CN108524930A - 一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗及其制备方法。所述制备方法包括：1)健康易感染鹅、鸡胚的筛选；2)生产用毒液的制备；3)两种毒液效价的测定、浓缩、灭活、配比、制苗及分装。本发明制备的小鹅瘟—新城疫二联灭活疫苗通过免疫种鹅，使种鹅在产蛋期内血清、种蛋卵黄小鹅瘟、新城疫特异性抗体均处于较高水平，所孵化雏鹅出雏后能通过吸收卵黄产生良好的被动免疫保护效果。本疫苗具有安全性高、免疫效果好、副作用小等优点。

Description

一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗及其制备方法，以及所述二联灭活疫苗的用途。
背景技术
小鹅瘟病毒(Gosling plague virus,GPV)，又称鹅细小病毒或Derzsy’e病原，它能够引起1月龄以内，以20日龄以内的为主的雏鹅爆发急性、接触性、致死性的疾病。新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)自1946年在我国首次分离至今已在中国存在了60多年，自上世纪90年代以来，临床上非典型ND的发生现象十分普遍，在鹅群中也常见ND的爆发和流行。一直以来，小鹅瘟和新城疫都困扰着我国养鹅业的发展，给广大养殖户带来了巨大的经济损失。为了有效防控禽流感和新城疫，同时也为了方便使用，我们通过抗原浓缩，合理配方研究，进而研制小鹅瘟—新城疫二联灭活疫苗并进行工业化生产和推广使用，达到一针防两病的效果，减少免疫应激反应和免疫成本。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗，其是基于非免疫鹅胚、SPF鸡胚扩繁种毒，经浓缩、灭活、配比后低温乳化制备小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗，为小鹅瘟、新城疫提供一种安全封闭式的制备方法，与传统生产工艺相比，制备所得的灭活疫苗具有安全性高、可多次免疫、不存在散毒的危害性等特点。
一方面，本发明提供了一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗，其特征在于，包括小鹅瘟病毒灭活疫苗和重组新城疫病毒灭活疫苗，所述小鹅瘟病毒灭活疫苗是将禽胚胎接种小鹅瘟病毒毒株得到的胚液灭活得到的，所述重组新城疫病毒灭活疫苗是将禽胚胎接种重组新城疫病毒株得到的胚液灭活得到的。
进一步地，所述接种小鹅瘟病毒毒株的禽胚胎为鹅胚，接种重组新城疫病毒株的禽胚胎为SPF鸡胚。
进一步地，所述小鹅瘟病毒毒株为TZ10株，重组新城疫重组病毒株为A-VII株。
进一步地，其中所述小鹅瘟病毒灭活疫苗和重组新城疫病毒灭活疫苗的体积分数比为1:1。
另一方面，本发明提供了一种小鹅瘟—重组新城疫二联油包水剂型灭活疫苗，其特征在于，由以下体积份数比的组分组成：小鹅瘟、新城疫二联灭活疫苗病毒液96体积份，吐温-804体积份，注射用白油94体积份，司本-805体积份，硬脂酸酯1体积份。
另一方面，本发明还提供了一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)筛选健康易感染鹅、鸡胚；
2)生产用毒液的制备
小鹅瘟病毒毒种繁殖及接种
种毒用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚，接种后每日照胚3～4次，选取48～120小时内死亡且病变明显的鹅胚，收获无菌且对1％鸡红细胞悬浮液凝集阴性的尿囊液样品；
将上述尿囊液样品用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚，继续孵育，每日照胚一次，将48小时之内死亡的鹅胚弃去，然后每4～6小时照胚一次，随时取出48～144小时死亡的鹅胚，置于2～8℃冷藏库冷却4小时以上；
重组新城疫病毒毒种繁殖及接种
将毒种用灭菌生理盐水作10-4或10-5稀释，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，收获接种72～120小时内死亡或感染鸡胚液，包括尿囊液及羊水；
