CN103642759A - 嵌合ibv 4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用。本发明的重组病毒是通过以下方法构建得到：将适应细胞培养的骨架病毒IBV Beaudette毒株的纤突蛋白膜外区基因片段置换成IBV4/91株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，经病毒拯救过程后在Vero细胞上盲传3-5代，直至特定细胞病变—合胞体现象出现，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。将本发明构建得到的重组传染性支气管炎病毒接种鸡只后表明，本发明重组病毒不仅对各种鸡只均安全、无副反应，而且能够诱导接种鸡只产生抵抗野生型毒株49/1攻击的免疫力。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组传染性支气管炎病毒及其鉴定方法，特别涉及一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用，本发明属于兽医微生物研究技术领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV为单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)。IBV对不同日龄的鸡均可感染，但感染主要侵害4周龄以下的雏鸡，临床以病鸡气管啰音、咳嗽、打喷嚏；肾脏苍白肿大、有大量尿酸盐沉积以及输卵管充血为主要特征，并可引起死亡，随鸡日龄的增长其抵抗力逐渐提高。该病自20世纪30年代在美国爆发以来，目前已成为世界性流行的主要禽病之一，对养鸡业造成了极大危害，它不仅可造成鸡的生长缓慢，而且容易导致继发感染，在伴有支原体和大肠杆菌混合感染时，该病表现得更为严重。近些年来，随着养殖规模的不断扩大，本病的流行呈上升趋势，造成了严重的经济损失，已成为继禽流感和新城疫之后危害养鸡业健康发展的重要传染病。
IBV基因组可由于点突变和基因重组而发生变异，因此IBV血清型较多。已知的血清型有以侵害呼吸道为主的Conn、Florida、M41、Iowa97等和以侵害肾脏为主的Holte、Australia T、Gray等。1991年英国发现了一种新的血清型的IBV---4/91，该毒株可引起鸡的肌肉损伤和蛋鸡产蛋率的下降。同时，IBV4/91毒株和其它血清型IBV毒株之间无交叉血清学反应，其免疫原基因S1的序列与欧洲17个IBV毒株之间差异高达21%-25%。目前，该血清型IBV在西班牙、德国、荷兰、意大利、泰国、中国等国均有发生和流行，对养鸡业危害较大。常用的Massachusetts型疫苗（H120、MA5等）对IBV4/91无免疫保护作用，只有使用同源毒株的疫苗进行免疫预防才能取得较好的效果。英特威公司虽然已研制出的IB4/91疫苗，能够对免疫鸡群提供一定的 免疫保护力，但是新的变异株还在不断出现，为传染性支气管炎疫苗的研究提出了新的挑战。本发明用IBV4/91毒株的纤突蛋白膜外区基因片段置换IBV Beaudette P65代毒株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，为研制可防控新变异株流行的应急疫苗提供方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服IB疫苗研制过程中需要耗时耗力分离纯化病毒、连续传代致弱病毒的不确定及毒力返强等问题以及疫苗生产过程中存在的外源病毒污染的风险、成本高、产毒量小、生产周期长等缺点，将IBV4/91毒株的纤突蛋白膜外区基因片段置换IBV Beaudette P65代毒株相应基因区段，进而构建重组病毒BeauR-4/91(S1)。此外，本发明还提供了一种用于构建重组传染性支气管炎病毒的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
本发明的一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于通过以下方法构建得到：用传染性支气管炎病毒4/91株（IBV4/91）的纤突蛋白膜外区基因片段置换适应Vero细胞培养的传染性支气管炎病毒Beaudette（IBV Beaudette）毒株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，经病毒拯救过程后在Vero细胞上盲传3-5代，直至特定细胞病变—合胞体现象出现，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。
在本发明中，优选的，所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株为适应Vero细胞培养的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的p65代毒，即Beaudette（p65）。
在本发明中，所述的传染性支气管炎病毒4/91株，记载于“鸡传染性支气管炎病毒M41、4/91及疫苗株Ma5、H52、H120N基因的克隆与序列分析”一文中，作者亓丽红，马秀丽等，发表于《家禽科学》期刊上，所述IBV4/91株可购买自中国兽医药品监察所。
