CN1923279A - 鸡新城疫－禽流感二联乳剂疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药品类。为克服已有技术中疫苗中弱毒疫苗不易保存、易受母源抗体的干扰，免疫效果不稳定、用甲醛灭活病毒的疫苗存在抗原性差还有致癌的潜在危险等技术问题特提出本方案。该鸡新城疫－禽流感二联乳剂疫苗是采用超高压灭活病毒的新工艺，将新城疫病毒株和禽流感病毒株分别在300MPA和500MPA环境下保持30分钟灭活病毒，两种病毒液以1∶1加入到占总量2％的吐温－80和占总量0.01％硫柳汞钠溶液搅拌成水相；将水相混合物缓慢加入到比例为0.921∶0.058∶0.02的7号白油、司班－80和硬脂酸铝配制的油相中，水相油相比例为1∶2，充分混合乳化制成油包水型的灭活ND－AI新城疫－禽流感二联疫苗。经实验和试用证明它具有性能稳定、免疫效果好、好保存及经济效益高的特点，值得推广使用。
Description
技术领域：本发明属于药品类，它具体涉及用于禽类的新城疫-禽流感二联乳剂疫苗的制备方法。
背景技术：新城疫和禽流感是危害养鸡业发展的两种重要的病毒传染病，广泛地流传于包括我国在内的世界各地，给养鸡业造成巨大的经济损失。目前对禽流感主要应用特定血清型毒株研制的灭活疫苗进行预防和控制，对鸡新城疫的防治，虽然有几种弱毒疫苗可用，但弱毒疫苗不易保存，而且易受母源抗体的干扰，免疫效果不稳定，因此目前都是应用灭活疫苗进行预防。在灭活疫苗的研制及生产中主要是采用热力和化学方法处理，但都存在一些技术问题不好克服。近年来发现可用超高压技术做病毒灭活处理，经试验发现在超高压条件下能够破坏分子内部非共价键的结合，能使病毒丧失原有的感染性但还保持住原病毒的免疫原性，可以诱导机体产生与原病毒相同的免疫反应，所以超高压技术在疫苗制备方面有极大的应用潜力。
发明内容：本发明的目的是为克服已有技术中疫苗的制备方法上存在的技术问题特提出本方案，它采用超高压的方法对病毒株处理，此法具有经济可靠且免疫效果好的特点。
按如上构思，本方案所提供的鸡新城疫-禽流感二联乳剂疫苗的制备方法，其特征是它们的工艺过程如下，
①将新城疫病毒(NDV)LA SOTA株在200～400MPA超高静水压下保压分钟做病毒灭活处理；
②将禽流感病毒(AIV)H9株在400～600MPA超高静水压下保压20～40分钟做病毒灭活处理；
③将(NDV)、(AIV)灭毒液按毒价比例1∶1混合，加入占总量2％的吐温-80和占总量0.01％硫柳汞钠溶液搅拌成水相；
④取比例为0.921∶0.058∶0.02的7号白油、司班-80和硬脂酸铝配制成油相；
⑤将水相混合物缓慢加入到油相中，其水相油相比为1∶2，用搅拌器充分混合乳化，即制成油包水型的灭活ND-AI新城疫-禽流感二联乳剂疫苗。
在本方案中，新城疫病毒(NDV)LA SOTA超高压灭活的压力的最佳值为300MPA，保压时间为30分钟。禽流感病毒(AIV)H9超高压灭活的压力的最佳值为500MPA，保压时间为30分钟。
采用本方案的优越性主要体现在该疫苗制备成本低，它的免疫效果好，其产生抗体的效果明显地高于化学方法中的甲醛灭毒或福尔玛林灭毒的疫苗，新城疫禽流感二联乳剂疫苗对家鸡禽类适用的范围广，值得推广使用。
附图说明：图1是两种灭活疫苗免疫抗体曲线。
具体实施方式：本方案是对已有技术中家鸡用的甲醛灭活病毒或福尔玛林灭活病毒疫苗的改进和提高。它是取新城疫病毒(NDV)LA SOTA株在300MPA超高压条件下保压30分钟、取将禽流感病毒(AIV)H9株在500MPA超高压条件下保压30分钟作病毒灭活处理，将两种灭活病毒液体按毒价比例近于1∶1混合，加入占总量2％的吐温-80和占总量0.01％硫柳汞钠溶液搅拌成水相；再将水相混合物缓慢加入到比例为0.921∶0.058∶0.02的7号白油、司班-80和硬脂酸铝配制的油相中，其水相油相比为1∶2，用搅拌器充分混合乳化，即制成油包水型的灭活ND-AI新城疫-禽流感二联乳剂疫苗。
在超高压处理下破坏了病毒颗粒内部的非共价键的结合，膜衣壳蛋白亚单位之间解体，破坏了它的传染性；在超高压处理时不破坏它内部的共价结合键，作为抗原的单个亚单位不被破坏，故其免疫原性不变。本方案的疫苗经具体的实验证明，它具有好保存、使用的家鸡产生的抗体效果好的特点，对其它禽类适用的范围广，因此值得批量制造推广使用。
本方案进行了鸡新城疫禽流感二联超高静水压灭活疫苗与甲醛灭活疫苗、常态对照组比较疫苗的免疫试验：其分组情况是将60只30日龄健康鸡分为3组，每组20只。第1组，肌肉注射超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂苗0.5ml/只；第2组，肌肉注射甲醛灭活ND-AI二联油乳剂苗0.5ml/只。免疫抗体的测定：于免疫当日(0天)和免设后7、15、20、60、80、100、120天各组分别随机抽样采血，测定血清NDV、AIV的HI抗体效价实验鸡HI抗体测定结果