将上述鸡胚液用灭菌生理盐水作10-4或10-5稀释，尿囊腔内接种10-11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置36～37℃孵育，每日照胚1次，将48小时内死亡的鸡胚弃去，此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置2～8℃冷却12～24小时；
收获
将上述冷却的鹅、鸡胚取出，吸取尿囊液，其中小鹅瘟病毒含量不低于105.50ELD50/0.2ml，新城疫红细胞凝集价不低于1:512(微量法)，病毒含量不低于108.00EID50/0.1ml；
3)病毒浓缩、灭活、配比、乳化及制成疫苗产品。
进一步地，所述步骤1)为11日龄易感染鹅胚，10～11日龄SPF鸡胚，通过对非免疫鹅胚卵黄中小鹅瘟琼扩抗体和/或接种前鹅胚内小鹅瘟病毒的检测来确保非免疫鹅胚的质量。
进一步地，所述步骤3)病毒浓缩后，鹅胚液中的小鹅瘟病毒含量不低于105.80ELD50/0.2ml，鸡胚液中重组新城疫病毒含量不低于108.30EID50/0.1ml。
进一步地，所述步骤3)浓缩中，使用中空纤维浓缩机。
进一步地，所述步骤3)灭活中使用的灭活剂为终浓度为0.2％的甲醛溶液。
进一步地，所述步骤3)两种病毒液体积配比为：小鹅瘟：新城疫＝1:1。
进一步地，所述步骤3)乳化的方法为：取三份油相放入乳化罐中，慢速搅拌的同时缓缓加入一份水相，加完后，搅拌混匀，然后使用剪切机高速连续乳化，温度设定为10～20℃之间。
进一步地，所述步骤3)乳化后制得油包水剂型二联灭活疫苗。
另一方面，本发明还提供了所述的小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
另一方面，本发明还提供了所述的小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗在制备预防或治疗由小鹅瘟、新城疫引起的动物疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明提供一种小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗，现在销售的都是单苗，本发明不仅做成了联苗，做到一针两防，减少免疫刺激，并且该疫苗免疫种鹅可以有效地保护雏鹅，大大减小免疫雏鹅带来的劳动力。
2.本发明提供的制备小鹅瘟—新城疫二联疫苗方法，使用了重组新城疫病毒为反向遗传操作技术构建的基因工程毒种A-VII，与最新流行的基因VIId亚型新城疫同源性最近，且通过反向遗传技术将其致弱，既安全又有效；本发明的小鹅瘟TZ10株为2010年前后分离的毒株，同样与流行株较近，且毒种的病毒含量高达105.50ELD50/0.2ml以上。
3.相对于传统的疫苗制备方法中增加了两种抗原浓缩、配比技术及高速低温乳化，有效的提高了病毒的繁殖效力，降低了抗原损失，显著提升疫苗产品质量，疫苗经浓缩后病毒含量明显提高。
具体实施方式
下面将通过具体的实施例来对本发明进行说明。
实施例1病毒接种及病毒液的培养制备
1.小鹅瘟毒种繁殖、接种及孵育观察
将小鹅瘟种毒用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚，接种后每日照胚3～4次，选取48～120小时内死亡且病变明显的鹅胚，收获无菌且对1％鸡红细胞悬浮液凝集阴性的尿囊液样品定量分装，注明收获日期、种毒代次等信息，冷冻保存。
将上述尿囊液样品用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚，石蜡封孔，置38℃继续孵育，不必翻蛋。
孵育和观察
接种后48小时内，每日照胚一次，将48小时之内死亡的鹅胚弃去，然后每4～6小时照胚一次，随时取出48～144小时死亡的鹅胚，置于2～8℃冷藏库，气室向上直立，冷却4小时以上，弃去144小时以后的活鹅胚。
2.重组新城疫病毒毒种繁殖、接种及孵育观察
