACACA GTGTTACAAGCGGTATTCGTATGTAGAAATACCGTCAAACCTGCTTGTTCAGAACGGTA TTCCGTTAAAAGATGGAGCGAACCTGTATGTTTATAAGCGTGTTAATGTGCGTTTGTTA CGCTACCTAACACAATAAACACACAGGGTCGAAGTTATGAAACTTTTGACCTCGTAGTG ATGTTGAGCGTGATTTTCTCGACATGTCTGAGGAGAGTTTTGTAGAAAGTATGGTAAAG AATTAGGTCTACAGCACATACTGTATGGTGAAGTTGATAAGCCCCAATAGGTGGTTTCC ACACTGTTATAGGTATGTGCAGACTTTTACGTGCGAATAAGTTGAACGCAAAGTCTGTT ACTAATTCTGATTCTGATGTCATGCAAAATTATTTTGTATTGGCAGACAATGGTTCCTC AAGCAAGTGTGTACTGTTGTGGATTTGCTGCTTGATGATTTCTTAGAACTTCTTAGGAC ATACTGAAAGAGTATGGTACTAATAAGTCTAAAGTTGTAACAGTGTCAATTGATTACCA TAGCATAAATTTTATGACTTGGTTTGAAGATGGCATTATTAAAACATGTTATCCACAGC TTCAA
[0088] SEQ ID NO: 5 (sequência de nucleotídeosnsp- 16 - nucleotídeos 19515-20423 de SEQ ID NO: 1) TCAGCATGGACGTGTGGTTATAATATGCCTGAACTTTATAAAGTTCAGAATTGTGTTAT GGAACCTTGCAACATTCCTAATTATGGTGTTGGAATAGCGTTGCCAAGTGGTATTATGA TGAATGTGGCAAAGTATACACAACTCTGTCAATACCTTTCGAAAACAACAATGTGTGTA CCGCATAATATGCGAGTAATGCATTTTGGAGCTGGAAGTGACAAAGGAGTGGTGCCAGG TAGTACTGTTCTTAAACAATGGCTCCCAGAAGGGACACTCCTTGTCGATAATGATATTG TAGACTATGTGTCTGATGCACATGTTTCTGTGCTTTCAGATTGCAATAAATATAAGACA GAGCACAAGTTTGATCTTGTGATATCTGATATGTATACAGACAATGATTCAAAAAGAAG CATGAAGGCGTGATAGCCAATAATGGCAATGATGACGTTTTCATATATCTCTCAAGTTT TCTTCGTAATAATTTGGCTCTAGGTGGTAGTTTTGCTGTAAAAGTGACAGAGACAAGTT GGCACGAAGTTTTATATGACATTGCACAGGATTGTGCATGGTGGACAATGTTTTGTACG CAGTGAATGCCTCTTCTTCAGAAGCATTCTTGATTGGTGTTAATTATTTGGGTGCAAGG AAAAGGTTAAGGTTAGTGGAAAAACGCTGCACGCAAATTATATATTTTGGAGGAATTGT AATTATTTACAAACCTCTGCTTATAGTATATTTGACGTTGCTAAGTTTGATTTGAGATT GAAAGCAACGCCAGTTGTTAATTTGAAAACTGAACAAAAGACAGACTTAGTCTTTAATT TAATTAAGTGTGGTAAGTTACTGGTAAGAGATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGAC TCTTTTGTGTGTACTATGTAG
[0089] SEQ ID NO: 6 (sequência de aminoácidonsp- 10) SKGHETEEVDAVGILSLCSFAVDPADTYCKYVAAGNQPLGNCVKMLTVHNGSGFAITSK PSPTPDQDSYGGASVCLYCRAHIAHPGGAGNLDGRCQFKGSFVQIPTTEKDPVGFCLRN KVCTVCQCWIGYGCQCDSLRQPKPSVQ
[0090] SEQ ID NO: 7 (sequência de aminoácidonsp- 14) GTGLFKICNKEFSGVHPAYAVTTKALAATYKVNDELAALVNVEAGSETIYKHLISLLGF KMSVNVEGCHNMFITRDEAIRNVRGWVGFDVEATHACGTNIGTNLPFQVGFSTGADFWT PEGLVDTSIGNNFEPVNSKAPPGEQFNHLRALFKSAKPWHWRPRIVQMLDNALCNVSDC WFVTWCHGLELTTLRYFVKIGKDQVCSCGSRATTFNSHTQAYACWKHCLGFDFVYNPLL VDIQQWGYSGNLQFNHDLHCNVHGHAHVASADAIMTRCLAINNAFCQDVNWDLTYPHIA NEDEVNSSCRYLQRMYLNACVDALKVNVVYDIGNPKGIKCVRRGDLNFRFYDKNPIVPN VKQFEYDYNQHKDKFADGLCMFWNCNVDCYPDNSLVCRYDTRNLSVFNLPGCNGGSLYV NKHAFHTPKFDRTSFRNLKAMPFFFYDSSPCETIQLDGVAQDLVSLATKDCTIKCNIGG AVCKKHAQMYADFVTSYNAAVTAGFTFWVTNNFNPYNLWKSFSALQ
[0091] SEQ ID NO: 8 (sequência de aminoácidonsp- 15) SIDNIAYNMYKGGHYDAIAGEMPTIVTGDECVFVIDQGVEKAVFFNQTILPTSVAFELY AKRNIRTLPNNRILKGLGVDVTNGFVIWDYTNQTPLYRNTVKVCAYTDIEPNGLIVLYD DRYGDYQSFLADNAAVLVSTQCYKRYSYVEIPSNLLVQNGIPLKDGANLYVYKRVNGAF VTLPNTLNTQGRSYETFEPRSDVERDFLDMSEESFVEKYGKELGLQHILYGEVDKPQLG GLHTVIGMCRLLRANKLNAKSVTNSDSDVMQNYFVLDNAGSYKQVCTWDLLLDDFLELL RNILKEYGTNKSKVVTVSIDYHSINFMTWFEDGIIKTCYPQLQ
[0092] SEQ ID NO: 9 (sequência de aminoácidonsp- 16) SAWTCGYNMPELYKVQNCVMEPCNIPNYGVGIALPSGIMMNVAKYTQLCQYLSKTTMCV PHNMRVMHFGAGSDKGVAPGSTVLKQWLPEGTLLVDNDIVDYVSDAHVSVLSDCNKYKT EHKFDLVISDMYTDNDSKRKHEGVIANNGNDDVFIYLSSFLRNNLALGGSFAViCVTET SWHEVLYDIAQDCAWWTMFCTAVNASSSEAFLVGVNYLGASEKVKVSGKTLHANYIFWN CNYLQTSAYSIFDVAKFDLRLKATPWNLKTEQKTDLVFNLIKCGKLLVRDVGNTSFTDS FVCTM
PATOGENICIDADE REDUZIDA
[0093] O coronavírus vivo, atenuado da presenteinvençãocompreende um gene da replicase variante que faz com que ovírustenhareduzidapatogenicidadeemcomparação com um coronavírus que expressa o gene de tiposelvagemcorrespondente.
[0094] O termo "atenuado" talcomoaquiutilizado, refere-se a um vírus que apresenta a referidareduzidapatogenicidade e podem ser classificadascomonão- virulenta. O, vírus vivo atenuado é um vírus de replicaçãoenfraquecidaaindacapaz de estimularumarespostaimune e a produção de imunidade, mas que não causa a doença real.
