ES2249769T3 - Clones quimericos de un adnc del virus de la bursitis infecciosa, productos de expresion y vacunas basadas en los mismos. - Google Patents
Clones quimericos de un adnc del virus de la bursitis infecciosa, productos de expresion y vacunas basadas en los mismos.Info
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Abstract
SE HACE REFERENCIA A CDNA QUIMERICOS PARA LA EXPRESION DE POLIPEPTIDOS INMUNOGENICOS QUE INCLUYEN DETERMINANTES EPITOPICOS GENETICOS PARA UNA CEPA DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD BURSAL INFECCIOSA BASICA Y AL MENOS ALGUNA OTRA CEPA DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD BURSAL INFECCIOSA. LOS DETERMINANTES EPITOPICOS GENETICOS CODIFICAN AMINOACIDOS O SECUENCIAS DE AMINOACIDOS QUE DEFINEN EPITOPOS UNIDOS POR ANTICUERPOS MONOCLONALES ESTABLECIDOS PREVIAMENTE. LOS INMUNOGENES EXPRESADOS POR EL CDNA PUEDEN EMPLEARSE PARA PROPORCIONAR UNA VACUNA CONTRA UN PLURALIDAD DE CEPAS IBDV. SE PONE DE MANIFIESTO EL DETERMINANTE EPITOPICO DE LAS CEPAS LETALES IBDV Y UN INMUNOGEN PARA CONFERIR INMUNIDAD RESPECTO A ELLOS. ASIMISMO, SE HA IDENTIFICADO Y SE PONE DE MANIFIESTO UN ANTICUERPO MONOCLONAL ESPECIFICO PARA LAS CEPAS LETALES IBDV, AL IGUAL QUE UNA VACUNA PARA LA INMUNIZACION PASIVA BASADA EN LO ANTERIOR. LOS INMUNOGENES QUE MANIFIESTAN EPITOPOS CONFORMACIONALES, EN LA FORMA DE PARTICULAS TIPO VIRUS, TIENEN EFECTIVIDADEN LA PREPARACION DE VACUNAS.
Description
Clones quiméricos de ADNc del virus de la
bursitis infecciosa, productos de expresión y vacunas basadas en
los mismos.
La presente invención proporciona inmunógenos
quiméricos del virus de la bursitis infecciosa ("infectious
bursal disease virus", IBDV) que protegen activamente frente a
la infección virulenta y letal por cepas clásicas y variantes del
IBDV y procedimientos para la obtención de vacunas con estos
inmunógenos y vacunas quiméricos.
El virus de la bursitis infecciosa (IBDV) es
responsable de una enfermedad inmunosupresiva altamente contagiosa
en pollos jóvenes que causa pérdidas significativas en la industria
avícola en todo el mundo (revisado en Kibenge (1988) J. Gen Virol.
69:1757-1775). La infección de pollos susceptibles
por cepas virulentas del IBDV puede conducir a un estado
inmunosupresivo altamente contagioso conocido como la bursitis
infecciosa ("infectious bursal disease", IBD). El daño causado
a los folículos linfoides de la bolsa de Fabricio y al bazo puede
agravar infecciones producidas por otros agentes y también reducir
la capacidad del pollo de responder a la vacunación (Cosgrove (1962)
Avian Dis. 6:385-389).
Hay dos serotipos del IBDV (McFerran y col.
(1980) Avian Path. 9:395-404). Los virus del
serotipo 1 son patógenos para pollos y difieren marcadamente en su
virulencia (Winterfiel y col. (1978) Avian Dis.
5:253-260), mientras que los virus del serotipo 2,
aislados de pavos, son avirulentos en pollos (Ismail y col. (1988)
Avian Dis. 32:757-759; Kibenge (1991) Virology
184:437-440).
El IBDV es un miembro de la familia
Bimaviridae y su genoma consta de dos segmentos de ARN
bicatenario (Dobos y col. (1979) J. Virol.
32:593-605). El segmento más pequeño B (\sim2800
bp) codifica VP1, la polimerasa de ARNbc. El segmento mayor A
(\sim3000 bp) codifica una poliproteína precursora de 110 kDa en
un único marco de lectura abierto ("open reading frame", ORF)
que es procesada para dar VP2, VP3 y VP4 maduras (Azad y col.
(1985) Virology 143:35-44). El segmento A también
puede codificar VP5, una proteína de 17 kDa de función desconocida,
en una pequeña ORF que solapa parcialmente con la ORF de la
poliproteína (Kibenge y col. (1991) J. Gen. Virol.
71:589-577).
Mientras que VP2 y VP3 son las principales
proteínas estructurales del virión, VP2 es el principal inmunógeno
protector del huésped y causa la inducción de anticuerpos
neutralizantes (Becht y col. (1988) J. Gen. Virol.
69:631-640; Fahey y col. (1989) J. Gen. Virol.
70:1473-1481). Se considera que VP3 es un antígeno
específico de grupo porque es reconocido por anticuerpos
monoclonales (AMCs) dirigidos contra VP3 de cepas de ambos
serotipos 1 y 2 (Becht y col. (1988) J. Gen. Virol.
69:631-640). VP4 es una proteasa codificada por el
virus y está implicada en el procesamiento de la proteína
precursora (Jagadish y col. (1988) J. Virol.
62:1084-1087).
En el pasado, el control de la infección por el
IBDV en pollos jóvenes se ha conseguido mediante la vacunación viva
con cepas avirulentas o, principalmente, mediante la transferencia
del anticuerpo materno inducido por la administración de vacunas
vivas y muertas contra el IBDV a gallinas reproductoras.
Desafortunadamente, en los últimos años se han aislado en los
Estados Unidos cepas variantes virulentas del IBDV de poblaciones
vacunadas (Snyder y col. (1988b) Avian Dis.
32:535-539; Van der Marel y col. (1990) Dtsch.
Tierarztl. Wschr. 97:81-83). El uso de una serie de
AMCs seleccionados, generados frente a diversas cepas del IBDV ha
llevado a la identificación de las variantes de ocurrencia natural
del virus, GLS, DS326, RS593 y Delaware en los Estados Unidos. Se
han sufrido pérdidas económicas sustanciales debido a la aparición
de estas variantes antigénicas (Delaware y GLS) en el campo (Snyder
y col. (1992) Arch. Virol. 127:89-101).
Estas cepas variantes son antigénicamente
diferentes de las cepas clásicas del IBDV aisladas en la forma más
típica antes de 1985 y carecen del (los) epítopo(s)
definidos por los anticuerpos monoclonales (AMCs) neutralizantes B69
y R63 (Snyder y col. (1988a) Avian Dis. 32:527-534;
Snyder y col. (1988b) Avian Dis. 32:535-539; Snyder
y col. (1992) Arch. Virol. 127:89-101). Desde la
aparición en el campo de estas variantes se han reformulado muchas
vacunas comerciales vivas y muertas para el IBDV en un intento de
ajustarse mejor al mayor espectro antigénico de los virus que se
reconoce que circulan en el campo.
Se han hecho esfuerzos para desarrollar una
vacuna recombinante para el IBDV y se ha clonado el genoma del IBDV
(Azad y col. (1985) Virology 143:35-44). El gen VP2
del IBDV se ha clonado y expresado en levaduras (Macreadle y col.
(1990) Vaccine 8:549-552), así como en un virus de
la viruela aviar recombinante (Bayliss y col. (1991) Arch. Virol.
120:193-205). Al inmunizar pollos con el antígeno
VP2 expresado en levaduras, el antisuero ofreció protección pasiva a
pollos frente a la infección por el IBDV. Usado en estudios de
inmunización activa, el antígeno VP2 con el virus de la viruela
aviar como vector ofreció protección contra mortalidad, pero contra
lesiones en la bolsa de Fabricio.
\newpage
Recientemente, se ha descrito la síntesis de las
proteínas estructurales VP2, VP3 y VP4 de la cepa variante del
IBDV, GLS, en un sistema de expresión de baculovirus (Vakharia y
col. (1993) J. Gen. Virol. 74:1201-1206). En un
estudio inicial de inmunidad activa en dos dosis en pollos SPF
(libres de patógenos específicos), las proteínas de GLS expresadas
mediante baculovirus fueron capaces de conferir el 79% de
protección frente a la infección virulenta por GLS (Vakharia y col.
