CN116286978A

CN116286978A - 一种重组载体、重组菌株或细胞系、重组钙结合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN116286978A
Application number: CN202310204900.7A
Authority: CN
Inventors: 林�建; 卢丹青; 杨倩; 李昱辰
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2043-03-03
Also published as: CN116286978B

Abstract

本发明公开了重组质粒、重组菌株或细胞系，重组钙结合蛋白及其应用，具体来源于鸡肠道黏液中的钙结合蛋白，可以在DF1细胞上抵抗M41以及IBDV的。本发明使用重组蛋白、重组质粒分别处理DF1细胞后，细胞中IBDV、IBV‑M41复制量明显降低，IBDV/IBV‑M41病毒的入侵及复制被抑制，且在体内实验上得到了印证。因此，该重组蛋白有望作为预防/治疗鸡传染性支气管炎病毒以及传染性法氏囊病毒的候选蛋白。

Description

一种重组载体、重组菌株或细胞系、重组钙结合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种重组载体、重组菌株或细胞系、重组钙结合蛋白及其应用，具体涉及鸡小肠黏液蛋白钙结合蛋白的应用。

背景技术

鸡作为最常见的养殖禽类之一在禽类产业中占有重要位置。但受到养殖业技术水平限制，家禽养殖常遭遇疾病等影响使得禽类产品的产量下降。解决禽类疾病尤其是传染性疾病，确保禽类产品稳定供应一直是农业生物行业的重要课题。近年来，鸡肉市场一直高位运行，鸡肉需求也越来越大，养殖行业发展迅速，鸡场的养殖模式逐步由散养户向集约化、规模化的方向发展；目前，蛋鸡集约化养殖日粮特点为高能量、高蛋白、低纤维，这种营养特点导致了免疫力下降。不可避免的是随之而来的禽类传染病的频繁发生以及传播扩散。

鸡小肠黏液中的绝大多数蛋白是免疫球蛋白(IgY)、粘蛋白2(MUC2)这种大分子蛋白，已有研亢证明MUC2可以抵抗外来病原体的入侵。研亢表明家禽肠道粘液层中富含很多抗菌物质如β-防御素、溶菌酶、抗生物素蛋白和IgA等，但忽略了对于抗病毒物质的研亢。在猪的小肠粘液中存在MUC2以及一种新型抗病毒蛋白calpain 1对于PEDV存在抗病毒效果。对于家禽来说，IBDV会感染肠道并影响肠道相关淋巴组织和微生物群组成的变化；IBV是引起鸡肠炎的典型病毒，两者均引起的严重生产问题亟待解决。

目前疫苗思路多数从病毒的抗原蛋白出发，而IBDV和IBV均为突变性较强的病毒，抗原区段产生的疫苗具有一定的局限性，因此筛选发挥广谱抗病毒作用的物质应从机体本身出发，探亢鸡小肠黏液中对抗病毒感染的有效成分以及作用的其潜在机制具有进一步研亢的重要性。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种含有编码钙结合蛋白的核酸或基因的重组载体。

本发明还要解决的技术问题是提供了真核及原核重组载体和表达细胞系，其含有所述的核酸或基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种具有抵抗禽传染性法氏囊病毒(IBDV)和禽传染性支气管炎病毒(IBV)感染功能的黏液蛋白的重组钙结合蛋白及其制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了重组载体、重组菌或细胞系，重组钙结合蛋白在制备预防禽传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)M41亚型的感染的药物或疫苗中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体是将编码钙结合蛋白的核酸或基因插入真核表达载体或原核表达载体中获得，所述钙结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述钙结合蛋白为CB-D28K(质谱蛋白编号P04354，名称来源于uniprotNames&Taxonomy栏，通用名，又名Calbindin)。

其中，所述真核表达载体包括但不仅限于pCDNA3.1，原核表达载体包括但不限于pet28a。

其中，编码所述的钙结合蛋白的核酸或基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括重组菌株或细胞系，将所述的重组载体转入宿主菌或宿主细胞后获得。

本发明内容还包括一种重组钙结合蛋白，所述重组钙结合蛋白是通过将所述的重组载体转入宿主菌或宿主细胞后表达、纯化获得。

其中，所述的细胞系是瞬转细胞系，是通过将所述的重组真核载体转入鸡成纤维细胞(DF1)后获得，所述细胞系包括但不仅限于鸡成纤维DF1细胞。

本发明内容还包括一种重组钙结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)编码钙结合蛋白的基因的获得；

2)将编码钙结合蛋白的基因导入表达载体中获得重组载体；

3)将重组载体转入宿主菌或宿主细胞后进行纯化即得。

其中，所述宿主菌为Rosetta菌株，所述宿主细胞为DF1细胞。

本发明内容还包括两种重组钙结合蛋白，包括鸡钙结合蛋白1和包括鸡钙结合蛋白2，所述鸡钙结合蛋白1是通过将所述的核酸或基因导入pet28a中，转入表达菌株中获得，主要用来研亢其胞外功能。所述鸡钙结合蛋白2是通过将所述的核酸或基因导入pCDNA3.1中，瞬转入细胞系获得，主要用来研亢其胞内功能。