在本发明中，所述的适应Vero细胞培养的IBV Beaudette毒株（Vero cell-adapted IBV Beaudette strain）记载在文献：An arginine-to-proline mutation in a domain with undefined functions within the helicase protein(Nsp13)is lethal to the coronavirus infectious bronchitis virus in cultured cells，Shouguo Fang，et al.,Virology358(2007)136-147中。
在本发明的一个具体实施例中，所述的适应Vero细胞培养的IBV Beaudette毒株为IBV Beaudette毒株的p65代毒（Vero cell-adapted IBV strain Beaudette(p65)），其GenBank号为DQ001339.1。记载在文献：The Cellular RNA Helicase DDX1Interacts with Coronavirus Nonstructural Protein14and Enhances Viral Replication，Linghui Xu et al,JOURNAL OF VIROLOGY,Sept.2010,p.8571–8583中，现由中国农业科学院兰州兽医研究所保存，提供。
在本发明中，优选的，所述的传染性支气管炎病毒4/91株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一个具体实施例中，本发明的一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒，命名为BeauR-4/91(S1)，分类命名为鸡传染性支气管炎病毒，其为病毒拯救成功后在Vero细胞上传代的第15代细胞毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏编号为：CGMCC No.7102，保藏时间为2013年1月18日。
本发明重组传染性支气管炎病毒BeauR-4/91(S1)的形态学观察：重组病毒BeauR-4/91(S1)由TCID50稳定的细胞毒扩大培养所得，经低温（4℃）高速离心、磷钨酸负染后在电镜下可看到直径约为80-120nm的病毒粒子，呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有松散的均匀分布的冠状突起。
此外，本发明还公开了一种以上任一项所述的重组传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）分别从IBV4/91毒株和适应Vero细胞培养的IBV Beaudette p65代毒株中提取总RNA，用以下引物进行反转录，其中引物Beau-21710R用于IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的反转录，引物Beau-5752R、Beau-8693R、Beau-15520R、Beau-20422R、Beau-27608R用于亲本病毒Beaudette p65代毒株骨架片段的反转录；
T7-leading5-GGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGACTTAAGATAGATATTAATA-3head
Beau-5752R5-CATGCGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-5749F5-GTATCCGTCTCTGTCGCTAGCTATAAGACCG-3
Beau-8693R5-TCACGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-8690F5-CGTACGTCTCGAGGCCTACCTTTCAGCG-3
Beau-15520R5-GCTAATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-15510F5-GCAGTGATTCATTGAGACGTATACG-3
Beau-20422R5-GAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-20419F5-GTGGTCTCTGCTTTGCTTTATGATAAAAATAC-3
Beau-21710R5-ATGGTCTCGTACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-21707F5-AGGGTCTCAATGTGACCGACTCAGCTG-3
Beau-27608R5-GAGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
Beau-5752R5-CATGCGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-8693R5-TCACGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-15520R5-GCTAATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-20422R5-GAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-21710R5-ATGGTCTCGTACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-27608R5-GAGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