(1993) J. Gen. Virol. 74:1201-1206). En un estudio
ampliado posterior de inmunidad cruzada activa, mediante el aumento
de la masa antigénica de la proteína de GLS expresada por
baculovirus se consiguió una protección completa frente a las cepas
variantes GLS y E/Del con una única dosis, pero único se ofreció
una protección parcial frente a la cepa clásica STC, a menos que se
administraran dos dosis.
En los últimos años se han determinado las
secuencias completas de nucleótidos del segmento de mayor tamaño A
de cinco cepas del serotipo 1 del virus IBDV:
002-73 (Hudson y col. (1986) Nucleic Acids Res.
14:5001-5012), Cu-1, PBG98, 52/70
(Bayliss y col. (1990) J. Gen. Virol. 71:1303-1312),
STC (Kibenge (1990) J. Gen. Virol. 71:569-577) y de
la cepa OH del serotipo 2 (Kibenge (1991) Virology
184:437-440). Además se ha secuenciado el gen VP2 de
cepas japonesas virulentas del IBDV (Lin y col. (1993) Avian Dis.
37:315-323) y de las variantes Delaware A y E (Lana
y col. (1992) Virus Genes 6:247-259; Heine y col.
(1991) J. Gen. Virol. 22:1835-1843). Sin embargo,
nadie ha clonado y caracterizado completamente la totalidad del
segmento largo de ninguna de las variantes del IBDV de los Estados
Unidos.
Los inventores han identificado ahora la región
del genoma del IBDV responsable de la variación antigénica. Se ha
construido una secuencia de ADN que contiene la región variable
central de la proteína VP2, así como un plásmido que incorpora la
misma. Esta secuencia de ADN se puede manipular para generar los
epítopos neutralizantes del virus que se deseen o polipéptidos
inmunogénicos de cualquier cepa del IBDV. A su vez, estos segmentos
inmunogénicos pueden incorporarse en nuevas vacunas recombinantes
para el IBDV.
La figura 1 ilustra la construcción de diversos
plásmidos quiméricos que codifican poliproteínas específicas del
IBDV. En la parte superior de la figura se muestra un mapa del
genoma del IBDV con sus regiones codificantes. En la figura se
incorporan sitios de restricción seleccionados: B, BamHI; E,
BstEII; N, NdeI; R, NarI; S, SpeI.
Guiones indican la sustitución de la secuencia D78 (fragmento
NdeI-NarI) en la secuencia de GLS para restablecer la
región epitópica B69. La línea continua y la línea de puntos indican
la sustitución de las secuencias de E/Del-22 y
DS326, respectivamente, en la secuencia de GLS para restablecer la
región epitópica B63 o para delecionar la región epitópica 179,
respectivamente.
La figura 2 es una micrografía electrónica de
partículas pseudovíricas del IBDV (| -- | = 100 nm). A. Partículas
vacías (sin ARN) reales del virus purificado. B. Partículas
pseudovíricas (cápsidas vacías) derivadas de un baculovirus
recombinante que expresa el segmento de mayor tamaño del genoma del
IBDV en células de insec-
tos.
tos.
La figura 3 es una comparación de las secuencias
deducidas de aminoácidos de las proteínas estructurales (VP2, VP3 y
VP4) de diez cepas del IBDV. Guiones (-) indican identidad de
aminoácidos y aspas (x) denotan una región en la que la secuencia
no se determinó. Una barra rellena (|) indica un hueco en la
secuencia y flechas verticales (\downarrow) marcan los posibles
sitios de corte de VP2/VP4 y VP4/VP3. Los dos picos de
hidrofilicidad en la región variable están marcados con una raya
encima.
La figura 4 es un árbol filogenético de las
proteínas estructurales del IBDV usando el programa PAUP (análisis
filogenético mediante el uso de parsimonia), versión 3.0 (Illinois
Natural History Survey, Champaign, Illinois).
La figura 5 refleja la secuencia de ADN y
aminoácidos del fragmento de las proteínas estructurales VP2/VP3/VP4
del virus GLS. Una línea vertical indica los puntos de inicio y
parada de las regiones VP2, VP4 y VP3.
La figura 6 refleja la secuencia de ADN y
aminoácidos del fragmento de las proteínas estructurales VP2/VP3/VP4
del virus E/Del-22.
La figura 7 es una tabla de las identidades de
aminoácidos en posiciones clave (determinantes epitópicos) en ocho
IBDV diferentes.
IBD - bursitis infecciosa como se ha
descrito anteriormente.
IBDV - virus de la bursitis infecciosa, un
virus capaz de, como mínimo, inducir lesiones en la bolsa de
Fabricio de aves de corral infectadas.
Determinantes epitópicos - aminoácidos o
secuencias de aminoácidos que corresponden a epítopos reconocidos
por uno o más anticuerpos monoclonales. La presencia del aminoácido
o de la secuencia de aminoácidos en la posición adecuada de la ORF
origina que el polipéptido muestre el epítopo correspondiente. Un
determinante epitópico se identifica por la identidad de
aminoácido(s) y su posición en la secuencia.
Determinantes epitópicos genéticos -
secuencias de nucleótidos de las ORFs que codifican los
determinantes epitópicos.
Epítopos conformacionales - epítopos
inducidos, total o parcialmente, por la estructura cuaternaria
(tridimensional) de un polipéptido del IBDV. Los epítopos
conformacionales pueden reforzar la unión entre un IBDV y un
anticuerpo monoclonal o inducir la unión donde la misma secuencia
sin el epítopo conformacional no induciría ninguna unión en
absoluto entre el anticuerpo y el polipéptido del IBDV.
Partículas pseudovíricas - partículas
tridimensionales de secuencias naturales o recombinantes de
aminoácidos con la apariencia de la estructura tridimensional del
IBDV (codificada por el segmento de mayor tamaño A) pero sin ARN
vírico. Las partículas pseudovíricas muestran epítopos
conformacionales mostrados por virus nativos de secuencia similar.
Las partículas pseudovíricas se generan por la expresión correcta
del ADN que codifica las proteínas estructurales VP2, VP3 y VP4 en
una ORF correcta.
Región de determinantes epitópicos -
Región limitada de la secuencia de aminoácidos de VP2 del IBDV que
está repleta de determinantes epitópicos, en la que la variación en
los aminoácidos de esta región limitada da lugar a un gran número
de epítopos reconocidos por distintos anticuerpos monoclonales.
Polipéptidos inmunogénicos recombinantes que
muestran los epítopos de dos o más IBDV nativos, así como partículas
pseudovíricas recombinantes que muestran los epítopos de dos o más
IBDV nativos y epítopos conformacionales son inmunógenos efectivos
para vacunas que se pueden usar para conferir protección frente a
una amplia diversidad de infecciones por IBDV en aves de corral
inoculadas. Los polipéptidos recombinantes y las partículas
pseudovíricas se obtienen mediante la expresión de ADN quimérico
preparado por la inserción en la región VP2 de un IBDV de base de
determinantes epitópicos de al menos un segundo IBDV. Esto se lleva
a cabo en la forma más sencilla por sustitución de los determinantes
epitópicos genéticos para las identidades y posiciones de
aminoácidos reflejados en al figura 7. Por tanto, donde el
determinante epitópico del segundo IBDV difiere de aquel del IBDV
de base, el determinante epitópico genético del segundo y diferente
IBDV se inserta en lugar del determinante epitópico genético en
dicha posición en el IBDV de base. Un ejemplo en el que se combinan
los determinantes epitópicos de los IBDV D78,
E/Del-22 y DS326 en el IBDV de base GLS se
establece en la figura 1. Por tanto, se puede preparar una
secuencia de ADN con determinantes epitópicos genéticos para una
pluralidad de IBDV nativos. Estos plásmidos recombinantes se pueden
insertar en una diversidad de vectores de
empaquetamiento/expresión, incluyendo baculovirus, virus de la
viruela aviar, virus del herpes de los pavos, adenovirus y vectores
de transfección similares. Los vectores pueden usarse para infectar
células de expresión convencionales, como las células SF9, líneas
celulares de fibroblastos de embriones de pollo, células de riñones
de embriones de pollo, células Vero y vehículos de expresión
similares. Los procedimientos de transfección y los procedimientos
de expresión, así como la inserción de plásmidos en vehículos de
transfección son bien conocidos y no constituyen un aspecto de la
invención por sí mismos.
