CN104399070A - 猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法，属于猪支原体肺炎灭活疫苗领域。本发明首先公开了一种由水相和油相按照1：1-3的体积比组成的猪支原体肺炎灭活疫苗，所述水相由吐温-80和猪肺炎支原体菌液按照2-5：95-98的比例组成，所述油相由聚氧乙烯40氢化蓖麻油、司本-80和白油按照1-2：5-8：90-94的比例组成。本发明进一步公开了制备所述猪支原体肺炎灭活疫苗的方法。本发明灭活疫苗的乳化佐剂中加入了具有亲水和疏水基的聚氧乙烯40氢化蓖麻油，显著增强了疫苗的乳化效果，显著降低了白油用量和疫苗的粘稠度，减低了注射的难度和动物的应激反应，抗体在较长的时间内能保持在较高的水平，对仔猪免疫效果显著。

Description

猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及灭活疫苗，尤其涉及猪支原体肺炎灭活疫苗，本发明进一步涉及制备该猪支原体肺炎灭活疫苗的方法，属于猪支原体肺炎灭活疫苗的制备领域。

背景技术

猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎，其病原最早由Mare、Switzer(1965)和Goodwin等(1965)从患肺炎猪的肺组织中分离出，并在实验室复制出本病，报导后该病原被命名为M.hyopneumoniae。长期以来，本病被认为是对养猪业造成重大经济损失、最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。本病虽为老病，但近年来由于经常和猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒等其它病原混合感染，造成重大的经济损失而突显出了其重要性。中国地方猪种对本病明显较引入品种易感。带菌猪是本病的主要传染源，病原体是经气雾或与病猪的呼吸道分泌物直接接触传播，其经母猪传给仔猪使本病在猪群中持久存在。其严重程度常因管理水平、季节、通风条件、猪的密度以及其它环境因素改变而有很大差异，最早可能发生于2～3周龄(地方品种有9日龄的)的仔猪，但一般传播缓慢，在6～10周龄感染较普遍，许多猪直到3～6月龄时才出现明显症状。易感猪与带菌猪接触后，发病的潜伏期大的为十天或更长时间，并且所有自然发生的病例均为混合感染，包括支原体、细菌、病毒及寄生虫等。

目前，预防猪支原体性肺炎的弱毒活疫苗存在操作复杂、不易推广的问题，亟待开发一种操作简单，免疫动物后能够提高体液免疫反应和增强免疫效果的猪支原体肺炎灭活疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法，该方法制备工艺简单，所制备的灭活疫苗免疫动物后能够提高体液免疫反应并增强免疫效果。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先提供了一种猪支原体肺炎灭活疫苗，所述灭活疫苗由水相和油相按照1：1-3的体积比组成；其中，所述的水相由吐温-80和猪肺炎支原体菌液按照2-5：95-98的体积比组成；所述的油相由聚氧乙烯40氢化蓖麻油(Kolliphor RH40)、司本-80和白油按照1-2：5-8：90-94的体积比组成。

为了达到更好的技术效果，所述灭活疫苗由水相和油相按照1：1的体积比组成。

优选的，所述的水相由吐温-80和猪肺炎支原体菌液按照4：96的体积比组成；所述的油相由聚氧乙烯40氢化蓖麻油、司本-80和白油按照1：6：93的体积比组成。

本发明还公开了一种制备所述猪支原体肺炎灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)培养猪肺炎支原体菌液，收获菌液；(2)加入灭活剂将菌液灭活；(3)制备油相和水相，将油相和水相混合，乳化；(4)将乳化好的疫苗定量分装，密封，即得。

其中，步骤(1)中采用发酵罐培养的方式培养猪肺炎支原体菌液；所述的培养方式如下：按发酵罐容积5％-20％的量将猪肺炎支原体接种到培养基中，优选为PPLO肉汤培养基；在以下培养条件下进行培养：温度37℃、pH值7.0、搅拌转速40-60r/min，通气培养15-96小时；采用逐步扩大培养方式，一直到所需的量；收获菌液。对收获的菌液进行抗原浓度测定，要求5×10⁸变色单位≤抗原水平/头份≤2×10¹⁰变色单位。