将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5)，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育。收获接种72～120小时内死亡或感染鸡胚液(尿囊液及羊水)定量分装，注明收获日期、种毒代次等信息，冷冻保存。
将上述鸡胚液用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5)，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，石蜡封孔，置36～37℃孵育。
接种后48小时内，每日照胚1次，将48小时内死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置2～8℃冷却12～24小时。
3.收获
将上述冷却的鹅、鸡胚取出，吸取尿囊液，其中小鹅瘟病毒含量应不低于105.50ELD50/0.2ml，新城疫红细胞凝集价不低于1:512(微量法)、病毒含量不低于108.00EID50/0.1ml。收获的两种病毒尿囊液进行纯化浓缩、灭活、配比、高温低速乳化及分装。
实施例2病毒液的浓缩、灭活及疫苗制备
1.病毒液的浓缩
将病毒通过无菌管道传送至中空纤维浓缩机进行浓缩，每种抗原均浓缩2倍以上，使浓缩后病毒液中小鹅瘟病毒含量不低于105.80ELD50/0.2ml，鸡胚液中重组新城疫病毒含量不低于108.30EID50/0.1ml。
2.病毒液的灭活
将浓缩后检验合格的小鹅瘟及新城疫病毒液分别加入甲醛溶液，使其甲醛溶液的终浓度均为0.2％，边加边搅拌，使其充分混合，当灭活罐中温度达到37℃开始计时，以120转/分进行灭活，NDV病毒液37℃灭活24h，GPV病毒液37℃灭活48h。灭活后的病毒液置2～8℃保存备用，应不超过1个月。
3.病毒液的配比及制备成疫苗产品
3.1病毒液的配比
将灭活检验合格的小鹅瘟、新城疫病毒按1:1(V/V)进行配比。
3.2油佐剂灭活疫苗的制备
取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加入边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-805份，混合后，高压灭菌备用。取配比后的制苗用病毒液96份，加入灭菌的吐温-804份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解。取3份油相放入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后，中速混合，然后高速乳化，制成小鹅瘟、新城疫二联灭活疫苗。
实施例3疫苗安全性试验
小鹅瘟—新城疫油乳剂二联灭活疫苗(TZ10株+A-Ⅶ株)，批号分别为GN-001P、GN-002P、GN-003P共3批，均由我公司研发中心实验室制备。小鹅瘟琼扩抗体阴性、新城疫抗体阴性或HI抗体不高于1:8的1月龄鹅、9月龄产蛋种鹅均购置高邮市心连心合作社。
1.单剂量一次接种的安全试验
实验方法
每批疫苗分别选取1月龄鹅10只、9月龄产蛋种鹅10只，每只胸部肌肉注射疫苗1.0ml，每组均另取10只相同来源、相同日龄的鹅，作为非免疫对照组。注射后连续观察21日，每日观察各组鹅精神状况、饮水、进食量等情况；免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鹅注射部位是否有红肿等局部注射反应；免疫前与免疫21日后称重，比较免疫组与对照组平均日增重；产蛋种鹅统计产蛋情况，剖杀所有鹅，检查注射部位疫苗吸收情况、是否有病理变化。
实验结果
3批疫苗每批分别单剂量一次性接种不同年龄段鹅，连续饲养观察21日，所有免疫组鹅，精神状态正常，采食和饮水正常，未出现任何全身不良反应。在免疫后7日、14日和21日，用手触摸接种部位，均未发现肿胀。免疫后21日，剖检注射部位均无疫苗颗粒存在，所有免疫鹅注射部位局部均无水肿、渗出、出血。免疫组与非免疫组鹅平均日增重没有明显差异。9月龄产蛋种鹅接种后，各免疫组在疫苗免疫后1周内种鹅产蛋数较非免疫组少2～3枚，随后逐渐恢复正常，免疫后21日各免疫组种鹅产蛋数与非免疫组比较无显著差异(见表1)。
表1单剂量一次接种的安全试验
2.单剂量重复接种的安全试验
实验方法