La expresión del ADNc quimérico de la invención
genera polipéptidos inmunogénicos que reflejan los epítopos de una
pluralidad de IBDV nativos, y la expresión de un segmento de ADNc
de VP2, VP3 y VP4 recombinante, en que la región VP2 comprende de
nuevo determinantes epitópicos genéticos de al menos dos IBDV
nativos, da lugar a partículas pseudovíricas inmunogénicas.
Los polipéptidos inmunogénicos y las partículas
pseudovíricas se pueden recoger mediante técnicas convencionales
(Dobos y col. (1979) J. Virol. 32:593-605). Los
polipéptidos y partículas pseudovíricas pueden usarse para preparar
vacunas que conferirán protección en aves de corral inoculadas, en
particular en pollos, y en una realización preferida, pollos
broiler, frente a la infección por todo IBDV que porte un epítopo
reflejado en la pluralidad de los determinantes epitópicos
presentes en el inóculo. Por tanto, un solo inmunógeno da lugar a
inmunidad frente a una diversidad de IBDV, todo IBDV cuyo
determinante epitópico genético haya sido incorporado en el ADNc
quimérico.
La administración de vacunas puede llevarse a
cabo eficazmente de acuerdo con procedimientos bien establecidos. En
la patente US 5064646 se describen procedimientos para la
inoculación eficaz de pollos basados en el, entonces novedoso,
aislamiento GLS del IBDV. En esta invención pueden emplearse
regímenes similares de administración y dosificación. Dado que los
polipéptidos y las partículas pseudovíricas carecen de ARN viral,
son avirulentos. Las vacunas pueden prepararse, por lo tanto,
mediante la simple incorporación de los polipéptidos inmunogénicos
y las partículas pseudovíricas en un vehículo farmacéutico,
típicamente una suspensión o una mezcla. Los valores de dosificación
adecuados se determinan sobre todo mediante técnicas rutinarias de
prueba y error, dados los diferentes títulos de anticuerpos
inducidos y/o la cantidad de los diferentes epítopos presentes que
inducirán una completa inmunización cruzada a una infección
virulenta. En general pueden usarse vehículos farmacológicamente
aceptables como tampón fosfato salino (PBS), medio de cultivo de
células, coadyuvantes oleosos del diluyente de la vacuna del virus
de Marek y otros coadyuvantes, etc. La administración se realiza
preferentemente a gallinas que entran en período de puesta de
huevos, lo que proporciona la inducción de anticuerpos que se
transfieren pasivamente a través del huevo al pollo, para evitar
una infección temprana por los IBDV presentes en el campo. Por el
contrario, la vacuna recombinante puede administrarse en un vector
de replicación en cualquier momento de la vida del pollo,
preferentemente con un día de edad. La experiencia ha demostrado
que, generalmente, el nivel de protección se puede mejorar con una
segunda inoculación.
Esta invención pueden entenderse mejor con
referencia a los ejemplos específicos que se establecen a
continuación.
Para determinar la base molecular de la variación
antigénica en el IBDV, se clonó el segmento genómico A de cuatro
cepas del IBDV: GLS, DS326, la variante Delaware E (E/Del) y D78 y
se caracterizó por secuenciación. Por comparación de las secuencias
deducidas de aminoácidos de estas cepas con otras secuencias de los
serotipos 1 y 2 publicadas con anterioridad, se identificaron los
supuestos restos de aminoácidos implicados en la unión con diversos
AMCs neutralizantes y se examinó la relación filogenética de las
proteínas estructurales del IBDV.
Las cepas del IBDV, GLS, DS326 y STC se
propagaron en la bolsa de pollos libres de patógenos específicos
(SPAFAS, Inc., Norwich, CT, EEUU). Las cepas del IBDV adaptadas a
cultivo de tejidos, E/Del-22, D78 y OH (serotipo 2)
se propagaron en células primarias de fobroblastos de embriones de
pollo derivados de huevos con embriones de 10 días de edad (SPAFAS,
Inc.) y se purificaron como se ha descrito (Snyder y col. (1988a)
Avian Dis. 32:527-534). Los AMCs contra diversas
cepas del IBDV se produjeron y caracterizaron utilizando protocolos
descritos previamente (Snyder y col. (1988a) Avian Dis.
32:527-534; Snyder y col. (1988b) Avian Dis.
32:535-539). Los AMCs B69 y R63 se prepararon contra
la cepa D78, mientras que los AMCs 8, 10, 57 y 179 se prepararon
contra la cepa GLS. Además, se preparó un nuevo AMC 67
neutralizante y específico de la cepa E/Del. La identificación de
los antígenos del IBDV por un ELISA de captura de antígenos
modificado (ELISA-CA) se llevó a cabo como se ha
descrito (Snyder y col (1992) Arch. Virol.
127:89-101).
Diversas cepas del IBDV se caracterizaron por sus
reactividades con una serie de AMCs como se muestra en la tabla
1.
| Reactividades con AMCs | ||||||||
| Cepas víricas | Clasificación | B69 | R63 | 179 | 8 | 10 | 57 | 67 |
| D78 | clásica | + | + | + | + | + | - | - |
| PBG98 | clásica | - | + | + | + | + | - | - |
| STC | clásica | + | + | + | + | + | - | - |
| 52/70 | clásica | + | + | + | + | - | - | - |
| OH (serotipo 2) | clásica | + | + | + | + | - | - | - |
| E/Del | variante | - | + | + | + | - | - | + |
| GLS | variante | - | - | + | + | + | + | - |
| DS326 | variante | - | - | - | + | + | + | - |
Todos los virus estándar del serotipo 1
reaccionaron con los AMCs B69, R63, 179 y 8, excepto PBG98 (una
vacuna británica, Intervet, UK) que no reaccionó con el AMC B69. En
contraste, todas las variantes víricas de los EEUU carecen del
epítopo neutralizante del virus B69. Además, las variantes GLS y
DS326 carecen del epítopo R63 pero tienen en común un epítopo
definido por el AMC 57. Por lo tanto, basado en las reactividades
con diversos AMCs estos virus se agruparon antigénicamente como
clásicos, GLS, DS326 y E/Del como variantes.
Se prepararon clones de ADN complementario que
contenían toda la región codificante del segmento de ARN de mayor
tamaño de diversas cepas del IBDV mediante procedimientos de
clonación estándar y procedimientos descritos previamente (Vakharia
y col. (1992) Avian Dis. 32:736-742; Vakharia y col.
(1993) J. Gen. Virol. 74:1201-1206). La completa
secuencia de nucleótidos de estos clones de ADNc se determinó por
el procedimiento dideoxi mediante un kit de secuenciación de ADN
con secuenasa (US Biochem. Corp., Columbus, OH). Las secuencias de
ADN y las secuencias deducidas de aminoácidos se analizaron
mediante un paquete de software PC/GENE (Intelligenetics, Inc.).
Estos análisis se reflejan en las figuras 5 y 6. Los datos de la
secuencia de nucleótidos de la cepa GLS se han depositado en la
biblioteca de datos GenBank y se les ha asignado el número de
acceso M97346.
Comparaciones de la secuencia de nucleótidos de
la cepa GLS (3230 bp de longitud) con ocho cepas del serotipo 1 y
una cepa del serotipo 2 del IBDV mostraron una homología de
secuencia \geq 92% y \geq 82%, respectivamente; lo que indica
que estos virus se encuentran estrechamente relacionados. Es
interesante observar que solamente hay de seis a nueve sustituciones
de bases entre las cepas D78, PBG98 y Cu-l, lo que
corresponde a una diferencia de aproximadamente el 0,2% al 0,3%
(resultados no mostrados). La figura 3 y la tabla 2 muestran una
comparación de las secuencias deducidas de aminoácidos y el
porcentaje de homología de la ORF de mayor tamaño del segmento A de
las diez cepas del IBDV, incluyendo cuatro cepas del IBDV usadas en
este estudio.
Estas comparaciones muestran que las proteínas
están muy conservadas. El grado de diferencia en la secuencia de
aminoácidos se extiende desde el 0,4% para la comparación de D78
frente a Cu-1 y el 10,3% para la comparación del
serotipo 1 (E/Del) frente al serotipo 2 (OH).