步骤(2)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)，其终浓度达到2mmol/L，其中BEI用2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)与0.2mol/L的NaOH溶液在37℃下水浴1h(每隔15、20min摇匀一次)配制成所需浓度的BEI灭活液，以0.22μm滤膜滤器过滤除菌，2～8℃存放备用；

加入灭活剂后在37℃下搅拌培养至少24小时；然后加入硫代硫酸盐灭菌水溶液中和过剩的二乙烯亚胺，在37℃下再连续搅拌培养至少24小时。

步骤(3)中，所述油相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，将白油90-94份加热到100℃，加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油1-2份，混匀，将油温降到50℃以后加入司本-805-8份搅拌均匀，125℃灭菌30分钟，冷却后即得；优选的，所述油相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，将白油93份加热到100℃，加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油1份，混匀，将油温降到50℃以后加入司本-806份搅拌均匀，125℃灭菌30分钟，冷却后即得；

步骤(3)中所述水相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，取灭菌的吐温-802-5份、检验合格的猪肺炎支原体菌液95-98份，混合，搅拌至吐温-80完全溶解，即得；优选的，所述水相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，取灭菌的吐温-804份、检验合格的猪肺炎支原体菌液96份，混合，搅拌至吐温-80完全溶解，即得。

步骤(3)中将油相和水相按照体积比油相：水相＝1-3：1混合；优选的，将油相和水相按照体积比1：1的比例混合均匀。

步骤(4)中所述的乳化是以4,000r/min乳化30min。乳化后，取样10ml，以3,000r/min离心15min，不分层，即可将乳化好的疫苗定量分装，密封。

本发明方法制备得到的猪支原体肺炎灭活疫苗对非靶动物、靶动物安全，单剂量重复接种及超大剂量接种安全，免疫后猪精神良好，采食正常，接种后的注射部位均未出现红肿现象；对仔猪免疫效果显著，免疫组肺部病变计分与对照组差异显著；免疫期持续6个月仍有很强的免疫效果。

本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明乳化佐剂中使用具有亲水和疏水基的聚氧乙烯40氢化蓖麻油，增强了乳化效果，减少了白油用量，简化了生产工艺；通过减少白油的用量，使疫苗的粘稠度降低，减少了注射的难度同时显著减轻了动物的应激反应；动物实验证明，本发明制备的猪支原体肺炎灭活疫苗对非靶动物、靶动物安全，对仔猪免疫效果显著，使抗体在较长的时间内保持在一个较高的水平，免疫期持续6个月仍有很强的免疫效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、菌株

猪肺炎支原体P-5722-3株购自美国辉动保公司，商品名称为：MHPPstock p-3，NL1042,4/14/88，由哈药集团生物疫苗有限公司保存。

实施例1猪支原体肺炎灭活疫苗的制备

1、菌株特点

1.1形态和生化特性

猪肺炎支原体P-5722-3株，菌体形态为环状、球状、丝状、杆状或点状多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性。

1.2培养特性

在Lps液体培养基中，置37℃培养5-10日，培养基pH值下降0.5以下，呈现轻度混浊；在固体培养基上，置37℃、含5％CO₂的潮湿环境中培养7～10日，低倍显微镜下可见灰白色支原体菌落。大多数菌落边缘整齐，有少数菌落边缘不整齐，多数菌落中间没有“脐”状特征。

1.3血清学特性

用代谢抑制试验鉴定，即将猪肺炎支原体菌液用Lps培养基稀释至10⁴～10⁵CCU/ml后，与含有20％的兔抗猪肺炎支原体阳性血清(琼扩效价不低于1：16)的Lps培养基等量混合，同时设不加阳性血清的猪肺炎支原体培养物对照管，置37℃培养15日，观察培养基颜色变化。对照管pH值下降0.5以上，含阳性血清的试管培养基颜色不发生变化或pH值下降低于0.5。猪肺炎支原体阳性血清能特异性地抑制猪肺炎支原体对培养基中葡萄糖的代谢。

