CN1260000A - 戊肝巴基斯坦毒株的重组蛋白及其在诊断方法和疫苗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在真核表达系统内表达戊肝巴基斯坦毒株(SAR－55)开放读码框2(ORF－2)蛋白质。表达出的蛋白可以作为抗原用于诊断性免疫测试和/或作为免疫原或疫苗来抗戊肝感染。

Description

戊肝巴基斯坦毒株的重组蛋白及其在诊断方法和疫苗中的用途

发明领域

本发明涉及肝炎病毒学领域。更具体地说，本发明涉及来自巴基斯坦的一种肠道传染的戊肝毒株(SAR-55)衍生的重组蛋白，使用这种蛋白的诊断方法和疫苗。

发明背景

传染性戊肝是一种非甲/非乙的肠道传染性肝炎，已被报道发生在亚洲、非洲和中美洲(Balayan，M.S.(1987)，Soviet Medical Reviews，Section E，VirologyReviews，Zhdanov，0-V.M(ed.)，Chur，Switzerland：Harwood Academic Publishers，vol.2，235-261；Pureell，R.G.等，(1988)，Euckerman，A.J.(ed.)的“Viral Hepatitis andLiver Desease”New York；Alam，R.Liss，131-139；Bradley，D.W.(1980)，BritishMedical Bulletin，46：442-461；Ticehurst，J.R.(1991)in Hollinger，F.B.，Lemon，S.M.，Margolis，H.S.(eds.)：“Viral Hepatitis and Liver Disease”，Williams & Wilkins，Baltimore，501-513)。在戊肝病毒(HEV)流行的国家中，推测为戊肝的散发性肝炎占报道肝炎总数达90％。开发一种血清诊断方法来检测受染个体血清内的抗HEV抗体是本领域的共识，但是，受感染的人或动物排出的HEV浓度很低，这就不可能将这种HEV用作抗原来血清检测，虽然在细胞培养中繁殖HEV已经获得了有限的成功(Huang，R.T.等，(1992)，J.Gen.Virol.，73：1143-1148)，目前，细胞培养已经远远不足以产生血清检测所需的抗原量。

最近，由于全世界致力于戊肝相关性病毒基因组序列鉴定的巨大努力，已经克隆了HEV的少数几种毒株的基因组(Tam，A.W.等，(1991)，Virology，185：120-131；Tsarev，S.A.等，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：559-563；Fry，K.E.等，(1992)，Virus Genes，6：173-185)。根据DNA序列分析，研究者假设HEV基因组分成3个开放读码框(ORF)，并假设这些开放读码框编码了完整的HEV蛋白。

Reyes等，1990，Science，247：1335-1339公开了一段HEV缅甸(Myanmar)毒株基因组的部分DNA序列。Tam等，1991和Reyes等，公布于1991年10月17日的PCT专利申请WO91/15603公开了HEV缅甸毒株的完整核苷酸序列及其推定氨基酸序列。以上文献的作者都假设该毒株序列内有3个正向开放读码框(ORF)。

Ichikawa等，1991，Microbiol，Immunol.，35：535-543，公开了用感染了HEV的Cynomolgus猴的血清筛选λgtll表达文库后分离了一系列长度为240至320核苷酸的克隆。以上克隆之一在大肠杆菌中表达了重组蛋白质。该融合蛋白由HEV缅甸毒株ORF-2的3’末端编码。

Yarbough等，1991，J.Virology，65：5790-5797说明了HEV墨西哥毒株和HEV缅甸毒株内ORF-2的3’末端编码的其它蛋白的表达。该论文说明了HEV两个衍生cDNA克隆的分离。这些克隆编码ORF-23’末端的蛋白质。这些克隆在大肠杆菌内表达融合蛋白。

Purdy等，1992，Archives of Virology，123：335-349和Favorov等，1992，J.ofMedical Virology，36：246-250，公开了一种较大的缅甸毒株ORF-2蛋白片段在大肠杆菌内的表达。以上参考文献以及在此以前所公开的，都只记述了用细菌表达系统来表达ORF-2基因。在本发明之前，还没有有关成功表达全长ORF-2蛋白的报道。

对HEV基因组构成和形态结构所作的比较与萼状病毒最相关。有趣的是，萼状病毒的结构蛋白是由其基因组的3’端部分编码的(Neil，J.D.等，(1991)，J.Virol.，65：5440-5447；和Carter，M.J.等，(1992)J.Arch.Virol.，122：223-235)，虽然没有直接证据表明HEV基因组的3’端部分也编码结构蛋白，但是3’端基因组区域部分小片段在细菌细胞内的表达产生了在ELISA和Western印迹法中与抗HEV血清反应的蛋白质(Yarborough等，(1991)；Ichikawa等，(1991)；Favorov等(1992)和Dawson，G.J.等(1991)J.Virol.Meth.；38：175-186)。但是，在本发明之前，ORF-2蛋白作为结构蛋白的功能始终没有得到证明。

由ORF-2基因一部分编码的一种小蛋白已经被用在免疫测试中检测动物血清中抗HEV的抗体。在血清学免疫测试中使用细菌表达的小蛋白作为抗原存在着以下潜在缺点。首先，细菌细胞内表达的这些小蛋白会造成溶解性问题，在将大肠杆菌裂解原液作为抗原用于免疫测试时还会造成患者血清与大肠杆菌蛋白的非特异交叉反应性(Purdy等，1992)。其次，因为时间和费用的限制，Western印迹印迹不适合用作检测抗HEV抗体的一线血清学测试。使用来自HEV基因组3’末端部分的小肽进行ELISA，在已知HEV感染者中只检测到41％阳性。其三，已经证明，包括细小核糖核酸病毒在内许多病毒的重要抗原和免疫原性表位与构象高度相关(Lemon，S.M.等，1991，Hollinger，F.B.，Lemon，S.M.，Margolis，H.S.编的“病毒性肝炎与肝脏疾病”(“Viral Hepatitis and Liver disease”)，Williams&Wilkins，Baltimore，20-24)。因此，据信，在真核系统内表达编码完整HEV基因的完整ORF将产生一种蛋白，它会形成HEV病毒样颗粒。与只表达HEV结构蛋白部分的上述小蛋白相比，这样的完整ORF蛋白将具有更接近于天然衣壳蛋白的免疫结构。所以，与目前使用的小蛋白相比，这类完整的ORF蛋白将是提呈性更高的抗原和更有效的免疫原。

发明概述

本发明涉及分离且基本纯的人戊肝病毒SAR-55毒株制剂。

本发明还涉及分离且基本纯的人戊肝病毒SAR-55毒株基因组RNA制剂。本发明还涉及人戊肝病毒SAR-55毒株的cDNA。

本发明的目的之一是提供能够指导产生重组HEV蛋白的合成核酸序列及其与之相当的天然核酸序列。所述的天然核酸序列可以从cDNA或基因组文库中筛选，从所述文库中能够鉴定和分离到能够指导HEV蛋白合成的基因。就此目的而言，核酸序列指编码蛋白的RNA、DNA、cDNA或它们的各种合成变异体。

本发明还涉及检测生物样品中戊肝病毒的方法，所依据的是用来自SAR-55cDNA的引物选择性扩增戊肝基因片段。

本发明还涉及SAR-55 cDNA的反义聚或寡核苷酸单链抑制戊肝基因表达的用途。

本发明还涉及分离且基本纯的HEV蛋白及其变异体，它们是由SAR-55的HEV基因组编码的，或是由合成的核酸序列编码的，本发明尤其涉及由HEV开放读码框2序列编码的重组蛋白。

本发明还涉及制备HEV基因组序列编码的重组HEV蛋白的方法，是通过克隆核酸，将cDNA插入表达载体，再在宿主细胞内表达重组蛋白。

本发明还涉及重组HEV蛋白作为诊断试剂和作为疫苗的用途。

本发明还包括检测生物样品中戊肝病毒特异性抗体的方法。这类方法可用于诊断HEV引起的感染和疾病，还可用于监测这类疾病的进展。这类方法还可以在治疗被HEV感染和至病的哺乳动物过程中监测治疗药物的药效。

本发明还涉及用于预防和治疗哺乳动物戊肝的药物组合物。

附图说明

图1显示用于表达HEV SAR-55毒株的完整ORF-2蛋白的重组载体。

图2A和2B是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，其中，被野生型杆状病毒或重组杆状病毒(含编码基因的ORF-2)感染的昆虫细胞裂解物或用考马斯蓝染色(A)，或与HEV感染的大猩猩的血清进行Western印迹杂交(B)。在2A和2B两图中，泳道1中都含非感染SF-9细胞的全细胞裂解液；泳道2含被野生型杆状病毒感染的细胞的裂解液；泳道3含被重组杆状病毒感染的细胞的裂解液；泳道4含分子量标记物。

图3A和3B分别显示30和20nm类病毒颗粒的免疫电子显微照片(IE)，这些颗粒是ORF-2蛋白在被重组病毒感染的昆虫细胞内表达而产生的。

图4显示以含有编码完整ORF-2基因的昆虫细胞所表达的重组ORF-2作为抗原的ELISA结果。将HEV的墨西哥毒株(Cyno-80A82、Cyno-9A97或Cyno-83)或巴基斯坦毒株(Cyno-374)接种给cynomologus猴子，此后在不同时刻测定血清抗HEV抗体水平。

图5A-D显示以含有编码完整ORF-2基因的昆虫细胞所表达的重组ORF-2作为抗原的ELISA结果。用HEV感染2个大猩猩，然后随时测定血清IgG或IgM抗HEV水平。

图6A-J显示用SAR-55的重组完整ORF-2蛋白作为抗原的ELISA结果与用HEV缅甸株(Genelabs)的重组部分ORF-2蛋白作为抗原的ELISA结果的比较。

图7A-J显示cynomologus猴子接种了SAR-55 HEV 10％粪(fecal)悬浮液的10倍系列稀释液(显示在分图上方的括弧内)后的抗HEV IgG ELISA和丙氨酸转氨酶(ALT)数据。ELISA所用的重组抗原是：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；3-2(M)，这是3-2表位(Yarbough等，(1991)J.Virol，65：5790-5797)和GST的融合体；SG3(B)，这是ORF-2的327个C末端氨基酸与GST融合体(Yarbough等，(1993)：戊肝诊断实验方法进展，“病毒性肝炎和肝脏疾病国际年会。学科计划与摘要卷。”Tokyo：VHFL p.87)；和直接在昆虫细胞内表达的一种55kDa的ORF-2产物。

图8A-E显示接种了SAR-55 HEV 10％粪(fecal)悬浮液的10倍系列稀释液(显示在分图上方的括弧内)后阳性cynomologus猴子的抗HEV IgM ELISA和ALT数据。ELISA所用的的重组抗原是：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；3-2(M)，这是3-2表位(Yarbough等，(1991))和GST的融合体；SG3(B)，这是ORF-2的327个C末端氨基酸与GST的融合体(Yarbough等，(1993))；和直接在昆虫细胞内表达的一种55kDa的ORF-2产物。