En la figura 3, los alineamientos de las
secuencias deducidas de aminoácidos de la ORF de mayor tamaño (1012
restos) de diez cepas del IBDV (incluyendo cuatro usadas en este
estudio) muestran que la mayor parte de los cambios de aminoácidos
tienen lugar en la región variable central, entre los restos 213 y
322 de la proteína VP2, como ha sido demostrado anteriormente por
Bayliss y col. (1990) J. Gen. Virol. M,
71:1303-1312. Es interesante observar que todas las
variantes de los EEUU (GLS, DS326 y E/Del) difieren de las otras
cepas en las dos regiones hidrófilas marcadas con una raya por
encima en la figura 3 (restos 212 a 223 y restos 314 a 324). Se ha
demostrado que estas dos regiones hidrófilas son importantes en la
unión de los AMCs neutralizantes y, por lo tanto, pueden estar
implicadas en la formación de un epítopo neutralizante del virus
(Heine y col. (1991) J. Gen. Virol. 22:1835-1843).
Recientemente, hemos demostrado que los AMCs dependientes de
conformación, B69, R63, 8, 179, 10 y 57 (véase tabla 2)
inmunoprecipitan la proteína VP2 (Snyder y col. (1992) Arch. Virol.
127:89-101). Además, el AMC 67, específico para
E/Del, también se une a la proteína VP2. Por lo tanto, para
identificar los aminoácidos implicados en la formación de epítopos
neutralizantes del virus y, por tanto, en la variación antigénica
comparamos las secuencias de aminoácidos de la proteína VP2 de virus
clásicos y variantes.
La comparación de la secuencia de D78 con la
secuencia de PBG98 muestra solo cuatro sustituciones de aminoácidos
en las posiciones 76, 249, 280 y 326. Sin embargo, las cepas STC y
52/70 también difieren de la secuencia de D78 en las posiciones 76,
280 y 326, pero estos virus se unen al AMC B69. Esto implica que la
Gln en la posición 249 (Gln249) puede estar implicada en la unión
con el AMC B69. Se ha de observar que todas las variantes de los
EEUU tienen una sustitución Gln\rightarrowLys en esta posición y,
por tanto, escapan a la unión con el AMC neutralizante B69. De
forma similar, la comparación de la secuencia de GLS con la
secuencia de DS326 en la región variable muestra seis sustituciones
de aminoácidos en las posiciones 222, 253, 269, 274, 311 y 320. Sin
embargo, otras cepas del IBDV que se unen al AMC 179 tienen
sustituciones de aminoácidos en las posiciones 222, 253, 269 y 274
que están conservadas en la naturaleza. Por lo tanto, esto sugiere
que Glu311 y Glu320 pueden estar implicados en la unión con el AMC
179. De nuevo, la comparación de las secuencias de GLS y DS326 con
todas las otras secuencias del IBDV muestra una única sustitución
Ala\rightarrowGlu en la posición 321, sugiriendo la contribución
de este resto en la unión con el AMC 57. Dado que el AMC 57 no
compite con el AMC R63, es imaginable que Ala321 pueda contribuir a
la unión con el AMC R63. De forma similar, la comparación de la
secuencia de E/Del con otras secuencias muestra cinco sustituciones
únicas en las posiciones 213, 286, 309, 318 y 323. Sin embargo, la
comparación de esta secuencia de E/Del (de un virus derivado de
cultivo de tejidos) con las secuencias de VP2 de A/Del y E/Del
publicadas previamente (virus derivados de la bolsa) sugiere la
implicación de Ile286, Asp318 y Glu323 en la unión con el AMC 67,
ya que los restos en las posiciones 213 y 309 no están sustituidos
en las secuencias de A/Del y E/Del, respectivamente (Heine y col.
(1991) J. Gen. Virol. 22:1835-1843; Lana y col.
(1992) Virus Genes 6:247-259; Vakharia y col. (1992)
Avian Dis. 36:736-742.
Las comparaciones de las secuencias de
aminoácidos también muestran una diferencia sorprendente entre las
secuencias del serotipo 1 y el serotipo 2. En la cepa OH del
serotipo 2 hay una inserción de un resto de aminoácido en la
posición 249 (serina) y una deleción de un resto en la posición 680.
Previamente se ha demostrado que los virus del serotipo 2 son de
forma natural avirulentos y no causan lesiones patológicas en
pollos (Ismail y col. (1988) Avian Dis.
32:757-759). Por lo tanto, estos sutiles cambios en
las proteínas estructurales de la cepa OH del serotipo 2 pueden
desempeñar un papel importante en la patogenicidad del virus.
Además, se ha postulado la hipótesis de que un motivo de secuencia
de aminoácidos,
S-W-S-A-S-G-S,
(restos 326 a 332) está conservado solo en las cepas virulentas y
podría estar implicado en la virulencia (Heine y col. (1991) J.
Gen. Virol. 22:1835-1843). Este motivo de secuencia
estaba también conservado en diversas cepas patógenas del IBDV
aisladas en Japón (Lin y col. (1993) Avian Dis.
37:315-323). La comparación de las secuencias de
aminoácidos en la región de este heptapéptido revela que la cepa OH
del serotipo 2 no patógeno tiene tres sustituciones, mientras que
cepas débilmente patógenas del serotipo 1 (D78,
Cu-1, PBG98 y 002-73) tienen una o
dos sustituciones es esta región. Además, la comparación de las
gráficas de hidrofilicidad de la región variable (aminoácidos 213 a
332) de cepas variantes del serotipo 1 y de la cepa OH del serotipo
2 indican una drástica reducción en la región del segundo pico
hidrófilo (restos de aminoácidos 314 a 324) para el serotipo 2
(resultados no mostrados). Dado que la mayor parte de los restos de
aminoácidos que causan variación antigénica residen en esta región,
estos restos pueden desempeñar un papel importante en la formación
de los epítopos neutralizantes del virus, así como en la
especificidad serotípica.
Para evaluar la relación antigénica de las
proteínas estructurales de diversas cepas del IBDV se construyó un
árbol filogenético basado en las secuencias de la ORF de mayor
tamaño de diez cepas del IBDV, incluyendo las variantes de los EEUU
incluidas en este estudio (figura 4). Se distinguieron tres linajes.
El primero, que es el más distante de los demás, es la cepa OH del
serotipo 2 y el segundo es la cepa australiana del serotipo 1
(002-73), geográficamente distante. El tercer
linaje consta de cuatro grupos distintos. El primer y segundo grupos
incluyen cepas altamente patógenas, concretamente la cepa infectiva
estándar (STC) en EEUU y la cepa de campo británica (52/70). El
tercer grupo comprende todas las cepas europeas. Las cepas de
vacuna D78 (Holanda), PBG98 (Reino Unido) y la cepa débilmente
patógena Cu-1 (Alemania). El cuarto grupo consta de
las cepas variantes de EEUU, en el que E/Del forma un subgrupo
diferente. Los grupos formados por el análisis filogenético se
correlacionan muy bien con los modelos de reactividad con los AMCs
(véase tabla 1). Como se muestra en la figura 4, todos los virus
variantes de EEUU que carecen el epítopo B69 forman un grupo
distinto, mientras que todos los virus clásicos que contienen un
epítopo B69 forman otro grupo (excepto PBG98). Además, las cepas
estrechamente relacionadas GLS y DS326, que contienen un epítopo
común AMC 57 y carecen del epítopo R63, pudieron separarse de la
otra cepa variante E/Del.
Basándose en esta información se construyó una
vacuna recombinante de la forma siguiente:
Se construyó y evaluó un baculovirus recombinante
que expresaba proteínas estructurales VP2, VP3 y VP4 quiméricas de
la cepa GLS. El baculovirus recombinante expresó una proteína VP2
quimérica que incorporaba todos los sitios de neutralización de GLS
definidos por los AMCs, así como un sitio de neutralización (B69)
específico de las cepas clásicas del IBDV en la forma de un
segmento VP2-VP4-VP3.
Se prepararon clones de ADN complementario que
contenían toda la región codificante del segmento de mayor tamaño de
las cepas GLS y D78 del IBDV mediante procedimientos de clonación
estándar y procedimientos descritos previamente (Vakharia y col.
(1992) Avian Dis. 36:736-742; Vakharia y col.