（2）利用引物对Beau-20419F和Beau-21710R扩增IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段，所得片段标记为4/91(S1e)，利用其它5对引物扩增IBV Beaudette P65代毒的骨架片段1—5，即引物对T7-leading head和Beau-5752R用于扩增骨架片段1，引物对Beau-5749F和Beau-8693R用于扩增骨架片段2，引物对Beau-8690F和Beau-15520R用于扩增骨架片段3，引物对Beau-15510F和Beau-20422R用于扩增骨架片段4，引物对Beau-21707F和Beau-27608R用于扩增骨架片段5，所得到的大小正确的片段进行切胶回收纯化，然后利用T4DNA连接酶将4/91(S1e)和Beaudette P65代毒的骨架片段1—5分别与pGEM-T Easy载体或者pCR-XL-TOPO载体进行连接，连接产物分别转化感受态细胞JM109，抗性筛选后挑斑摇菌，提取对应的质粒，然后进行PCR鉴定和测序鉴定，分别标记为pT-4/91(S1e)、pT-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pT-rBeau-4、pT-rBeau-5并保存备用；
（3）将步骤（2）得到的pT-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pT-rBeau-4、pT-rBeau-5和pT-4/91(S1e)6种阳性质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109后，挑斑摇菌，扩大培养16-18h，大量提取质粒备用；
（4）将步骤（3）所得阳性质粒进行酶切：
pT-rBeau-1用Bsa I和Nhe I进行双酶切，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-1，备用；pL-rBeau-2用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-2；pL-rBeau-3用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-3；pT-rBeau-4用Bsa I酶切，37℃温育 3h后加入BsmB I，置于55℃温育3h，切胶回收产物标记为rBeau-4；pT-rBeau-5用Bsa I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-5，备用；pT-4/91(S1e)用Bsa I酶切切胶回收相应片段，标记为r4/91(S1e)，备用；
（5）基因片段的连接：首先将酶切后的基因片段rBeau-1、rBeau-2和rBeau-3用T4DNA连接酶进行4℃过夜连接，同时将酶切后的基因片段rBeau-4、r4/91(S1e)和rBeau-5采用同样的方法进行4℃过夜连接，然后将上述两种连接产物混合，利用T4DNA连接酶进行进一步的连接，并纯化得到全长cDNA；
（6）体外转录：将上述纯化后的全长cDNA利用mMessage mMachine T7试剂盒进行体外转录并用DNase I处理后，苯酚\氯仿纯化，获得全长cDNA转录本；
（7）将全长cDNA转录本电转化入Vero细胞，加入含2%胎牛血清的DMEM，37℃培养过夜，将电转化12h后的Vero细胞换成含5%胎牛血清的DMEM继续培养，36h后将细胞培养皿密封后放于-70℃冰箱中反复冻融3次，连续盲传3-5代，若特定细胞病变—合胞体现象出现，利用RT-PCR方法检测IBV基因组的存在，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。
在本发明中，优选的，步骤（4）中所获得r4/91(S1e)片段，大小为1308bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，优选的，步骤（7）中将全长cDNA转录本电转化入Vero细胞包括以下步骤：将接近90%铺满的Vero细胞用0.25%胰酶消化。500×g离心后用预冷的PBS重悬，重复此操作1次后用1mL PBS最终制成Vero细胞悬液，取其中的300μL Vero细胞悬液与纯化后的转录本一同加入电转杯中，电转脉冲条件为：450V，50μF，电转后的Vero细胞重新铺板，加入含2%胎牛血清的DMEM，37℃培养过夜。
此外，将本发明构建得到的重组传染性支气管炎病毒接种鸡只后，结果表明，本发明重组病毒不仅对各种鸡只均安全、无副反应，而且能够诱导接种鸡只产生抵抗野生型毒株49/1攻击的免疫力。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的重组传染性支气管炎病毒在制备预防鸡传染性支气管炎的疫苗中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种疫苗组合物，其特征在于含有本发明所述的重组传染性支气管炎病毒。
附图说明
图1为重组IBV BeauR-4/91(S1)的基因组结构及构建全长cDNA时基因组的拆 分；
A：IBV Beaudette(P65)株基因组结构及重组IBV置换基因位置；
B：构建重组IBV BeauR-4/91(S1)全长cDNA时基因组的拆分；
图2为RT-PCR鉴定重组病毒BeauR-4/91(S1)基因组的复制；