[0095] O termo "patogenicidade" é aquiutilizado de acordo com o seusignificado normal, referir-se aopotencial do vírus para causardoençaem um indivíduo. Tipicamente, a patogenicidade de um coronavírus é determinadaatravés do ensaio de doençaassociadossintomas, porexemplo, espirros, snicking e redução da atividadeciliartraqueal.
[0096] O termo "patogenicidadereduzida" é usado para descrever que onível de patogenicidade de um coronavírus é diminuída, rebaixadaoudiminuídaemcomparação com um correspondente, de tiposelvagemcoronavírus.
[0097] Emumaconcretização, o coronavírus da presenteinvençãotemumapatogenicidadereduzidaemcomparação com o vírus M41-CK parental a partir do qual foiderivadoou um coronavíruscontrolo. Oscoronavírus de controlopodem ser um coronavírus com umapatogenicidadeconhecida, porexemplo, um coronavirus replicase expressa a proteína de tiposelvagem.
[0098] A patogenicidade de um coronavíruspode ser avaliadautilizandométodosbemconhecidosnaarte. Tipicamente, a patogenicidade é avaliadaanalisandoossintomasclínicosem um sujeitodesafiados com o vírus, porexemplo, umagalinha.
[0099] Como ilustração, a galinhapode ser contestadaem 8-24 dias de idadepor nasal ouinoculação ocular. Ossintomasclínicosassociados com infecção, IBV, podem ser avaliadas 3-10 diaspós-infecção. Ossintomasclínicoscomumenteavaliado para determinar a patogenicidade de um coronavírus, porexemplo, um IBV, incluemofegar, tossir, espirrar, snicking, depressão, penasenrugadas e perda de atividadeciliartraqueal.
[00100] A replicase variante da presenteinvenção, quandoexpressaem um coronavírus, podemcausarumaredução do nível dos sintomasclínicosemcomparação com um coronavírus que expressauma replicase do tiposelvagem.
[00101] Por exemplo, um coronavírusexpressando a replicase variantepodecausar um número de snicks poraveporminuto, que é menos do que 90%, menos do que 80%, menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos de 20% oumenos do que 10% do número de snicks causadaspor um vírus que expressam o tiposelvagem replicase.
[00102] Um coronavírusexpressandouma replicase variante de acordo com a presenteinvençãopodemcausarsibilosemmenos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos de 20% oumenos do que 10% de o número de avesem um rebanhoinfectado com o vírusexpressando o tipo replicase selvagem.
[00103] Um coronavírusexpressandouma replicase variante de acordo com a presenteinvençãopoderesultarematividadeciliartraqueal que é pelomenos 60%, pelomenos 70%, pelomenos 80%, pelomenos 90% oupelomenos 95% do nível de atividadeciliartraquealemavesnãoinfectadas.
[00104] Um coronavirus replicase expressaumavariante de acordo com a presenteinvençãopodefazer com que ossintomasclínicos, talcomodefinidonaTabela 2, a um nívelmaisbaixo do que um coronavírus que expressam o tiposelvagemreplicase.
Figure img0003
[00105] A replicase variante da presenteinvenção, quandoexpressaem um coronavírus, podemfazer com que ovírus se replica emníveisnão-patogênicos in ovo.
[00106] Durante o desenvolvimento de vacinas para ser administrada in ovoaembriões de galinha, deve ser dada atenção a doispontos: o efeito dos anticorposmaternossobre as vacinas e o efeito das vacinas no embrião. Osanticorposmaternossãoconhecidosporinterferir com aimunizaçãoativa. Por exemplo, as vacinas com estirpes fracas nãoinduzirníveis de anticorposprotetores, quandoadministradas a frangos de corte com anticorposmaternoscomoestasestirpessãoneutralizados pela associaçãoanticorposmaternos.
[00107] Assim, umapartícula viral deve ser suficientementeeficientesnareplicação de propagação e para garantir que elenão é neutralizadopelosanticorposmaternosderivadas contra o vírus. Osanticorposmaternosderivadossãouma piscina finito de anticorposeficazes, que diminuem com aidade do frango e neutralização do vírus dessa maneiranão equivale aoestabelecimento da imunidade de longoprazo para o embrião / pinto. A fim de desenvolveraimunidade a longoprazo contra o vírus, o embrião de galinhachocados e devedesenvolverumarespostaimuneprotetoraadequada, que é distinta para o efeito dos anticorposmaternos-derivados.
[00108] Para ser útil para a vacinação in ovo, o vírusdevetambémnãoreplicar e propagara um nível que faz com que sejapatogênico para o embrião.
[00109] A patogenicidadereduzidaemtermos de o embriãopodesignificar que ocoronavírus causa umamenorreduçãona taxa de eclosão de comparação, um controle de coronavírus de tiposelvagemcorrespondente. Assim, o termo "semserempatogênicas para o embrião” no contexto da presenteinvençãopodesignificar "semcausareclosãoreduzida", quandocomparado com um controlocoronavírus.
[00110] Uma variante da replicase adequadapode ser identificadautilizandométodos que sãoconhecidos no estado da técnica. Por exemplo, experiências de desafiocomparativosseguintesnavacinação in ovo de embriões com ousemanticorposmaternos-derivadospode ser executada (ouseja, em que a camadatemounãotemsidovacinados contra IBV).
[00111] Se a replicase variantepermite que ovírus se propagara um nível que é demasiadoelevado, o embriãonãochocaráounãoseráviávelincubaçãoseguinte (isto é, o vírus é patogênico para o embrião). Um vírus que é patogênico para o embriãopodematar o embrião.
[00112] Se a variante da replicase provocaumareduçãonareplicação viral e propagação, que é muitogrande, o vírusseráneutralizadopelosanticorposmaternos-derivados. desafiosubsequente do pintinho com IBV, portanto, resultar no desenvolvimento de sintomasclínicos (porexemplo, pieira, snicking, perda de atividadeciliar) e o aparecimento da doençanapintainhodesafiado; umavez que iránãoconseguiramdesenvolverumaimunidadeeficaz contra o vírus. VARIANTE
[00113] Tal comoaquiutilizado, o termo "variante" é sinónimo de "mutante" e refere-se a um ácidoousequência de amino ácidonucleico que difereemcomparação com a correspondentesequência de tiposelvagem.
[00114] Uma sequênciavariante / mutantepodesurgirnaturalmente, oupode ser criadaartificialmente (porexemplo, pormutagênesedirigidaao local). O mutantepodeterpelomenos 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com a partecorrespondente da sequência de tiposelvagem. O mutantepodetermenos de 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 mutação (s) através da porçãocorrespondente da sequência de tiposelvagem.
[00115] O termo "tiposelvagem" é usado para significar um gene ouproteínapossuindoumasequência de ácidonucleotídeoou amino, o qual é idênticoao gene nativoouproteína, respectivamente (isto é, o gene ouproteína viral).
[00116] As comparações de identidadepode ser realizadoporolho, oumaisgeralmente, com aajuda de programas de comparação de sequênciasfacilmentedisponível. Estes programas de computadordisponíveiscomercialmentepodemcalcular a% de identidade entre duasoumaissequências. Um programa de computadoradequado para realizaressealinhamento o pacote de GCG é Wisconsin Bestfit (Universidade de Wisconsin, EUA; Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12: 387.). Osexemplos de outros softwares que podemrealizarcomparações de sequênciasincluem, mas nãoestãolimitados a, o pacote BLAST (ver Ausubel et al, 1999 ibid -. Capítulo 18), FASTA (Atschul et al, 1990, J. Mol Biol, 403-410) ea suite GENEWORKS de ferramentas de comparação, ClustalX (ver Larkin et al (2007). ClustalW eClustal X versão 2.0 Bioinformatics, 23:. 2947-2948). Tanto BLAST e FASTA estãodisponíveis para pesquisa off-line e on-line (ver Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, para algumasaplicações, prefere-se utilizar o programa GCG Bestfit. Uma nova ferramenta, chamada BLAST 2 Sequences estátambémdisponível para comparação de proteína e sequência de nucleotídeos (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 e tatiana@ncbi.nlm .nih.gov).