本发明内容还包括所述的重组载体、所述的重组菌株或细胞系在生产重组钙结合蛋白中的应用。

本发明内容还包括所述的重组载体、所述的重组菌株或细胞系，所述的重组钙结合蛋白在制备抗IBDV和IBV-M41病毒药物或疫苗中的应用。

其中，所述应用通过其能够结合胞外的钙离子，减少病毒因钙离子过多流入而增加的入侵以及在体内过表达的抗病毒机制在于其影响了细胞中的cGAS-STING通路以及干扰素通路达到抵抗禽传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)的效果。

本发明还包括所述的重组载体、所述的重组菌株或细胞系，所述的重组钙结合蛋白在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎或鸡传染性囊病的药物或疫苗中的应用

本发明还包括利用PEI以及胆酸钠溶液对动物进行滴鼻，检测重组钙结合蛋白的体外免疫作用。

有益效果：本发明首次通过分离纯化获得了鸡钙结合蛋白，并进一步获得了该蛋白的核苷酸及氨基酸序列，通过实验研亢发现，鸡钙结合蛋白可以抵抗禽传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)，因此进一步进行重组鸡钙结合蛋白的制备以及应用。本发明的重组鸡钙结合蛋白具备较高的活性和显著的抗IBDV以及IBV病毒的功能。

附图说明

图1为鸡小肠黏液中蛋白的提取以及全蛋白和分组蛋白的试验效果；

图2为鸡小肠黏液中分组蛋白的试验效果；

图3为质谱分析以及候选蛋白的初筛结果；

图4为生信分析候选蛋白亚细胞定位及信号肽结果；

图5为四种真核载体构建过程；

图6为四种真核载体构建测序结果；

图7为四种真核载体在DF1细胞中表达效果；

图8为四种真核载体转染后24h抗病毒效果；

图9为真核载体pcDNA3.1-CALB1转染后48h抗病毒效果；

图10为CALB1在小肠及外泌体中存在的结果；

图11为原核载体pet28a-CALB1构建过程及测序结果；

图12为原核载体pet28a-CALB1表达优化及纯化结果；

图13为pet28a-CALB1蛋白抗病毒效果；

图14为pet28a-CALB1蛋白通过影响钙离子影响病毒入侵结果；

图15pcDNA3.1-CALB1转染后在动物上的免疫效果；

图16为免疫组化验证pcDNA-CALB1转染后，在肺部对M41的抑制效果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：

1、材料：DF-1细胞(本实验室保存，是IBDV/IBV-M41易感细胞)；N87细胞(本实验室保存，是IBV-QX易感细胞)；21日龄白羽鸡(购买自南京特给力种植专业合作社)的空肠、回肠及黏液。

2、试剂：DMEM培养基(南京森贝伽生物科技有限公司)；胎牛血清(gibco公司)；0.05％胰酶(gibico公司)；0.25％胰酶(南京生航生物技术有限公司)；RIPA强裂解液(广州硕谱生物科技有限公司)；Trizol(宝日医生物技术北京有限公司)；氯仿(深圳三品科技公司)；DEPC水(武汉市盖云天生物技术有限公司)；无水乙醇(深圳三品科技公司)；反转录试剂包(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；荧光定量试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；10％蛋白预制胶(上海雅酶生物医药科技有限公司)；L.M.P低熔点琼脂糖胶(北京索莱宝科技有限公司)；5×SDS变性蛋白上样缓冲液(上海翊圣生物科技有限公司)；IBV-N蛋白单克隆抗体(南京巴傲得生物科技有限公司)；抗鸡钙结合蛋白多克隆抗体(南京含章生物科技有限公司)；抗His-tag单克隆抗体(上海翊圣生物科技有限公司)；HRP-标记的GAPDH(上海翊圣生物科技有限公司)；二抗山羊抗兔(上海翊圣生物科技有限公司)；二抗羊抗鼠(南京巴傲得生物科技有限公司)。

实施例1鸡小肠黏液中蛋白的提取以及全蛋白和分组蛋白的试验效果

肠道黏液蛋白的获取：在窒息杀死21日龄白羽鸡后，放在75％酒精中浸泡5min，用手术剪剪开腹部露出肠段，取离盲肠上端口5cm位置区段往上为空肠肠段样品，取盲肠中间位置为回肠肠段样品，放在冰上准备刮取。提前灭菌准备一瓶含有1％PMSF的PBS(0.01mM，PH＝7.4)并冷却，用小剪刀从中间轻轻剪开，用枪头吸取上述PBS(0.01mM，PH＝7.4)轻轻冲洗掉肠中的粪便，然后用两个载玻片，一个固定肠断段，一个轻轻从上至下刮取黏液防止刮到上皮细胞，期间用PBS(0.01mM，PH＝7.4)小剂量的不断冲洗，直至肠段表面看起来较平，没有明显的黏液，收集所有冲洗黏液用的PBS(0.01mM，PH＝7.4，下同)。在低温下3500rpm离心30min。再通过0.22μm的除菌滤膜。