泳道1：接种了第一代病毒液的Vero细胞总RNA RT-PCR结果；泳道2：未接种病毒液的Vero细胞总RNA RT-PCR结果；泳道M：DNA Marker
图3为western-blot方法对BeauR-4/91(S1)N蛋白表达的鉴定；
泳道1：接种了第4代病毒液且培养30h后的Vero细胞样品；泳道2：未接种病毒液且培养30h后的正常Vero细胞样品；泳道M：蛋白Marker
图4为重组IBV BeauR-4/91(S1)感染Vero细胞后产生的细胞病变。
A为正常Vero细胞；B为BeauR-4/91(S1)感染Vero细胞24h时的细胞病变。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步描述本发明，本发明的创新之处将会随着实施方案而更为清晰。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1本发明IBV重组病毒BeauR-4/91(S1)的构建
具体的构建方法是采用下述步骤来完成的：
1.用RNAiso Plus试剂(Takara,China)分别从含IBV4/91毒株的尿囊液和含Beaudette(P65)的细胞裂解液中提取总RNA。用表1中下游引物分别进行反转录，其中引物Beau-21710R用于IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的反转录。引物Beau-5752R、Beau-8693R、Beau-15520R、Beau-20422R、Beau-27608R用于亲本病毒Beaudette(P65)毒株骨架片段的反转录。
表1IBV重组病毒BeauR-4/91(S1)构建时所用到的引物对
2.利用表1中引物对Beau-20419F和Beau-21710R扩增IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段，所得片段标记为4/91(S1e)。利用其它5对引物扩增IBV Beaudette(P65)株骨架片段1—5(如图1所示)，即引物对T7-leading head和Beau-5752R用于扩增骨架片段1，引物对Beau-5749F和Beau-8693R用于扩增骨架片段2，引物对Beau-8690F和Beau-15520R用于扩增骨架片段3，引物对Beau-15510F和Beau-20422R用于扩增骨架片段4，引物对Beau-21707F和Beau-27608R用于扩增骨架片段5。所用DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。经10min加尾反应(在原50μL扩增体系中加入1μL EX Taq酶和4μL dNTP，然后置于72℃延伸10min)后，琼脂糖凝胶电泳检查RT-PCR产物的特异性和大小，若片段大小与预期扩增大小一致，进行切胶回收纯化，然后利用T4DNA连接酶将4/91(S1e)和Beaudette(P65)株骨架片段1—5分别与pGEM-T Easy载体(Promega)或者pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen)进行连接，连接产物分别转化感受态细胞JM109，抗性筛选后挑斑摇菌16-18h，提取对应的质粒，然后进行PCR鉴定或者酶切鉴定。将上述鉴定为阳性的质粒取少量送于Invitrogen公司进行测序，其中测序结果为阳性(无缺失、无突变等)的质粒才确定为最终阳性质粒，分别标记为pT-4/91(S1e)、pT-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pT-rBeau-4、pT-rBeau-5并保存备用。
3.将上述pT-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pT-rBeau-4、pT-rBeau-5和pT-4/91(S1e)6种阳性质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109后，挑斑摇菌，扩大培养16-18h，大量提取质粒备用。
4.将步骤3所得阳性质粒进行酶切：
(1)Beaudette(P65)株骨架片段1rBeau-1酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pT-rBeau-120μL；Bsa I1.5μL；Nhe I1.5μL；BSA1μL；dH2O21μL。置于37℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-1，备用。
(2)Beaudette(P65)株骨架片段2rBeau-2酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pL-rBeau-220μL；BsmB I2.5μL；dH2O22.5μL。55℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-2，备用。
(3)Beaudette(P65)株骨架片段3rBeau-3酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pL-rBeau-320μL；BsmB I2.5μL；dH2O22.5μL。55℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-3，备用。