[00117] A sequênciapodeterumaoumaisdeleções, inserçõesousubstituições de resíduos de aminoácidos que produzemumaalteraçãosilenciosa e resultamemumamoléculafuncionalmenteequivalente. As substituições de aminoácidosdeliberadaspodem ser feitas com base emsemelhançaempolaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e / ou a naturezaanfipática dos resíduosdesde que aatividadesejaretida. Por exemplo, carregadonegativamenteaminoácidosincluemácidoaspártico e ácidoglutâmico; aminoácidoscarregadospositivamenteincluemlisina e arginina; e aminoácidos com grupos de cabeçapolaresnãocarregadospossuindovalores de hidrofilicidadesemelhantesincluemleucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.
[00118] As substituiçõesconservativaspodem ser feitas, porexemplo, de acordo com a Tabelaabaixo, osaminoácidos no mesmobloconasegundacoluna e preferencialmentenamesmalinhanaterceiracolunapodem ser substituídosunspelos outros:
Figure img0004
[00119] O coronavírus da presenteinvençãopodecompreenderumavariante do gene da replicase que codificaumaproteína que compreendeumamutaçãoemcomparação com qualquer um dos SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 9, que, quandoexpressaem um coronavírus, faz com que ovírusterreduzidopatogenicidadeemrelaçãoa um coronavírus que expressam o correspondente replicase do tiposelvagem.
[00120] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreendepelomenosumaoumaismutações de aminoácidosemqualquercombinação de NSP-10, NSP-14, NSP-15 e NSP-16.
[00121] O gene variante de replicase do coronavírus da presenteinvençãopodecodificarumaproteínacompreendendoumamutação, talcomodefinidonassequências mod M41 apresentadosnaFigura 10.
[00122] O gene variante de replicase do coronavírus da presenteinvençãopodecodificarumaproteína que compreendeumaoumaismutações de aminoácidosseleccionadas a partir da lista de:
[00123] Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6,
[00124] Val para Leunaposição 393 da SEQ ID NO: 7;
[00125] Leu para Ilenaposição 183 da SEQ ID NO: 8;
[00126] Val para Ilenaposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[00127] O gene variante de replicase do coronavírus da presenteinvençãopodecodificarumaproteína que nãocompreendeumamutação no nsp-2, nsp-3, nsp-6 ou nsp-13.
[00128] O gene variante de replicase do coronavírus da presenteinvençãopodecodificarumaproteína que nãocompreendeumamutação no NSPL 0 que corresponde a treonina para isoleucinamutaçãocausadaporumamutaçãonaposição de nucleotídeo 12008 no gene relatadoporAmmayappan et al. (Arch Virol (2009) 154: 495-499).
[00129] Ammayappan et al (comoacima) relata aidentificação da sequência de alteraçõesresponsáveis pela atenuação da estirpe de IBV Arkansas DPI. O estudoidentificou 17 alterações de aminoácidosemumavariedade de proteínas de IBV apósmúltiplaspassagens, aprox. 100, do vírusemovosembrionados. Nãofoiinvestigado se o vírusatenuado (Arca DP1 101) é capaz de se replicarnapresença de anticorposmaternosderivadas contra o vírus in ovo, sem ser patogênico para o embrião. Dado que estevírusfoiproduzidopormúltiplaspassagensemovos SPF embrionados, umametodologiasemelhante para as vacinas IBV clássicas, é provável que estevírus é patogênico para osembriões. O víruspodetambém ser sensívelaanticorposmaternos-se derivados das galinhasforamvacinados com um serotiposemelhante.
[00130] O gene variante de replicase do coronavírus da presenteinvençãopodecodificarumaproteína que compreendequalquercombinação de umaoumaismutações de aminoácidosfornecidanalistaacima.
[00131] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende a mutação de aminoácidos Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6.
[00132] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende a mutação de aminoácidos Val para Leunaposição 393 da SEQ ID NO: 7.
[00133] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende a mutação de aminoácidos Leu para Ilenaposição 183 da SEQ ID NO: 8.
[00134] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende a mutação de aminoácidos Val para Ilenaposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[00135] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6, e Val para Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7.
[00136] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6 Leu para Ile naposição 183 da SEQ ID NO: 8.
[00137] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6 e Val para Ile naposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[00138] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Val para Leunaposição 393 da SEQ ID NO: 7 e Leu para se deitarnaposição 183 da SEQ ID NO: 8.
[00139] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Val para Leunaposição 393 da SEQ ID NO: 7 e Val para Ile naposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[00140] O gene da replicase variantepodecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Leu para Ilenaposição 183 da SEQ ID NO: 8 e Val para lie naposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[00141] A variante do gene da replicase podecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Pro para Leu naposição 85 da SEQ ID NO: 6, Val para Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7 e Leu para se deitarnaposição 183 da SEQ ID NO : 8.
[00142] A variante do gene da replicase podecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Pro para Leunaposição 85 da SEQ ID NO: 6 Leu para Ile naposição 183 da SEQ ID NO: 8 e Val para Ile naposição 209 da SEQ ID NO: 9.
[00143] A variante do gene da replicase podecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Pro para Leu naposição 85 da SEQ ID NO: 6, Val para Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7 e Val para Ile naposição 209 da SEQ ID NO : 9.
[00144] A variante do gene da replicase podecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Val para Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7, Leu para se deitarnaposição 183 da SEQ ID NO: 8 e Val para Ile naposição 209 da SEQ ID NO : 9.
[00145] A variante do gene da replicase podecodificarumaproteína que compreende as mutações de aminoácidos Pro para Leu naposição 85 da SEQ ID NO: 6, Val para Leu naposição 393 da SEQ ID NO: 7, Leu para se deitarnaposição 183 da SEQ ID NO : 8 e Val para Ile naposição 209 da SEQ ID nO: 9.
[00146] O gene variante replicase tambémpode ser definida no nível de nucleotídeos.
[00147] Por exemplo, a sequência de nucleotídeos da variante do gene da replicase do coronavírus da presenteinvençãopodecompreender um oumaisnucleotídeosdentro das regiõessubstituiçõesselecionadas a partir da lista de: 11884-12318, 16938-18500, 19515-20423 e 18.501-19.514 de SEQ ID NO: 1.
[00148] Por exemplo, a sequência de nucleotídeos da variante do gene da replicase do coronavírus da presenteinvençãopodecompreenderumaoumaissubstituições de nucleotídeosselecionada a partir da lista de: C para Tnaposição de nucleotídeo 12137; G para C naposição de nucleotídeo 18114; T para A naposição de nucleotídeo 19047; e G para A naposição de nucleotídeo 20139; emcomparação com a sequênciaapresentadacomo SEQ ID NO: 1.
[00149] Tal comoaquiutilizado, o termo "substituição" é sinónimo do termomutação e significa que as sequências de nucleotídeosnaposiçãoidentificadadifereao da sequência de nucleotídeos de tiposelvagem.
