CN115887634A - 鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗及应用。本发明构建的CHO稳定表达细胞株具有产量高、稳定性好、易于规模化生产等优点。本发明构建了QX‑RBD‑YFc和GⅥ‑RBD‑Yfc蛋白的二联亚单位疫苗，同时构建了表达这两个蛋白的细胞系。QX‑RBD‑YFc蛋白、GⅥ‑RBD‑YFc蛋白能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，这两个蛋白使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到1‑2g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗及应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV属于Nido病毒目(Ni dovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)中第三群的成员。病毒基因组由单股不分节段的正链RNA组成，长约27.6kb.含有4种结构蛋白，即纤突(Spike，S)糖蛋白、核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白、膜(Membrane，MD糖蛋白和小膜(Sma11Envelope，E)糖蛋白。IBV基因组3'端和5'端都有非编码区(UTR)，与病毒的复制和转录有关，可与病毒复制酶和潜在的其他宿主蛋白相互作用【3】。5'端帽状结构后有长约60～70个核昔酸的先导序列，紧接着是病毒编码的复制酶基因，覆盖了病毒基因组的三分之二，并被翻译成多聚蛋白la和lab，这两种多聚蛋白通过自身蛋白水解活性被切割成15种非结构蛋白(nsp2-16)，Jackwood等对每种蛋白的功能进行了描述【4】。3'端约1/3的结构基因编码4种结构蛋白，即纤突蛋白(Spike protein，S)、膜蛋白(Membrane protein，M)、小膜蛋白(Envelopeprotein，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)。S蛋白决定了冠状病毒典型的冠状特征，翻译后被碱性蛋白酶裂解为S1和S2两个亚单位。S1亚基来源于s蛋白的N端部分，包含至少2个与宿主受体结合的结构域(RBD)，负责病毒与宿主细胞的结合【5】，此外，S1亚基还具有诱导产生中和抗体的抗原表位【6】。S2亚基通过跨膜结构域镶嵌入病毒囊膜中，与S1亚基非共价连接，并将其锚定在病毒粒子上，S2亚基含有一个内部融合肽和两个七肽重复序列，是病毒融合的基础【7】。直到2016年Viviana等基于S1基因全长序列确定了GI-GVI等6个基因型，其中GI基因型包括27个亚型【8】。
针对鸡传染性支气管炎病毒，现有疫苗几乎均为全病毒灭活疫苗或者活疫苗，也存在一些亚单位疫苗比如CN 109985235 A中所公开的鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗，使用中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞共表达IBV-S1蛋白和S2蛋白，S1蛋白和S2蛋白之间能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，能够激发中和抗。专利中所使用的氨基酸序列SEQ ID NO:3经过NCBI的blast比较与QDA76309.1(strain＝"M41")的相似性为100％,使用的另一个氨基酸序列SEQ ID NO:4的序列比对结果为与QWC71247.1(strain＝"IBV/M41/Y191")的相似性为99.28％。两氨基酸序列均为M41毒株S蛋白。
M41均属于GI基因型种的GI-1基因亚型。已知IBV容易变异且血清型较多，各血清型毒株间交叉保护性较弱，因此开发符合流行毒株血清型的疫苗和建立相应的免疫效果评价方法具有十分重要的意义。近年来QX型已经成为亚洲及欧洲流行的主要血清型之一，占我国流行毒株分离鉴定毒株总数的70％以上