黏液全蛋白提取：量取50mL单蒸水加热倒入锥形瓶中，将放入磁子的锥形瓶放在磁力搅拌器上，加入硫酸铵粉末直至硫酸铵在水中无法溶解，0.22μm滤膜过滤多余的硫酸铵沉淀并除菌后，即为饱和的硫酸铵溶液。将硫酸铵和黏液样品按不同比例20％、40％、50％、70％、90％加入，过夜24h沉淀蛋白质，8000rpm在4℃下离心20min弃上清，1mL包含蛋白酶抑制剂PMSF的PBS(PH＝7.4)复溶得到蛋白质样品，用最小规格的超滤离心管去盐2500g离心1h，电泳后考马斯亮蓝染色确定最佳沉淀浓度，过0.22μm滤膜除菌即获得蛋白样品，并用BCA蛋白浓度试剂盒检测浓度。

细胞与样品预处理：DF-1细胞提前24h，N87细胞提前48h接种到6孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂的恒温培养箱培养细胞生长汇合至90％左右用于后续试验。

设置组分如下：

1)阴性对照(Negative control)：DF-1细胞加入无血清无双抗的空白DMEM培养基，N87细胞加入无血清无双抗的1640培养基(上海源培生物科技股份有限公司购买)。

2)处理组(Incubate)：加入浓度10μg/mL、100μg/ml、1mg/ml、10mg/ml蛋白与1×10⁶PFU病毒(IBDV、IBV-QX、IBV-M41)加入对应空白培养基中混合后，加入细胞板。

3)阳性对照(Positive control)：加入只含1×10⁶PFU病毒的空白培养基(DF-1细胞加入无血清无双抗的空白DMEM培养基，N87细胞加入无血清无双抗的1640培养基)。

以上加入病毒的处理组，IBDV均在处理后1h洗去，IBV-QX、IBV-M41均在处理后2h洗去(图1A)。

TRrizol法提取RNA：按上述对各组进行处理后，12h、24h后吸出细胞表面上清。用空白DMEM/1640培养基清洗三遍，向12孔板中加入1mL提前预冷的Trizol试剂，用trizol法提取RNA进行后续实验。

cDNA合成：检测上述步骤提取的病毒的RNA浓度，使用诺唯赞公司的反转录试剂盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)，按照说明书进行反转录。

荧光定量：利用snapgene软件设计qPCR引物，引物序列如表1。

表1 本试验中所用到的引物

Table 1 The primers used in this study

使用诺唯赞荧光定量试剂盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行qPCR。根据说明书配置10μL的反应体系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5μL，Primerl(10μM)0.2μL，Primer2(10μM)0.2μL，cDNA模板500ng，并加RNase Free ddH₂O至10μL。

qPCR反应程序如下：

Step1：95℃30s；

Step2：95℃10s，60℃30s(共跑40个循环)；

Step3：95℃15s，60℃60s，95℃15s。

空斑形成试验检测全部蛋白抗病毒上清的病毒滴度：将DF1细胞平铺到12孔板中，在37℃、5％CO₂的恒温培养箱培养至刚好铺满一层。将IBDV接毒组及全蛋白处理组上清用DMEM空培稀释至10^-2、10^-3、10^-4倍，每孔加入450μL。1h后吸取上清，用DMEM空培清洗3遍后，加入0.8％的琼脂糖低熔点胶(2×DMEM稀释)，室温放置15min，琼脂糖凝胶凝固，置于恒温培养箱中培养。之后每天观察，直至显微镜下观察到病变或者出现空斑，用1％多聚甲醛固定细胞，每孔1mL，室温放置2h。弃去多聚甲醛和琼脂糖凝胶，加入适量的0.5％的结晶紫染色2h，每孔1mL。用单蒸水轻柔冲洗，在拷贝台上拍照纪录结果。

通过荧光定量以及空斑实验结果，我们发现全蛋白在DF1细胞上对IBDV(图1E、1H)、IBV-M41(图1C、1F)、IBV-QX(图1D、1G)具有显著抑制效果，噬菌斑中和实验中，与阳性对照组相比，处理组上清形成的空斑数量较少(图1B)。

蛋白分组方法：先将全蛋白组分通过100kda的超滤离心管，此步为了排除黏液中存在的固有免疫蛋白IgY以及之前有研亢报道的MUC2对筛选结果的影响。随后陆续通过50kda、30kda、10kda的超滤离心管(图2A)，在3000rpm下低速离心直至每组分液体基本过滤完成，加入1mL PBS(PH＝7.4)洗3遍，利用更小规格的离心管进行浓缩。由此空肠、回肠分别获得组分50kda-100kda、30kda-50kda、10-30kda、＜10kda，共8组，加上阴性对照(negativecontrol，只在细胞上加入空白培养基)和阳性对照(positive control，只在细胞上加入空白培养基稀释的病毒悬液)，共10组。通过荧光定量以及空斑实验结果(图3)，我们发现分组蛋白的回肠10-30kda组分在DF1细胞上对IBV-QX(图2B)、IBDV(图2C)、IBV-M41(图2D)均具有显著抑制效果。