图9显示溴乙锭染色的2％琼脂糖凝胶，其上进行的是用SAR-55 HEV的10％粪悬浮液的10倍系列稀释液(显示在凝胶上各泳道的上方)所产生的PCR产物的分离。PCR产物的预计长度为约640碱基对，以M标记的泳道含有的是DNA大小标志。

图10显示用于在酵母中表达完整的ORF-2蛋白或低分子量片段的pPIC9载体。

图11显示戊肝病毒(HEV)基因组和编码全长(bHEV ORF2 fl)和截短HEVORF2(bHEV ORF2 5’tr和bHEV ORF2 5’-3’tr)衣壳基因的重组杆状病毒的组织图。

图12A和12B显示编码HEV ORF2全长基因的重组杆状病毒的时序性蛋白表达。用bHEV ORF2 fl病毒以感染复数(MOI)5感染Sf-9昆虫细胞。在4天的感染中，每天收集感染细胞和培养基上清液。通过8-16％蛋白质梯度凝胶上的SDS-PAGE分离细胞裂解液和培养基上清液并用胶状考马斯蓝染色(图12A)。一式两份蛋白质凝胶上的蛋白质通过电印迹转移到硝酸纤维素薄膜上，抗体先与猩猩抗HEV初级抗血清(1∶500)结合(图12B)，然后用次级山羊抗人IgG2抗血清-碱性磷酸盐(1∶5000)，用层析法检测HEV蛋白。泳道1，海蓝(Sea-blue)分子量标记物；泳道2，拟感染细胞；泳道3，感染后(p.i.)1天的细胞；泳道4，p.i.2天的细胞；泳道5，p.i.3天的细胞；泳道5，p.i.4天的细胞；泳道6，海蓝蛋白分子量标记物；泳道7，拟感染上清液；泳道8，p.i.1天的上清液；泳道9，p.i.2天的上清液；p.i.3天的上清液；泳道10，p.i.4天的上清液。分图A和B中泳道的指定是相同的。

图13A-13C显示感染了bHEV ORF2 fl病毒的昆虫细胞裂解物中蛋白质层析洗脱曲线。图13A显示Q Sepharose快速强阴离子交换柱上，用NaCl在Q上样缓冲液中0-300mM线性梯度洗脱的蛋白质的阴离子交换层析洗脱曲线。图13B显示SOURCE 15Q高效强阴离子交换柱上，用NaCl在Q上样缓冲液中0-300mM线性梯度洗脱的Q组份峰的HEV 55KDa蛋白质的洗脱曲线。图13C显示SOURCE15Q层析流份集合的洗脱曲线，集合中包含55KDa蛋白质，然后对该蛋白进行Sephacryl S 200柱上的凝胶过滤。

图14显示经Sephacryl S 200柱凝胶过滤所得流份中HEV 55KDa蛋白的SDS-PAGE和Western印迹。在Sephacryl S 200柱时，对含有55KDa蛋白质的SOURCE 15Q层析组份集合进行凝胶过滤。对选定柱层析流份中的等分样品进行SDS-PAGE和Western印迹分析(下分图)，或上样在考马斯蓝染色的8-20％NOVEX梯度凝胶上(上分图)。用恢复期感染HEV大猩猩的抗血清通过Western印迹检测HEV蛋白。泳道1，海蓝蛋白分子量标记物；泳道2，Q流份集合；泳道3至12，流份的凝胶过滤。

图15显示重组HEV ORF2 55kD蛋白的Lys C消化肽曲线，该蛋白纯化自感染了bHEV ORF2 fl病毒的Sf-9昆虫细胞裂解液。

图16显示重组HEV ORF2 55kD蛋白的羧基末端氨基酸分析结果，该蛋白纯化自感染了bHEV ORF2 fl病毒的Sf-9昆虫细胞裂解液。

图17显示重组HEV 55kD蛋白的电喷质谱曲线，该蛋白纯化自感染了bHEVORF2 fl病毒的Sf-9昆虫细胞裂解液。

图18A和18B显示编码HEV ORF2基因的重组杆状病毒的时序性蛋白表达。Sf-9昆虫细胞以感染复数5被HEV ORF2 5’tr或5’-3’tr病毒感染，感染后共4天。在4天的感染中，每天收集感染细胞和培养基上清液，并如图12图例中所述进行分析。图18A和B分别显示bHEV ORF2 5’tr(图18A)和5’-3’tr(图18B)病毒感染产生的与细胞相关的蛋白质的SDS-PAGE(泳道1-5)和Western印迹(泳道6-10)的结果。图18C和D分别显示bHEV ORF2 5’tr(图18C)和5’-3’tr(图18D)病毒感染后分泌的蛋白的SDS-PAGE(泳道1-5)和Western印迹(泳道6-10)的结果。泳道1和6，拟感染细胞；泳道2和7，p.i.1天的细胞；泳道3和8，p.i.2天的细胞；泳道4和9，p.i.3天的细胞；泳道5和10，p.i.4天的细胞。

用海蓝蛋白分子量标记物来测定所述蛋白的分子量。感染了活HEV的大猩猩的抗HEV抗体被用来在Western印迹中检测HEV蛋白。

本发明的详细说明

本发明涉及分离且基本纯的戊肝(HEV)巴基斯坦毒株SAR-55。本发明还涉及编码HEV蛋白的病毒基因的克隆和用表达系统来表达重组蛋白。更具体地说，本发明涉及SAR-55的开放读码框(ORF)的克隆与表达。

本发明涉及分离的HEV蛋白。较好的是，本发明的HEV蛋白与天然HEV蛋白基本同源，最好在生物学上相当。本说明书和权利要求书中的“生物学上相当”表示组合物是抗原性和/或免疫原性的。本发明的HEV蛋白可以在给哺乳动物注射后激发保护性抗体的产生，因此可以在哺乳动物受到野生型HEV攻击时提供保护。本说明书和权利要求书中的“基本同源”表示的是氨基酸序列与天然HEV蛋白质一定的同源程度。较好的是，同源程度超过70％，超过90％更好，特别好的一组蛋白与天然HEV蛋白在两蛋白比较区域内的同源性超过99％。

较好的是由ORF基因编码的HEV蛋白。特别感兴趣的是HEV ORF-2基因编码的蛋白，特别是HEV SAR-55毒株的ORF-2基因编码的蛋白。ORF-1、ORF-2和ORF-3蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：3：

                        (SEQ ID NO.：1)Met Glu Ala His Gln Phe Ile Lys Ala Pro Gly Ile Thr Thr Ala1                5                  10                  15Ile Glu Gln Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asn Ser Ala Leu Ala Asn

             20                 25                  30Ala Val Val Val Arg Pro Phe Leu Ser His Gln Gln Ile Glu Ile

             35                 40                  45Leu Ile Asn Leu Met Gln Pro Arg Gln Leu Val Phe Arg Pro Glu

             50                 55                  60Val Phe Trp Asn His Pro Ile Gln Arg Val Ile His Asn Glu Leu

             65                 70                  75Glu Leu Tyr Cys Arg Ala Arg Ser Gly Arg Cys Leu Glu Ile Gly

             80                 85                  90Ala His Pro Arg Ser Ile Asn Asp Asn Pro Asn Val Val His Arg

             95                 100                 105Cys Phe Leu Arg Pro Ala Gly Arg Asp Val Gln Arg Trp Tyr Thr

            110                 115                 120Ala Pro Thr Arg Gly Pro Ala Ala Asn Cys Arg Arg Ser Ala Leu

            125                 130                 135Arg Gly Leu Pro Ala Ala Asp Arg Thr Tyr Cys Phe Asp Gly Phe

            140                 145                 150Ser Gly Cys Asn Phe Pro Ala Glu Thr Gly Ile Ala Leu Tyr Ser

            155                 160                 165Leu His Asp Met Ser Pro Ser Asp Val Ala Glu Ala Met Phe Arg

            170                 175                 180His Gly Met Thr Arg Leu Tyr Ala Ala Leu His Leu Pro Pro Glu

            185                 190                 195Val Leu Leu Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Thr Ala Ser Tyr Leu Leu

            200                 205                 210Ile His Asp Gly Arg Arg Val Val Val Thr Tyr Glu Gly Asp Thr

            215                 220                 225Ser Ala Gly Tyr Asn His Asp Val Ser Asn Leu Arg Ser Trp Ile

            230                 235                 240Arg Thr Thr Lys Val Thr Gly Asp His Pro Leu Val Ile Glu Arg

            245                 250                 255Val Arg Ala Ile Gly Cys His Phe Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala

            260                 265                 270Pro Glu Pro Ser Pro Met Pro Tyr Val Pro Tyr Pro Arg Ser Thr

            275                 280                 285Glu Val Tyr Val Arg Ser Ile Phe Gly Pro Gly Gly Thr Pro Ser

            290                 295                 300Leu Phe Pro Thr Ser Cys Ser Thr Lys Ser Thr Phe His Ala Val

            305                 310                 315Pro Ala His Ile Trp Asp Arg Leu Met Leu Phe Gly Ala Thr Leu

            320                 325                 330Asp Asp Gln Ala Phe Cys Cys Ser Arg Leu Met Thr Tyr Leu Arg

            335                 340                 345Gly Ile Ser Tyr Lys Val Thr Val Gly Thr Leu Val Ala Asn Glu

            350                 355                 360Gly Trp Asn Ala Ser Glu Asp Ala Leu Thr Ala Val Ile Thr Ala

            365                 370                 375Ala Tyr Leu Thr Ile Cys His Gln Arg Tyr Leu Arg Thr Gln Ala

            380                 385                 390Ile Ser Lys Gly Met Arg Arg Leu Glu Arg Glu His Ala Gln Lys

            395                 400                 405Phe Ile Thr Arg Leu Tyr Ser Trp Leu Phe Glu Lys Ser Gly Arg

            410                 415                 420Asp Tyr Ile Pro Gly Arg Gln Leu Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Arg

            425                 430                 435Arg Trp Leu Ser Ala Gly Phe His Leu Asp Pro Arg Val Leu Val

            440                 445                 450Phe Asp Glu Ser Ala Pro Cys His Cys Arg Thr Ala Ile Arg Lys

            455                 460                 465Ala Val Ser Lys Phe Cys Cys Phe Met Lys Trp Leu Gly Gln Glu

            470                 475                 480Cys Thr Cys Phe Leu Gln Pro Ala Glu Gly Val Val Gly Asp Gln

            485                 490                 495Gly His Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Gly Ser Asp Val Asp Pro Ala

            500                 505                 510Glu Ser Ala Ile Ser Asp Ile Ser Gly Ser Tyr Val Val Pro Gly

            515                 520                 525Thr Ala Leu Gln Pro Leu Tyr Gln Ala Leu Asp Leu Pro Ala Glu

            530                 535                 540Ile Val Ala Arg Ala Gly Arg Leu Thr Ala Thr Val Lys Val Ser