[00150] A sequêncianucleotídicapodecompreenderqualquercombinação das substituições de nucleotídeosseleccionada a partir da lista de: C para Tnaposição de nucleotídeo 12137; G para C naposição de nucleotídeo 18114; T para A naposição de nucleotídeo 19047; e G para A naposição de nucleotídeo 20139; emcomparação com a sequênciaapresentadacomo SEQ ID NO: 1.
[00151] A sequêncianucleotídicapodecompreender a substituição C12137T.
[00152] A sequêncianucleotídicapodecompreender a substituição G18114C.
[00153] A sequêncianucleotídicapodecompreender a substituição T19047A.
[00154] A sequêncianucleotídicapodecompreender a substituição G20139A.
[00155] A sequêncianucleotídicapodecompreender o C12137T substituições e G181 14C.
[00156] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições C12137T e T19047A.
[00157] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições C12137T e G20139A.
[00158] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições G18114C e T19047A.
[00159] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições G18114C e G20139A.
[00160] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições T19047A e G20139A.
[00161] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições C12137T, G18114C e T19047A.
[00162] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições C12137T, T19047A e G20139A.
[00163] A sequência de nucleotídeospodecompreender as substituições C12137T, G181 14C e G20139A.
[00164] A sequência de nucleotídeospodeincluir as substituições G18114C, T19047A e G20139A.
[00165] A sequêncianucleotídicapodecompreender as substituições C12137T, G18114C, T19047A e G20139A.
[00166] A sequência de nucleotídeospodenãocompreenderumasubstituição, o que corresponde à substituição C12008T relatadoporAmmayappan et al. (Como acima).
[00167] A sequência de nucleotídeospode ser natural, sintéticaourecombinante. Pode ser duplaou de cadeia simples, que pode ser DNA ou RNA oucombinaçõesdestes. Pode, porexemplo, ser DNAc, produto de PCR, a sequência de DNA gnômicoouRNAm.
[00168] A sequência de nucleotídeospode ser optimizado para a produção de códonnacélulahospedeira / hospedeiro da escolha.
[00169] Ele pode ser isolado, oucomoparte de um plasmídeo, vírusoucélulahospedeira. PLASMÍDEO
[00170] Um plasmídeo é umamolécula de DNA extra- cromossomalseparado a partir do DNA cromossómico que é capaz de se replicarindependentemente do DNA cromossómico. Eles sãogeralmente circular e de cadeiadupla.
[00171] Osplasmídeosouvectores (comoelessãoporvezesconhecidos) podem ser utilizados para expressarumaproteínaemumacélulahospedeira. Por exemplo, umacélulahospedeirabacterianapode ser transfectada com um plasmídeocapaz de codificarumaproteínaem particular, afim de expressaressaproteína. O termotambémincluicromossomasartificiais de levedura e cromossomasartificiais de bactérias que sãocapazes de acomodarmaislongasporções de DNA.
[00172] O plasmídeo da presenteinvençãocompreendeumasequência de nucleotídeoscapaz de codificar para umaregiãodefinida da proteína replicase. Tambémpodecompreenderumaoumaissequênciaadicionalcoronavírusnucleotídeo (s) ousequência (s) nucleotídicacapaz de codificarumaoumaisproteínas de outros coronavírus, tais como o gene S e / oudo gene 3.
[00173] O plasmídeopodetambémcompreender um marcador de resistência, talcomo o gene da xantina-guaninafosforribosiltransferase (gpt) de Escherichia coli, que confereresistênciaaoácidomicofenólico (MPA) napresença de xantina e hipoxantina e é controladopelo P7.5 do vírus vaccinia precoce / promotor tardio.
VÍRUS VACCINIA RECOMBINANTE
[00174] A presenteinvençãotambém se relaciona com um vírus de vaccinia recombinante (rVV) compreendendo um gene da replicase variante, talcomoaquidefinido.
[00175] O vírus vaccinia recombinante (rVV) pode ser feitautilizando um sistema de genéticainversa, com base vaccinia vírus.
[00176] A esterespeito, a presenteinvençãotambémproporciona um método para fabricarumapartícula viral por: (i) transfecção de um plasmídeo, talcomodescritonasecção anterior para umacélulahospedeira; (ii) a infecção da célulahospedeira com um vírus de recombinação que compreende o genoma de umaestirpe de coronavírus com um gene da replicase; (iii) permitir que a recombinaçãohomólogaocorra entre as sequências de genes de replicase do plasmídeo e as sequênciascorrespondentes no genoma do vírus de recombinação para produzir um gene da replicase modificada; (iv) selecionar para a recombinação de víruscompreendendo o gene da replicase modificada.
[00177] O termo "gene da replicase modificado" refere-se a um gene da replicase que compreende um gene da replicase variante, talcomodescritoemligação com o primeiroaspecto da presenteinvenção. Especificamente, o termorefere-se a um gene que é derivado de um gene da replicase do tiposelvagem, mas compreendeumasequência de nucleotídeos que faz com que codificamumaproteínavariante de replicase, comoaquidefinido.
[00178] A recombinaçãopodeenvolvertodoouparte do gene da replicase. Por exemplo, a recombinaçãopodeenvolverumasequência de nucleotídeos que codifica para qualquercombinação de NSP-10, NSP-14, NSP-15 e / ou NSP- 16. A recombinaçãopodeenvolverumasequência de nucleotídeos que codifica para um aminoácidooumutaçãocompreendeumasubstituição de nucleotídeostalcomodefinidoacima.
[00179] O genoma da cepa de coronavíruspodemnãopossuira parte da proteína replicase correspondente à partefornecidopeloplasmídeo, de modo que umaproteínamodificada é formadaatravés da inserção da sequêncianucleotídicaproporcionadapeloplasmídeo.
[00180] O vírus da recombinação é umaadequada para permitir a recombinaçãohomóloga entre o seugenoma e do plasmídeo. O vírus vaccinia é particularmenteadequadocomorecombinaçãohomóloga é utilizadarotineiramente para introduzir e eliminarsequências para o genoma do vírus vaccinia.
[00181] O métodoacimareferidoinclui, opcionalmente, aetapa de: (v) recuperação do coronavírusrecombinante que compreende o gene da replicase modificada a partir do DNA do vírus de recombinação a partir do passo (iv).
[00182] Osmétodos para recuperação de coronavírusrecombinante, tais como IBV recombinante, sãoconhecidosnaarte (Ver Britton et al (2005) verpágina 24; e PCT / GB2010 / 001293).
[00183] Por exemplo, o DNA do vírus da recombinação a partir da etapa (iv) pode ser inseridoem um plasmídeo e utilizados para transfectarcélulas que expressamcitoplasmática T7 RNA polimerase. As célulaspodem, porexemplo, ser pré-infectado com um vírus da varíolaaviária que expressa RNA-polimerase de T7. O coronavírusrecombinantepodeentão ser isolado, porexemplo, a partir do meio de crescimento.
[00184] Quando o plasmídeo é inserido no genoma do vírus vaccinia, um intermediárioinstável é formado. Osrecombinantes que compreendem o plasmídeopode ser seleccionada para, porexemplo, utilizando um marcador de resistência no plasmídeo.
[00185] Recombinantespositivospodementão ser verificado para conter o gene da replicase modificadapor, porexemplo, por PCR e sequenciamento.
[00186] Grandes quantidades de recombinação do vírus, incluindo o gene da replicase modificada (porexemplo, vírus vaccinia recombinante, (rVV) podem ser cultivadas e o DNA extraído a fim de levar a cabo o passo (v)).