1.4安全性

用30～50日龄健康易感猪3头，经胸腔接种10头份/头或经鼻腔接种20头份/头，观察20日，不出现由注射引起的不良反应或死亡。

1.5免疫原性

用30～50日龄健康易感猪5头，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将菌液稀释成5×10⁶CCU/ml，经胸腔内接种1ml/头(或经鼻腔内接种2ml/头)，同时设对照猪5头，免疫45日后，连同对照猪用1：50稀释的济南株猪肺组织强毒(购自中国兽医微生物菌种保藏中心，cvcc354)气管内注射5ml，观察25日扑杀，检查肺脏病变并按肺脏病变计分计算免疫原性保护率。经胸腔接种的免疫猪肺脏病变保护率大于70％，经鼻腔接种免疫猪的肺脏病变保护率大于60％。

2、猪支原体肺炎灭活疫苗的制备

(1)采用发酵罐培养猪肺炎支原体菌液。将猪肺炎支原体按发酵罐容积5％-20％的量接种到PPLO肉汤培养基中，将温度调节37℃、pH值控制在7.0、搅拌转速40-60r/min，通气培养15-96小时，采用逐步扩大培养方式，一直到所需的量，收获菌液。

(2)对收获的菌液进行抗原浓度测定。取35支无菌试管，每一管装1.8ml PPLO肉汤。在第一支试管里加入0.2ml待测抗原(灭活前原菌液)，充分混匀即-1，从中吸取0.2ml加入第二支试管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到第11支试管即-11，其中从-4到-11每个梯度加4支试管。在37℃培养，观察培养基颜色改变的情况，以颜色发生变化为依据，颜色发生变化判定为抗原在培养基中具有代谢活力；颜色没有发生变化，判定为抗原在培养基中没有代谢活力，计算CCU/ml。参照《中国兽药典》附录进行病毒半数致死量、感染量测定法进行计算。要求，5×10⁸变色单位≤抗原水平/头份≤2×10¹⁰变色单位。

(3)将合格的菌液进行灭活，在菌液培养的最后阶段，培养物pH值达到7.8，在该值至少保持在1小时内无大变化。此时加入过滤灭菌的二乙烯亚胺(BEI)，其中BEI用2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)与0.2mol/L的NaOH溶液在37℃下水浴1h(每隔15、20min摇匀一次)配制成所需浓度的BEI灭活液，以0.22μm滤膜滤器过滤除菌，2～8℃存放备用。加入后使其浓度达到2mmol/L，在温度37℃下搅拌培养至少24小时。然后加入硫代硫酸盐灭菌水溶液来中和过剩的BEI。在温度37℃下再连续搅拌培养至少24小时。灭活后，用硫代硫酸盐中和前，取样本，用适合的培养基检测其灭活程度。用适合的培养基进行批量样品的无菌测试。灭活培养物可被转到灭菌的器皿中置2-7℃保存直至装瓶。

(4)将灭活好的菌液进行无菌检验和灭活检验。无菌检验根据现行《中国兽药典》附录进行检验，全部无菌。灭活检验将经过灭活将灭活的菌液用PPLO肉汤稀释成含5％、10％、20％，并设阴性对照，在37℃下，80r/m，培养16-17日，观察有无颜色变化，均无颜色变化判定灭活彻底。

(5)制备疫苗，通过制备油相和水相，等比例乳化而成。按体积比计，油相按配方要求分别量取聚氧乙烯40氢化蓖麻油1份、司本-806份、白油93份，将白油加热到100℃按照体积加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油，混匀；将油温降到50℃以后加入司本-80搅拌均匀，125℃灭菌30分钟，冷却后即得到所述疫苗的油相。水相制备：按体积比计，取灭菌的吐温-804份、检验合格的菌液96份，导入配苗罐中，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。按体积比计，取油相1份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以4,000r/min乳化30min。乳化后，取样10ml，以3,000r/min离心15min，不分层。