            545                 550                 555Gln Val Asp Gly Arg Ile Asp Cys Glu Thr Leu Leu Gly Ash Lys

            560                 565                 570Thr Phe Arg Thr Ser Phe Val Asp Gly Ala Val Leu Glu Thr Asn

            575                 580                 585Gly Pro Glu Arg His Asn Leu Ser Phe Asp Ala Ser Gln Ser Thr

            590                 595                 600Met Ala Ala Gly Pro Phe Ser Leu Thr Tyr Ala Ala Ser Ala Ala

            605                 610                 615Gly Leu Glu Val Arg Tyr Val Ala Ala Gly Leu Asp His Arg Ala

            620                 625                 630Val Phe Ala Pro Gly Val Ser Pro Arg Ser Ala Pro Gly Glu Val

            635                 640                 645Thr Ala Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Arg Phe Asn Arg Glu Ala Gln

            650                 655                 660Arg Leu Ser Leu Thr Gly Asn Phe Trp Phe His Pro Glu Gly Leu

            665                 670                 675Leu Gly Pro Phe Ala Pro Phe Ser Pro Gly His Val Trp Glu Ser

            680                 685                 690Ala Asn Pro Phe Cys Gly Glu Ser Thr Leu Tyr Thr Arg Thr Trp

            695                 700                 705Ser Glu Val Asp Ala Val Pro Ser Pro Ala Gln Pro Asp Leu Gly

            710                 715                 720Phe Thr Ser Glu Pro Ser Ile Pro Ser Arg Ala Ala Thr Pro Thr

            725                 730                 735Pro Ala Ala Pro Leu Pro Pro Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Thr

            740                 745                 750Leu Ser Ala Pro Ala Arg Gly Glu Pro Ala Pro Gly Ala Thr Ala

            755                 760                 765Arg Ala Pro Ala Ile Thr His Gln Thr Ala Arg His Arg Arg Leu

            770                 775                 780Leu Phe Thr Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Val Phe Ala Gly Ser Leu

            785                 790                 795Phe Glu Ser Thr Cys Thr Trp Leu Val Asn Ala Ser Asn Val Asp

            800                 805                 810His Arg Pro Gly Gly Gly Leu Cys His Ala Phe Tyr Gln Arg Tyr

            815                 820                 825Pro Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ser Phe Val Met Arg Asp Gly Ala

            830                 835                 840Ala Ala Tyr Thr Leu Thr Pro Arg Pro Ile Ile His Ala Val Ala

            845                 850                 855Pro Asp Tyr Arg Leu Glu His Asn Pro Lys Arg Leu Glu Ala Ala

            860                 865                 870Tyr Arg Glu Thr Cys Ser Arg Leu Gly Thr Ala Ala Tyr Pro Leu

            875                 880                 885Leu Gly Thr Gly Ile Tyr Gln Val Pro Ile Gly Pro Ser Phe Asp

            890                 895                 900Ala Trp Glu Arg Asn His Arg Pro Gly Asp Glu Leu Tyr Leu Pro

            905                 910                 915Glu Leu Ala Ala Arg Trp Phe Glu Ala Asn Arg Pro Thr Cys Pro

            920                 925                 930Thr Leu Thr Ile Thr Glu Asp Val Ala Arg Thr Ala Asn Leu Ala

            935                 940                 945Ile Glu Leu Asp Ser Ala Thr Asp Val Gly Arg Ala Cys Ala Gly

            950                 955                 960Cys Arg Val Thr Pro Gly Val Val Gln Tyr Gln Phe Thr Ala Gly

            965                 970                 975Val Pro Gly Ser Gly Lys Ser Arg Ser Ile Thr Gln Ala Asp Val

            980                 985                 990Asp Val Val Val Val Pro Thr Arg Glu Leu Arg Asn Ala Trp Arg

            995                 1000                1005Arg Arg Gly Phe Ala Ala Phe Thr Pro His Thr Ala Ala Arg Val

            1010                1015                1020Thr Gln Gly Arg Arg Val Val Ile Asp Glu Ala Pro Ser Leu Pro

            1025                1030                1035Pro His Leu Leu Leu Leu His Met Gln Arg Ala Ala Thr Val His

            1040                1045                1050Leu Leu Gly Asp Pro Asn Gln Ile Pro Ala Ile Asp Phe Glu His

            1055                1060                1065Ala Gly Leu Val Pro Ala Ile Arg Pro Asp Leu Ala Pro Thr Ser

            1070                1075                1080Trp Trp His Val Thr His Arg Cys Pro Ala Asp Val Cys Glu Leu

            1085                1090                1095Ile Arg Gly Ala Tyr Pro Met Ile Gln Thr Thr Ser Arg Val Leu

            1100                1105                1110Arg Ser Leu Phe Trp Gly Glu Pro Ala Val Gly Gln Lys Leu Val

            1115                1120                1125Phe Thr Gln Ala Ala Lys Ala Ala Asn Pro Gly Ser Val Thr Val

            1130                1135                1140His Glu Ala Gln Gly Ala Thr Tyr Thr Glu Thr Thr Ile Ile Ala

            1145                1150                1155Thr Ala Asp Ala Arg Gly Leu Ile Gln Ser Ser Arg Ala His Ala

            1160                1165                1170Ile Val Ala Leu Thr Arg His Thr Glu Lys Cys Val Ile Ile Asp

            1175                1180                1185Ala Pro Gly Leu Leu Arg Glu Val Gly Ile Ser Asp Ala Ile Val

            1190                1195                1200Asn Asn Phe Phe Leu Ala Gly Gly Glu Ile Gly His Gln Arg Pro

            1205                1210                1215Ser Val Ile Pro Arg Gly Asn Pro Asp Ala Asn Val Asp Thr Leu

            1220                1225                1230Ala Ala Phe Pro Pro Ser Cys Glu Ile Ser Ala Phe His Glu Leu

            1235                1240                1245Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Pro Ala Pro Val Ala Ala Val Leu

            1250                1255                1260Pro Pro Cys Pro Glu Leu Glu Gln Gly Leu Leu Tyr Leu Pro Gln

            1265                1270                1275Glu Leu Thr Thr Cys Asp Ser Val Val Thr Phe Glu Leu Thr Asp

            1280                1285                1290Ile Val His Cys Arg Met Ala Ala Pro Ser Gln Arg Lys Ala Val

            1295                1300                1305Leu Ser Thr Leu Val Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Thr Lys Leu Tyr

            1310                1315                1320Asn Ala Ser His Ser Asp Val Arg Asp Ser Leu Ala Arg Phe Ile

            1325                1330                1335Pro Ala Ile Gly Pro Val Gln Val Thr Thr Cys Glu Leu Tyr Glu

            1340                1345                1350Leu Glu Glu Ala Met Val Glu Lys Gly Gln Asp Gly Ser Ala Val

            1355                1360                1365Leu Glu Leu Asp Leu Cys Ser Arg Asp Val Ser Arg Ile Thr Phe

            1370                1375                1380Phe Gln Lys Asp Cys Asn Lys Phe Thr Thr Gly Glu Thr Ile Ala

            1385                1390                1395His Gly Lys Val Gly Gln Gly Ile Ser Ala Trp Ser Lys Thr Phe

            1400                1405                1410Cys Ala Leu Phe Gly Pro Trp Phe Arg Ala Ile Glu Lys Ala Ile

            1415                1420                1425Leu Ala Leu Leu Pro Gln Gly Val Phe Tyr Gly Asp Ala Phe Asp

            1430                1435                1440Asp Thr Val Phe Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala Lys Ala Ser Met

            1445                1450                1455Val Phe Glu Asn Asp Phe Ser Glu Phe Asp Ser Thr Gln Asn Asn

            1460                1465                1470Phe Ser Leu Gly Leu Glu Cys Ala Ile Met Glu Glu Cys Gly Met

            1475                1480                1485Pro Gln Trp Leu Ile Arg Leu Tyr His Leu Ile Arg Ser Ala Trp

            1490                1495                1500Ile Leu Gln Ala Pro Lys Glu Ser Leu Arg Gly Phe Trp Lys Lys

            1505                1510                1515His Ser Gly Glu Pro Gly Thr Leu Leu Trp Asn Thr Val Trp Asn

            1520                1525                1530Met Ala Val Ile Thr His Cys Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Gln Val

            1535                1540                1545Ala Ala Phe Lys Gly Asp Asp Ser Ile Val Leu Cys Ser Glu Tyr

            1550                1555                1560Arg Gln Ser Pro Gly Ala Ala Val Leu Ile Ala Gly Cys Gly Leu

            1565                1570                1575Lys Leu Lys Val Asp Phe Arg Pro Ile Gly Leu Tyr Ala Gly Val

            1580                1585                1590Val Val Ala Pro Gly Leu Gly Ala Leu Pro Asp Val Val Arg Phe

            1595                1600                1605Ala Gly Arg Leu Thr Glu Lys Asn Trp Gly Pro Gly Pro Glu Arg

            1610                1615                1620Ala Glu Gln Leu Arg Leu Ala Val Ser Asp Phe Leu Arg Lys Leu

            1625                1630                1635Thr Asn Val Ala Gln Met Cys Val Asp Val Val Ser Arg Val Tyr

            1640                1645                1650Gly Val Ser Pro Gly Leu Val His Asn Leu Ile Glu Met Leu Gln

            1655                1660                1665Ala Val Ala Asp Gly Lys Ala His Phe Thr Glu Ser Val Lys Pro

            1670                1675                1680Val Leu Asp Leu Thr Asn Ser Ile Leu Cys Arg Val Glu

            1685                1690

                      (SEQ ID NO.：2)Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro1                5                   10                  15Met Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg

            20                   25                  30Gly Arg Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg

            35                   40                  45Val Asp Ser Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn

            50                   55                  60Pro Phe Ala Pro Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg

            65                   70                  75Val Arg Gln Pro Ala Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln

            80                   85                  90Ala Gln Arg Pro Ala Ala Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala

            95                   100                 105Gly Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro

            110                 115                 120Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln

            125                 130                 135Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr Ser Ser Val Ala Thr Gly

            140                 145                 150Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu Ser Pro Leu Leu Pro

            155                 160                 165Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala Thr Glu Ala Ser

            170                 175                 180Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr Ile Arg Tyr Arg

            185                 190                 195Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile Ser Ile Ser

            200                 205                 210Phe Tyr Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met Asn

            215                 220                 225Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile

            230                 235                 240Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn

            245                 250                 255Gln Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu

            260                 265                 270Ala Thr Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val

            275                 280                 285Asn Ser Tyr Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu

            290                 295                 300Asp Phe Ala Leu Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn

            305                 310                 315Thr Asn Thr Arg Val Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg

            320                 325                 330Leu Arg Arg Gly Ala Asp Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala

            335                 340                 345Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly

            350                 355                 360Val Gly Glu Ile Gly Arg ly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu

            365                 370                 375Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser

            380                 385                 390Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn

            395                 400                 405Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln

            410                 415                 420Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu

            425                 430                 435Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp

            440                 445                 450Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu

            455                 460                 465Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr

            470                 475                 480Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser

            485                 490                 495Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val

            500                 505                 510Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro

            515                 520                 525Leu Ser Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro

            530                 535                 540Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala

            545                 550                 555Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu

            560                 565                 570Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr

            575                 580                 585Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val

            590                 595                 600Leu Ala Pro His Ser Val Leu Ala Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp

            605                 610                 615Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp Asp Phe Cys Pro Glu Cys

            620                 625                 630Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe Gln Ser Thr Val Ala

            635                 640                 645Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys Thr Arg Glu Leu

            650                 655                 660

                       (SEQ ID NO.：3)Met Asn Asn Met Ser Phe Ala Ala Pro Met Gly Ser Arg Pro Cys1                5                   10                  15Ala Leu Gly Leu Phe Cys Cys Cys Ser Ser Cys Phe Cys Leu Cys

             20                  25                  30Cys Pro Arg His Arg Pro Val Ser Arg Leu Ala Ala Val Val Gly

             35                  40                  45Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Val Val Ser Gly Val Thr Gly Leu

             50                  55                  60Ile Leu Ser Pro Ser Gln Ser Pro Ile Phe Ile Gln Pro Thr Pro

             65                  70                  75Ser Pro Pro Met Ser Pro Leu Arg Pro Gly Leu Asp Leu Val Phe

             80                  85                  90Ala Asn Pro Pro Asp His Ser Ala Pro Leu Gly Val Thr Arg Pro

             95                 100                 105Ser Ala Pro Pro Leu Pro His Val Val Asp Leu Pro Gln Leu Gly

            110                 115                 120Pro Arg Arg

三字母缩写是遵照20种天然氨基酸的常规氨基酸速记法。

较好的重组HEV蛋白至少具有一种ORF蛋白。可以制备包含一个或多个相同或不同ORF蛋白的其它重组蛋白来改变蛋白的生物学特性。可以理解的是，分散的氨基酸或氨基酸序列的增加、取代或缺失可能加强HEV蛋白的生物学活性。

本发明还涉及能够指导上述HEV蛋白或与之基本同源的蛋白质的产生的核酸序列。这种核酸序列被称为SAR-55，如SEQ ID NO.：4所示，已于1992年9月17日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，保藏号为75302。AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG GAGGCCCATC AGTTTATCAA       50GGCTCCTGGC ATCACTACTG CTATTGAGCA GGCTGCTCTA GCAGCGGCCA       100ACTCTGCCCT TGCGAATGCT GTGGTAGTTA GGCCTTTTCT CTCTCACCAG       150CAGATTGAGA TCCTTATTAA CCTAATGCAA CCTCGCCAGC TTGTTTTCCG       200CCCCGAGGTT TTCTGGAACC ATCCCATCCA GCGTGTTATC CATAATGAGC       250TGGAGCTTTA CTGTCGCGCC CGCTCCGGCC GCTGCCTCGA AATTGGTGCC       300CACCCCCGCT CAATAAATGA CAATCCTAAT GTGGTCCACC GTTGCTTCCT       350CCGTCCTGCC GGGCGTGATG TTCAGCGTTG GTATACTGCC CCTACCCGCG       400GGCCGGCTGC TAATTGCCGG CGTTCCGCGC TGCGCGGGCT CCCCGCTGCT      450GACCGCACTT ACTGCTTCGA CGGGTTTTCT GGCTGTAACT TTCCCGCCGA      500GACGGGCATC GCCCTCTATT CTCTCCATGA TATGTCACCA TCTGATGTCG      550CCGAGGCTAT GTTCCGCCAT GGTATGACGC GGCTTTACGC TGCCCTCCAC      600CTCCCGCCTG AGGTCCTGTT GCCCCCTGGC ACATACCGCA CCGCGTCGTA      650CTTGCTGATC CATGACGGCA GGCGCGTTGT GGTGACGTAT GAGGGTGACA      700CTAGTGCTGG TTATAACCAC GATGTTTCCA ACCTGCGCTC CTGGATTAGA      750ACCACTAAGG TTACCGGAGA CCACCCTCTC GTCATCGAGC GGGTTAGGGC      800CATTGGCTGC CACTTTGTCC TTTTACTCAC GGCTGCTCCG GAGCCATCAC      850CTATGCCCTA TGTCCCTTAC CCCCGGTCTA CCGAGGTCTA TGTCCGATCG      900ATCTTCGGCC CGGGTGGCAC CCCCTCCCTA TTTCCAACCT CATGCTCCAC      950CAAGTCGACC TTCCATGCTG TCCCTGCCCA TATCTGGGAC CGTCTCATGT     1000TGTTCGGGGC CACCCTAGAT GACCAAGCCT TTTGCTGCTC CCGCCTAATG     1050ACTTACCTCC GCGGCATTAG CTACAAGGTT ACTGTGGGCA CCCTTGTTGC     1100CAATGAAGGC TGGAACGCCT CTGAGGACGC TCTTACAGCT GTCATCACTG     1150CCGCCTACCT TACCATCTGC CACCAGCGGT ACCTCCGCAC TCAGGCTATA     1200TCTAAGGGGA TGCGTCGCCT GGAGCGGGAG CATGCTCAGA AGTTTATAAC     1250ACGCCTCTAC AGTTGGCTCT TTGAGAAGTC CGGCCGTGAT TATATCCCCG     1300GCCGTCAGTT GGAGTTCTAC GCTCAGTGTA GGCGCTGGCT CTCGGCCGGC     1350TTTCATCTTG ACCCACGGGT GTTGGTTTTT GATGAGTCGG CCCCCTGCCA     1400CTGTAGGACT GCGATTCGTA AGGCGGTCTC AAAGTTTTGC TGCTTTATGA     1450AGTGGCTGGG CCAGGAGTGC ACCTGTTTTC TACAACCTGC AGAAGGCGTC     1500GTTGGCGACC AGGGCCATGA CAACGAGGCC TATGAGGGGT CTGATGTTGA     1550CCCTGCTGAA TCCGCTATTA GTGACATATC TGGGTCCTAC GTAGTCCCTG     1600GCACTGCCCT CCAACCGCTT TACCAAGCCC TTGACCTCCC CGCTGAGATT     1650GTGGCTCGTG CAGGCCGGCT GACCGCCACA GTAAAGGTCT CCCAGGTCGA     1700CGGGCGGATC GATTGTGAGA CCCTTCTCGG TAATAAAACC TTCCGCACGT     1750CGTTTGTTGA CGGGGCGGTT TTAGAGACTA ATGGCCCAGA GCGCCACAAT     1800CTCTCTTTTG ATGCCAGTCA GAGCACTATG GCCGCCGGCC CTTTCAGTCT     1850CACCTATGCC GCCTCTGCTG CTGGGCTGGA GGTGCGCTAT GTCGCCGCCG     1900GGCTTGACCA CCGGGCGGTT TTTGCCCCCG GCGTTTCACC CCGGTCAGCC     1950CCTGGCGAGG TCACCGCCTT CTGTTCTGCC CTATACAGGT TTAATCGCGA     2000GGCCCAGCGC CTTTCGCTGA CCGGTAATTT TTGGTTCCAT CCTGAGGGGC     2050TCCTTGGCCC CTTTGCCCCG TTTTCCCCCG GGCATGTTTG GGAGTCGGCT     2100AATCCATTCT GTGGCGAGAG CACACTTTAC ACCCGCACTT GGTCGGAGGT     2150TGATGCTGTT CCTAGTCCAG CCCAGCCCGA CTTAGGTTTT ACATCTGAGC     2200CTTCTATACC TAGTAGGGCC GCCACACCTA CCCCGGCGGC CCCTCTACCC     2250CCCCCTGCAC CGGATCCTTC CCCTACTCTC TCTGCTCCGG CGCGTGGTGA     2300GCCGGCTCCT GGCGCTACCG CCAGGGCCCC AGCCATAACC CACCAGACGG     2350CCCGGCATCG CCGCCTGCTC TTTACCTACC CGGATGGCTC TAAGGTGTTC     2400GCCGGCTCGC TGTTTGAGTC GACATGTACC TGGCTCGTTA ACGCGTCTAA     2450TGTTGACCAC CGCCCTGGCG GTGGGCTCTG TCATGCATTT TACCAGAGGT     2500ACCCCGCCTC CTTTGATGCT GCCTCTTTTG TGATGCGCGA CGGCGCGGCC     2550GCCTACACAT TAACCCCCCG GCCAATAATT CATGCCGTCG CTCCTGATTA     2600TAGGTTGGAA CATAACCCAA AGAGGCTTGA GGCTGCCTAC CGGGAGACTT     2650GCTCCCGCCT CGGTACCGCT GCATACCCAC TCCTCGGGAC CGGCATATAC     2700CAGGTGCCGA TCGGTCCCAG TTTTGACGCC TGGGAGCGGA ATCACCGCCC     2750CGGGGACGAG TTGTACCTTC CTGAGCTTGC TGCCAGATGG TTCGAGGCCA     2800ATAGGCCGAC CTGCCCAACT CTCACTATAA CTGAGGATGT TGCGCGGACA     2850GCAAATCTGG CTATCGAACT TGACTCAGCC ACAGACGTCG GCCGGGCCTG     2900TGCCGGCTGT CGAGTCACCC CCGGCGTTGT GCAGTACCAG TTTACCGCAG     2950GTGTGCCTGG ATCCGGCAAG TCCCGCTCTA TTACCCAAGC CGACGTGGAC     3000GTTGTCGTGG TCCCGACCCG GGAGTTGCGT AATGCCTGGC GCCGCCGCGG     3050CTTCGCTGCT TTCACCCCGC ACACTGCGGC TAGAGTCACC CAGGGGCGCC     3100GGGTTGTCAT TGATGAGGCC CCGTCCCTTC CCCCTCATTT GCTGCTGCTC     3150CACATGCAGC GGGCCGCCAC CGTCCACCTT CTTGGCGACC CGAATCAGAT     3200CCCAGCCATC GATTTTGAGC ACGCCGGGCT CGTTCCCGCC ATCAGGCCCG     3250ATTTGGCCCC CACCTCCTGG TGGCATGTTA CCCATCGCTG CCCTGCGGAT     3300GTATGTGAGC TAATCCGCGG CGCATACCCT ATGATTCAGA CCACTAGTCG     3350GGTCCTCCGG TCGTTGTTCT GGGGTGAGCC CGCCGTTGGG CAGAAGCTAG     3400TGTTCACCCA GGCGGCTAAG GCCGCCAACC CCGGTTCAGT GACGGTCCAT     3450GAGGCACAGG GCGCTACCTA CACAGAGACT ACCATCATTG CCACGGCAGA     3500TGCTCGAGGC CTCATTCAGT CGTCCCGAGC TCATGCCATT GTTGCCTTGA     3550CGCGCCACAC TGAGAAGTGC GTCATCATTG ACGCACCAGG CCTGCTTCGC     3600GAGGTGGGCA TCTCCGATGC AATCGTTAAT AACTTTTTCC TTGCTGGTGG     3650CGAAATTGGC CACCAGCGCC CATCTGTTAT CCCTCGCGGC AATCCTGACG     3700CCAATGTTGA CACCTTGGCT GCCTTCCCGC CGTCTTGCCA GATTAGCGCC     3750TTCCATCAGT TGGCTGAGGA GCTTGGCCAC AGACCTGCCC CTGTCGCGGC     3800TGTTCTACCG CCCTGCCCTG AGCTTGAACA GGGCCTTCTC TACCTGCCCC     3850AAGAACTCAC CACCTGTGAT AGTGTCGT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所用的核酸缩写是本领域中通用的。