实施例2质谱分析以及候选蛋白的初筛结果

根据实施例1中的结果，本实施例选择空肠10-30kda组以及回肠10-30kda组作为对比进行质谱分析(图4)，最终得到四种候选蛋白(由质谱的蛋白编号在uniprot上搜索匹配到的蛋白)，通过LC-MS/MS对鸡小肠黏液中的10-30kda蛋白组分进行定性分析。根据分析结果，与UniProt数据库进行比对。根据质谱数据信息，考虑到超滤离心管分离时的误差，将匹配到的蛋白大小为15-35kda筛选出来，并通过Graphpad-pism9.5匹配的蛋白信息通过气泡图显示。在所有候选蛋白(紫色框)中，通过查阅相关文献以及UniProt网站(https://www.uniprot.org/)，根据各蛋白性质筛选出四个可分泌的候选蛋白进行后续的实验探亢，分别为：SRSF1、CALB1、SOD1、GSTM2。其中质谱中编号P80566/F1NQW8代表SOD1，编号A0A1L1RRA5/Q5ZML3代表SRSF1，编号P04354代表CALB1，编号P20136代表GSTM2。

实施案例3四种候选蛋白真核载体构建

为了验证四种候选蛋白的单一抗病毒活性，首先构建真核载体(图5)在DF1细胞中研亢其连续时间点的抗病毒效果。

载体pcDNA3.1酶切：为了提高连接效率，在诺唯赞官网上选择CE Design引物设计软件中输入pcDNA3.1全部序列，通过比较各酶切位点的同源臂百分比，选择N端HindIII、C端BamHI酶切位点。双酶切反应条件为30℃，30min；37℃，30min。按照所述在EP管中加好体系，配制1％琼脂糖凝胶，120V恒压进行核酸电泳，随后依照Gel Extraction试剂盒说明书进行切胶回收后，尽快用于连接，剩余样品储存在-20℃保存。

其反应体系及如下：

目的基因扩增：在uniprot以及NCBI上检索了候选蛋白的相关信息，获得CDS序列，在上述网站下框中输入CDS序列，得到同源臂最符合条件(GC值在30％-70％之间)的真核扩增引物如下所示：

引物名称	引物序列
		SOD1-HindIII-F-PC	ctagcgtttaaacttaagcttATGGCGACGCTGAAGGCC
SOD1-BamHI-R-PC	gaattccatggtggcggatccGCACTTGGCTATTCCAATTACA
		SRSF1-HindIII-F-PC	ctagcgtttaaacttaagcttATGTCCGGAGGGGGCGTG
SRSF1-BamHI-R-PC	gaattccatggtggcggatccTGTACGAGATCGGGATCTGC
		CALB1-HindIII-F-PC	ctagcgtttaaacttaagcttATGACGGCGGAGACGCAC
CALB1-BamHI-R-PC	gaattccatggtggcggatccATTTTCCTCAGCACAGAGAATGAGA
		GSTM2-HindIII-F-PC	ctagcgtttaaacttaagcttATGGTGGTCACGTTGGGTTATT
GSTM2-BamHI-R-PC	gaattccatggtggcggatccCTCTTTCTTGTTGTTCCACAGCG

利用PCR从鸡的小肠组织中扩增目的蛋白的cDNA。

PCR扩增条件如下：

PCR扩增体系如下：

按照上述在EP管中加好体系，配制1％琼脂糖凝胶，120V恒压进行核酸电泳，随后依照Gel Extraction试剂盒说明书进行切胶回收后，测定浓度，最后得到了SOD1、SRSF1、CALB1、GSTM2的四个基因片段，保存样品于4℃，尽快用于连接，剩余样品储存在-20℃保存。

真核载体连接：根据ClonExpress II One Step Cloning Kit说明书计算体系，进行连接，条件为37℃，30min时间过长或过短都会影响酶连效率，连接完毕后降温至4℃或立刻冰浴冷却。上述连接体系以及时间可根据片段长度进行适当的调整，本实验中的候选蛋白碱基数量均小于1000bp，且同源臂GC含量适中，因此连接30min，最后得到pcDNA3.1-SOD1、pcDNA3.1-SRSF1、pcDNA3.1-CALB1、pcDNA3.1-GSTM2重组质粒。

连接产物转化：准备好42℃水浴锅，在冰上解冻保存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞DH5α，从管底观察，在感受态细胞颜色从白色逐渐转为透明时，按不多于1/10的比例，分别取10μL pcDNA3.1-SOD1、pcDNA3.1-SRSF1、pcDNA3.1-CALB1、pcDNA3.1-GSTM2重组产物加入离心管，轻弹管壁混匀，后续按照DH5α说明书内容进行。