。2007年GVI-1基因型毒株(又称TC07-2型)首先在广东省分离鉴定出来，以后又陆续在亚洲的其他国家问世。流行病学监测表明GVI-1基因型IBV毒株分离率近年不断上升，特别是我国南方地区较为常见【2】。抗体的Fab段介导与抗原的特异结合，而抗体效应功能的发挥则依赖恒定区C段(Fc)，主要功能如下:①抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)，Fab与细菌的抗原表位结合，可通过其Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力Fc受体结合，介导吞噬，促进吞噬细胞对细菌的吞噬。②抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，Fc与NK cell、巨噬细胞等表面的Fc受体结合，介导杀伤细胞。Fc段的作用是刺激机体的免疫反应，起到免疫增强剂的作用。
目前流行的QX型IBV属于GI-19基因亚型，GVI型的占比也在逐年增加。所以我们以目前流行的毒株序列为模板，分别克隆了IBV-QX-S1和IBV-GⅥ-S1的RBD基因并与鸡的IgY的Fc基因片段联合表达，分别获得的QX-RBD-YFc融合蛋白和GⅥ-RBD-YFc融合蛋白。因此，本研究的目的就是研制一种针对QX型和GVI-1基因型的IBV亚单位疫苗，为OX型和GVI-1基因型IBV的免疫防控提供全面的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供了鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗，该疫苗包括两个重组融合蛋白，分别为IBV-QX-RBD-YFc(氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示)和IBV-GVI-RBD-YFc(氨基酸序列为SEQ ID N O.9所示)。
本发明的另一个目的在于提供了两株制备IBV-QX-RBD-YFc和IBV-GVI-RBD-YFc融合蛋白的细胞株，保藏编号分别为：CCTCC NO：C2022349和CCTCC NO：C2022351。
本发明的最后一个目的在于提供了重组融合蛋白IBV-QX-RBD-YFc和IBV-GⅥ-RBD-YFc在制备预防鸡传染性支气管炎病毒的重组亚单位疫苗中的应用，该重组蛋白免疫原性好，能引起鸡强烈的免疫应答，所产抗体有中和作用，可对鸡传染性支气管炎病毒有中和作用，对防治鸡传染性支气管炎病毒有显着效果。为了实现以上发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种预防或治疗鸡传染性支气管炎病毒感染的重组亚单位疫苗，所述的亚单位疫苗包括重组融合蛋白IBV-QX-RBD-YFc(氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示)和IBV-GⅥ-RBD-YFc(氨基酸序列为SEQ ID N O.9所示)。
以上所述的重组亚单位疫苗，是IBV-QX-RBD-Yfc和IBV-GⅥ-RBD-Yfc按照质量比1:1～2混合而成。
本发明的保护范围还包括：表达IBV-QX-RBD-Yfc蛋白的保藏编号为CCTCC NO：C2022349的细胞株，表达IBV-GⅥ-RBD-YFc蛋白的保藏编号为CCTCC NO：C2022351的细胞株。
本发明的保护范围还包括上述亚单位疫苗的应用，用于制备治疗或预防鸡传染性支气管炎病毒感染疾病的药物。
以上所述的应用，在作为重组亚单位疫苗免疫鸡时，其佐剂为白油。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明使用CHO细胞联合表达鸡传染性支气管炎病毒QX株的S1蛋白RBD和禽IgY的Fc段蛋白，GⅥ株的S1蛋白RBD和禽IgY的Fc段蛋白，真核表达蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量高，达到1-2g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。本发明的亚单位疫苗可以大规模生产，容易质控，安全性高，免疫原性好，批次间稳定，生产成本低。
(2)本发明使用了核酸密码子优化的QX毒株RBD蛋白序列和鸡的IgY的Fc段蛋白序列，同一个载体中共表达QX毒株RBD和IgY的Fc段蛋白，以及优化的GⅥ毒株RBD蛋白序列和鸡的IgY的Fc段蛋白序列，同一个载体中共表达GⅥ毒株的RBD受IgY的Fc段蛋白。将禽免疫球蛋白IgY的Fc与抗原蛋白进行基因融合，从而使蛋白质和多肽具有抗体样的特性。能够显著增加蛋白的稳定性及延长血浆半衰期并增强在鸡体内的体液免疫和细胞免疫效应。
附图说明:
图1为IBV-QX-RBD-YFc和IBV-QX-RBD-RBD用his标签抗体进行的Western-Blot检测。
图2为IBV-GⅥ-RBD-YFc和IBV-QX-NTD用his标签抗体进行的Western-Blot检测。