(1993) J. Gen. Virol. 74:1201-1206). Para insertar
la secuencia génica codificante del epítopo B69 de la cepa D78 del
IBDV, se construyó el plásmido pB69GLS de la manera siguiente
(véase figura 1). Clones de ADNc de longitud completa de D78 y GLS
(plásmidos pD78 y pGLS-5) se digirieron con las
enzimas NdeI-NarI y NarI-SpeI para
liberar un fragmento NdeI-NarI (0,26 kb) y un
fragmento NarI-SpeI (0,28 kb), respectivamente. Estos
dos fragmentos se ligaron a continuación en el plásmido
pGLS-5 cortado con NdeI-SpeI para
obtener el plásmido quimérico pB69GLS. Como resultado de esta
inserción se sustituyeron tres aminoácidos en la proteína VP2 de
GLS. Estas sustituciones tuvieron lugar en las posiciones 222
(Thr-Pro), 249 (Lys-Gln) y 254
(Ser-Gly) en la región variable de la proteína VP2
(Vakharia y col. (1992) Avian Dis. 36:736-742).
Para insertar los genes estructurales quiméricos del IBDV en el
genoma de Baculovirus, el plásmido pB69GLS se digirió
completamente con la enzima BstEII y parcialmente con la
enzima BamHI, se combinó con el fragmento
NheI-BstEII (derivado del plásmido pGLSBacI, véase
Vakharia y col. (1993) J. Gen. Virol. 74:1201-1206)
y después se ligó con el vector de transferencia pBlueBacII
(Invitrogen Corp., San Diego, CA) cortado con
NheI-BamHI. Finalmente, se obtuvo el baculovirus
recombinante I-7 usando procedimientos descritos
previamente (Vakharia y col. (1993) J. Gen. Virol.
74:1201-1206). Véase tabla 3.
Células SF9 de Spodoptera frugiperda,
infectadas a una multiplicidad de 5 UFP por célula con el
baculovirus recombinante I-7, se propagaron como
cultivos en suspensión en botellas de un litro con medio
TNM-FH de Hink (JHR Biosciences, Lenxa, KS)
suplementado con el 10% de suero bovino fetal a 28ºC durante 3 a 4
días. Las células infectadas se recogieron por centrifugación a baja
velocidad, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en un
volumen mínimo de PBS. La masa de células se sonificó en un baño de
hielo tres veces durante un minuto, con intervalos de 2 minutos y
se clarificó por centrifugación a baja velocidad. Una alícuota de
cada lisado celular se ensayó con AMCs contra el IBDV mediante
ELISA-CA para estimar la masa antigénica presente
(Snyder y col. (1988b) Avian Dis. 32:535-539). Las
preparaciones con las masas antigénicas más altas se reunieron y se
titularon comparativamente en un ELISA-CA contra la
vacuna de baculovirus recombinante para el IBDV,
V-IBDV-7-1, usada en
un estudio previo (Vakharia y col. (1993) J. Gen. Virol.
74:1201-1206). La masa antigénica de la preparación
recombinante I-7, como se determinó mediante
ELISA-CA con el AMC neutralizante específico de
grupo 8, se ajustó por dilución para ser igual a la de la vacuna
V-IBDV-7-1 y se
emulsionó a continuación con un volumen igual del coadyuvante
incompleto de Freund y se usó para inoculación.
Los virus infectivos: las cepas clásicas IM y STC
y las cepas variantes E/Del y GLS-5 se obtuvieron
de fuentes reconocidas previamente (Snyder y col. (1988a) Avian
Dis. 32:527-534; Snyder y col. (1992) Arch. Virol.
127:89-101). Tras una instilación intraocular, los
virus se titularon en las bolsas de pollos libres de patógenos
específicos (SPF) (SPAFAS, Inc., Storrs, Conn.). Para las cepas
STC, E/Del y GLS-5 se determinó una dosis de 100
para el 50 por ciento de pollos infectados (CID_{50} 100) basada
en mediciones del peso de la bolsa respecto al peso corporal. Las
cien dosis letales (100 LD) de la cepa IM se calcularon basadas en
la mortalidad a los ocho días de la inoculación
("post-inoculation" PI).
Pollos Leghorn blancos se criaron desde la salida
del huevo en unidades de aislamiento con filtración HEPA (Monair
Anderson, Peachtree City, GA). Se tomaron muestras previas de
sangre de pollos de ocho semanas, se les ataron las alas
individualmente, se dividieron en 10 grupos de 15 pollos y se
trataron de la forma siguiente. Los pollos de los grupos
I-V no recibieron inoculaciones y sirvieron como
controles negativos o positivos de infección. Los pollos de los
grupos V-X se inocularon por vía intramuscular con
0,5 ml del inóculo I-7 preparado anteriormente a
partir de los lisados de células infectadas por baculovirus
recombinantes. A las tres semanas después de la inoculación se
tomaron muestras de sangre de todos los pollos y los pollos de los
grupos II-IX se infectaron con la cepa infectiva
apropiada del IBDV por instilación ocular. Cuatro días después de
la infección, cinco pollos de cada grupo se sacrificaron de forma
humanitaria y se les extirpó la bolsa cloacal. Todas las bolsas se
procesaron y posteriormente se analizaron por la presencia del
antígeno del IBDV mediante ELISA-CA como se ha
descrito (Snyder y col. (1988b) Avian Dis.
32:535-539). Además, los pollos en los grupos
infectados con IM se contabilizaron como muertos y se sacrificaron
humanitariamente cuando fue evidente que estaban moribundos debido
a la infección por IM. Ocho días después de la infección se
sacrificaron y pesaron los pollos restantes en todos los grupos. La
bolsa de Fabricio de cada pollo se extirpó cuidadosamente y también
se pesó. Se calculó la relación del peso de la bolsa al peso
corporal para cada pollo como ha sido descrito por Lucio y Hitchner
(Lucio y col. (1979) Avian Dis. 23:466-478). Todo
valor para los pollos infectados individualmente que se encontrará
a más o menos dos unidades de desviación estándar de la media del
correspondiente grupo de control se contabilizó como un indicador
positivo de la infección por IBDV. Las bolsas abiertas se fijaron
por inmersión en formalina neutra tamponada al 10%. Porciones
transversales de las bolsas se procesaron a través de alcoholes de
distintos grados y xileno, se insertaron en parafina, se
seccionaron, se tiñeron con hematoxilina-eosina y
se examinaron con un microscopio óptico. La protección frente a la
infección se definió como la ausencia de cualquier lesión inducida
por el IBDV en la bolsa de Fabricio.
La cepa clásica D78, así como la cepa variante
del IBDV adaptada a cultivos celulares, GLS, se crecieron en células
primarias de fibroblastos de embriones de pollo y se usaron en
pruebas de neutralización de virus (NV) para analizar los sueros
del ensayo de la vacuna, esencialmente como se ha descrito (Snyder y
col. (1988a) Avian Dis. 32:527-534). El suero de
los ensayos también se analizó por la presencia de anticuerpos
contra el IBDV usando un kit comercial ELISA de anticuerpos del
IBDV (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD).
El contenido antigénico de la vacuna quimérica de
GLS contra el IBDV, I-7, se evaluó en un
ELISA-CA con una serie de AMCs específicos de VP2 y
VP3. La masa antigénica relativa de cada epítopo expresado en la
vacuna I-7 se comparó con lotes analizados
previamente de vacunas de subunidades de GLS no modificadas
expresadas por baculovirus (Vakharia y col. (1993) J. Gen. Virol.
74:1201-1206). El estado de cada epítopo definido
por un AMC en la vacuna quimérica I-7 se comparó
con el estado de aquellos epítopos definidos por AMCs que se
encuentran en los virus de infección del IBDV de tipo salvaje
usados para evaluar la eficiencia de la vacuna I-7.