酶切验证及测序验证：挑取前一天培养的转化平板上的单菌落分装在八联排EP管中，每一管加入20uLddH₂O，混匀后将单菌落混液接种于5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基试管中，37℃过夜摇菌12h。用双酶切鉴定，结果出现空载和目的片段大小的两个条带，则重组成功。将过夜培养的菌液提取质粒，取部分送到生工公司进行测序验证。测序验证结果正确(图6)的质粒即可进行下一步试验。最终获得了重组载体pcDNA3.1-SOD1、pcDNA3.1-SRSF1、pcDNA3.1-CALB1、pcDNA3.1-GSTM2的阳性质粒。

实施例4重组载体SOD1、SRSF1、CALB1、GSTM2在DF1细胞中表达的验证以及对病毒复制的影响

由于病毒的复制阶段在细胞中进行，我们想要验证蛋白对病毒的复制的影响，就需要在细胞中用真核载体进行病毒复制阶段的验证。我们通过转染试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司)，将质粒导入DF1细胞，因为真核质粒上带有RFP荧光蛋白的序列且位于目的片段之后，所以可以直接通过荧光显微镜的方法观察并验证目的蛋白的表达。

提前24h铺好DF-1的12孔细胞板。根据每100μL体系中1000ng质粒、2.5μL罗氏试剂的标准，配置体系，并用DMEM空白培养基补齐。设置阴性对照(不接毒)、阳性对照(加入pcDNA3.1空载质粒)、处理组(分别转染pcDNA3.1-SOD1、pcDNA3.1-SRSF1、pcDNA3.1-CALB1、pcDNA3.1-GSTM2)6个组别。进行操作时，按照空白DMEM培养基、质粒、罗氏试剂的顺序进行添加。轻柔吹打混匀后，在超净台中静置15min，中间弹匀一次，再甩下去，此步目的是为了更均匀的形成脂质复合体。细胞板弃掉原带血清培养基，用DMEM空培洗板两次，弃掉洗液，每孔添加500μL空培备用。待质粒静置完毕，旋转滴加进细胞孔，轻轻吹吸混匀，然后八字摇匀，37℃二氧化碳细胞培养箱培养，在24h、48h时于荧光显微镜下观察。24h与48h均有红色荧光，可知蛋白均顺利表达，且在48h表达量较高(图7)。

重组真核载体pcDNA3.1-SOD1、pcDNA3.1SRSF1、pcDNA3.1-CALB1、pcDNA3.1-GSTM2对病毒复制的影响：首先，转染后选取24h进行攻毒，吸取原培养基弃掉，用空白DMEM培养基清洗三次，并接种1×10⁶PFU病毒IBV-M41，接种2h后弃去含病毒培养基，清洗三次，并加入1mL的病毒维持液(含2％血清、2％双抗)，放入二氧化碳恒温培养箱中培养后收取6h、12h、24h、48h、60h样品。通过本次定量结果我们发现，钙结合蛋白CALB1(pcDNA3.1-CALB1)效果最为符合预期，由于其在48h、60h效果最好(图8)，因此联想到可能与蛋白表达量相关。因此在转染后48h攻毒，设置组别阴性对照(不接毒)、阳性对照(加入pcDNA3.1空载质粒)、处理组(pcDNA3.1-CALB1)，转染后12h、24h分别收取攻毒IBV-M41和IBDV的RNA样品，48h收取攻毒IBV-M41的蛋白样品。荧光定量结果表明12h和24h时间下，提前过表达CALB1蛋白可以抑制IBV-M41和IBDV的复制(图9A)，蛋白免疫印迹结果表明提前过表达CALB1蛋白可以抑制IBV-M41的复制(图9B)，噬菌斑中和实验结果表明提前过表达CALB1蛋白可以抑制IBDV的复制(图9C)。

由于N87细胞的特殊性，真核载体均未能在胞内表达，因此后续的研亢集中在DF1细胞以及IBV-M41、IBDV病毒上。

实施例5 CALB1在肠道中的定位

为了检测钙结合蛋白在肠道中的分布，我们通过免疫组化试验进行观察。(图10A)。

组织固定：取下的新鲜小肠组织放入含4％的多聚甲醛的离心管中进行固定。

修块及脱水：将固定好的组织置于滤纸上，用刀片切出2个光滑的平面，然后转移至新的10mL离心管内。依次用浓度为75％(过夜约12h)、85％(1h)、95％(1h)及100％(1h)的无水乙醇浸泡修好的组织块，无水乙醇重复两次。