每批疫苗分别选取1月龄鹅10只、9月龄产蛋种鹅10只，每只胸部肌肉注射疫苗1.0ml，第一次接种后14日，每组以相同方法、相同剂量再接种一次，每组均另取10只相同来源、相同日龄的鹅，作为非免疫对照组。第二次注射后连续观察21日，每日观察各组鹅精神状况、饮水、进食量等情况；第二次免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鹅注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应；免疫前与第二次免疫21日后称重，比较免疫组与对照组平均日增重；产蛋种鹅统计产蛋情况，剖杀所有鹅，检查注射部位疫苗吸收情况是否有病理变化。
实验结果
3批疫苗每批分别单剂量重复接1月龄鹅、9月龄种鹅，所有免疫组鹅，精神状态正常，采食和饮水正常，未出现任何全身不良反应。在免疫后7日、14日和21日，用手触摸接种部位，均未发现肿胀。免疫后21日剖检注射部位，均无疫苗颗粒存在，所有免疫鹅注射部位局部均无水肿、渗出、出血。免疫组与非免疫组鹅平均日增重用没有明显差异。9月龄产蛋种鹅接种后，各免疫组在疫苗免疫后1周内种鹅产蛋数较非免疫组少2～3枚，随后逐渐恢复正常，免疫后21日各免疫组种鹅产蛋数与非免疫组比较无显著差异(见表2)。
表2单剂量重复接种的安全实验
3.双倍剂量一次接种的安全试验
实验方法
每批疫苗分别选取1月龄鹅10只、9月龄产蛋种鹅10只，鹅每只胸部肌肉注射疫苗2.0ml，每组均另取10只相同来源、相同日龄的鹅，作为非免疫对照组。注射后连续观察21日，每日观察各组鹅精神状况、饮水、进食量等情况；免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鹅注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应；免疫前与免疫21日后称重；产蛋种鹅统计产蛋请况；分别任取每批次疫苗免疫后21日种鹅所产鹅胚20枚，做好标记，比较鹅胚孵化率是否有差异；剖杀所有鹅，检查注射部位疫苗吸收情况、是否有病理变化；免疫前与免疫21日后称重，比较免疫组与对照组平均日增重；产蛋种鹅统计产蛋情况，剖杀所有鹅，检查注射部位疫苗吸收情况是否有病理变化。
实验结果
3批疫苗按照双倍剂量接种1月龄鹅、9月龄种鹅，所有免疫组鹅，精神状态正常，采食和饮水正常，未出现任何全身不良反应。在免疫后7日、14日和21日，用手触摸接种部位，均未发现肿胀。免疫后21日剖检注射部位，3批次疫苗免疫1、7、9月龄种鹅均有1～3只接种部位延肌纤维走向有少量乳黄色疫苗颗粒未吸收，其他种鹅接种部位均无疫苗颗粒存在，所有免疫鹅注射部位局部均无水肿、渗出、出血。免疫组与非免疫组鹅平均日增重没有明显差异。9月龄产蛋种鹅接种后，各免疫组在疫苗免疫后1周内种鹅产蛋数较非免疫组少2～3枚，随后逐渐恢复正常，免疫后21日各免疫组种鹅产蛋数与非免疫组比较无显著差异(见表3)。
表3双倍剂量接种安全实验
上述结果表明，生产的3批次小鹅瘟—新城疫二联灭活疫苗(TZ10株+A-Ⅶ株)对种鹅是安全的，免疫后不引起种鹅任何全身和局部不良反应，均不影响种鹅的生产性能，表明采用该疫苗生产工艺在实验室制备的疫苗能够达到对鹅的安全性要求。根据上述实验结果暂定该疫苗的安全性实验规程为：用1月龄左右的小鹅瘟琼扩抗体阴性，新城疫抗体阴性或HI抗体不高于1∶8的健康鹅10只，每只各胸部肌肉注射疫苗2ml，观察21日，应不出现因注射疫苗引起的局部和全身不良反应。
实施例4疫苗免疫效力实验
小鹅瘟、新城疫油乳剂灭活疫苗(TZ10株+A-Ⅶ株)，批号分别为GN-001P、GN-002P、GN-003P共3批，均由我公司研发中心实验室制备。小鹅瘟琼扩抗体阴性、新城疫抗体阴性或HI抗体不高于1:8的8月龄健康开产种鹅，均购自高邮市心连心合作社。小鹅瘟病毒TZ10株F5病毒液(病毒含量104.78ELD50/0.2ml)由公司研发中心实验室制备，新城疫病毒JS02/06株(病毒含量108.80ELD50/0.1ml)由由扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室分离、鉴定和提供。阳性血清、小鹅瘟琼扩抗原、新城疫抗原均由公司研发中心制备。