(6)将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，即得。

实施例2猪支原体肺炎灭活疫苗的安全性试验

根据本发明实施例1的制备方法，试制3批猪支原体肺炎灭活疫苗，分别对试制的3批猪支原体肺炎灭活疫苗进行非靶动物、单剂量、超剂量和单剂量重复注射剂量安全试验。

1、猪支原体肺炎灭活疫苗对非靶动物的安全性试验

小白鼠的安全试验，试制的3批疫苗分别皮下注射体重14～24g小白鼠8只，每只0.5ml，同时设立生理盐水免疫对照组，观察14日，观察有无疫苗所致的不良反应。

结果见表1，接种疫苗的小白鼠未出现任何不良反应，全部健活，证明本发明制备的猪支原体肺炎灭活疫苗对非靶动物使用安全。

表1疫苗注射非靶动物安全性试验

2、猪支原体肺炎灭活疫苗对靶动物的单剂量接种的安全试验

用试制的3批猪支原体肺炎灭活疫苗分别单剂量(2.0ml)肌肉注射2周龄健康易感猪各10头，同时设立生理盐水免疫对照组，观察试验猪接种后的安全性，观察21日，观察疫苗接种后注射部位是否出现红肿反应，精神、采食异常等不良反应。

结果见表2，免疫后猪精神良好，采食正常，接种后的注射部位均未出现红肿现象，对照试验猪均正常，证明本发明制备的猪支原体肺炎灭活疫苗单剂量接种安全。

表2靶动物的单剂量接种的安全试验

3、猪支原体肺炎灭活疫苗对靶动物的单剂量重复注射接种的安全试验

用试制的3批猪支原体肺炎灭活疫苗分别单剂量肌肉注射2周龄健康易感猪各10头，同时设立生理盐水免疫对照组，21后再次单剂量肌肉注射一次，同时对照组生理盐水免疫，观察21日，观察疫苗接种后注射部位是否出现红肿反应，精神、采食异常等不良反应。

结果见表3，结果表明，该疫苗对接种猪无不良影响，免疫后的猪精神良好，采食正常，接种后的注射部位均未出现红肿现象；对照试验猪均正常。证明本发明制备的猪支原体肺炎灭活疫苗单剂量重复接种安全。

表3靶动物的单剂量重复接种的安全试验

4、猪支原体肺炎灭活疫苗对靶动物的超大剂量接种的安全试验

用试制的3批猪支原体肺炎灭活疫苗分别超大剂量肌肉注射2周龄健康易感猪各10头，同时设立生理盐水免疫对照组，观察试验猪接种后的安全性，观察21日，观察疫苗接种后注射部位是否出现红肿反应，精神、采食异常等不良反应。

结果见表4，免疫后的猪精神良好，采食正常，接种后的注射部位均未出现红肿现象，对照试验猪均正常，证明本发明制备的猪支原体肺炎灭活疫苗超大剂量接种安全。

表4靶动物的超大剂量接种的安全试验

实施例3猪支原体肺炎灭活疫苗的免疫性试验

根据本发明实施例1的制备方法，试制3批猪支原体肺炎灭活疫苗。

1、灭活疫苗的免疫效果测定

用试制的三批猪支原体肺炎灭活疫苗分别肌肉注射猪肺炎支原体血清抗体阴性健康易感猪各10头，每头2.0ml，另设10头作为对照猪注射生理盐水，同条件下隔离饲养，注射后14日，以同样剂量剂进行二免。所有试验猪按照常规饲养进行管理，仔猪于24日龄断奶，65日龄转入育肥舍。免疫后称取并记录各试验猪初生体重、断奶体重、出栏体重，统计并记录各组试验猪各阶段饲料消耗情况。诊断和记录试验期间试验猪中发病猪的病名、发病和死亡日龄，并计算呼吸道发病率，进行免疫效果的测定。

结果见表5，根据统计学分析结果表明，三批疫苗之间免疫效果差异不显著，与对照差异显著，尤其肺部病变计分，免疫组与对照组差异显著，说明本发明制备的猪支原体肺炎灭活疫苗起到了很好的免疫效果。

表5免疫效果的测定结果

注:同列数据肩标小写字母完全不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)。

2、免疫持续期试验

用试制的三批猪支原体肺炎灭活疫苗分别肌肉注射2周龄健康易感猪10头，每头2.0ml，同时设立对照组注射生理盐水。分别于注射后30，60，90及180日通过前腔静脉采血并分离血清，按照ELISA抗体检测试剂盒说明书进行检测，在波长为650nm处测量和记录样品和对照的吸光度值，进行免疫持续期的测定。