[00187] Ossistemas de genéticainversaadequadossãoconhecidos no estado da técnica(Casais et al (2001) J. Virol 75: 12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77: 9084-9089; Britton et ai (2005) J. virológicamétodos 123: 203-211; Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454: 255-273). CÉLULA
[00188] O coronavíruspode ser utilizado para infectarumacélula.
[00189] Partículas de Coronavirus podem ser colhidas, porexemplo, a partir do sobrenadante, pormeio de métodosconhecidos no estado da técnica, e, opcionalmente, purificado.
[00190] A célulapode ser utilizada para produzir a partícula de coronavírus.
[00191] Assim, a presenteinvençãotambémproporciona um método para a produção de um coronavírus que compreende as seguintesetapas: (i) ainfecção de umacélula com um coronavírus de acordo com a invenção; (ii) permitindo que ovírus se replicarnacélula; e (iii) a colheita do vírus da progênie.
[00192] A presenteinvençãotambémproporcionaumacélulacapaz de produzir um coronavírus de acordo com ainvençãoutilizando um sistema de genéticainversa. Por exemplo, a célulapodecompreender um genoma de vírus de recombinaçãocompreendeumasequência de nucleotídeoscapaz de codificar para o gene da replicase do presenteinvenção.
[00193] A célulapode ser capaz de produzirvírus de recombinaçãorecombinante (porexemplo, vírus vaccinia) contendo o gene da replicase.
[00194] Emalternativa, a célulapode ser capaz de produzircoronavírusrecombinantepor um sistema de genéticainversa. A célulapodeexpressarou ser induzidasaexpressar a polimerase de T7, a fim de resgatar a partícula viral recombinante. VACINA
[00195] O coronavíruspode ser utilizado para produzirumavacina. A vacinapode, através de uma forma viva atenuada do coronavírus da presenteinvenção e podecompreenderainda um veículofarmaceuticamenteaceitável. Tal comoaquidefinido, os "portadoresfarmaceuticamenteaceitáveis" adequados para usonainvençãosãobemconhecidos dos técnicosversados no assunto. Tais transportadoresincluem, semlimitação, água, solução salina, solução salina tamponada, tampão de fosfato, soluçõesaquosas / álcool, emulsõesoususpensões. Outros diluentes e excipientesutilizadosconvencionalmentepodem ser adicionados de acordo com técnicasconvencionais. Tais transportadorespodemincluiretanol, polióis, e misturasadequadas dos mesmos, óleosvegetais, e ésteresorgânicosinjetáveis. Tampões e agentes de ajuste de pH, tambémpode ser empregue. Ostampõesincluem, semlimitação, ossaispreparados a partir de um ácidoorgânicoou base. tampõesrepresentativosincluem, semlimitação, sais de ácidosorgânicos, tais comosais de ácidocítrico, porexemplo, citratos, ácidoascórbico, ácidoglucônico, histidina-Hel, ácidocarbônico, ácidotartárico, ácidosuccínico, ácidoacético, ouácidoitálico, Tris, cloridratotrimethanmine, outampões de fosfato. Transportadoresparentéricospodemincluirsolução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose, trealose, sacarose, e cloreto de sódio, lactato de Ringer ouóleosfixos. Transportadorasintravenosapodeincluirreabastecefluidos e nutrientes, reabastecedores de electrólitos, tais comoaquelesbaseadosem dextrose de Ringer e semelhantes. Osconservantes e outros aditivos, tais como, porexemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentesquelantes (porexemplo, EDTA), gases inertes e semelhantespodemtambém ser fornecidosnosveículosfarmacêuticos. A presenteinvençãonão é limitada pela selecção do transportador. A preparaçãodestascomposiçõesfarmaceuticamenteaceitáveis, a partir dos componentesacimadescritos, possuindoisotonicidade pH adequado, estabilidade e outrascaracterísticasconvencionaisestádentro da perícia da arte. Ver, porexemplo, textoscomo Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed, Lippincott Williams & Wilkins, bar, 2000;!. e The Handbook of Pharmaceutical Excipients, editar 4.sup.th., eds. RC Rowe et ai, APhA Publications, 2003.
[00196] A vacina da presenteinvençãoirá ser administradaemuma "quantidadeterapeuticamenteeficaz", que refere-se aumaquantidade de um ingredienteativo, porexemplo, um agente de acordo com a presenteinvenção, suficiente para efetuarresultadosbenéficosoudesejadosquandoadministradoa um indivíduooupaciente. Uma quantidadeeficazpode ser administradaemumaoumaisadministrações, aplicaçõesoudosagens. Uma quantidadeterapeuticamenteeficaz de umacomposição de acordo com ainvençãopode ser prontamentedeterminadapor um vulgar peritonaarte. No contextodestainvenção, uma "quantidadeterapeuticamenteeficaz" é uma que produzumaalteraçãoobjetivamedidaem um oumaisparâmetrosassociadoscondição da BronquiteInfecciosasuficiente para efetuarresultadosbenéficosoudesejados .Umaquantidadeeficazpode ser administradaemumaoumaisadministrações. Para os fins destainvenção, umaquantidadeeficaz de medicamento, composto, ou a composiçãofarmacêutica é umaquantidadesuficiente para reduziraincidência da BronquiteInfecciosa. Tal comoaquiutilizado, o termo "terapêutico" engloba o espectrocompleto de tratamentos para umadoença, condiçãooudesordem. Um agente de "terapêutico" da invençãopodematuar de umamaneira que é profiláticaoupreventiva, incluindoaqueles que incorporamprocedimentosconcebidos para dirigirosanimais que podem ser identificadoscomoestandoemrisco (farmacogenética); ou de uma forma que é benéficaoucurativananatureza; oupodeatuar para retardar a taxa ouextensão da progressão de, pelomenos, um sintoma de umadoençaoudistúrbio a ser tratado.
[00197] A presenteinvençãotambém se referea um método para a produção de talvacina que compreende o passo de infectarcélulas, porexemplocélulas Vero, com umapartícula viral que compreendeumaproteína da replicase, talcomodefinidoemligação com o primeiroaspecto da invenção.
MÉTODO DE VACINAÇÃO
[00198] O coronavírus da presenteinvençãopodem ser utilizados para tratar e / ouprevenirumadoença.
[00199] Para "tratar" significaadministrar a vacinaa um indivíduotendoumadoençaexistente, a fim de diminuir, reduziroumelhorarpelomenos um sintomaassociado com a doença e / ou para retardar, reduziroubloquear a progressão da doença.
[00200] Para "prevenir" significaaadministrar a vacina a um paciente que aindanãotenhacontraído a doença e / ou que nãoestá a mostrarquaisquersintomas da doença para impedirouprejudicar a causa da doença (porexemplo, infecção) ou para reduzirouprevenir o desenvolvimento de pelomenos um sintomaassociado com a doença.
[00201] A doençapode ser qualquerdoençacausadapor um coronavírus, talcomoumadoençarespiratória e / ou a gastroenteriteemhumanos e hepatite, gastroenterite, encefalite, ouumadoençarespiratóriaem outros animais.
[00202] A doençapode ser da bronquiteinfecciosa (IB); diarreiaepidemicasuína; gastroenteritetransmissível; vírus da hepatite de ratos; encefalomielitehemaglutinanteporcina; síndromerespiratóriaaguda grave (SARS); oudoençaBluecomb.
[00203] A doençapode ser bronquiteinfecciosa.
[00204] A vacinapode ser administrada a pintosougalinhaseclodidas, porexemplo, gotasocularesouadministração intranasal. Emboraprecisos, estesmétodospodem ser, porexemplo, caro para grandesbandos de frangos. As alternativasincluemainoculaçãoporpulverização de administração para águapotável, mas pode ser difícil de assegurarumaaplicaçãouniformevacinautilizando tais métodos.