La tabla 3 muestra que los niveles de masa antigénica para los
epítopos 8, 57 y B29 de la actual vacuna quimérica
I-7 fueron similares a los de una vacuna de
subunidades de GLS no modificadas analizada recientemente,
V-IBDV-7-1, pero
aproximadamente 4 veces superiores a los de la vacuna original no
modificada V-IBDV-7.
| Nivel relativo de epítopo AMC^{A} | Infección | Estado del epítopo AMC^{B} | |||||||||
| Vacuna | 8 | 57 | B69 | 67 | B29 | Virus | 8^{C} | 57^{C} | B69^{C} | 67^{C} | B29^{D} |
| V-IBD-7^{E} | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | GLS | + | + | - | - | + |
| V-IBD-7-1^{E} | 3 | 3 | 0 | 0 | 2 | STC | + | - | + | - | + |
| I-7^{F} | 3 | 3 | 9 | 0 | 2 | IM | + | - | + | - | + |
| E/Del | + | - | - | + | + | ||||||
| ^{A} \begin{minipage}[t]{155mm} El nivel relativo de cada epítopo AMC se determinó por ELISA-CA, y el nivel de cada epítopo AMC se fijó en 1 para la vacuna usada previamente, V-IBD-7 (15). El máximo nivel es 9. Cada incremento de 1,0 representa aproximadamente el doble de la cantidad de epítopo presente en la vacuna original V-IBD-7. La vacuna V-IBD-7-1 también ha sido descrita previamente (16). \end{minipage} | |||||||||||
| ^{B} El estado de los epítopos AMC se determinó por ELISA-CA y se representa como presente (+) o ausente (-). | |||||||||||
| ^{C} El epítopo neutralizante del AMC reside en VP2 del IBDV. | |||||||||||
| ^{D} El epítopo no neutralizante del AMC reside en VP3 del IBDV. | |||||||||||
| ^{E} \begin{minipage}[t]{155mm} Vacunas de baculovirus recombinantes que incorporan proteínas no modificadas del segmento de mayor tamaño A de GLS. \end{minipage} | |||||||||||
| ^{F} \begin{minipage}[t]{155mm} Vacuna actual de baculovirus recombinante que incorpora proteínas quiméricas modificadas del segmento de mayor tamaño A de GLS. \end{minipage} | |||||||||||
Una diferencia principal entre las vacunas no
modificadas y quiméricas fue la aparición del epítopo clásico B69 en
el producto quimérico de GLS. El nivel del epítopo B69 se fijó
arbitrariamente en 9, ya que no se pudieron establecer
comparaciones con las vacunas de subunidades de GLS no modificadas.
Por comparación del estado de los epítopos definidos por los AMC de
los virus de infección con las vacunas de las subunidades de GLS,
no modificadas y quiméricas, (tabla 3) se pudo observar que
mientras el producto quimérico expresó el epítopo que se encuentra
en los virus infectivos clásicos STC e IM, también retuvo todos los
epítopos homólogos de GSL.
La tabla 4 muestra los resultados de un ensayo de
protección cruzada y resultados serológicos obtenidos antes de la
infección.
| Número protegido | ^{2}Log media título NV | |||||||
| Grupo | Vacunación^{A} | Infección^{B} | ELISA | Histo^{D} | Relación | D78 | GLS | media |
| n° | -CA^{C} | bolsa/ | ELISA | |||||
| cuerpo^{D} | ||||||||
| I | ninguna | ninguna | NA | NA | NA | \leq4 | \leq4 | 0 |
| II | ninguna | STC | 0/5 | 0/10 | 0/10 | \leq4 | \leq4 | 0 |
| III | ninguna | IM | 0/5 | 0/5^{B} | 5/5^{B} | \leq4 | \leq4 | 0 |
| IV | ninguna | E/Del | 0/5 | 0/10 | 0/10 | \leq4 | \leq4 | 0 |
| V | ninguna | GLS-5 | 0/5 | 0/10 | 0/10 | \leq4 | \leq4 | 0 |
| VI | I-7 | STC | 5/5 | 10/10 | 10/10 | 107,7(1,8)^{F} | 10,4(1,4)^{F} | 1235(312)^{F} |
| VII | I-7 | IM | 5/5 | 10/10 | 10/10 | 10,0(1,4) | 10,4(2,1) | 1201(791) |
| VIII | I-7 | E/Del | 5/5 | 10/10 | 10/10 | 11,4(1,2) | 10,6(1,9) | 1089(409) |
| IX | I-7 | GLS-5 | 5/5 | 10/10 | 10/10 | 11,0(1,5) | 12,0(2,0) | 1220(339) |
| X | I-7 | ninguna | 5/5 | NA | NA | 9,9(1,4) | 9,3(1,4) | 1140(473) |
| ^{A} La vacunación tuvo lugar a las ocho semanas de edad | ||||||||
| ^{B} \begin{minipage}[t]{155mm} La infección con los virus se realizó por instilación intraocular a las tres semanas de la inoculación o a las once semanas de edad en los controles. \end{minipage} | ||||||||
| ^{C} \begin{minipage}[t]{155mm} La protección se determinó mediante examen por ELISA-CA de 1/3 de cada grupo, cuatro días después de la infección. \end{minipage} | ||||||||
| ^{D} \begin{minipage}[t]{155mm} La protección se determinó histológicamente y por la relación del peso de la bolsa al peso corporal a los ocho días. \end{minipage} | ||||||||
| ^{E} \begin{minipage}[t]{155mm} Cinco pollos se contabilizaron como muertos debido a la infección con IM antes de los ocho días después de la infección. \end{minipage} | ||||||||
| ^{F} Una desviación estándar. |
Los grupos II-V sirvieron como
controles de infección y, como indican las evaluaciones
ELISA-CA, de relación del peso de la bolsa al peso
corporal e histológica, todos los pollos no vacunados fueron
completamente susceptibles a la infección virulenta por el IBDV con
todas las cepas usadas. La infección por IM produjo una enfermedad
letal en un tercio del grupo de pollos de control. Por el
contrario, pollos de ocho semanas de los grupos
VI-IX fueron vacunados una vez con la vacuna
quimérica de GLS, y tres semanas después de la inoculación todos
los pollos vacunados estuvieron completamente protegidos frente a la
infección por todos los virus infectivos, incluyendo la enfermedad
letal producida en los controles por la cepa IM. Serológicamente,
los títulos de las pruebas NV de cruzamiento recíproco llevadas a
cabo en sueros antes de la infección con los virus de cultivo de
tejidos D78 y GLS guardaron esencialmente entre sí una relación
definida por un factor de 2. Los títulos ELISA medios fueron
relativamente bajos, pero también uniformes entre los grupos
vacunados.
En estudios iniciales con vacunas de subunidades
de GLS expresadas por baculovirus, después de la administración de
dos dosis, la vacuna V-IBDV-7 de
GLS (tabla 3) solo pudo inducir niveles de anticuerpos activos
capaces de proporcionar el 79% de protección frente a la infección
por homólogos de GLS (Vakharia y col. (1993) J. Gen. Virol.
74:1201-1206) En un estudio posterior, la masa
antigénica de la vacuna original
V-IBDV-7 se incrementó 4 veces
aproximadamente (calculado en el sitio del AMC específico de grupo
8) y se iniciaron ensayos de infección cruzada con vacunación con
una dosis y dos dosis con la vacuna de la subunidad de GLS no
modificada, designada como
V-IBDV-7 (tabla 3). En estos ensayos, dos dosis de la vacuna proporcionaron una protección cruzada completa frente a la infección por los virulentos STC, E/Del y GLS. Sin embargo, en el ensayo con una dosis de vacuna, mientras se consiguió una protección completa frente a la infección por las variantes del virus E/Del y GLS, solo se alcanzó una protección del 44% frente al virus clásico STC, más distantemente relacionado. Estos estudios podrían significar que se podría obtener esta mejor protección cruzada simplemente mediante el incremento de la masa antigénica y/o de las dosis de la vacuna. Sin embargo, también fue evidente, en ausencia de vacunación homóloga, que inferiores niveles de anticuerpo, inducidos por una dosis de la vacuna de la subunidad de GLS V- IBDV-7-1, no ofrecieron suficiente protección cruzada frente a la infección por IBDV clásicos. Esto podría significar que con niveles de anticuerpo aún inferiores, como en los casos de anticuerpo materno en disminución, esta protección cruzada se reduciría probablemente aún más. De hecho, aunque sin estar infectada por el virus STC, en algunos estudios de anticuerpos maternos pasivos llevados a cabo usando otra dosificación de la vacuna V-IBDV-7, mientras se alcanzó protección homóloga frente a GLS, la progenie de las gallinas vacunadas solo estuvo protegida en el 57% frente a una infección por el más estrechamente relacionado E/Del.