作为RNA病毒的蛋白质编码链的这一方向的序列按常规称为“正”序列，即如SEQ ID NO.：4所示。

根据SAR-55的开放读码框推定的氨基酸序列有SEQ ID NO.：1、SEQ IDNO.：2和SEQ ID NO.：3。ORF-1从SEQ ID NO.：4的核苷酸28开始，共5078个核苷酸；ORF-2从SEQ ID NO.：4的核苷酸5147开始，共1979个核苷酸；ORF-3从SEQ ID NO.：4的核苷酸5106开始，共368个核苷酸。

我们考虑到了DNA序列的变异，这些变异将得到指导ORF-2蛋白同系物产生的DNA序列。“ORF-2蛋白同系物”在说明书和权利要求书中都表示氨基酸序列与本文中的基本相同，但其中一个或一个以上氨基酸被生物学上认为相当的残基所取代，使得所得的蛋白(即“同系物”)具有抗原性和/或免疫原性。需要指出的是，以上DNA序列代表的是本发明的优选实施方式。由于遗传密码子的简并性，可以理解的是，可以对核苷酸做出各种选择而产生能够指导ORF-2蛋白或其同系物产生的DNA序列。所以，与上述序列功能相当的DNA序列，或与指导ORF蛋白同系物(根据前文的氨基酸序列)产生的序列功能相当的DNA序列都属于本发明范围之内。

本发明涉及根据戊肝基因片段的选择性扩增来检测生物样品中戊肝病毒的方法。较好的是，本发明使用的单链引物对来自一段DNA双链片段相对两链的非同源区，该DNA双链片段则来自基因组所含某区域与SEQ ID NO.：4的SAR-55序列同源的戊肝病毒。这样的引物可在以后的过程中用于扩增选定的核酸序列，正如美国专利4,683,202所述。

本发明还涉及来自SAR-55cDNA序列同系物的单链反义聚或寡核苷酸抑制戊肝基因表达的用途。这些反义聚或寡核苷酸可以是DNA或RNA。所针对的序列通常是信使RNA，如果是加工或翻译RNA所必需的一段单链序列则更好。反义聚或寡核苷酸可以与聚赖氨酸(Lemaitre，M.等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA84：648-652)之类聚阳离子共轭；将形成的共轭物以有效量给予哺乳动物，以与信使RNA杂交并抑制其功能。

本发明包括制造HEV蛋白的重组DNA方法，以包含至少一个ORF蛋白的蛋白质为佳，包含至少一个ORF-2蛋白的蛋白质最好。重组ORF蛋白可以由一个ORF蛋白构成，或由相同或不同的多个ORF蛋白组合而成。可用天然或合成的核酸序列来指导HEV蛋白质的产生。在本发明实施例之一中，该方法包括：

a)制备一段能够指导宿主产生HEV蛋白的核酸序列；

b)将核酸序列克隆到能够转移到宿主内并在其中复制的载体内，所述的载体含有该核酸序列的操作性元件；

c)将含有核酸和操作性元件的载体转移到能够表达所述蛋白的宿主内；

d)在适合载体扩增和蛋白质表达的条件下培养宿主；

e)收获蛋白质。

在本发明另一实施例中，利用重组DNA合成HEV核酸编码的蛋白(编码至少一个HEV ORF或相同或不同的多个ORF蛋白的核酸序列更好，编码至少一个ORF-2氨基酸序列的核酸序列)的方法包括：

a)培养含有核酸序列的转化或转染宿主，所述核酸能够指导宿主在适合蛋白质表达的条件下产生蛋白质，所述蛋白质表现为与分离自HEV、氨基酸序列为SEQ ID NO.：1、SEQ ID NO.：2或SEQ ID NO.：3的天然HEV蛋白质基本同源，或它们的组合。

在实施例之一中，HEV SAR-55毒株的病毒基因组RNA序列如下所述被分离并克隆到cDNA中。从采自感染了SAR-55的cynomolgus猴的生物样品中抽提病毒RNA，然后反转录病毒RNA并用聚合酶链反应扩增，扩增所用的引物与缅甸HEV毒株(Tam等(1991))的基因组或SAR-55基因组的正链和负链互补。将PCR片段亚克隆到pBR322或pGEM-32中，然后测定双链PCR片段的序列。

选用于本发明的载体包括可以插入上述核酸序列与任何优选或必需的操作性元件的任何载体，而且，这些载体可以接着转移到宿主中并在其中复制。较好的载体是限制性位点已经描述清楚并含有适合核酸序列转录的优选或必需操作元件的载体。

“操作元件”在此包括至少一个启动子，至少一个终止密码子和载体核酸正确转录和其后的翻译所优选或必需的任意其它DNA序列。具体地说，我们认为这样的载体应含有至少一段宿主能识别的复制起始序列和至少一个可选标记，和至少一个能够引发核酸序列转录的启动子序列。

在构建本发明的克隆载体时，还需要注意的是，可以在每个载体中插入核酸序列的多份拷贝及其辅助性操作元件。在一个这类实施例中，宿主中每一载体产生的所需HEV蛋白的产量更大。可以插入载体的DNA序列(1段序列或两段不同的序列)的多拷贝数量只受所得载体根据其大小转移到合适的宿主中并在其中辅助和转录的能力的限制。

在另一实施例中，可将含有HEV蛋白编码序列的限制性消化片段插入可用于原核或真核细胞的合适的表达载体。“合适”的意思是载体能够携带和表达编码HEV蛋白，最好是至少一个ORF蛋白的完整核酸序列。较好的表达载体是用于真核细胞的载体。这类载体的例子包括但不限于用于在酵母中表达疫苗病毒载体(如pPIC9，vector-Invitrogen)、腺病毒或疱疹病毒的载体，以杆状病毒转移载体为佳。较好的载体是包含完整ORF-2基因的p63-2，和包含完整ORF-3和ORF-2基因的p59-4。以上载体在1992年9月10日与美国典型培养物保藏中心(12301Parklawn Drive，Rockvill，MD20852USA)保藏，保藏号为75299(p63-2)和75300(p59-4)。更好的载体是编码ORF-2的第112至660位氨基酸的bHEV ORF-25’tr，编码ORF-3的第112至607位氨基酸的bHEV ORF-2 5’-3’tr，和编码HEVORF-2的第112至578位氨基酸的杆状病毒。实施例1说明了将ORF-2基因克隆到pBlueBac中形成p63-2。该方法包括用限制性酶NruI和BglII消化HEV SAR-55毒株的基因组，将含有BlnI和BglII位点的多接头插入载体的独特NheI位点，用衔接子将NruI-BglII ORF-2片段插入BlnI-BglII pBlueBac。

在另一实施例中，然后可将选定的重组表达载体转染到合适的真核细胞系统内表达重组蛋白。所述的真核细胞系统包括但不限于酵母和诸如HeLa、MRC-5、CV-1、HuH7或HepG2等细胞系。较好的真核细胞系统之一是Sf9昆虫细胞。较好的方法包括使用杆状病毒表达载体和Sf9昆虫细胞系。

可以用本领域的多种已知技术来检测表达出的重组蛋白，其中包括实施例2中用含抗HEV抗体的抗血清进行的考马斯蓝染色和Western印迹。另一种方法是通过实施例3中的免疫电子显微镜法检测类病毒颗粒。

在另一实施例中，可以获得裂解原液形式的SF9细胞系所表达的重组蛋白，或者可以通过本领域各种已知蛋白质纯化技术纯化裂解液，所述方法包括差异沉淀、分子筛层析、离子交换层析、等电聚焦、凝胶电泳、亲和性和免疫层析等。在亲和性层析法中，可以通过一根含有结合了ORF蛋白的特异性抗体的树脂的层析柱来纯化重组蛋白。实施例16举例说明了分别从杆状病毒感染的细胞裂解液及其上清液中纯化重组法表达的HEV ORF2蛋白的方法。

另一实施例中，可将表达出的本发明重组蛋白用于免疫试验来诊断包括人、大猩猩、旧世界猴类、新世界猴类及其它灵长类动物等在内的哺乳动物的戊肝感染。在更好的实施例中，该免疫试验被用来检测人中的戊肝感染。使用HEV蛋白(尤其是ORF蛋白，更特殊的是ORF2蛋白)的免疫试验与使用部分ORF蛋白的免疫试验相比，是诊断戊肝感染的高特异性、灵敏度和重复性方法。

本发明的免疫测试可以是放射性免疫试验、Western印迹试验、免疫荧光试验、酶联免疫试验、化学发光试验、免疫组织化学试验等。ELISA的业内已知标准技术参见Methods in Immunodiagnosis，第2版，Rose&Bigazzi编辑，John Wiley&Sons，1980，和Campell等，Methods of Immunology，W.A.Benjamin，Inc.，1964，以上两篇都在此纳为参考。所述的试验可以是业内所说的直接、间接、竞争性或非竞争性免疫试验。(Oellerich，M.1984.J.Clin.Chem.Clin.，BioChem.22：895-904)。适合这类检测的生物样品包括但不限于组织活检抽提液、全血、血浆、血清、脑脊液、胸膜液、尿液等。

在实施例之一中，测试血清与固相反应物反应，所说固相反应物的表面结合了作为抗原的重组HEV蛋白，ORF蛋白或诸如ORF-2与ORF-3、ORF-1与ORF-3等不同ORF蛋白组合更好。最好，HEV蛋白主要由HEV ORF2的氨基酸112-607构成。可以利用已知技术来制备固相表面反应物，用于将蛋白质与固相支持物结合。所说的结合方法包括蛋白质在支持物上的非特异性吸附或蛋白质与支持物上反应性基团的共价结合。在抗原与抗HEV抗体反应后，洗涤去除未结合的血清成份，抗原-抗体复合体与诸如带标记的抗人抗体等第二抗体反应。标记可以是某种酶，该酶可以通过固相支持物在合适的荧光或比色试剂存在下培养来检测。也可以是其它可测标记，例如放射性标记或胶体金等。