[00205] A vacinapode ser fornecidaemuma forma adequada para a suaadministração, tais como um conta-gotas para uso intraocular.
[00206] A vacinapode ser administradaporinoculação in ovo, porexemplo, porinjeção de ovosembrionados. Vacinação in ovotem a vantagem de que eleproporcionaumaresistênciafaseprecoce para a doença. Tambémfacilitaaadministração de uma dose uniformeporobjeto, aocontrário de inoculaçãoporpulverização e administraçãoatravés da água de beber.
[00207] A vacinapode ser administrada a qualquercompartimentoapropriado do ovo, incluindofluidoalantóico, sacovitelino, âmnio, oucélula de ar do embrião. Pode ser administrado a seguir a concha (célula de ar) de membrana e da membranacorioalantóica.
[00208] Normalmente, a vacina é injetadaemovosembrionados, nosestágiosavançados do desenvolvimentoembrionário, geralmentedurante o últimotrimestre do período de incubação, como 3-4 dias antes de chocar. Emfrangos, a vacinapode ser administrada entre o dia 15-19 do período de incubação de 21 a dezdias, porexemplo, no dia 17 ou 18.
[00209] O processopode ser automatizadousando um processo de injeçãorobótico, tais comoosdescritos no documento WO 2004/078203.
[00210] A vacinapode ser administradaem conjunto com umaoumaisoutrasvacinas, porexemplo, vacinas para outrasdoenças, tais como o vírus da doença de Newcastle (NDV). A presenteinvençãotambémforneceumacomposição de vacina que compreendeumavacina de acordo com ainvençãoem conjunto com umaoumaisoutra (s) vacina. A presenteinvençãotambémproporciona um kit compreendendoumavacina de acordo com ainvençãoem conjunto com umaoumaisoutra (s) vacina para administraçãoseparada, sequencialousimultânea.
[00211] A composição de vacinaou de vacina da invençãopode ser utilizada para tratar um ser humano, animal ouobjetoaviário. Por exemplo, o sujeitopode ser um pintainho, galinhaou o mouse (como um rato de laboratório, porexemplo, ratinhotransgénico).
[00212] Tipicamente, um médicoouveterináriodeterminará a dosagematual que serámaisadequada para um sujeito individual ougrupo de sujeitos e elavariará com aidade, peso e resposta do sujeitoespecífico (s).
[00213] A composiçãopodecompreender, opcionalmente, um transportador, diluente, excipienteouadjuvantefarmaceuticamenteaceitável. Aescolha de transportadorfarmacêutico, excipienteoudiluentepode ser selecionado com respeito à via de administraçãopretendida e a práticafarmacêuticapadrão. As composiçõesfarmacêuticaspodemcompreendercomo (ouemadiçãoao) o transportador, excipienteoudiluente, qualquerligante (s) apropriado, lubrificante (s), agente (s), agente (s) de revestimento de suspensão, agente (s) solubilizante e outros agentesveiculares que podeajudarouaumentaraentregaouimunogenicidade do vírus.
[00214] A invençãoserá agora adicionalmentedescritapormeio de Exemplos, osquais se destinam a servir para auxiliar um peritonaartenarealização da invenção e não se destinam de forma alguma a limitar o âmbito da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Geração de um sistema de genéticainversa de IBV baseadoem M41 -CK
[00215] Um DNAc de comprimentocompleto de M41-CK foiproduzidaporsubstituição do DNAc Beaudette no sistema de genéticainversa de vírus da vacíniapreviamentedescritosem PCT / GB2010 / 001293 (aquiincorporadoporreferência) com osDNAcsintéticoderivado da sequência de consenso de M41.
[00216] O DNAc do IBV dentro de vírus da vacíniarecombinanteestrutura (rVV) rVV-BeauR-M41-Rep descrito no Armesto, Cavanagh e Britton (2009). PLoS ONE 4 (10): e7384. DOI: 10.1371 / journal.pone.0007384, que consistiuna replicase derivado da estirpe Beaudette do IBV e os genes estruturais e acessórias e 3 'UTR de IBV M41 -CK, foiaindamodificado pela substituição do Beaudette 5' UTR-Nsp2- NSP3 sequência com a sequênciacorrespondente de IBV M41 -CK. O DNAc do IBV resultanteconsistia de 5 'UTR-Pne2-NSP3 da M41, NSP4-Nsp16 de Beaudette e os genes estruturais e acessórias e 3' UTR de M41. Este cDNA foiaindamodificado pela deleção da sequência de Beaudette-Nsp16 NSP4. O DNAcresultante, com falta Nsp4-16, foimodificadoemmaisquatropassosem que o PTS suprimidoforamsequencialmentesubstituídas com as sequênciascorrespondentes de M41 -CK, o DNAc de substituiçãorepresentado M41 -CK Nsp4-8, Nsp9- 12, Nsp12-14 e finalmente Nsp15-16. Cadasubstituição de DNAccontinhaaprox. 500 nucleotídeosnaextremidade 5' que corresponde à sequência 3' mais M41 previamenteinserido e aprox. 500 nucleotídeosnaextremidade 3 'correspondentes à sequência do gene S do M41. Isto permitiuainserção da sequência de DNAc de M41, porrecombinaçãohomóloga e adiçãosequencial de sequênciacontígua gene da replicase M41. Os cDNAs sintéticoscontendo o M41 -derived sequências NSP foramadicionadosporrecombinaçãohomólogautilizando o sistema do invençãor anterior descreveutransitóriaselecçãodominante (TDS) (ver PCT / GB2010 / 001293). Os cDNAs -derived M41 contendo a sequênciacorrespondenteaos M41 nsp-10, -14, -15 e -16 continhaosaminoácidosmodificadosnasposições 85, 393, 183 e 209, respectivamente, comoindicadonaFigura 10.
[00217] Um DNAc de comprimentocompleto que representa o genoma de M41 -CK foigerado no vírus Vaccinia representando as sequênciassintéticas. Dois rIBVs, M41-R-6 e M41-R-12, foramresgatadas e mostrado para crescer de umamaneirasemelhantecomo M41 -CK (Fig. 1).
EXEMPLO 2 - Determinar a patogenicidade do vírusresgatado M41
[00218] Osvírusresgatados no Exemplo 1 foramutilizados para infectaragentepatogênicoespecífico de 8 dias de idade, livres
[00219] (SPF) pintos de ocular e nasal inoculação para testá-los para patogenicidade, comoobservadoporsinaisclínicosemuma base diária 3-7 diasapósainfecção e para a atividadeciliardias 4 e 6 após a infecção. A perda de atividadeciliar é um métodobemestabelecido para determinar a patogenicidade do IBV. Osdoisvírus M41 -R foramencontrados para ser apatogênicoquandocomparado com M41-CK emboraelesmostramalgunssinaisclínicosemcomparação com os pintos de controlonãoinfectadas (Fig. 2) e um pouco de perda, mas inconsistente da atividadeciliar (Fig. 3).
[00220] Assim, os clones moleculares de M41 M41 -R - CK nãoerampatogênicosquandoemcomparação com o vírus parental M41-CK.