图3为IBV-GⅥ-RBD-RBD用his标签抗体进行的Western-Blot检测。
图4为IBV-GⅥ-NTD用his标签抗体进行的Western-Blot检测。
图5为IBV-QX-RBD-YFc用鸡传染性支气管炎的阳性血清进行的Western-Blot检测。
图6为IBV-GⅥ-RBD-YFc用鸡传染性支气管炎的阳性血清进行的Western-Blot检测。
图7为IBV-QX-RBD-Y Fc蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；
其中M：Marker；1:IBV-QX-RBD-Y Fc蛋白；2:阴性对照。
图8为IBV-GⅥ-RBD-Y Fc蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；
其中：M：Marker；1:IBV-GⅥ-RBD-Y Fc蛋白；2:阴性对照。
图9为免疫组3和对照组的拭子样品RT-PCR检测结果；
显示分别在攻毒后3日，6日和9日采集的喉拭子的RT-PCR鉴定结果，泳道1-10为非免疫组试验鸡，11-20为免疫组3试验鸡。
图10为IBV感染后的临床症状和组织病理照片；
其中：A：非免疫鸡感染IB之后出现流鼻液的症状；B：非免疫感染鸡气管内有炎性分泌物；C：免疫鸡气管内无异常；D：非免疫感染鸡气管黏膜下层有炎性细胞浸润E：免疫鸡气管无异常；F：非免疫感染鸡的肺脏；G：免疫鸡的肺脏；H：非免疫感染鸡的脾脏；I：免疫鸡的脾脏；J：非免疫感染鸡的肾脏；K：免疫鸡的肾脏；L：非免疫感染鸡的法氏囊；M：免疫鸡的法氏囊。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所示试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
含有RBD的不同融合蛋白的合成：
由于融合蛋白存在不可预知性，并非只要有免疫原性的蛋白进行融合，都会产生良好的免疫效果，因此，申请人合成了多条多核苷酸用于融合蛋白的表达，部分合成的序列如下(下述多核苷酸均已根据CHO细胞中密码子偏好性进行优化后，委托北京擎科生物有限公司进行基因合成)：
SEQ ID NO.1为IBV-QX-RBD-YFc的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO.8所示蛋白；
SEQ ID NO.2为IBV-QX-RBD-RBD的多核苷酸序列；
SEQ ID NO.3为IBV-GⅥ-RBD-YFc的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO.9所示蛋白；
SEQ ID NO.4为IBV-GⅥ-RBD-RBD的多核苷酸序列；
SEQ ID NO.5为IBV-QX-NTD的多核苷酸序列；
SEQ ID NO.6为IBV-GⅥ-NTD的多核苷酸序列；
SEQ ID NO.7为pCMV-GS载体序列；
其中，IBV-QX表示传染性支气管炎病毒QX株，IBV-GⅥ表示传染性支气管炎病毒GⅥ株，RBD为鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的RBD结构域，YFc为鸡的IgY的Fc段蛋白，NTD为鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的NTD结构域。RBD-RBD表示两个RBD结构域串联。
实施例2：
重组表达质粒的构建：
分别将IBV-QX-RBD-YFc(SEQ ID NO.1所示)，IBV-QX-RBD-RBD(SEQ ID NO.2所示)，IBV-GⅥ-RBD-YFc(SEQ ID NO.3所示)，IBV-GⅥ-RBD-RBD(SEQ ID NO.4所示)，IBV-QX-NTD(SEQ ID N O.5所示)，IBV-GⅥ-NTD(SEQ ID NO.6所示)构建到pCMV-GS载体质粒中，委托北京擎科生物技术有限公司合成，得到重组表达质粒，重组质粒分别命名为pCMV-IBV-QX-RBD-YFc、pCMV-IBV-QX-RBD-R BD、pCMV-IBV-GⅥ-RBD-YFc、pCMV-IBV-GⅥ-RBD-RBD、pCMV-IBV-QX--NTD、pCMV-IBV-GⅥ-NT D，经测序比对，结果与目的基因序列一致。
实施例3：
重组质粒的真核表达：