组织透明：将已脱水的组织于通风橱内，浸泡在二甲苯内，并依据组织大小来调整透明时间。

组织浸蜡：将透明完毕的组织迅速转移至60℃蜡箱中，置于含有蜡液的烧杯中浸泡2h。

组织包埋：将上述组织的一个平面竖直立在含有蜡液的矩形纸盒中，然后等待蜡液完全凝固。

组织切片：将包埋好的蜡块置于石蜡切片机内，切出5μm厚度的组织切片，贴于黏附载玻片上，37℃烘干后备用。

免疫组化染色过程如下：切片脱蜡：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换新的二甲苯，浸泡2min。然后依次用浓度为100％、95％、85％及75％的酒精浸泡2min，其中无水乙醇重复两次。最后用蒸馏水轻柔洗涤切片1min，以去除残留乙醇。抗原修复：将脱蜡后的切片置于提前煮沸的抗原修复液(20g/L柠檬酸9mL，29.4g/L柠檬酸三钠41mL，混合后稀释10倍)继续煮沸15min，中间5min停一次。置于室温至完全冷却。消除过氧化物酶：用0.01M的组化专用PBS(PH＝7.4)(Nac18.5g，Na₂HPO₄.12H₂O7.06g，NaH₂PO₄.2H₂O0.5g、单蒸水1L)清洗切片，洗3次。然后滴加3％过氧化氢，置于37℃恒温培养箱，孵育2h。封闭蛋白：用免疫组化笔圈出组织，然后滴加5％的BSA，置于37℃温箱封闭2小时。抗体孵育：首先用组化PBS(PH＝7.4)洗去残留的BSA，然后加入IBVN蛋白的多克隆抗体(1：100稀释)(美国SouthernBiotech公司)，4℃过夜孵育。用组化PBS(PH＝7.4)洗去1抗后，继续滴加二抗(生物素化羊抗鼠IgG)，37℃温箱孵育2h后用PBS(PH＝7.4)清洗。最后向圈中的组织滴加SABC显色液(链霉亲和素-生物素复合物)(广州硕谱生物科技有限公司)，室温作用1h后洗去。显色：使用DAB显色试剂盒在显微镜下进行显色。封片：滴加10％甘油于载玻片，并按压盖玻片封片。与阴性对照组相比，阳性对照图片中有明显的阳性区域，证明钙结合蛋白在肠道中广泛存在。

为了再次验证钙结合蛋白的胞内胞外位置，我们检测了外泌体，刮取小肠黏液后，将获取的黏液3500rpm离心20min，通过0.22μm的除菌滤膜。将除过菌的小肠黏液放入超速离心机中10000rpm离心70min，取对应位置的沉淀，用强蛋白裂解液RIPA进行溶解，加入5×SDS蛋白上样缓冲液煮沸10min以上，获取的蛋白样品用Western bloting进行验证。在外泌体样品中，可以看到谱图上有一条清晰的CALB1条带。此结果明确了钙结合蛋白在外泌体中的存在，再次佐证其来自黏液且可以在胞外进行作用(图10B)。

实施例6原核表达载体pet28a-CALB1的构建以及蛋白的表达及纯化

以鸡小肠组织为扩增模板扩增目的基因片段CALB1(图11A中)，扩增体系同实施例3，扩增引物以及扩增条件如下所示。

表2 扩增引物序列

表3 扩增条件

用HindIII、BamHI双酶切pet28a载体(图11A左)，反应条件为30℃，30min；37℃，30min。核酸电泳之后进行胶回收，将载体与扩增片段CALB1配好体系放入pcr仪进行连接，连接条件为37℃，30min，85℃，5sec。连接体系如下：

表4 pet28a-CALB1连接体系

以下步骤均在超净台中进行：将连接产物10μL，加入提前化冻的DH5α感受态细胞中，轻弹混匀。冰浴30min后，快速放入42度水浴锅中热激45sec，期间不要大幅度摇晃。随后再放入冰水浴中静置2min。加入900μL无抗性LB培养基，轻柔地翻转EP管。固定在恒温摇床中37℃，200rpm复苏1h。时间到后，取出EP管，5000rpm离心3min。吸弃去900μL上清，将剩余的菌吸打混匀，涂在卡那抗性的LB平板上，12h后挑取单菌落提取质粒酶切验证(图11A右)，并摇菌送测序确定无突变菌种(图11B)。用诺唯赞的质粒小提试剂盒(DC201-01)提取已验证的原核重组质粒pet28a-CALB1载体。

原核载体转入表达感受态：预先准备42℃水浴锅。取100μL冰上融化的Rosetta2(DE3)感受态细胞置于2mL灭菌离心管中，加入10μL上述已验证目的质粒pet28a-CALB1载体并轻轻混匀，后续按照Rosetta感受态说明书进行。

诱导：挑取菌点若干进行菌落PCR，有正确大小条带的菌落进一步用5mL添加卡那霉素的LB液体培养基过夜摇菌12h，然后按1∶100添加液体培养基转入锥形瓶中，摇菌至检测出OD在0.4，经记录约3.5h，放在冰上冰浴2h促进蛋白质折叠，加入0.6mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃，180rpm继续摇菌过夜。

考马斯亮蓝检测(图12A框内)：分别取未诱导和诱导后的菌液1mL，4000rpm，4℃离心15min，用100μL PBS(PH＝7.4)重悬。并按比例加入25μl 5×SDS蛋白上样缓冲液，煮沸15min。用雅酶凝胶试剂盒(上海雅酶生物医药科技有限公司，货号PG112)配置1.0mm厚度PAGE凝胶。开启电泳，待前沿带跑至胶板距离底端0.5cm时，将蛋白胶小心地从制胶玻璃板中剥离，放进染色盒，加入浸没蛋白胶的考马斯亮蓝染剂(约20mL)，染色0.5h后收集染色剂(可重复用3次)用单蒸水洗脱多余染液，置于LED拷贝台上观察记录。