[00221] Osinventoresidentificaramváriasdiferenças de nucleotídeos no M41 -R emcomparação com as sequências de M41-CK. A maioriadesteserammutaçõessinónimas, comoaalteração do nucleotídeonãoafecta a sequência de aminoácidos da proteínaassociada com a sequência. No entanto, quatromutaçõesnãosinónimasforamidentificadas no gene da replicase de IBV específico para NSP-10, NSP-14, NSP-15 e NSP-16 componentes do gene da replicase, estasmutaçõesresultouemalterações de aminoácidos (Tabela 3). Tabela 3. Mutaçõesnão-Sinonimousidentificados no NSDS de genoma de comprimentocompleto M41-R
Figure img0005
[00222] A fim de determinar se as mutaçõesidentificadaseramresponsáveis pela perda de patogenicidadeassociada com M41 -R, a mutação Nsp-10 foireparada e as mutaçõesem nsp-14, -15 e -16 foramreparados e mostrado para crescer de umamaneirasemelhantecomo M41 -CK (Figura 9). Osinventores, assim, gerouosrIBVs, M41 R-nsp10rep e M41 R-nsp14, 15, 16rep, usando cDNAs sintéticascontendoosnucleotídeoscorretasutilizandosistema anterior descrito (TDS) do invençãor (ver PCT / GB2010 / 001293).
[00223] OsrIBVsforamavaliados para patogenicidadeem pintos comodescritoanteriormente. Ambos osrIBVsmostraramaumento da patogenicidadequandocomparado com M41-R, mas nãoaonívelobservado com M41 -CK (Figs 4 e 5). M41 R-nsp14, 15, 16rep deusinaisclínicos e maisreduçãonaatividadeciliar do que M41 R-nsp10rep, emgeralestesresultadosindicaram que as mudançasassociadas com osquatronsppareceafetarpatogenicidade.
[00224] Para determinarospapéis do PTS napatogenicidade do DNAc de comprimentocompletocorrespondente a R-M41 nsp10rep foiusada para reparar as mutaçõesem Nsps14, 15 e 16, utilizando um DNAcsintético que contémosnucleotídeoscorretos, utilizando o sistema de TDS.
[00225] OsseguintesrIBVsforamproduzidos: - R-M41 nsp10, 15rep - M41-R com as mutaçõesem NSP-10 e NSP-15 reparados M41 R-nsp10, 14, 15rep - M41-R com mutações no nsp-10, -14 e -15 reparado M41 R-nsp10, 14, 16rep - M41-R com mutações no NSP-10, -14 e -16 reparado M41 R-nsp10, 15, 16rep - M41 -R com mutações no NSP- 10, -15 e -16 reparado M41-K - Todos as quatromutações, nsp-10, -14, -15 e - 16 reparadoem M41 -R
[00226] OsrIBVsforammostrados para crescer de umamaneirasemelhantecomo M41 -CK (Figura 9) e avaliadosquanto à patogenicidadecomodescritoanteriormente. M41 -K (em que todas as quatromutaçõestinhasidoreparado) resultouemsinaisclínicos e perda de 100% de atividadeciliar (ciliostasecompleta) por 4 diaspós-infecção (Fig. 6, 7 e 8). Os outros rIBVsdemonstradodiferentesníveis de patogenicidade, para além do R-M41 nsp10, 15, 16rep, que era essencialmenteapatogênica. Estes resultadosconfirmaram que oreparo de todososquatro PTS restauradospatogenicidade para M41 -R; novamenteapoiandoaevidência anterior de que as mutaçõesdescritasnosquatro NSPS estãoimplicadosnaatenuação M41-CK.
[00227] OsinventorestambémgerourIBV M41 R-NSP 10, 14 rep (NSP 10 e 14 sãoreparados, NSP 15 e 16 contêmmutações) e rIBV M41 R-NSP 10, 16 rep (NSP 10 e 16 sãoreparados, NSP 14 e 15 contêmmutações) e avaliou a patogenicidadedestesvírus.
[00228] rIBV M41 R-NSP 10, 14 rep menospatogénica do que M41-K, mas causoucerca de 50% ciliostasenosdias 4-6 apósainfecção. rIBV M41 R-NSP 10, 16 representantefoiquaseapatogênica e nãocausouciliostase (veja a Figura 11 ac).
[00229] Assim, o genomaassociado com M41-R é um potencialgenomaespinha dorsal de um IBV atenuadoracionalmente.
EXEMPLO 4 - Vacinação / Estudo de Desafio com M41 -R
[00230] O vírus da vacinacandidatosforamtestadosemestudosem que osovos de galinhafertilizadosforamvacinadas in ovoaos 18 diasembrionamento e no qual foideterminadaaeclodibilidade dos ovosinoculados. A saúdeclínica dos frangosfoiinvestigado e as galinhasforamdesafiadosaos 21 dias de idade com um vírusdesafio IB M41 virulentaem 103,65 EID50 por dose.
[00231] Ossinaisclínicosforaminvestigadosapósdesafioprotecção pela vacina e um teste de ciliostasefoirealizada a 5 diasapós o desafio para investigar o efeito de osvírus de desafioemmovimento dos cílios e protecção pela vacina contra a ciliostase (inibição do movimentociliar).
[00232] Vacinação in ovoemovos de frangocomerciais
[00233] A concepção da experiência é dado naTabela 4 e osresultadosclínicossãoapresentadosnaTabela 5. eclosão dos ovosinoculados com IB M41 -R foi boa e galinhaseramsaudáveis. IB M41-R protegidos contra ossinaisclínicosapós o desafionosfrangos (placebo: 19/19 afetados, IB M41 -R: 3/18 afetada e um morto). Osresultados do teste de ciliostasesão dadas naTabela 6. IB M41-R geradoprotecção contra a ciliostase.
[00234] Tabela 4 - Projeto de um eclodibilidade, segurança, estudo de eficáciaemovoscomerciais
Figure img0006
1 volume de dose 0.1 ml, NA, nãoaplicável. 2 103.65 EID50 por dose Tabela 5 - percentagens Hatch e dados clínicos antes e após o desafioemgalinhascomerciais, para o projeto Ver Tabela1.
Figure img0007
1 Sistema respiratórioperturbado 2 Zumbindo 3 Mudança de voz 4 Respiraçãodifícil 5 Fistulas intra-orbital inchados 6 Crescimentodesigual 7 FraquezaTabela 6 - Resultados do teste ciliostasedepois e desafio para modeloverTabela 1.
Figure img0008
[00235] Vacinação in ovoemovosespecíficosisentos de agentespatogênicos (SPF)
[00236] O desenho do estudoemovos SPF é dado naTabela 7 e é semelhante à concepção dos estudos com frangos de cRNAecomerciais, mas a dose de vacinação para IB M41 -R foimaior, (105 EID50 por dose).
[00237] Osresultados (Tabela 8) mostram que a porcentagemescotilha para IB M41 -R escotilhafoibaixa, e 19 de 40 eclodiram e osfilhoteseramfracos. Oitofilhotesmorreram. Osrestantes 1 1 frangosforamdesafiados e 1 1 dos pintos nascidos de ovos que tinhamsidoinoculados com solução salina foramdesafiados.
[00238] No teste de ciliostaseapós o desafioverificou-se que todososfrangosvacinadas in ovo com IB M41-R foramprotegidos, enquanto que nenhum dos controlosfoiprotegido, verTabela 9.
[00239] Tabela 7. Projeto de umaEclodibilidade, segurança, estudo de eficáciaemovos SPF
Figure img0009
Figure img0010
1 Dose volume 0.1 ml, NA, nãoaplicável. 2 dose de desafio 103.3 EID50 em 0.2 m Tabela 8. Percentagens Hatch e dados clínicos antes e depoisdesafioemgalinhas SPF, para o projetoconsulte a Tabela7.
Figure img0011
Tabela 9. Resultados de teste de ciliostasesapósdesafio, pormodelovertabela7.