在一优选实施例中，重组杆状病毒载体表达的蛋白被用作特异性结合剂来检测抗HEV抗体，以IgG或IgM抗体为宜，所说的重组杆状病毒载体含有SAR-55的ORF-2序列，该序列编码HEV ORF2的氨基酸112-607。实施例10显示ELISA的结果，其中固相以氨基酸112至607构成的重组55kD蛋白质作为表面抗原。这种蛋白能够检测响应不同HEV毒株而产生的抗体，但是不能检测响应甲肝、乙肝、丙肝或丁肝所产生的抗体。

HEV蛋白和类似物可以单独或与诸如第二抗体之类其它反应试剂一起制备成试剂盒的形式用于免疫试验。

重组HEV蛋白，较好的是一种ORF蛋白或多种ORF蛋白的组合，更好的是ORF2蛋白，以及本发明的基本同源蛋白质及类似物可用作疫苗保护哺乳动物抵抗戊肝的攻击。作为免疫原的这类疫苗可以是细胞、来自被重组表达载体转染的细胞的裂解液或含有表达蛋白的培养物上清液。或者，免疫原是部分或基本纯化的重组蛋白。虽然免疫原可以以纯或基本纯的形式给予，但以药物组合物、配方或制剂的形式给予为宜。

本发明制剂既可人用也可兽用，包含上述免疫原，和一种或多种药学上认可的载体，和可选性的其它治疗性成份。载体必须是“认可的”即与制剂的其它成份相容，而且不损害接受者。制剂以单位剂型的形式给予较为方便，这可以用制药业的常规方法来制备。

所有的方法都包括将活性成份与包含一种或多种辅助成份的载体相结合的步骤。通常，将活性成份与液相载体或精细粉碎的固体载体或以上两者均匀而密切结合，然后根据需要将产物成形为所需的制剂。

适合静脉、肌内、皮下或腹膜内给药的剂型宜包含活性成份的无菌水溶液，所说溶液最好与接受者的血液是等渗的。这样的制剂宜如下制备：将固体活性成份溶解在含有生理相容性物质例如氯化钠(0.1-2.0M)，甘油等，且缓冲后的pH与生理条件相容的水中，形成水溶液，然后将所说的溶液灭菌。以上溶液可以装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封在安瓿瓶或小瓶中。

本发明制剂可以含有稳定剂。稳定剂的例子是聚乙二醇、蛋白质、多糖、氨基酸、无机酸和有机酸，它们可以单独或混合使用。这些稳定剂的含量宜为每重量份免疫原0.11-10,000重量份。如果要用2种以上稳定剂，以它们的总量落在上述范围内为宜。以合适的浓度和pH将这些稳定剂用在水溶液中。这类水溶液具体的渗透压在0.1-3.0摩尔渗透压之间，以0.8-1.2为宜。水溶液的pH调在5.0-9.0之间，以6-8之间为佳。在配制本发明免疫原时，可以使用抗吸附剂。

可用其它制药方法来控制作用的持续时间。用聚合物来复合或吸附蛋白质或其衍生物可以获得控释制剂。选择合适的大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)及其浓度，以及以控释为目的的掺入方法，可以做到控释。另一种利用控释制剂来控制作用持续时间的方法是将蛋白质、蛋白类似物或其功能性衍生物掺入聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯和乙酸乙烯酯的共聚物等聚合材料颗粒中。或者，不是将上述物质掺入聚合物颗粒，而是分别用例如团聚技术或界面聚合将上述物质包裹在制备好的例如羟甲基纤维素或明胶微米级胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微米级胶囊中，或者掺入例如脂质体、白蛋白微球粒、微米级乳液、微米级颗粒和纳米级胶束或粗乳液等胶态药物传递系统中。如果需要的是口服剂型，可将组合物与半乳糖、蔗糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸镁、晶体纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甘油、藻酸钠或阿拉伯树胶等常用载体混合。

如前文所述，本发明蛋白质可以试剂盒的形式给予，可以是纯蛋白质的形式也可以是药物组合物形式。

可以按常规方法进行疫苗接种。例如，可将免疫原溶解在诸如盐水或水等合适的吸收剂、或完全或不完全佐剂中使用。而且为使蛋白质具有免疫原性，免疫原与载体可以结合或不结合。所述的载体分子包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素等。免疫原可以通过各种途径给予，只要该途径对产生抗体来说合适，例如静脉、腹膜内、肌内、皮下等。免疫原可以一次性给予，或者分几次间隔地给予，直到产生明显的抗HEV抗体效价。血清中的抗体可以用免疫试验来检测。

另一实施例中，免疫原是能够指导宿主合成HEV ORF蛋白的核酸序列。所述的核酸序列可以用本领域技术人员已知的方法插入到合适的表达载体中。能够高效体内转移的表达载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒和牛痘病毒载体。这类表达载体的操作元件已经在现有文献中公开，并且是本领域技术人员已知的。这样的表达载体可以静脉、肌内、皮下、腹膜内或口服给予。

另一实施例中，直接基因转移通过肌内注射(例如)含有指导宿主合成HEVORF蛋白的核酸序列的质粒性真核表达载体来完成。这样的方法曾被用于体内生产乙肝表面抗原，并得到了抗该表面抗原的抗体应答(Davis等，(1993)HumanMolecular Genetics，2：1847-1851；另外参见Davis等，(1993)Human Gene Therapy，4：151-159&733-740)和Davis，H.L.等，Proc Natl Acad Sci USA(1996)93：7213-7218)。

当免疫原是部分纯化或基本纯化的重组HEV ORF蛋白时，引发抗HEV的保护性抗体应答的有效剂量范围是约0.1μg至约100μg。更好的范围是约0.5μg至约70μg，而最好的范围是约10μg至50μg。

引发抗HEV的保护性抗体应答的HEV-ORF蛋白编码核酸序列的有效剂量范围是约1至约5000μg；更好的范围是约300至2000μg。

含有能够指导宿主合成HEV ORF蛋白的核酸序列的表达载体可以以试剂盒的形式提供，如前所述，它们可以是单独的纯形式，或者是药物组合物的形式。

给予本发明的免疫原可以是为了预防或者是为了治疗。在用于预防时，免疫原须在接触HEV之前或在HEV感染症状出现之前给予。预防性给予免疫原的作用是在哺乳动物体内防止或减弱此后可能的HEV感染。在用于治疗时，免疫原在各种HEV感染症状或疾病表现刚开始时(或在此后立即)给予。治疗性给予免疫原的作用是减弱感染或疾病。

优选实施例之一是用HEV SAR-55毒株的ORF-2序列或其对等序列表达的重组ORF-2蛋白制备的疫苗。因为重组ORF-2蛋白已被证明提供抗异源或同源HEV毒株攻击的保护，所以它们可用于抗各种HEV毒株而提供保护。

除了作为疫苗的用途，组合物可以用来制备抗类HEV病毒颗粒的抗体。所述抗体可以作为抗病毒药物直接使用。为了制备抗体，将病毒颗粒或病毒颗粒的非颗粒性抗原与前述用于疫苗的载体结合，然后用来免疫动物宿主。在适当的时间间隔后收集宿主的血清或血浆，得到含有与病毒颗粒反应的抗体的组合物。用饱和硫酸铵或DEAE Sephadex，或其它本领域技术人员已知的方法可以获得γ球蛋白或IgG抗体。这些抗体没有与诸如药物等其它抗病毒物质相关的许多副作用。

通过将可能的不良免疫系统应答减小到最低程度可以制备出与宿主系统相容性更高的抗体组合物。这是通过去除异种抗体的全部或部分Fc或使用宿主动物的同种抗体(例如使用来自人/人杂交瘤的抗体)做到的。例如，用相应的非免疫原性部分代替抗体中的免疫原性部分可以制备出人源化抗体(例如嵌合抗体)(在人体中是非免疫原性的)。这样的嵌合抗体可含有一种物种抗体的反应性部分或抗原结合部分，和另一物种抗体的Fc部分(非免疫原性的)。嵌合抗体的实例包括但不限于非人哺乳动物-人嵌合抗体，啮齿类-人嵌合抗体，小鼠-人抗体和大鼠-人嵌合抗体(Robinson等，国际专利申请184,187；Taniguchi M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，PCT专利申请WO86/01533；Cabilly等，1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439；Nishimura等，1987 Canc.Res.47：999；Wood等，1985 Nature 314：446；Shaw等，1988 J.Natl.Cancer Inst.80：15553，以上文献均在此纳为参考)。

有关“人源化”嵌合抗体的综合论述可参见Morrison S.，1985 Science229：1202和Oi等，1986 BioThechiques 4：214。

合适的“人源化”抗体还可以用CDR或CEA取代法来制备(Jones等，1986Nature 321：552；Verhoeyan等，1988 Science 239：1534；Biedleret等，1988 J.Immunol.141：4053，以上文献均在此纳为参考)。

抗体或抗原结合性片段还可以通过基因工程来制备。在大肠杆菌内同时表达重链和轻链基因的技术正是PCT专利申请WO901443、WO901443和9014424，Huse等，1989 Science 246：1275-1281的主题。

抗体还可以用于加强免疫应答。抗体的用量可以与用于其它治疗性目的时的抗体用量相似。例如，在例如狂犬病、麻疹和乙肝等其它病毒病潜伏期的早期，按0.02-0.1ml/lb体重给予混合γ球蛋白，用以干扰病毒进入细胞。这样，与HEV病毒颗粒反应的抗体可以以纯形式或与其它抗病毒物质一起被动给予感染了HEV的宿主，用以加强抗病毒药物的效力。

或者，可以通过给予抗独特型抗体作为免疫原来诱导抗HEV抗体。通常，用如前制备的纯抗HEV抗体制剂在宿主中诱导抗独特型抗体。宿主被给予适当稀释的组合物。在给予后，通常是重复给予后，宿主产生抗独特型抗体。为了消除对Fc区的免疫原性应答，可以使用宿主动物同种产生的抗体或去除所给抗体的Fc区。给宿主引入抗独特型抗体后，采集血清或血浆得到抗体组合物。如前文为得到抗HEV抗体那样纯化组合物，或用结合于亲和性基质上的抗HEV抗体进行亲和性层析来纯化组合物。所产生的抗独特型抗体在构象上类似原HEV抗原，可以不用HEV颗粒抗原而用它来制备HEV疫苗。

用于在动物体内诱导抗病毒抗体时，注入抗体的方式与用作疫苗时是相同的，即通过肌内、腹膜内、皮下等方式注射在含或不含佐剂的生理学合适稀释剂中所成的有效浓度溶液。一次或多次加强剂量注射是需要的。

本发明的HEV衍生蛋白还将用于产生抗血清，所述抗血清是用于接触前或接触后预防的。此时，HEV蛋白或蛋白混合物与合适的佐剂配制在一起，按照产生人抗血清的已知方法注射给志愿受试人。免疫后的数周内监视注射蛋白引起的抗体应答，即间期内取样，然后用前文所述的免疫试验来检测是否存在抗HEV抗血清抗体。