(4)Beaudette(P65)株骨架片段4rBeau-4酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pT-rBeau-420μL；Bsa I1.5μL；dH2O22μL。37℃温育3h后加入BsmB I1.5μL，置于55℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-4，备用。
(5)IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pT-4/91(S1e)20μL；Bsa I2.5μL；dH2O22.5μL。37℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为r4/91(S1e)，备用。其大小为1308bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(6)Beaudette(P65)株骨架片段5rBeau-5酶切体系(50μL)为：10×NEBuffer45μL；pT-rBeau-520μL；Bsa I2.5μL；dH2O22.5μL。37℃温育3h，琼脂糖凝胶电泳检查酶切完全与否，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-5，备用。
5.基因片段的连接：首先将酶切后的基因片段rBeau-1、rBeau-2和rBeau-3用T4DNA连接酶进行4℃过夜连接。同时将酶切后的基因片段rBeau-4、r4/91(S1e)和rBeau-5采用同样的方法进行4℃过夜连接。然后将上述两种连接产物混合，利用T4DNA连接酶进行进一步的连接，最终产物用苯酚\氯仿\异戊醇纯化，用乙醇进行沉淀，RNase-free H2O溶解，0.5%琼脂糖凝胶电泳检查连接效果，并纯化全长cDNA。
6.体外转录：将上述纯化后的全长cDNA利用mMessage mMachine T7试剂盒进行体外转录并用DNase I处理后，苯酚\氯仿纯化。
7.全长cDNA转录本电转化入Vero细胞：将接近90%铺满的Vero细胞用0.25%胰酶消化。500×g离心后用预冷的PBS重悬，重复此操作1次后用1mL PBS最终制成Vero细胞悬液。取其中的300μL Vero细胞悬液与纯化后的转录本一同加入电转杯中，电转脉冲条件为：450V，50μF。电转后的Vero细胞重新铺板，加入含2%胎牛血清的DMEM，37℃培养过夜。
8.拯救病毒的收获：将步骤7中电转化12h后的Vero细胞换成含5%胎牛血清 的DMEM继续培养，36h后将细胞培养皿密封后放于-70℃冰箱中反复冻融3次。连续盲传3-5代，若特定细胞病变—合胞体现象出现，则初步证明重组病毒拯救成功。
实施例2本发明IBV重组病毒拯救成功的鉴定
1方法
1.1RT-PCR法检测病毒基因组的复制(即负链RNA的检测)
将电转化IBV全长cDNA转录本的Vero细胞培养48h后置于-70℃冰箱，反复冻融3次后接种铺满单层的Vero细胞进行病毒传代，待培养48h时将维持液(含2%胎牛血清的DMEM)弃去，加入RNAiso Plus试剂反复吹打使细胞裂解，然后提取总RNA并进行反转录。反转录所用引物为正向引物14931-F(5’-GCTTATCCACTAGTACATC-3’)。反应体系(20μL)为：5×primescript buffer4μL；模板RNA3.5μL；引物14931-F(20μM)1μL；dNTP Mixture(2.5μM each)4μL；RNase Inhibitor0.5μL；primescript reverse transcriptase1μL；RNase free dH2O6μL。42℃反转录45min后直接作为PCR模板进行PCR扩增，所用到的引物为：14931-F和15600-R(5’-CTTCTCGCACTTCTGCACT-3’)。若病毒RNA进行了复制，则在RT-PCR产物中出现一条大小约670bp的条带，测序确定序列的正确性。
1.2Western-blot法检测病毒蛋白的表达
利用western-blot方法对BeauR-4/91(S1)N蛋白的表达进行检测。将反复冻融3次后的第4代重组病毒细胞毒液接种于铺满单层的Vero细胞，待培养30h时将维持液(含2%胎牛血清的DMEM)弃去，用细胞铲轻轻刮掉细胞，收集于1.5mL离心管中，加入2×SDS loading buffer(含有200mM DTT和10mM碘乙酰胺)进行蛋白样品的裂解处理。然后进行SDS-PAGE电泳和蛋白转印操作，4℃过夜封闭(封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST)转印后的PVDF膜，接着依次与1：2000稀释的anti-N兔源一抗和1：5000稀释的anti-Rabbit IgG HRP二抗进行结合，每结合一种抗体1h后用含0.1%吐温的TBST洗膜4次，每次5min。最后在膜上滴加ECL，进入暗室进行曝光。曝光时间以条带粗细进行调节。其中抗体的稀释液为封闭液(吐温含量为0.05%)。
2结果
2.1病毒基因组复制的检测
利用RT-PCR的方法检测重组病毒负链RNA，从而证明病毒基因组进行了复制。 RT-PCR结果显示，接种了第一代病毒液的Vero细胞培养48h时，RT-PCR产物中出现了一条大小约670bp的条带，而未接种病毒液的正常Vero细胞培养48h时，RT-PCR产物中没有出现大小约670bp的条带(如图2所示)。将上述大小约670bp的条带切胶纯化后送于Invitrogen公司测序。测序结果表明，该条带是重组IBV基因组序列。上述结果证明重组病毒基因组进行了复制，进而说明IBV重组病毒拯救成功。