V-IBDV-7 (tabla 3). En estos ensayos, dos dosis de la vacuna proporcionaron una protección cruzada completa frente a la infección por los virulentos STC, E/Del y GLS. Sin embargo, en el ensayo con una dosis de vacuna, mientras se consiguió una protección completa frente a la infección por las variantes del virus E/Del y GLS, solo se alcanzó una protección del 44% frente al virus clásico STC, más distantemente relacionado. Estos estudios podrían significar que se podría obtener esta mejor protección cruzada simplemente mediante el incremento de la masa antigénica y/o de las dosis de la vacuna. Sin embargo, también fue evidente, en ausencia de vacunación homóloga, que inferiores niveles de anticuerpo, inducidos por una dosis de la vacuna de la subunidad de GLS V- IBDV-7-1, no ofrecieron suficiente protección cruzada frente a la infección por IBDV clásicos. Esto podría significar que con niveles de anticuerpo aún inferiores, como en los casos de anticuerpo materno en disminución, esta protección cruzada se reduciría probablemente aún más. De hecho, aunque sin estar infectada por el virus STC, en algunos estudios de anticuerpos maternos pasivos llevados a cabo usando otra dosificación de la vacuna V-IBDV-7, mientras se alcanzó protección homóloga frente a GLS, la progenie de las gallinas vacunadas solo estuvo protegida en el 57% frente a una infección por el más estrechamente relacionado E/Del.
La vacuna quimérica GLS I-7, que
incorpora el epítopo de neutralización clásico B69, se evaluó en un
ensayo de infección cruzada con vacunación con una sola dosis. Para
hacer comparable el presente ensayo con ensayos anteriores, la
vacuna I-7 se formuló de modo que la masa antigénica
relativa de la vacuna de la subunidad quimérica I-7
fuera casi idéntica, por ELISA-CA, a la de la vacuna
no modificada
V-IBDV-7-1 usada
previamente (tabla 3). La tabla 4 muestra los resultados de la
infección cruzada después de administrar una sola dosis de la
vacuna I-7. Los resultados fueron similares a los
obtenidos con la vacuna no modificada
V-IBDV-7-1 usada
previamente, en que la protección frente a las cepas GLS y E/Del fue
completa. Sin embargo, la vacuna I-7 ofreció
completa protección frente a la infección patógena y letal por las
cepas clásicas STC e IM, respectivamente. Dado que las masas
antigénicas de los epítopos de GLS y de los epítopos comunes de
grupo en las vacunas V-IBDV-7 e
I-7 fueron cuidadosamente equilibradas e igualadas,
es razonable concluir que el aumento comparativo en eficacia de la
vacuna I-7 frente a la infección por cepas clásicas
del IBDV fue debido solamente a la incorporación del epítopo de
neutralización de los IBDV clásicos, B69, en la secuencia de la
proteína VP2 de GLS.
Como se ha observado anteriormente, el ADNc
recombinante y los inmunógenos expresados a partir del mismo de esta
invención pueden limitarse a la región inmunogénica VP2. En otras
palabras, puede ser suficiente preparar un clon de ADNc que
codifique los determinantes epitópicos de un virus de base, por
ejemplo GLS, así como un segundo determinante epitópico de un IBDV
como D78. Otros determinantes epitópicos, todos en la región de
determinantes epitópicos de VP2 pueden incorporarse, clonarse y
expresarse como se ha discutido anteriormente.
Como se refleja en la figura 2, partículas
pseudovíricas se generan por la expresión del ADN que codifica las
secuencias de las proteínas estructurales
VP2-VP4-VP3. Los inmunógenos de
estas partículas pseudovíricas pueden separarse de los inmunógenos
correspondientes solo a VP2, tanto en términos de anticuerpos
monoclonales como por procedimientos de separación convencionales
como electroforesis y cromatografía. Sin embargo, la diferencia en
reactividad con anticuerpos monoclonales indica con fuerza que en
las partículas pseudovíricas inducidas por la secuencia de las
proteínas estructurales VP2-VP4-VP3
se encuentran epítopos presentes que no están presentes en
inmunógenos expresados solo por la idéntica región VP2. Estos
epítopos son tanto lineales como conformacionales. Los epítopos
conformacionales difieren de los epítopos lineales y se reflejan en
la conformación, no solo en la secuencia de aminoácidos del virus
mismo. Como resultado, la inoculación de aves de corral con una
partícula pseudovírica recombinante puede proporcionar una
protección frente a la infección de campo por IBDV aún superior a
la inoculación con los inmunógenos de la región VP2 solamente. Esto
es debido al ensamblaje espontáneo de todos los elementos
estructurales del virus.
Los solicitantes han descubierto que la expresión
de la región VP2 como parte del segmento único de las proteínas
estructurales VP2-VP4-VP3 genera
partículas pseudovíricas como las de la figura 2. Se ha demostrado
que estas partículas reaccionan con anticuerpos que no reaccionan
de forma similar con el idéntico inmunógeno VP2 recombinante. Por
tanto, las partículas pseudovíricas pueden dar lugar a títulos de
anticuerpos superiores y/o una protección sutilmente diferente (más
amplia) cuando se inoculan aves de corral huésped con ellas.
Por lo tanto, esta invención incluye (1)
inmunógenos VP2 recombinantes que comprenden determinantes
epitópicos de al menos dos cepas diferentes del IBDV y (2)
partículas pseudovíricas de segmentos
VP2-VP4-VP3, en las que la región
VP2 de nuevo contiene determinantes epitópicos de al menos dos
cepas diferentes del IBDV, así como las secuencias de nucleótidos
que codifican 1 y 2, y vacunas incluyendo los mismos.
Como se refleja en los ejemplos establecidos
anteriormente, determinantes epitópicos genéticos de una cepa del
IBDV pueden insertarse en la región VP2 de una secuencia genética
diferente de un IBDV de base, y usarse a continuación para expresar
un inmunógeno que presente los epítopos de ambos IBDV. De hecho,
los ejemplos anteriores demuestran la combinación de al menos tres
determinantes epitópicos diferentes del IBDV. Se pueden combinar
más. La vacuna resultante incluye un agente activo, el inmunógeno
expresado, que proporciona protección frente a la infección por un
amplio espectro de IBDV, más bien que las vacunas del tipo anterior
basadas en virus que ofrecen protección frente a una única cepa o
familia de cepas.
La figura 7 refleja las identidades de
aminoácidos en la región de determinantes epitópicos de siete cepas
diferentes del IBDV. No se pretende que se limiten a éstas, sino
que son representativas. Imunógenos recombinantes deseables, tanto
inmunógenos solo de VP2 como inmunógenos de las partículas
pseudovíricas VP2-VP4-VP3, se
construyen mediante sustitución de los determinantes epitópicos
genéticos por los aminoácidos de cambio en las posiciones señaladas
en la figura 7 (las posiciones no señaladas se conservan en todas
las cepas del IBDV). Esto induce la expresión de los inmunógenos de
la invención. Claramente, las combinaciones posibles, aunque
alcanzan un número elevado, tienen un límite y pueden investigarse
con la técnica rutinaria. Las combinaciones representativas tienden
a reflejar combinaciones de determinantes epitópicos para IBDV
dominantes.
Un recombinante E/Del/GLS puede incluir cambios
en la región de determinantes epitópicos de E/Del en las posiciones
213 Asn-Asp, 253 Gln-His y 269
Thr-Ser.
Un recombinante DS326/D78 puede incluir las
sustituciones de aminoácidos, y las correspondientes sustituciones
de nucleótidos, 76 Sr-Gly, 249
Lys-Gln, 253 Gln-His y 270
Ala-Thr.
Evidentemente, una amplia diversidad de
combinaciones son posibles y se le ocurrirán a los expertos en la
materia. La región de determinantes epitópicos que, a grandes
rasgos, incluye la región de los aminoácidos 5-433
de la región VP2, constituye, por tanto, una "casete"
recombinante que puede adaptarse por mutagénesis de sitio
específico para conseguir inserciones y/o deleciones de aminoácidos
para proporcionar los deseados clones de ADNc, polipéptidos,
partículas pseudovíricas y vacunas recombinantes con una protección
mejorada frente a una amplia diversidad de IBDV.
Como se ha observado, típicamente la infección
por el IBDV origina un estado inmunosupresivo y se refleja en
lesiones en la bolsa de Fabricio. Esto es típico de los virus que
se encuentran en los Estados Unidos. Sin embargo, existe un IBDV
letal, es decir, infecciones por IBDV que dan lugar a mortalidad de
pollos como resultado directo de la infección por IBDV. Aunque se
han desarrollado vacunas basadas en el aislamiento de estos IBDV,
las vacunas resultantes son "calientes", es decir, ellas
mismas originan o inducen un estado inmunosupresivo, y los pollos
inoculados deben reforzarse con antibióticos frente a otros agentes
infecciosos. Este método de protección es tan poco deseable como
para haber sido suspendido en la mayoría de las granja avícolas
comerciales en Europa. Actualmente no se dispone de ninguna vacuna
segura contra el IBDV letal.