表1 (GMP Log2)
| 组别 | 免疫剂量(ml) | HI抗体种类 | 免疫后HI抗体测定时间(d) | |||||||
| 0 | 7 | 15 | 20 | 60 | 80 | 100 | 120 | |||
| 静压灭活疫苗免疫组 | 0.50 | NDV | 4.2 | 6.5 | 8.0 | 10.2 | 9.9 | 9.4 | 8.6 | 7.4 |
| AIV | 2.0 | 5.2 | 7.6 | 9.8 | 9.4 | 8.9 | 8.2 | 7.1 | ||
| 甲醛灭活疫苗免疫组 | 0.50 | NDV | 4.2 | 5.6 | 7.2 | 9.3 | 8.6 | 7.6 | 7.2 | 6.5 |
| AIV | 2.0 | 4.5 | 7.0 | 8.8 | 8.0 | 7.3 | 6.8 | 6.1 | ||
| 对照组 | NDV | 4.2 | 5.0 | 4.6 | 5.3 | 5.8 | 5.3 | 5.1 | 4.6 | |
| AIV | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | ||
表1中两个试验组0天及对照组0～120天测定的AIV HI抗体效价均≤2。
从表中可以看出，试验期间测得的NDV、AIV HI抗体效价，静压灭活疫苗免疫组和甲醛灭活疫苗免疫组的两种抗体的效价均高于对照组的相应值(p＜0.01)，说明试验组两种疫苗都有明显的免疫效果。
从以下的图1中可看出两种疫苗用后产生的抗体的情况，静压灭活疫苗免疫组的NDV、AIV HI抗体效价明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值，说明静压灭活疫苗的免疫效果优于甲醛灭活疫苗。
两种疫苗NDV HI抗体效价比较
表2 (GMP Log2)
| 免疫剂量(ml) | 组别 | HI抗体 | 免疫后时间(d) | 7-120天抗体平均值 | |||||||
| 0 | 7 | 15 | 20 | 60 | 80 | 100 | 120 | ||||
| 0.50 | 静压疫苗组 | NDV | 4.2 | 6.5 | 8.0 | 10.2 | 9.9 | 9.4 | 8.6 | 7.4 | 8.57 |
| 甲醛疫苗组 | 4.2 | 5.6 | 7.2 | 9.3 | 8.6 | 7.6 | 7.2 | 6.5 | 7.43 | ||
| 抗体效价之差 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 1.3 | 1.8 | 1.4 | 0.9 | 1.14 | |||
由表2可以看出，在试验测定的7～120天中，静压灭活疫苗免疫组的NDV HI抗体效价在不同测定时期，均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值(p＜0.01)，平均高出1.14Log2。
表3两种疫苗AIV HI抗体效价比较(GMP Log2)
| 免疫剂量(ml) | 组别 | HI抗体 | 免疫后时间(d) | 7-120天抗体平均值 | |||||||
| 0 | 7 | 15 | 20 | 60 | 80 | 100 | 120 | ||||
| 0.50 | 静压疫苗组 | AIV | 2 | 5.2 | 7.6 | 9.8 | 9.4 | 8.9 | 8.2 | 7.1 | 8.03 |
| 甲醛疫苗组 | 2 | 4.5 | 7.0 | 8.8 | 8.0 | 7.3 | 6.8 | 6.1 | 6.93 | ||
| 抗体效价之差 | 0.7 | 0.6 | 1.0 | 1.4 | 1.6 | 1.4 | 1.0 | 1.10 | |||
由表3可以看出，在试验测定的7～120天中，静压灭活疫苗免疫组的AIV HI抗体效价在不同测定时期，也均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值(p＜0.01)，平均高出1.10Log2。从表2、3还可以看出，超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗与甲醛灭活ND-AI二联油乳剂疫苗相比，抗体产生速度相当，但超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗免疫的试验鸡的抗体蜂值高、维持性好、衰减较慢。