2.2Western-blot法检测病毒蛋白的表达
利用western-blot方法对IBV重组病毒的N蛋白表达情况进行了检测。结果显示，接种了第4代病毒液且培养30h后的Vero细胞样品在50kDa处出现一条特异性的条带，而未接种病毒液且培养30h后的正常Vero细胞样品在50kDa处没有出现条带(如图3所示)。这一结果表明，接种了第4代病毒液且培养30h后的Vero细胞中含有IBV重组病毒的N蛋白，再一次证明了IBV重组病毒拯救成功。
实施例3本发明IBV重组病毒BeauR-4/91(S1)的培育
1方法
1.1重组病毒的遗传稳定性检测
拯救成功的重组病毒在Vero细胞上进行连续传代，每一代Vero细胞接种上一代病毒液1mL，至90%细胞出现细胞病变时收获病毒。取第3、第5、第7、第10和第15代细胞病毒液，用RNAiso Plus试剂提取总RNA后进行反转录，反转录引物为：IBV-S-LOW21980(5-CTTACCATAACTAACATAAGGGC-3)。取3.5μL反转录产物直接作为PCR模板进行PCR扩增，所用到的上游引物为：IBV-S-UP20368(5-TGAGATTGAAAGCAACGCCAGTTG-3)。扩增片段纯化后送于Invitrogen公司进行测序。
1.2病毒滴度测定
取重组病毒的第3代、5代、7代、10代、15代细胞毒分别依次做10倍梯度稀释，每一代次的稀释度从10-1到10-8，然后接种到置于96孔细胞板且培养24h的Vero细胞上。每一稀释度的细胞毒接种每排的前10孔，第11和12孔接种维持液DMEM，100μL/孔。接种的96孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。第24h、48h和72h观察细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。
取细胞病变时间稳定的第15代细胞毒测定EID50。其测定方法与上述TCID50测定方法类似，将第15代细胞毒做10倍梯度稀释，选择10-4到10-74个稀释度分 别接种5枚10日龄的SPF鸡胚，0.1mL/枚。对照鸡胚接种正常Vero细胞裂解液0.1mL/枚。将鸡胚置于37℃温箱内孵化7天，每日照胚，记录7天内鸡胚的感染数和生存数，按Reed-Muench法计算EID50。
2结果
2.1IBV重组病毒的遗传稳定性
不同代次的IBV重组病毒接种Vero细胞后致使90%以上细胞发生病变所需要的时间各不相同(表2)。第3代、5代、7代、10代、15代细胞毒提取总RNA后进行RT-PCR，结果显示，上述各代细胞毒均扩增出一条大小约1600bp的特异条带，与预期大小一致。经测序后证实，上述条带是IBV重组病毒基因组序列，且完整包含IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段，无突变和缺失。该结果证明IBV重组病毒的遗传稳定性良好。
表2不同代次的IBV细胞毒致使90%以上细胞产生病变时所需时间
2.2病毒滴度测定结果
拯救成功的IBV重组病毒可以在Vero细胞上增殖，第3代TCID50为102.4/0.1mL，继续传代后病毒滴度逐渐升高，第10代和15代趋于稳定，滴度分别达到104.67/0.1mL、104.75/0.1mL。测得细胞病变时间稳定的第15代细胞毒的EID50为105.5/0.1mL(表3)。
表3不同代次的IBV细胞毒的滴度测定结果
2.3IBV重组病毒BeauR-4/91(S1)的保藏
将获得的第15代重组传染性支气管炎病毒进行保藏并用于以下试验，所述的第15代重组传染性支气管炎病毒命名为BeauR-4/91(S1)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号为：CGMCC No.7102，保藏时间为2013年1月18日。
实施例4重组IBV BeauR-4/91(S1)的免疫效力评价
1方法
40只7日龄SPF雏鸡随机分成A、B两组（20只/组），分别饲养于负压隔离器 中。A组作为免疫组，接种第15代细胞毒BeauR-4/91(S1)（CGMCC No.7102）(105.5EID50/0.1mL)，每只鸡滴鼻点眼0.1mL。B组作为对照组，每只鸡滴鼻点眼0.1mL正常Vero细胞裂解液。免疫后第7、第14和第21天采集两组鸡群的血液，分离血清后进行特异性抗体的检测。具体方法参照美国IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒说明书进行。最后一次采血的第2天用野生型毒株49/1攻击两组鸡群所有鸡只，每只滴鼻0.1mL(原病毒液稀释至103EID50/0.1mL)。攻毒后每天观察、记录鸡群的发病情况。
2结果
免疫后第7、第14和第21天，分别对两组鸡群采血并分离血清后应用间接ELISA试剂盒检测鸡只抗体时发现，A组免疫后第7天鸡只IBV抗体阳性率为0%(0/20)，待免疫后14天时70%(14/20)鸡只IBV抗体阳性，至21天时A组90%(18/20)鸡只血清表现为IBV抗体阳性。B组作为对照组，鸡血清中IBV抗体一直为阴性(表4)。使用野生型毒株49/1对两组鸡群进行滴鼻攻毒后观察至第7天，发现免疫组90%(18/20)鸡只精神状态良好，采食量和饮水量没有变化，呼吸正常，没有传支临床症状；而对照组所有鸡只表现为精神沉郁，采食、饮水量下降，咳嗽、眼睛湿润、流鼻液，羽毛蓬松、喜蹲伏。
表4重组IBV BeauR-4/91(S1)的免疫效力评价