采用CHO真核表达系统，转染前一天以2×106cell/mL的密度将细胞接种到新鲜培养基中，置于37℃，5％CO2,150-175rpm转速的恒温摇床中培养；转染当天，取样计算细胞密度和活率。细胞密度应该在(3-5)×106cell/mL，活率高于90％。调整细胞密度到3×106cell/mL，将细胞置于125mL的细胞摇瓶中，总体积为20mL；用optim培养基分别稀释20μg的质粒(pCMV-IBV-QX-RBD-YFc、pCMV-IBV-QX-RBD-RBD、pCM V-IBV-GⅥ-RBD-YFc、pCMV-IBV-GⅥ-RBD-RBD、pCMV-IBV-QX-NTD、pCMV-IBV-GⅥ-NTD)至总体积为0.5mL，用移液器轻轻吹打混匀；用optim培养基稀释40μL的lipe8000转染试剂至总体积0.5mL，用移液器轻轻吹打混匀；将稀释好的DNA与转染试剂轻轻混匀，逐滴加入到细胞培养液中，滴加的同时轻轻摇动细胞瓶，摇匀后放回摇床继续培养，培养96小时收取培养上清用于检测细胞表达，
采用his标签抗体通过免疫印迹(Western-Blot)检测蛋白的表达情况，发现IBV-QX-RBD-YFc(图1)、IBV-QX-RBD-RBD(图1)、IBV-GⅥ-RBD-YFc(图2)、IBV-GⅥ-RBD-RBD(图3)均得到了表达。IBV-Q X-NTD(图2)和IBV-GⅥ-NTD(图6)均未表达。说明，并非所有的融合蛋白都可以在CHO真核表达系统中表达。
再通过免疫印迹(Western-Blot)检测IBV-QX-RBD-YFc、IBV-QX-RBD-RBD、IBV-GⅥ-RBD-YFc、I BV-GⅥ-RBD-RBD蛋白的免疫原性，表达的蛋白与鸡传染性支气管炎的阳性血清反应，检测结果显示只有IBV-QX-RBD-YFc(图5)和IBV-GⅥ-RBD-YFc(图6)与鸡传染性支气管炎的阳性血清反应，IBV-QX-R BD-RBD和IBV-GⅥ-RBD-RBD蛋白的Western-Blot检测为阴性。说明，即便被报道具有免疫原性，但由于蛋白结构的空间构象，蛋白融合表达后，蛋白的原始功能难以预知。
将分别转入pCMV-IBV-QX-RBD-YFc和pCMV-IBV-GⅥ-RBD-YFc质粒的细胞通过5分钟1500转每分钟的低速离心将培养基更换为含有25μM的MSX(蛋氨酸亚枫亚氨)的新鲜培养基中，并按照150μL每孔、0.5-1个细胞每孔的密度均匀铺至96孔板中，各铺5块板。静置培养3-4周后，每周吸取细胞培养上清并补充新鲜培养基至150μL每孔。将吸取的100ul细胞培养上清通过SDS-PAGE检测各克隆的蛋白表达情况，各挑选5株克隆用于后续亚克隆，在亚克隆的过程中发现随着克隆次数的增加，存在表达量不升反降的现象，有的亚克隆株在后续克隆中甚至检测不到蛋白表达，通过三轮的亚克隆后将2株表达量较高的克隆逐步转移至6孔板，最后将表达量最高的单克隆细胞株扩大至细胞摇瓶进行补料培养，通过澄清、离心过滤纯化后确定单克隆株的细胞产量，筛选到的高效表达IBV-QX-RBD-YFc和IBV-GⅥ-RBD-YFc蛋白的细胞株，结果如表1所示，并将筛选到的表达量最高的IBV-QX-RBD-YFc单克隆细胞株于2022年12月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞株CHO/IBV-QX-RBD-YFc，保藏编号CCTCC NO：C2022349。地址：中国武汉武汉大学。
表达量最高的IBV-GⅥ-RBD-YFc单克隆细胞株已于2022年12月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞株CHO/IBV-GVI-RBD-YFc，保藏编号CCTCC NO：C2022351。地址：中国武汉武汉大学。
表1克隆株蛋白表达量测定
实施例4：
IBV-QX-RBD-YFc及IBV-GⅥ-RBD-YFc重组蛋白的纯化及活性鉴定。
1、IBV-QX-RBD-YFc和IBV-GⅥ-RBD-YFc重组蛋白的表达纯化
将实施例3中筛选到的稳定高效表达细胞株扩大规模至250ml培养液的1L细胞瓶中，在37℃、5％二氧化碳、120转/分钟、连续培养14天，补料培养后，收集上清先后Ni excel填料使用AKTA纯化仪进行纯化，QX-RBD-YFc最佳的洗杂和洗脱咪唑浓度分别为50mmol和300mmol，GⅥ-RBD-YFc也是相同的。收集的洗脱液脱盐后备用，获得纯化后的QX-RBD-YFc重组蛋白有效浓度为171μg/mL，GⅥ-RBD-YFc重组蛋白的有效浓度为179μg/mL，纯化获得的QX-RBD-YFc及GⅥ-RBD-YFc重组蛋白纯化效率如表2所示。纯化后的QX-RBD-YFc(图7)及GⅥ-RBD-YFc(图8)经SDS-PAGE鉴定。
表2两种重组蛋白纯化回收效率
实施例5：