Western Blot检测(图12B框内)：电泳步骤同上，用转膜仪进行转膜。结束后，首先标记出PVDF膜正反面，一般用圆珠笔标记防止被洗掉，切下PVDF膜上的有样品部分留存，泡在TBST中备用，用TBST缓冲液配置5％的脱钙牛奶，将条带浸泡在其中，封闭2h，此时从-20℃冰箱中，取出一免抗体解冻。封闭完成弃去脱脂牛奶，将PVDF膜条带从牛奶中取出，用圆珠笔标记条带的位置，放在洗脱盒中置于脱色仪上，少量多次倒入TBST缓冲液清洗。根据marker条带以及所需的大小做好标记后切出目的条带。将各个条带放入对应的一抗中，固定在4℃混匀仪孵育14h过夜。隔天取出一抗中的条带，将条带小心沿着边缘夹起，放入洗脱盒，分入条带盒中每个分格中一个条带，面朝上，TBST脱色仪上以75～90rpm的转速清洗5次，每次8min，取出清洗后的条带。同时室温水浴化二抗，加入相应二抗，脱色仪50rpm孵育2h，回收二抗，并用TBST清洗5次，每次8min。清洗后显影液处理条带，曝光拍照。

可溶性检测(图12C框内)：检测诱导成功的剩余菌液7000rpm，4℃离心15min，用10mL Lysis Buffer重悬，并加入终浓度为0.3mg/mL的溶菌酶。超声破碎仪25％功率超声3s，间歇5s冷却，直至溶液澄清。尽量保持菌液低温，可以用冰浴降温。10000rpm，4℃离心25min，将上清转移到另一个管中。用相同体积1mL溶解沉淀和上清，取100μL沉淀和上清检测样品的可溶性。即分别将沉淀和上清进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝法检测蛋白含量对比。可见诱导组别中明显的诱导条带，诱导条带在沉淀和上清中均有存在，说明蛋白质部分溶解于上清中(图12C)。在上清中存在条带可以证明蛋白质可溶，说明蛋白质可以且确实分泌成为了胞外蛋白，进一步证明所选蛋白可能具有我们所探亢的肠道黏液抗病毒活性。

重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)的表达以及纯化条件：通过考马斯亮蓝染色法以及western bloting鉴定重组蛋白可以表达，条带位置在25kda左右。

为了使重组蛋白的表达量尽可能提高，从诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度三个方面的条件进行优化。通过考马斯亮蓝染色法确定表达条件为28℃(图12E)，诱导16h(图12F)，IPTG浓度为0.8mM(图12G)。

使用Ni NTA Beads重力柱(天地人和生物科技有限公司)进行蛋白纯化，通过高压细胞破碎仪将菌体破裂后，9000rpm，4℃离心25min，获取上清，吸取上清加入重力柱进行纯化，具体操作根据说明书进行。最后获得条带基本单一的重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)(图12D)。

实施例7重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)的抗病毒浓度确定以及抗病毒效果

通过实时荧光定量试验验证重组蛋白在胞外抑制病毒的浓度与阶段。在DF1细胞上直接加入终浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL的重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)与10⁶PFU的IBV病毒混匀在1mLDMEM空白培养基中，直接加在12孔板DF1细胞中(5×10⁵个)，24h后收取RNA样。用Trizol法提取RNA，并使用诺唯赞的逆转录试剂盒(R212-01)得到cDNA样品。使用诺唯赞的荧光定量酶(Q711-02)检测病毒的mRNA表达水平。与阳性对照组相比，10ug/mL的重组蛋白效果最好(图13A)。

为初步摸查鸡小肠黏液抗IBV/IBDV作用的具体作用阶段和具体方式，选择10ug/mL的重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)进行以下试验：

吸附阶段：将10⁶PFU的IBV和IBDV分别与10μg/mL重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)加入DMEM空培中，加入到DF1细胞中，分别放入4℃，2h/1h后洗去上清，24h后收取样品。

入侵阶段：将10⁶PFU的IBV和IBDV分别与10μg/mL重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)加入DMEM空培中，加入到DF1细胞中，分别放入37℃，2h/1h后吸取上清，24h后收取样品。

孵育阶段：将10⁶PFU的IBV和IBDV分别与10μg/mL重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)加入DMEM空培中，分别放进37℃温箱中孵育1h后，加入DF1细胞中，分别放入37℃，2h/1h后吸取上清，24h后收取样品。

通过荧光定量验证后，对于IBV/IBDV，重组鸡钙结合蛋白在入侵阶段的抗病毒效果较好，病毒IBV-M41的mRNA相对表达量从1×10⁵PFU降低到7.5×10³PFU，病毒IBDV的mRNA相对表达量从1×10⁴PFU降低到6×10²PFU。(图13B、13C)。