实施例5重组IBV BeauR-4/91(S1)的安全性试验
1方法
1.13日龄SPF雏鸡安全性试验
80只3日龄SPF雏鸡随机分成A、B、C、D4组，20只/组。A组通过滴鼻点眼途径每只接种0.1mL第15代细胞毒BeauR-4/91(S1)(105.5EID50/0.1mL，单剂量接种)；B组以同样方式接种同一病毒0.1mL，一周后每只鸡重复接种一次(单剂量重复接种)；C组通过滴鼻点眼途径每只接种该重组病毒1mL(大剂量接种)，D组作为对照组，接种正常Vero细胞裂解液0.2mL。观察2周后剖检，观察是否出现IBV特异性临床症状及病理变化。
1.2AA种鸡安全性试验
将40只AA种鸡随机分成A、B、C、D4组，10只/组，各组接种剂量与3日龄SPF鸡安全性试验相同，观察4周，期间测定其产蛋数及孵化率等指标。
2结果
2.13日龄SPF雏鸡安全性试验结果
从单剂量接种、单剂量重复接种和大剂量接种试验结果可见，IBV重组病毒BeauR-4/91(S1)接种3日龄SPF雏鸡后精神状态及采食饮水量正常，没有出现IBV特异性临床症状及病理变化(表5)，且对照组所得结果成立。由此证明该重组病毒对SPF雏鸡安全可靠。
表5重组IBV BeauR-4/91(S1)接种3日龄SPF雏鸡的安全性试验
2.2AA种鸡安全性试验结果
各组AA种鸡分别单剂量接种、单剂量重复接种和大剂量接种重组病毒BeauR-4/91(S1)后表现为精神状态及采食饮水量正常，没有出现IBV特异性临床症状及病理变化，对照组和各试验组AA种鸡产蛋数及孵化率无显著差异(表6)。证明了该重组病毒对AA种鸡安全可靠。
表6重组IBV BeauR-4/91(S1)接种AA种鸡的安全性试验
Claims (9)
1.一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于通过以下方法构建得到：用传染性支气管炎病毒4/91株（IBV4/91）的纤突蛋白膜外区基因片段置换适应Vero细胞培养的传染性支气管炎病毒Beaudette（IBV Beaudette）毒株的纤突蛋白膜外区基因片段来构建重组病毒，经病毒拯救过程后在Vero细胞上盲传3-5代，直至特定细胞病变—合胞体现象出现，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。
2.如权利要求1所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株为适应Vero细胞培养的禽传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的p65代毒。
3.如权利要求1或2所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的传染性支气管炎病毒4/91株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的传染性支气管炎病毒Beaudette毒株的纤突蛋白膜外区基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的重组传染性支气管炎病毒，其特征在于所述的重组病毒命名为BeauR-4/91(S1)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.7102。
5.一种构建权利要求1-4任一项所述的重组传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）分别从IBV4/91毒株和适应Vero细胞培养的IBV Beaudette p65代毒株中提取总RNA，用以下引物进行反转录，其中引物Beau-21710R用于IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的反转录，引物Beau-5752R、Beau-8693R、Beau-15520R、Beau-20422R、Beau-27608R用于亲本病毒Beaudette p65代毒株骨架片段的反转录；
T7-leading5-GGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGACTTAAGATAGATATTAATA-3head
Beau-5752R5-CATGCGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-5749F5-GTATCCGTCTCTGTCGCTAGCTATAAGACCG-3
Beau-8693R5-TCACGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-8690F5-CGTACGTCTCGAGGCCTACCTTTCAGCG-3
Beau-15520R5-GCTAATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-15510F5-GCAGTGATTCATTGAGACGTATACG-3
Beau-20422R 5-GAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-20419F 5-GTGGTCTCTGCTTTGCTTTATGATAAAAATAC-3
Beau-21710R 5-ATGGTCTCGTACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-21707F 5-AGGGTCTCAATGTGACCGACTCAGCTG-3