结果见表6，所测得结果利用统计学分析，表明所制备的3批产品间差异不显著，免疫组与对照组差异显著，免疫后60日抗体呈上升趋势，至6个月免疫效果仍然为阳性。免疫组与对照组肺部病变差异显著。本发明制备的猪支原体肺炎灭活疫苗免疫效果显著，免疫期持续6个月仍有很强的免疫效果。

表6免疫持续期的测定

注:同列数据肩标小写字母完全不同表示差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)。

3、与进口产品免疫效果比较

用试制的三批猪支原体肺炎灭活疫苗与在市场上购买的英特威国际有限公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)进口疫苗比较，分别肌肉注射健康易感猪10头，每头2.0ml，另设10头作为对照猪注射生理盐水，同条件下隔离饲养，注射后14日，以同样剂量剂进行二免。所有试验猪按照常规饲养进行管理，仔猪于24日龄断奶，65日龄转入育肥舍。免疫后称取并记录各试验猪初生体重、断奶体重、出栏体重，统计并记录各组试验猪各阶段饲料消耗情况。诊断和记录试验期间试验猪中发病猪的病名、发病和死亡日龄，并计算呼吸道发病率，进行免疫效果的测定。

结果见表7，可以看出本发明制备的3批疫苗免疫效果均比进口疫苗强，试验猪呼吸道发病率、死亡率和肺部病变记分均低于进口疫苗免疫组，差异不显著。

表7免疫效果的测定结果

Claims (10)

1.一种猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于：按体积比计，由水相和油相按照1：1-3的比例组成；其中，所述水相由吐温-80和猪肺炎支原体菌液按照2-5：95-98的比例组成；所述油相由聚氧乙烯40氢化蓖麻油、司本-80和白油按照1-2：5-8：90-94的比例组成。

2.按照权利要求1所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于：由水相和油相按照1：1的比例组成。

3.按照权利要求1所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于：所述水相由吐温-80和猪肺炎支原体菌液按照4：96的比例组成；所述油相由聚氧乙烯40氢化蓖麻油、司本-80和白油按照1：6：93的比例组成。

4.一种制备权利要求1-3任何一项所述的猪支原体肺炎灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养猪肺炎支原体菌液，收获菌液；(2)加入灭活剂将猪肺炎支原体菌液灭活；(3)制备油相和水相；将油相和水相混合，乳化；(4)将乳化好的疫苗定量分装，密封，即得。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中采用发酵罐培养猪肺炎支原体菌液；所述的培养方式如下：按发酵罐容积5％-20％的容积量将猪肺炎支原体接种到培养基中，在以下条件进行培养：温度37℃、pH值7.0、搅拌转速40-60r/min，通气培养15-96小时，逐步扩大培养，收获菌液。

6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述灭活剂为二乙烯亚胺，其终浓度达到2mmol/L；加入灭活剂后在37℃下搅拌培养至少24小时；然后加入硫代硫酸盐灭菌水溶液中和过剩的二乙烯亚胺，在37℃下再连续搅拌培养至少24小时。

7.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述油相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，将白油90-94份加热到100℃，加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油1-2份，混匀，将油温降到50℃以后加入司本-805-8份搅拌均匀，125℃灭菌30分钟，冷却后即得；

所述水相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，取灭菌的吐温-802-5份、猪肺炎支原体菌液95-98份，混合，搅拌至吐温-80完全溶解，即得。

8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述油相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，将白油93份加热到100℃，加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油1份，混匀，将油温降到50℃以后加入司本-806份搅拌均匀，125℃灭菌30分钟，冷却后即得；所述水相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，取灭菌的吐温-804份、检验合格的猪肺炎支原体菌液96份，混合，搅拌至吐温-80完全溶解，即得。

9.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中水相和油相按照1：1-3的体积比混合；优选的，将水相和油相按照1：1的体积比混合；所述的乳化是以4,000r/min乳化30min。

10.权利要求4-9任何一项所述制备方法制备得到的猪支原体肺炎灭活疫苗。