IBV-QX-RBD-YFc和IBV-GⅥ-RBD-YFc重组蛋白亚单位疫苗的制备
在白油佐剂(白油佐剂：蛋白溶液体积比为1:2)中加入适量纯化的鸡传染性支气管炎病毒蛋白，使蛋白终浓度为50μg/ml，经乳化，质检合格后置于4℃保存。
试验分3组：第一组QX-RBD-YFc蛋白抗原含量50μg/ml。第二组是GVI-RBD-YFc蛋白，抗原含量为50μg/ml。第三组是QX-RBD-YFc蛋白与GVI-RBD-YFc蛋白混合物，两者按等体积进行混合，各蛋白终浓度仍为50μg/ml。免疫实验：肌肉注射3～4周龄SPF鸡30只，每组10只，每只0.3ml，另10只不注射为对照，经21日免疫，取上文免疫鸡和对照鸡采血，分离血清并用商品化ELISA试剂盒测定抗体。用鸡传染性支气管炎病毒AH株(QX型)气管内接种，每株接种0.1ml(含105.0EID50)，攻毒后第3日，第6日，第9日分别采集咽拭子进行RT-PCR分离鉴定。引物：特异性引物序列为：5'CCT AAG AAC GGT TGG AAT 3'的上游；下游5'TAC TCT CTACAC ACA CAC 3'。目的片段尺寸740bp。攻毒第12天进行剖检，观察气管有无炎性分泌物存在，同时对实验鸡的组织器官进行病变检查，取气管，肺，肝脏，牌部和肾脏制成病理组织切片。
表3拭子样品的RT-PCR鉴定结果
由表3结果可得，ELISA抗体检测结果显示免疫组3抗体水平最高，都在0.2以上。但由剖检观察气管内有无黏液结果表明，3个免疫组与1个对照组无显着差异。而咽拭子样本RT-PCR试验结果表明免疫组1及免疫组2阳性占60％以上，免疫组3全阴性(图9)。但对照组为全阳性(图9)。提示免疫组3免疫保护效果最佳。疫苗能很好保护试验鸡抵抗传染性支气管炎的感染。
临床观察结果表明，攻毒3d以后，仅有少数试验鸡表现为流鼻液症状(图10中A)。无甩头，鼻液等现象、精神差和其他临床症状，6～9d无明显甩头，鼻液现象、精神差和其他临床症状，期间剖检可见少量攻毒组试验鸡气管黏液大量分泌(图10中B)，免疫组黏液不明显(图10中C)。其它器官未见明显病变；攻毒组在12d,15d时，除羽毛蓬松外，其他各组实验鸡均无显着性差异。病理学结果表明：非免疫攻毒组的实验鸡气管粘膜固有层、黏膜下层炎性较多，细胞浸润，黏膜下层有明显水肿(图10中D)，免疫组黏液不明显(图10中E)。非免疫攻毒组与免疫组肺脏显微镜下均未见明显病变(图10中F和图10中G)，非免疫攻毒组及免疫组脾脏显微镜下未见明显病变(图10中H和图10中I)，非免疫攻毒组和免疫组肾脏镜检未见明显病变(图10中J和图10中K)，非免疫攻毒组及免疫组法氏囊显微镜下未见明显病变(图10中L和图10中M)。
实施例6：
IBV-QX-RBD-YFc和IBV-GⅥ-RBD-YFc重组蛋白亚单位疫苗免疫持续期
将实施例5中制备的第三组亚单位疫苗对21日龄SFP鸡免疫，每只0.3ml，并在免疫结束后每21天取一次血以检测其抗体，监测免疫后9周的抗体变化规律。结果如表4所示，免疫3周后抗体全部阳性，6周后抗体继续上升，至9周时抗体稍有降低。这说明IBV-QX-RBD-YFc及IBV-GVI-RBD-YFc重组蛋白亚单位疫苗免疫原性好，能刺激机体生成高水平保护性中和抗体，可用于制备高效亚单位疫苗。
表4亚单位疫苗免疫鸡后，血清抗体滴度ELISA检测结果
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Claims (5)
1.鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗，所述的亚单位疫苗包括：SEQ ID NO.8所示蛋白和SEQ ID NO.9所示蛋白。
2.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗中的SEQ ID NO.8所示蛋白和SEQ ID NO.9所示蛋白的质量比为1:1~2。
3.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗中的SEQ ID NO.8所示蛋白由保藏编号为CCTCC NO：C2022349的细胞株的表达得到，SEQ ID NO.8所示蛋白由保藏编号为CCTCC NO：C2022351的细胞株表达得到。
4.权利要求1所述的亚单位疫苗在制备治疗或预防鸡传染性支气管炎病毒感染疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的亚单位疫苗免疫鸡时，其佐剂为白油。
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