Beau-27608R 5-GAGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
Beau-5752R 5-CATGCGGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3
Beau-8693R 5-TCACGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3
Beau-15520R 5-GCTAATCGTCTCAATGAATCAC-3
Beau-20422R 5-GAGGTCTCACAGCACTACATAGTGCAC-3
Beau-21710R 5-ATGGTCTCGTACATTAGTAATAAAACC-3
Beau-27608R 5-GAGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3
（2）利用引物对Beau-20419F和Beau-21710R扩增IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段，所得片段标记为4/91(S1e)，利用其它5对引物扩增IBV Beaudette P65代毒的骨架片段1—5，即引物对T7-leading head和Beau-5752R用于扩增骨架片段1，引物对Beau-5749F和Beau-8693R用于扩增骨架片段2，引物对Beau-8690F和Beau-15520R用于扩增骨架片段3，引物对Beau-15510F和Beau-20422R用于扩增骨架片段4，引物对Beau-21707F和Beau-27608R用于扩增骨架片段5，所得到的大小正确的片段进行切胶回收纯化，然后利用T4DNA连接酶将4/91(S1e)和Beaudette P65代毒的骨架片段1—5分别与pGEM-T Easy载体或者pCR-XL-TOPO载体进行连接，连接产物分别转化感受态细胞JM109，抗性筛选后挑斑摇菌，提取对应的质粒，然后进行PCR鉴定和测序鉴定，分别标记为pT-4/91(S1e)、pT-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pT-rBeau-4、pT-rBeau-5并保存备用；
（3）将步骤（2）得到的pT-rBeau-1、pL-rBeau-2、pL-rBeau-3、pT-rBeau-4、pT-rBeau-5和pT-4/91(S1e)6种阳性质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109后，挑斑摇菌，扩大培养16-18h，大量提取质粒备用；
（4）将步骤（3）所得阳性质粒进行酶切：
pT-rBeau-1用Bsa I和Nhe I进行双酶切，并切胶回收相应片段，标记为rBeau-1，备用；pL-rBeau-2用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-2；pL-rBeau-3用BsmB I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-3；pT-rBeau-4用Bsa I酶切，37℃温育3h后加入BsmB I，置于55℃温育3h，切胶回收产物标记为rBeau-4；pT-rBeau-5用Bsa I酶切，其切胶回收产物标记为rBeau-5，备用；pT-4/91(S1e)用Bsa I酶切切胶回收相应片段，标记为r4/91(S1e)，备用；
（5）基因片段的连接：首先将酶切后的基因片段rBeau-1、rBeau-2和rBeau-3用T4DNA连接酶进行4℃过夜连接，同时将酶切后的基因片段rBeau-4、r4/91(S1e)和rBeau-5采用同样的方法进行4℃过夜连接，然后将上述两种连接产物混合，利用T4DNA连接酶进行进一步的连接，并纯化得到全长cDNA；
（6）体外转录：将上述纯化后的全长cDNA利用mMessage mMachine T7试剂盒进行体外转录并用DNase I处理后，苯酚\氯仿纯化，获得全长cDNA转录本；
（7）将全长cDNA转录本电转化入Vero细胞，加入含2%胎牛血清的DMEM，37℃培养过夜，将电转化12h后的Vero细胞换成含5%胎牛血清的DMEM继续培养，36h后将细胞培养皿密封后放于-70℃冰箱中反复冻融3次，连续盲传3-5代，若特定细胞病变—合胞体现象出现，利用RT-PCR方法检测IBV基因组的存在，即获得了嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（4）中所获得r4/91(S1e)片段，大小为1308bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（7）中将全长cDNA转录本电转化入Vero细胞包括以下步骤：将接近90%铺满的Vero细胞用0.25%胰酶消化。500×g离心后用预冷的PBS重悬，重复此操作1次后用1mL PBS最终制成Vero细胞悬液，取其中的300μL Vero细胞悬液与纯化后的转录本一同加入电转杯中，电转脉冲条件为：450V，50μF，电转后的Vero细胞重新铺板，加入含2%胎牛血清的DMEM，37℃培养过夜。
8.权利要求1-4任一项所述的重组传染性支气管炎病毒在制备预防鸡传染性支气管炎的疫苗中的应用。
9.一种疫苗组合物，其特征在于含有权利要求1-4任一项所述的重组传染性支气管炎病毒。
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