本实验还用蛋白裂解液收集了细胞的蛋白样品，通过免疫印迹试验的方法来验证重组蛋白对IBV-M41亚型的抵抗效果。检测细胞中病毒载量的变化，与阳性对照组相比，重组蛋白处理组的病毒蛋白表达量明显降低(图13D、13E)。

在24h时，进行显微镜观察，发现IBDV阳性对照组相比阴性对照组以及处理组细胞出现明显病变(图13F)。在此时收取上清通过噬菌斑中和试验检测病毒粒子释放数量发现，阳性对照组的病毒粒子释放数量明显较多。

实施例8鸡钙结合蛋白与Ca²⁺结合的抗病毒机制

由前期的实施例6得到结果，重组鸡钙结合蛋白CALB1(pet28a-CALB1)在病毒入侵阶段效果较好，因此联想到钙离子通路，有部分研亢认为钙离子可以通过钙离子通道的打开增加病毒的入侵，因此本试验在DF1细胞上对两种病毒进行试验，为了验证是否是在入侵阶段具有效果，我们将钙离子与病毒同时加入细胞，并在同一时间(IBDV接毒1h后，IBV-M41接毒2h后)洗掉病毒。首先是IBDV病毒，在12h、24h时表现出加入10mM的钙离子(图14B)可以增加病毒的入侵且细胞对比单独的IBDV组病变均较为明显，在48h时细胞表现出大量的死亡(图14A)，收集上述处理的24h上清，通过噬菌斑中和试验检测发现，对比阳性对照组(positive control)，噬菌斑数量明显增多，由此证明Ca²⁺可以促进IBDV的入侵以及复制(图14C)。由于IBV-M41在DF1上的复制量本身比IBDV要低，因此本试验排除最开始变化不明显的时间点，检测6h、12h、24h时病毒RNA水平以及蛋白水平的变化，并且剔除0.1mMCa²⁺组，结果表明对于IBV-M41，10mMCa²⁺组也呈现同样的趋势(图14E)。因此后续试验选取10mMCa²⁺组作为阳性对照，试验结果表明在入侵阶段加入了10mg钙结合蛋白后，病毒载量相对于阳性对照组的确有所下降(图14D、14F)。

实施例9钙结合蛋白的在动物上的免疫效果

选取21日龄白羽鸡进行体内试验，由于原核蛋白的表达量较低，选择在攻毒前48h直接转染质粒pcDNA3.1-CALB1进行免疫试验。我们通过凝胶阻滞实验(图15B)发现0.01μg/uL的B-PEI(上海麦克林生化科技股份有限公司)足够形成转染复合物(图15A)，B-PEI与质粒室温孵育30min后，再加LoadingBuffer。在做体内实验时B-PEI与质粒室温孵育30min后，再加1μg/μL胆酸钠溶液。我们在3只免疫组白羽鸡鼻腔中分别打入50μg PCDNA3.1-CALB1，3只空白组白羽鸡鼻腔中打入50μg PCDNA3.1不接毒，3只阳性对照组白羽鸡鼻腔中打入50μgPCDNA3.1接毒30μL IBV-M41(10⁶PFU/30μL)。通过荧光定量结果表明在过表达CALB1蛋白的部位，气管、肺、肾脏、腺胃、脾脏、心脏中的病毒载量有所下降(图15C)。因为IBV-M41为经典呼吸型病毒，主要感染鸡的肺部，因此我们通过免疫组化(步骤同实施例5)观察肺部，结果表明PCDNA3.1-CALB1滴鼻处理组与PCDNA3.1滴鼻处理组相比，病毒阳性的区域明显减少(图16)。

Claims

1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体是将编码钙结合蛋白的核酸或基因插入真核表达载体或原核表达载体中获得，所述钙结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，编码所述的钙结合蛋白的核酸或基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.重组菌株或细胞系，将权利要求1或2所述的重组载体转入宿主菌或宿主细胞后获得。

4.一种重组钙结合蛋白，其特征在于，所述重组钙结合蛋白是通过将权利要求1或2所述的重组载体转入宿主菌或宿主细胞后表达、纯化获得。

5.权利要求4所述的一种重组钙结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)编码钙结合蛋白的基因的获得；

2)将编码钙结合蛋白的基因导入表达载体中获得重组载体；

3)将重组载体转入宿主菌或宿主细胞后进行纯化即得。

6.权利要求1或2所述的重组载体、权利要求3所述的重组菌株或细胞系在生产重组钙结合蛋白中的应用。

7.权利要求1所述的重组载体、权利要求3所述的重组菌株或细胞系，权利要求4所述的重组钙结合蛋白在制备抗IBDV和/或IBV-M41病毒药物或疫苗中的应用。

8.权利要求1所述的重组载体、权利要求3所述的重组菌株或细胞系，权利要求4所述的重组钙结合蛋白在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎或鸡传染性囊病的药物或疫苗中的应用。