可以将免疫个体的抗血清给予存在被感染危险的个体作为接触前预防。抗血清还可以用于治疗接触后患者，这类似用高效价抗乙肝病毒的抗血清来进行接触后预防。当然，本领域技术人员不难理解，用标准技术从免疫个体的抗血清中纯化得到的免疫球蛋白(HEV免疫球蛋白)可以用作接触前预防或用于接触后患者的治疗。

就抗类HEV病毒颗粒及蛋白的抗体和抗独特型抗体的体内用途和诊断性用途而言，都以使用单克隆抗体为佳。可以如下制得抗病毒颗粒或抗独特型的单克隆抗体。取免疫动物的脾细胞或淋巴细胞用已知方法无限繁殖化或制备杂交瘤。(Goding，J.W.1983.Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Pladermic Press，Inc.NY，NY，pp.56-97)。为了生成人-人杂交瘤应选用人淋巴细胞供体。合适的淋巴细胞供体可以是已知感染了HEV的供体(因血液中存在抗病毒抗体或通过病毒培养证明已经被感染)。可以从外周血样品中分离淋巴细胞，或者用接受了脾切除的供体的脾细胞。可以用Epstein-Barr病毒(EBV)将人淋巴细胞无限繁殖化，或用人融合伴(human fusion partner)产生人-人杂交瘤。用肽体外初次免疫也可以用于产生人单克隆抗体。

筛选免疫细胞分泌的抗体，确定分泌具有所需特异性的抗体的克隆。抗病毒颗粒的单克隆抗体必须结合HEV病毒颗粒。抗独特型抗体的单克隆抗体必须结合抗病毒颗粒的抗体。选择产生具有所需特异性的抗体的细胞。

另一实施例中，通过收集编码人或大猩猩B细胞的V基因的信使RNA得到单克隆抗体，所述的人或大猩猩是经感兴趣的抗原免疫的。用逆转录聚合酶链反应扩增编码免疫球蛋白重链和轻链的信使RNA，随机组合，克隆到丝状噬菌体内展示。在与固相结合的选定抗原上“筛选”，挑取带有感兴趣抗体的噬菌体。回收展示出抗原同源抗体的结合位点的噬菌体，扩增，将它们所带的抗体基因组装成编码完整的抗体分子。在大肠杆菌中表达这类抗感兴趣抗原的特异性抗体，如前文就人单克隆抗体那样纯化和使用。从组合文库中获得人单克隆抗体可参见例如Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，(1992)Journal of Molecular Biology，第227卷，pp.381-388；和Chanock，R.M.等，(1993)Infectious Agents and Disease，第2卷，pp.118-l31。

以上所述抗体或其抗原结合性片段可单独或配制成药物组合物以试剂盒的形式供体内使用。抗体可以用于治疗、用于免疫试验诊断、或作为免疫亲和性物质用于纯化本发明的ORF蛋白。

物质

实施例使用了以下物质：

灵长类动物。黑猩猩(Chimp)(Pan troglodytes)。旧世界猴类：犬猴(Cynomolgusmonkeys)(Cyno)(Macaca fascicularis)、恒河猴(Rhesus)(M.mulatta)、pigtail猴(PT)(M.nemestrina)和非洲绿猴(AGM)(Cercopithecus aethiops)。新世界猴类：mustarched tamarins(Tam)(Saguinus mystax)、栗鼠猴(SQM)(Saimiri sciureus)和owl猴(OWL)(Aotus trivigatus)。灵长类动物单独笼养在控制事物危害的条件下。动物的居住、维持和照顾均符合或超过科学管理灵长类动物的各项要求。

通过静脉注射给大多数动物接种含于0.5ml胎牛血清稀释的粪悬浮液中的HEV，SAR-55毒株，参见(Tsarev，S.A.等，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：559-563；和Tsarev，S.A.等(1993)，J.Infect.Dis.(167：1302-1306))。用汇集自7名巴基斯坦戊肝患者的粪液接种Chimp-1313和1310。

约在接种前和后1周时2次采集血清样品。用市售的测试试剂盒(Medpath Inc.，Rockville，MD)测定丙氨酸转氨酶(ALT)、异柠檬酸脱氢酶(ICD)和γ谷氨酰基转移酶(GGT)等血清内肝酶水平。如前所述进行血清学测试。

             实施例1

鉴定HEV SAR-55毒株基因组的DNA序列

制备用于PCR的病毒RNA模板。感染了HEV犬猴的胆汁(10μl)，20％(重量/体积)SDS(最终浓度为1％)、K蛋白酶(10mg/ml)、1μltRNA(10mg/ml)和3μl0.5MEDTA混合成最终体积250μl，55℃孵育30分钟。用苯酚/氯仿(1∶1(体积/体积))65℃从胆汁中抽提总核酸2次，再用氯仿抽提1次，然后乙醇沉淀，95％乙醇洗涤，用于RT-PCR。当RNA更纯时，RT-PCR扩增来自粪便特别是血清的HEV RNA更高效。如前所述用K蛋白酶处理血清(100μl)或10％粪便悬浮液(200μl)。孵育30分钟后，加入300μl CHAOS缓冲液(4.2M硫氰酸胍/0.5 N-十二烷基肌氨酸/0.025M Tris-HCl，pH8.0)。用苯酚/氯仿65℃2次抽提核酸接着用氯仿室温抽提。然后在上层相中加入7.5M乙酸铵(225μl)，用0.68ml 2-丙醇沉淀核酸。将沉淀溶于300μl CHAOS缓冲液，加入100μl水。重复氯仿抽提和2-丙醇沉淀。将核酸溶于水，乙醇沉淀，95％乙醇洗涤，用于RT-PCR。

引物。用Applied Biosystems391型DNA合成仪合成94段引物，长21至40核苷酸(nt)，与HEV缅甸毒株(BUR-121)基因组(Tam，A.W.等，(1991)，Virology，185：120-131)或SAR-55基因组的正链和负链互补。这94段引物的序列如下所示，从SEQ ID NO.：5至SEQ ID NO.：98：

HEV引物：引物    ORF区                 序列D3042B  1   ACATTTGAAT TCACAGACAT TGTGC               (SEQ ID NO.：5)R3043B  1   ACACAGATCT GAGCTACATT CGTGAG              (SEQ ID NO.：6)D3044B  1   AAAGGGATCC ATGGTGTTTG AGAATG              (SEQ ID NO.：7)R3045B  1   ACTCACTGCA GAGCACTATC GAATC               (SEQ ID NO.：8)R261S   1   CGGTAAACTG GTACTGCACA AC                  (SEQ ID NO.：9)D261S   1   AAGTCCCGCT CTATTACCCA AG                  (SEQ ID NO.：10)D259S   1   ACCCACGGGT GTTGGTTTTT G                   (SEQ ID NO.：11)R255S  1     TTCTTGGGGC AGGTAGAGAA G                (SEQ ID NO.：12)R254S  2     TTATTGAATT CATGTCAACG GACGTC           (SEQ ID NO.：13)D242S  1     AATAATTCAT GCCGTCGCTC C                (SEQ ID NO.：14)R241S  1     AAGCTCAGGA AGGTACAACT C                (SEQ ID NO.：15)R231S  1     AAATCGATGG CTGGGATCTG ATTC             (SEQ ID NO.：16)R230S  1     GAGGCATTGT AGAGCTTTGT G                (SEQ ID NO.：17)R229S  1     GATGTTGCAC GGACAGCAAA TC               (SEQ ID NO.：18)R228S  1     ATCTCCGATG CAATCGTTAA TAAC             (SEQ ID NO.：19)R227B  I     TAATCCATTC TGTGGCGAGA G                (SEQ ID NO.：20)R218B  2     AAGTGTGACC TTGGTCCAGT C                (SEQ ID NO.：21)D217B  2     TTGCTCGTGC CACAATTCGC TAC              (SEQ ID NO.：22)D211B  1     CATTTCACTG AGTCAGTGAA G                (SEQ ID NO.：23)D202B  2     TAATTATAAC ACCACTGCTA G                (SEQ ID NO.：24)R201B  2     GATTGCAATA CCCTTATCCT G                (SEQ ID NO.：25)R200S  1     ATTAAACCTG TATAGGGCAG AAC              (SEQ ID NO.：26)R199S  1     AAGTTCGATA GCCAGATTTG C                (SEQ ID NO.：27)R198S  2     TCATGTTGGT TGTCATAATC C                (SEQ ID NO.：28)R193B  1     GATGACGCAC TTCTCAGTGT                  (SEQ ID NO.：29)R192B  1     AGAACAACGA ACGGAGAAC                   (SEQ ID NO.：30)D191B  1     AGATCCCAGC CATCGACTTT G                (SEQ ID NO.：31)R190S  2     TAGTAGTGTA GGTGGAAATA G                (SEQ ID NO.：32)D189B  2     GTGTGGTTAT TCAGGATTAT G                (SEQ ID NO.：33)D188B  2     ACTCTGTGAC CTTGGTTAAT G                (SEQ ID NO.：34)R187S  2     AACTCAAGTT CGAGGGCAAA G                (SEQ ID NO.：35)D186S  2     CGCTTACCCT GTTTAACCTT G                (SEQ ID NO.：36)D185B  2，3  ATCCCCTATA TTCATCCAAC CAAC             (SEQ ID NO.：37)D184S  2，3  CTCCTCATGT TTCTGCCTAT G                (SEQ ID NO.：38)R181S  2     GCCAGAACGA AATGGAGATA GC               (SEQ ID NO.：39)R180B  1     CTCAGACATA AAACCTAAGT C                (SEQ ID NO.：40)D179S  1     TGCCCTATAC AGGTTTAATC G                (SEQ ID NO.：41)D178B  1     ACCGGCATAT ACCAGGTGC                   (SEQ ID NO.：42)D177B  2     ACATGGCTCA CTCGTAAATT C                (SEQ ID NO.：43)R174B  1     AACATTAGAC GCGTTAACGA G                 (SEQ ID NO.：44)D173S  1     CTCTTTTGAT GCCAGTCAGA G                 (SEQ ID NO.：45)D172B  1     ACCTACCCGG ATGGCTCTAA GG                (SEQ ID NO.：46)R166B  2     TATGGGAATT CGTGCCGTCC TGAAG(EcoR I)     (SEQ ID NO.：47)R143B  1     AGTGGGAGCA GTATACCAGC G                 (SEQ ID NO.：48)D141B  1     CTGCTATTGA GCAGGCTGCT C                 (SEQ ID NO.：49)R142S  1     GGGCCATTAG TCTCTAAAAC C                 (SEQ ID NO.：50)D135B  1     GAGGTTTTCT GGAATCATC                    (SEQ ID NO.：51)R134B  1     GCATAGGTGA GACTG                        (SEQ ID NO.：52)R133B  1     AGTTACAGCC AGAAAACC                     (SEQ ID NO.：52)D132S  2，3  CCATGGATCC TCGGCCTATT TTGCTGTTGC TCC    (SEQ ID NO.：54)