Los inventores han desarrollado un anticuerpo
monoclonal, AMC 21, depositado bajo las condiciones del Tratado de
Budapest en la "American Type Culture Collection" (Colección
americana de cultivos tipo), nº de acceso del depósito ATCC HB
11566. Este anticuerpo monoclonal es específico y neutralizante de
las cepas letales del IBDV. La especificidad se refleja en la tabla
5, la cual confirma que, a diferencia de otros anticuerpos
monoclonales, el AMC 21 es específico de un epítopo mostrado solo
por las cepas del IBDV con un potencial letal.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
* Cepas de campo: todas las cepas
clásicas de campo analizadas hasta la fecha que se han aislado en
los EEUU tienen el marcador
21.
Nota: 1. Lukert y STC son derivados
de Edgar. 2. Univax es un derivado de Bursa Vac. 3. Bursa Blend es
un derivado de 2512
Winterfield.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha de observar que a lo largo de esta
solicitud se hace referencia a una diversidad de anticuerpos
monoclonales que se usan para confirmar la presencia de los
epítopos de los diferentes IBDV en los inmunógenos quiméricos
recombinantes originales de la solicitud. Estos anticuerpos
monoclonales se han depositado también bajo las condiciones del
Tratado de Budapest y son de libre disposición. Sin embargo, no son
necesarios para la práctica de esta invención y no constituyen un
aspecto de la misma. Esto es a diferencia del AMC 21.
Como en el caso de otros AMCs desarrollados por
los inventores en esta invención para el IBDV, la inmunización
pasiva contra las cepas letales del IBDV, diseñada especialmente
para conseguir inmunización en un nivel uniforme estandarizado y
para aumentar cualquier nivel de procedencia materna contra la
infección de campo por un IBDV letal, puede conseguirse mediante la
vacunación de pollos de un día de edad con una vacuna que comprende
un vehículo farmacológicamente aceptable como los descritos
anteriormente, en el que está presente una cantidad del AMC 21
efectiva para proporcionar una protección mejorada a los pollos
inoculados.
El nivel de protección necesario se puede
conseguir con una sola dosis de la vacuna administrada en el huevo
o a un pollo de un día de edad, con una concentración del AMC 21
entre 1 \mug y 1 mg, o con vacunaciones repetidas con una dosis
efectiva inferior, pero llevadas a cabo durante más tiempo. Si se
usan las vacunaciones repetidas, los niveles de dosificación deben
estar entre 1 \mug y 1 mg. El nivel de concentración necesario
para vacunar pollos de mayor edad aumenta con el peso del ave y se
puede determinar empíricamente.
La investigación más detallada de las secuencias
de aminoácidos de las cepas letales en la región de los
determinantes epitópicos refleja la identidad altamente conservada
del Asn en la posición 279 de VP2 en las cepas no letales, con una
identidad Asp conservada en la misma posición en las cepas letales.
Por consiguiente, el determinante epitópico de la cepa letal
reconocido por el AMC 21, exclusivo de las cepas letales, difiere
empíricamente de aquel de las cepas no letales del IBDV en la
sustitución 279 Asp-Asn. De acuerdo con los
procedimientos establecidos anteriormente, un inmunógeno
recombinante quimérico que confiere una protección eficaz frente al
IBDV letal, algo que no era posible anteriormente con ningún
tipo de vacuna sin inducir un estado inmunosupresivo, puede
prepararse por inserción del determinante epitópico genético para
279Asn en un IBDV de base no letal como GLS. Esto conferirá
protección frente al IBDV de base, al IBDV letal, así como también
a todos los demás IBDV cuyos determinantes epitópicos se inserten.
Las vacunas preparadas a partir de estos inmunógenos, bien de VP2
solo o bien en la forma de partículas pseudovíricas de los
segmentos VP2-VP4-VP3, se usan de la
misma manera discutida anteriormente.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Universidad de Maryland College Park
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4312 Knox Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: College Park
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Maryland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL:20742
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CLONES QUIMÉRICOS DE ADNc DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA, PRODUCTOS DE EXPRESIÓN Y VACUNAS BASADAS EN LOS MISMOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Edición 1.0, Versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 95914198.7
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/219262
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-marzo-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: GLS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CEPA: DS326
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CEPA: E/DEL
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- CEPA: D78
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- CEPA: CU-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (L)
- CEPA: PBG98
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:6:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (M)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (N)
- CEPA: 52/70
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (O)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (P)
- CEPA: STC
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (Q)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (R)
- CEPA: 002-73
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (S)
- ORGANISMO: Virus de la bursitis infecciosa
\vskip0.500000\baselineskip
- (T)
- CEPA: OH
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3230 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 114...3149
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 64...3099
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser}
Claims (5)
1. Un inmunógeno polipeptídico quimérico que
comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 de un
primer virus de la bursitis infecciosa (IBDV) o cepa de base del
IBDV, excepto por al menos un aminoácido X, en el que X es un
determinante epitópico de una segunda cepa del IBDV;
caracterizado porque dicho inmunógeno
polipeptídico confiere protección frente a la infección por IBDV
clásicos y variantes y se selecciona del grupo que consta de:
un inmunógeno polipeptídico quimérico en el que
la cepa de base del IBDV es IBDV GLS y la segunda cepa del IBDV es
IBDV D78 y en el que dicho determinante epitópico de la segunda
cepa del IBDV consta de tres sustituciones de aminoácidos en dicho
IBDV GLS en las posiciones 222, 249 y 254, respectivamente de Thr
por Pro, Lys por Gln y Ser por Gly;
un inmunógeno polipeptídico quimérico en el que
la cepa de base del IBDV es IBDV GLS y la segunda cepa del IBDV es
IBDV E/Del y en el que dicho determinante epitópico de la segunda
cepa del IBDV consta de cinco sustituciones de aminoácidos en dicho
IBDV GLS en las posiciones 269, 284, 286, 318, 321 y 323,
respectivamente de Ser por Thr, Thr por Ala, Thr por Ile, Gly por
Asp, Glu por Ala y Asp por Glu;
un inmunógeno polipeptídico quimérico en el que
la cepa de base del IBDV es IBDV GLS y la segunda cepa del IBDV es
IBDV DS326 y en el que dicho determinante epitópico de la segunda
cepa del IBDV consta de cuatro sustituciones de aminoácidos en
dicho IBDV GLS en las posiciones 269, 284, 311 y 320,
respectivamente de Ser por Thr, Thr por Ala, Glu por Lys y Gln por
Leu;
un inmunógeno polipeptídico quimérico en el que
la cepa de base del IBDV es IBDV E/Del y la segunda cepa del IBDV es
IBDV GLS y en el que dicho determinante epitópico de la segunda
cepa del IBDV consta de tres sustituciones de aminoácidos en dicho
IBDV E/Del en las posiciones 213, 253 y 269, respectivamente de Asn
por Asp, Gln por His y Thr por Ser;
un inmunógeno polipeptídico quimérico en el que
la cepa de base del IBDV es IBDV DS326 y la segunda cepa del IBDV es
IBDV D78 y en el que dicho determinante epitópico de la segunda
cepa del IBDV consta de cuatro sustituciones de aminoácidos en
dicho IBDV DS326 en las posiciones 76, 249, 253 y 270,
respectivamente de Ser por Gly, Lys por Gln, Gln por His y Ala por
Thr.
2. Una vacuna que confiere protección frente al
IBDV en aves de corral, que comprende un inmunógeno polipeptídico
quimérico de la reivindicación 1 y un vehículo farmacológicamente
aceptable.
3. Un ADNc quimérico que cuando se inserta de
forma funcional como ADN heterólogo en el ADN de un huésped de
expresión, codifica el inmunógeno de la reivindicación 1.
4. Un vehículo de transfección para la infección
de un huésped de expresión que comprende el ADNc de la
reivindicación 3 conectado funcionalmente con el ADN de baculovirus,
del virus de la viruela aviar, del virus del herpes de los pavos o
de adenovirus.
5. Un vehículo de expresión para la expresión del
inmunógeno de la reivindicación 1, que comprende un huésped de
expresión seleccionado del grupo que consta de células SF9, células
de fibroblastos de embriones de pollo, células de riñones de
embriones de pollo y células Vero transfectadas con el vehículo de
la reivindicación 4.
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