1实验方法
1.1分组与免疫选取8月龄健康开产种鹅40只(GPV琼扩抗体阴性、NDV HI抗体≤2log2)，随机分成4组，每组40只。任选三组分别免疫GN-001P、GN-002P、GN-003P批次疫苗，胸部肌肉注射1ml/只，剩余一组为非免疫对照组，各实验组鹅分别做好标记。
1.2种鹅血清、卵黄抗体检测
各实验组鹅免疫后每周逐只采血至免疫后28日，分离血清，检测GPV琼扩抗体和NDV HI抗体；每组分别任取免疫后4～5周内种鹅所产鹅蛋10枚(连同对照组)，检测卵黄中GPV琼扩抗体和NDVHI抗体。
1.33日龄雏鹅被动免疫攻毒实验
每实验组分别任取免疫后4～5周内所产种蛋30枚(连同对照组)，做好标记，置38℃孵化箱孵化29～30日，将免疫组孵出的雏鹅任选20只，对照组20只，戴上脚标，置于攻毒区隔离器中饲养3日，每组雏鹅采血分离血清，检测GPV琼扩抗体及NDV HI抗体。同时进行攻毒实验：GPV攻毒组，用GPV-TZ10株F5代攻毒(每毫升尿囊液病毒含量104.78ELD50/0.2ml)，每只雏鹅口服0.5ml，颈部皮下注射0.5ml，攻毒10只；NDV攻毒组，用新城疫检验强毒JS02/06株肌肉注射攻击，106.0ELD50/只，攻毒10只。免疫组与对照组分别隔离饲养观察14日，记录发病、死亡及保护情况。
2实验结果
2.1种鹅血清抗体检测
实验室生产的三批疫苗，以1ml/只剂量免疫，免疫健康易感产蛋种鹅，28d后各组鹅的GPV琼扩抗体效价平均值均≥3.6log2，NDVHI抗体效价几何平均值均≥10.3log2，非免疫对照组的GPV琼扩抗体均为阴性、NDV HI抗体均≤2log2，具体结果见表4、表5。
表4种鹅免疫28d后血清GPV琼扩抗体效价(Nlog2)
表5种鹅免疫28d后血清NDVHI抗体效价(Nlog2)
2.2鹅蛋卵黄抗体检测
每批次疫苗免疫组免疫后4～5周内任取10枚鹅蛋，其卵黄GPV琼扩抗体效价平均值均≥3.0log2，NDVHI抗体效价平均值均≥9.9log2，非免疫对照组10枚鹅蛋卵黄GPV琼扩抗体均为阴性、NDV HI抗体均≤2log2，结果见表6、7。
表6免疫后4周鹅蛋卵黄GPV琼扩抗体效价
表7免疫后4～5周内鹅蛋卵黄NDVHI抗体效价
2.3 3日龄雏鹅被动免疫攻毒实验
2.3.1 3日龄雏鹅血清GPV琼扩抗体NDV HI抗体检测
3批疫苗被动免疫组每组10只雏鹅血清GPV琼扩抗体效价平均值均≥2.9log2，NDVHI抗体效价平均值均≥8.4log2。结果见表8、9。
表8 3日龄雏鹅被动免疫血清GPV琼扩抗体效价
表9 3日龄雏鹅被动免疫血清NDVHI抗体效价
2.3.2 3日龄雏鹅被动免疫攻毒实验
3批疫苗被动免疫组每组10只雏鹅攻毒后采食、饮水、精神状态均正常，无小鹅瘟临床症状发生，攻毒后14日每组均10/10健活。非被动免疫对照组雏鹅攻毒后第3日精神开始出现精神萎靡、卧地聚堆、站立不稳、采食、饮水开始减少，排稀灰白色或黄绿色粪便，攻毒后第5日出现死亡，至攻毒后10日共死亡9只雏鹅。每只病死鹅剖检，心、肝、脾等实质性器官肉眼病变不明显，脑壳均充血、出血，尤其小脑部显著，肠道小肠段有部分肠管外观较正常肠道粗大，质地较硬，剖开可见小鹅瘟典型的淡灰或淡黄色纤维素性样栓塞，易于剥离，肠粘膜光滑，栓子切面层层纤维素性渗出物与坏死物凝固而成的假膜。被动免疫攻毒保护结果见表10。
表10 3日龄雏鹅被动免疫攻毒(小鹅瘟TZ10株)
3批疫苗被动免疫组的雏鹅采用新城疫基因Ⅶ型JS02/06强毒株攻毒后，采食、饮水、精神状态均正常，无新城疫临床症状，对强毒株攻击保护率均达100％。对照组雏鹅攻毒后，10日内100％发病，80％死亡。对死亡鹅只进行剖解，均出现新城疫典型临床症状。被动免疫攻毒结果见表11。
表11 3日龄雏鹅被动免疫攻毒(A-Ⅶ株JS02/06强毒株)
上述实验结果表明，3批次疫苗对种鹅具有很好的免疫效果，使雏鹅出雏时血清中含有较高水平的小鹅瘟、新城疫抗体，可以有效的抵抗小鹅瘟、新城疫病毒的攻击。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。

Claims (13)