Figure img0012
[00240] Emconclusão, IB M41 -R era seguroemovoscomerciais, geradoproteção contra ossinaisclínicos e atécertoponto contra ciliostase.
[00241] Emovos SPF vacinadas com IB M41 R um númerorelativamentebaixo de frangosnascidos. Isto pode ser devidoao 10s EID50 porovo de IB M41 -R utilizado. Este foi 10 vezesmaiselevada do que a dose utilizadanosestudosanterioresem que houve um nívelelevado de taxa de eclosão. As percentagensmaisbaixas de escotilhatambémpodem ser causadasporumaparticularmenteelevadasusceptibilidade da batelada de ovos SPF porvírus, comoem outros estudos, o nível de mortalidadeembrionáriafoitambémmaiselevada que tinhasidoanteriormenteobservada.
[00242] Após o desafiotodososfrangos sobreviventesapósaeclosãoforamcompletamenteprotegida contra ciliostase. Conclui-se que o IB M41 -R tem um grandepotencialcomovacina para ser administrada in ovo.
[00243] Todas as publicaçõesmencionadasnaespecificaçãoacimasãoaquiincorporadasporreferência. Váriasmodificações e variações dos métodosdescritos e sistema da invençãoserãoevidentes para ostécnicosversados no assuntosemafastamento do escopo e do espírito da invenção. Embora a invençãotenhasidodescritaemligação com concretizaçõespreferidasespecíficas, deverá ser entendido que ainvençãocomoreivindicadanãodeve ser indevidamentelimitada a tais concretizaçõesespecíficas. De fato, váriasmodificações dos modosdescritos para realizarainvenção que é óbvia para osespecialistasembiologia molecular, virologiaoucamposrelacionadosdestinam-se aestardentro do escopo das reivindicaçõesseguintes.

Claims (24)

1. Coronavírusatenuado vivo caracterizadopelofato de que compreende um gene replicase variantecodificandopoliproteínas que compreendemumamutaçãoemumaoumais das proteínasnãoestruturais (s) (nsp)-10, nsp-14, em que o gene da replicase variantecodificaumaproteínacompreendendoumamutação de aminoácido de Pro para Leu naposiçãocorrespondente à posição 85 da SEQ ID NO: 6, e / ou, em que o gene da replicase variantecodificaumaproteínacompreendendoumamutação de aminoácido de Val para Leu naposiçãocorrespondente à posição 393 da SEQ ID NO: 7.
2. Coronavírus, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelofato de que compreendeaindaumamutaçãoem um oumais de nsp-15 correspondendo a SEQ ID NO: 8 e nsp-16 correspondendo a SEQ ID NO: 9.
3. Coronavírus, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelofato de que o gene replicase variantecodificaumaproteínacompreendendoumaoumaismutações de aminoácidosselecionadas a partir de: um aminoácido de Leu a Ile naposiçãocorrespondente à posição 183 da SEQ ID NO: 8; e umamutação de aminoácido Val para Ile naposiçãocorrespondente à posição 209 de SEQ ID NO: 9.
4. Coronavírus, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelofato de que o gene replicase codificaumaproteínacompreendendo a mutação de aminoácido de Pro para Leunaposiçãocorrespondente à posição 85 da SEQ ID NO: 6.
5. Coronavírus, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelofato de que o gene da replicase codificaumaproteínacompreendendo as mutações de aminoácidos Val a Leu naposiçãocorrespondente à posição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu para Ilenaposiçãocorrespondente à posição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val a Ile naposiçãocorrespondente à posição 209 da SEQ ID NO: 9.
6. Coronavírus, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 5, caracterizadopelofato de que o gene da replicase codificaumaproteínacompreendendo as mutações de aminoácidos Pro a Leu naposiçãocorrespondente à posição 85 da SEQ ID NO: 6; Val a Leu naposiçãocorrespondente à posição 393 da SEQ ID NO: 7; Leu para Ilenaposiçãocorrespondente à posição 183 da SEQ ID NO: 8; e Val a Ile naposiçãocorrespondente à posição 209 da SEQ ID NO: 9.
7. Coronavírus, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 6, caracterizadopelofato de que o gene replicase compreendeumaoumaissubstituições de nucleotídeosselecionada a partir da lista de: C para T naposiçãocorrespondente a posiçãonucleotídica 12137; G para C naposiçãocorrespondente a posiçãonucleotídica 18114; T para A naposiçãocorrespondente a posição nucleotídica19047; e G para A naposiçãocorrespondente a posiçãonucleotídica 20139; emcomparação com a sequênciaapresentadacomo SEQ ID NO: 1.
8. Coronavírus, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 7, caracterizadopelofato de que é um vírus da bronquiteinfecciosa (IBV).
9. Coronavírus, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizadopelofato de que é IBV M41.
10. Coronavírus, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelofato de que compreendeumaproteína S, pelomenos, parte dos quais é de um serotipo de IBV que nãoseja M41.
11. Coronavírus, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelofato de que a proteína S é de um serotipo de IBV que nãoseja M41.
12. Coronavírus, de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 11, caracterizadopelofato de que tempatogenicidadereduzidaemrelaçãoa um coronavírus que expressauma replicase do tiposelvagemcorrespondente, de tal modo que quando o vírus é administrado a um ovoembrionado, é capaz de se replicarsem ser patogênico para o embrião.
13. Gene replicase variantecaracterizadopelofato de que é definidoconformequalqueruma das reivindicações 1 a 7.
14. Proteínacodificadapor um gene replicase coronavírusvariantecaracterizadopelofato de que é conformedefinido pela reivindicação 13.
15. Plasmídeocaracterizadopelofato de que compreende um gene replicase conformedefinido pela reivindicação 14.
16. Método para produzir o coronavírusconformedefinidoporqualqueruma das reivindicações 1 a 13, caracterizadopelofato de que compreende as seguintesetapas: (i) transfectar um plasmídeoconformedefinido pela reivindicação 15 emumacélulahospedeira; (ii) infectar a célulahospedeira com um vírus de recombinação que compreende o genoma de uma cepa de coronavírus com um gene replicase; (iii) permitir que a recombinaçãohomólogaocorra entre as sequências de genes replicase do plasmídeo e as sequênciascorrespondentes no genoma do vírus de recombinação para produzir um gene replicase modificado; e (iv) selecionar para a recombinação de víruscompreendendo o gene replicase modificado.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelofato de que ovírus da recombinação é um vírus vaccinia.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizadopelofato de que tambémincluiaetapa de: (v) recuperar o coronavírusrecombinantecompreendendo o gene replicase modificado a partir do DNA do vírus de recombinação a partir da etapa (iv).
19. Vacinacaracterizadapelofato de que compreende um coronavírusconformedefinidoporqualqueruma das reivindicações 1 a 12 e um veículofarmaceuticamenteaceitável.
20. Uso de um coronavírusconformedefinidoporqualqueruma das reivindicações 1 a 12 caracterizadopelofato de que é para fabricação de umavacina para prevenção de umadoençaem um sujeito.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelofato de que a doença é a bronquiteinfecciosa (IB).
22. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelofato de que a vacina é administradaporcolírio, administração intranasal, administraçãoporbeber água, injeção de pós-eclosão e injeção in ovo.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelofato de que a vacinação é vacinação in ovo.
24. Método para produzirumavacinaconformedefinido pela reivindicação 19 caracterizadopelofato de que compreendeaetapa de infectarumacélulahospedeira com um coronavírusconformedefinidoporqualqueruma das reivindicações 1 a 12.
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