总之，在试验期间，由测得NDV、AIV HI抗体效价分析表明，静压灭活疫苗免疫组和甲醛灭活疫苗免疫组的两种抗体的效价均高于对照组的相应值(p＜0.01)，说明两种疫苗都有明显的免疫效果。而且可以看出静压灭活疫苗免疫组的NDV、AIV HI抗体效价分别为8.57Log2和8.03Log2，明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值7.43Log2和6.93Log2(p＜0.01)，说明静压灭活疫苗的免疫效果优于甲醛灭活疫苗。
另外，在试验鸡同种抗体水平比较方面：经分析证明，在免疫测定期间，静压灭活疫苗免疫组的NDV HI抗体效价在不同测定时期，均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值(p＜0.01)，平均高出1.14Log2。静压灭活疫苗免疫组的AIVHI抗体效价在不同测定时期，也均明显高于甲醛灭活疫苗免疫组的相应值(p＜0.01)，平均高出1.10Log2。
讨论：病毒超高静水压灭活条件的确定NDV、AIV两种病毒对超高静水压的耐受性有一定的差异，我们通过试验确定了NDV、AIV病毒临界灭活条件，NDV的临界灭活条件为450Mpa 30min，而AIV的临界灭活条件为250Mpa 30min。但为了确保安全，NDV、AIV病毒液分别选用500Mpa、300Mpa超高静水压下分别保压灭活30min处理。试验证明该灭活条件下病毒灭活彻底。
抗原病毒两种灭活方法的差异，超高静水压处理是一种低温高压物理处理方法，可导致病毒囊膜上的蛋白亚单位组合形式发生改变使病毒失去感染性，但不影响其抗原结构，由于病毒囊膜结构的物理性改变，还可使病毒的部分膜内抗原得以暴露，使其抗原性增强。而甲醛灭活法，是一种传统的抗原病毒灭活方法，这种方法是一种化学灭活方法，其灭活原理是通过醛类的还原作用和醛化作用使病毒蛋白变性，进而使病毒灭活。对制备疫苗的抗原灭活而言，甲醛灭活具有两大缺陷：首先甲醛灭活可降低或影响病毒抗原的抗原性；其次是甲醛是一种潜在的致癌物质，对动物健康不利，更重要的是甲醛疫苗用于供食用的动物，将对人类健康产生潜在危害。
结论：用超高静水压并保压一定时间，对NDV、AIV病毒液进行超高压冷处理，可使两种病毒完全灭活，用灭活病毒抗原制备的超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗安全、稳定。用灭活病毒抗原制备的超高静水压灭活ND-AI二联乳剂疫苗与甲醛灭活的ND-AI二联乳剂疫苗相比，在抗原含量相同的情况下，前者免疫效果更好，前者免疫的试验鸡血清NDV、AIV HI抗体效价较后者分别高出1.14Log2和1.10Log2(p＜0.01)。而且实验还证明超高静水压灭活ND-AI二联油乳剂疫苗与甲醛灭活ND-AI二联乳剂疫苗相比，抗体产生速度相当，但超高静水压灭活ND-AI二联乳剂疫苗免疫的试验组鸡的抗体维持性好，衰减较慢，充分显示了二联乳剂疫苗的优越性。
Claims (3)
1.一种鸡新城疫-禽流感二联乳剂疫苗的制备方法，其特征是它们的工艺过程如下，
①将新城疫病毒(NDV)LA SOTA株在200～400MPA超高静水压下保压分钟做病毒灭活处理；
②将禽流感病毒(AIV)H9株在400～600MPA超高静水压下保压20～40分钟做病毒灭活处理；
③将(NDV)、(AIV)灭毒液按毒价比例1∶1混合，加入占总量2％的吐温-80和占总量0.01％硫柳汞钠溶液搅拌成水相；
④取比例为0.921∶0.058∶0.02的7号白油、司班-80和硬脂酸铝配制成油相；
⑤将水相混合物缓慢加入到油相中，其水相油相比为1∶2，用搅拌器充分混合乳化，即制成油包水型的灭活ND-AI新城疫-禽流感二联乳剂疫苗。
2.按照权利要求1所述的二联乳剂疫苗的制备方法，其特征是新城疫病毒(NDV)LA SOTA超高压灭活的压力的最佳值为300MPA，保压时间为30分钟。
3.按照权利要求1所述的二联乳剂疫苗的制备方法，其特征是禽流感病毒(AIV)H9超高压灭活的压力的最佳值为500MPA，保压时间为30分钟。
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|---|---|---|---|---|
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| CN104415330A (zh) * | 2013-09-11 | 2015-03-18 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种疫苗组合物及其制备方法与应用 |
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2005
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