1.一种小鹅瘟—重组新城疫二联油包水剂型灭活疫苗，其特征在于，由体积比为1：3的水相：油相组成，其中水相组成为小鹅瘟、重组新城疫二联灭活疫苗病毒液96体积份和吐温-804体积份，所述油相组成为：注射用白油94体积份、司本-805体积份和硬脂酸酯1体积份。
2.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其中所述小鹅瘟病毒毒株为TZ10，重组新城疫病毒毒株为A-VII。
3.根据权利要求1所述的灭活疫苗，其中所述小鹅瘟灭活疫苗病毒液和重组新城疫病毒灭活病毒液体积份数比为1:1。
4.一种权利要求1-3任一所述的小鹅瘟—重组新城疫二联油包水剂型灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)筛选健康易感染鹅、鸡胚；
2)生产用毒液的制备
小鹅瘟病毒毒种繁殖及接种
种毒用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚，接种后每日照胚3～4次，选取48～120小时内死亡且病变明显的鹅胚，收获无菌且对1％鸡红细胞悬浮液凝集阴性的尿囊液样品；
将上述尿囊液样品用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释，0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚，继续孵育，每日照胚一次，将48小时之内死亡的鹅胚弃去，然后每4～6小时照胚一次，随时取出48～144小时死亡的鹅胚，置于2～8℃冷藏库冷却4小时以上；
重组新城疫病毒毒种繁殖及接种
将毒种用灭菌生理盐水作10-4或10-5稀释，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，收获接种72～120小时内死亡或感染鸡胚液；
将上述鸡胚液用灭菌生理盐水作10-4或10-5稀释，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置36～37℃孵育，每日照胚1次，将48小时内死亡的鸡胚弃去，此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置2～8℃冷却12～24小时；
收获
将上述冷却的鹅、鸡胚取出，吸取尿囊液，其中小鹅瘟病毒含量不低于105.50ELD50/0.2ml，新城疫病毒含量不低于108.00EID50/0.1ml且红细胞凝集价不低于1:512。
3)病毒浓缩、灭活、配比、乳化及制成疫苗产品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)为11日龄易感染鹅胚，10～11日龄SPF鸡胚，通过对非免疫鹅胚卵黄中小鹅瘟琼扩抗体和/或接种前鹅胚内小鹅瘟病毒的检测来确保非免疫鹅胚的质量。
6.根据权利要求4所述的制备方法，所述步骤3)病毒浓缩后，鹅胚液中的小鹅瘟病毒含量不低于105.80ELD50/0.2ml，鸡胚液中重组新城疫病毒含量不低于108.30EID50/0.1ml。
7.根据权利要求4所述的制备方法，所述步骤3)浓缩中，使用中空纤维浓缩机。
8.根据权利要求4所述的制备方法，所述步骤3)灭活中使用的灭活剂为终浓度为0.2％的甲醛溶液。
9.根据权利要求4所述的制备方法，所述步骤3)两种病毒液体积配比为：小鹅瘟：重组新城疫＝1:1。
10.根据权利要求4所述的制备方法，所述步骤3)乳化的方法为：取三份油相放入乳化罐中，慢速搅拌的同时缓缓加入一份水相，加完后，搅拌混匀，然后使用剪切机高速连续乳化，温度设定为10～20℃之间。
11.根据权利要求4所述的制备方法，所述小鹅瘟病毒毒株为TZ10，重组新城疫病毒株为A-VII。
12.根据权利要求4-11任一所述的小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
13.权利要求1-3任一项或权利要求12所述的小鹅瘟—重组新城疫二联灭活疫苗在制备治疗或预防由小鹅瘟和/或新城疫病毒引起的动物疾病的药物中的应用。
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