         (BamHI)D131B  5’NC AGGCAGACCA CATATGTG                     (SEQ ID NO.：55)R119B  1     GGTGCACTCC TGACCAAGCC                   (SEQ ID NO.：56)D118B  1     ATTGGCTGCC ACTTTGTTC                    (SEQ ID NO.：57)R117B  1     ACCCTCATAC GTCACCACAA C                 (SEQ ID NO.：58)R116B  1     GCGGTGGACC ACATTAGGAT TATC              (SEQ ID NO.：59)D115B  1     CATGATATGT CACCATCTG                    (SEQ ID NO.：60)D114B  1     GTCATCCATA ACGAGCTGG                    (SEQ ID NO.：61)R112B  2     AGCGGAATTC GAGGGGCGGC ATAAAGAACC AG     (SEQ ID NO.：62)

         (EcoRI)R111B  2     GCGCTGAATT CGGATCACAA GCTCAGAGGC        (SEQ ID NO.：63)

         TATGCC(EcoRI)D110B  2     GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC(BamHI) (SEQ ID NO.：64)D109B  2     TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG(BamHI) (SEQ ID NO.：65)D108B  1     AAATTGGATC CTGTGTCGGG TGGAATGAAT        (SEQ ID NO.：66)

         AACATGTC(BamHI)R107B  1     ATCGGCAGAT CTGATAGAGC GGGGACTTGC CGGATCC(SEQ ID NO.：67)D101B  2     TACCCTGCCC GCGCCCATAC TTTTGATG          (SEQ ID NO.：68)R100B  1     GGCTGAGATC TGGTTCGGGT CGCCAAGAAG GTG    (SEQ ID NO.：69)

         (BglII)R99B   2     TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG (BglII)   (SEQ ID NO.：70)R98B   2       GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC(BglII)  (SEQ ID NO.：71)D97S   1       CCGTCGGATC CCAGGGGCTG CTGTCCTG(BamHI)   (SEQ ID NO.：72)R96B   2       AAAGGAATTC AAGACCAGAG GTAGCCTCCT        (SEQ ID NO.：73)

           C(EcoRI)D95B   2       GTTGATATGA ATTCAATAAC CTCGACGG          (SEQ ID NO.：74)R94B   3’NC   TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA        (SEQ ID NO.：75)

           AATGAG(BglII)D90B   2       TCACTCGTGA ATTCCTATAC TAATAC(EcoRI)     (SEQ ID NO.：76)R89B   3’NC   TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA        (SEQ ID NO.：77)

           AATG(BamHI)R88B   1       TGATAGAGCG GGACTTGCCG GATCC(BamHI)      (SEQ ID NO.：78)R87B   1       TTGCATTAGG TTAATGAGGA TCTC              (SEQ ID NO.：79)D86B   1       ACCTGCTTCC TTCAGCCTGC AGAAG             (SEQ ID NO.：80)R81B   1       GCGGTGGATC CGCTCCCAGG CGTCAAAAC(BamHI)  (SEQ ID NO.：81)D80B   1       GGGCGGATCG AATTCGAGAC CCTTCTTGG (EcoRI) (SEQ ID NO.：82)R79B   1       AGGATGGATC CATAAGTTAC CGATCAG (BamHI)   (SEQ ID NO.：83)D78B   1       GGCTGGAATT CCTCTGAGGA CGCCCTCAC(EcoRI)  (SEQ ID NO.：84)R77B   1       GCCGAAGATC TATCGGACAT AGACCTC(BglII)    (SEQ ID NO.：85)R76B   2       CAGACGACGG ATCCCCTTGG ATATAGCCTG(BamHI) (SEQ ID NO.：86)D75B   5’NC   GGCCGAATTC AGGCAGACCA CATATGTGGT        (SEQ ID NO.：87)

           CGATGCCATG (EcoRI)D72B   1       GCAGGTGTGC CTGGATCCGG CAAGT(BamHI)      (SEQ ID NO.：88)R71B   1       GTTAGAATTC CGGCCCAGCT GTGGTAGGTC (EcoRI)(SEQ ID NO.：89)D63B   1       CCGTCCGATT GGTCTGTATG CAGG              (SEQ ID NO.：90)D61B   1       TACCAGTTTA CTGCAGGTGT GC                (SEQ ID NO.：91)D60B   1       CAAGCCGATG TGGACGTTGT CG                (SEQ ID NO.：92)R59B   2，3    GGCGCTGGGC CTGGTCACGC CAAG              (SEQ ID NO.：93)D50B   1       GCAGAAACTA GTGTTGACCC AG                (SEQ ID NO.：94)R49B   2       TAGGTCTACG ACGTGAGGCA AC                (SEQ ID NO.：95)R48B   1       TACAATCTTT CAGGAAGAAG G                 (SEQ ID NO.：96)R47B   I       CCCACACTCC TCCATAATAG C                 (SEQ ID NO.：97)D46B   1       GATAGTGCTT TGCAGTGAGT ACCG              (SEQ ID NO.：98)

序列左侧的缩写表示：R和D分别表示反向和正向引物；B和S分别表示来自戊肝缅甸-121毒株和戊肝SAR-55毒株的序列；5’NC和3’NC分别表示HEV基因组5前导和3前导非编码区；1、2和3分别表示来自开放读码框1、2或3的序列。部分序列右侧的()表示在这些序列中插入了一个人工限制性位点。

为了克隆PCR片段，在引物的5’端增加了长3至7nt的EcoRI、BamHI或BglII限制性位点。

RT-PCR。通常，100μl的RT-PCR混合物包含模板，10mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，2.5mM MgCl2，全部4种dNTP(各0.2mM)，50pmol正向引物，50pmol反向引物，40单位RNasin(Promega)，16单位禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(Promega)，4单位AmpliTaq(Cetus)，覆盖以100μl轻矿物油。混合物42℃孵育1小时，然后35轮PCR循环扩增：94℃1分钟，45℃1分钟，72℃1分钟。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。

PCR片段的克隆。末端含限制性位点的PCR片段用EcoRI和BamHI，或EcoRI和BglII限制性酶消化，克隆到EcoRI/BamHI消化的pBR322或pGEM-3Z(Promega)中。或者，用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR片段克隆到pCR1000(Invitrogen)中。

PCR片段和质粒测序。从1％琼脂糖凝胶切取PCR片段，用Geneclean(Bio101，La Jolla，CA)纯化。用Sequenase(United States Biochemical)，如Winship，P.R.(1984)，Nucleic Acids Rev.，17：1266所述测定双链PCR片段的序列。用CsCl梯度纯化双链质粒，用Sequenase试剂盒(United States Biochemical)测定质粒的序列。

序列的计算机分析。用Genetics Computer Group(Madison，WI)的软件包(Devereaux，J.等(1984)，Nucleic Acids Rev.，12：387-395，第7.5版，VAX8650计算机上(National Cancer Institute，Frederick，MD))比较各HEV毒株的核苷酸序列。

                          实施例2

                   构建重组表达载体：P63-2

用含有HEV毒株SAR-55(Tsarev，S.A.等(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：559-563)基因组完整ORF-2的质粒获得限制性片段NruI-BglII。NruI在ORF-2起始密码子ATG上游5核苷酸处剪切HEV cDNA。预先在HEV基因组的3’末端加一个人工BgIII位点，就在聚A序列之前(Tsarev，S.A.等(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：559-563)。为了将该片段插入pBlueBac转移质粒(Invitrogen)，在载体的独特NheI位点引入一个合成多接头。该多接头含有的HEV cDNA和pBlueBac序列中都没有的BlnI和BglII位点。用图1中的衔接子(adapter)将NruI-BglII ORF-2片段插入BlnI-BglII pBlueBac。

                           实施例3

                  P63-2在SF9昆虫细胞内的表达

按照Invitrogen的程序，用钙沉淀法将P63-2和AcMNPV杆状病毒DNA(Invitrogen)共转染给SF9细胞(Invitrogen)，AcMNPV杆状病毒DNA能够产生活性完整杆状病毒，病毒包装P63-2成为重组杆状病毒。该重组杆状病毒经噬斑纯化4次。用所得的重组杆状病毒63-2-IV-2感染SF9细胞。

SDS-PAGE和Western blot。昆虫细胞重悬于加样缓冲液(50mM Tris-HCl，pH6.8，100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝和10％甘油)，按Laemmli，U.K.(1970)，Nature，227：680所述进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶以考马斯蓝染色，或将蛋白质电印迹到BA-85硝酸纤维素滤膜(Schleicher&schuell)上。转移后，在含10％胎牛血清和0.5％明胶的PBS中封闭硝酸纤维素膜。1∶1000稀释的大猩猩-1313的超免疫血清被用作原初抗体(primary antibody)。1∶2000稀释的带磷酸酶标记经亲和性纯化的山羊抗人IgG(Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.)被用作次级抗体。滤膜孵育在Western blue稳化的碱性磷酸酶底物(Promega)中。孵育均在封闭溶液中进行，并用含0.05％Tween-20(Sigma)的PBS洗涤。

HEV ORF-2的表达。感染了重组杆状病毒63-2-IV-2的SF9细胞合成的主要蛋白其表观分子量为74KD(图2A，泳道3)。这一大小略大于对完整ORF-2所做的估计(71KD)。这一大小差异可能是因为蛋白质的糖基化作用，因为在N末端至少有一个潜在糖基化位点(Asn-Leu-Set)。未感染细胞(图2A，泳道1)或用野生型非重组杆状病毒感染的细胞(图2A，泳道2)中没有该蛋白。后一种情况中，检测到的以多角体蛋白为主。用Chimp-1313血清(经HEV超免疫)进行Western印迹分别分析相同的裂解液(图2B)，只有重组细胞裂解液中的蛋白质发生反应(泳道3)，主条带仍然对应于74KD的蛋白(图2B)。考马斯蓝染色的凝胶中约25、29、35、40至45和55至70KDa的次要条带(图2A，泳道3)在Western印迹法中也与血清反应(图2B中泳道3)。其中有些分子量大于74KD的条带是糖基化程度不同的结果，分子量更低的条带则表示发生了加工和/降解。在Western印迹中，HEV接种前Chimp-1313的血清与以上蛋白都不反应。

                           实施例4

               重组感染SF9细胞的免疫电子显微镜检

在含10mM Tris-HCl，pH7.4，0.3％十二烷基肌氨酸钠的CsCl(1.30g/ml)中超声波裂解5×106个重组感染SF9细胞，然后以40,000rpm离心68小时(SW60Ti)。取其中ELISA应答性最高，浮密度1.30g/ml的50μl稀释在1ml PBS中，加5μlchimp-1313超免疫血清。用另一戊肝毒株(Mexican HEV)再次攻击感染过的大猩猩，如此制备超免疫血清。样品室温孵育1小时，然后4℃孵育过夜。用SW60Ti转子以30,000rmp，4℃离心2小时沉淀出免疫复合物。沉淀重悬于蒸馏水，3％PTA反染色，放在碳网上，用放大40,000倍的电子显微镜EM-10，Carl Zeiss，Oberkochen，Germany，检查。

VLP的检测。感染了野生型或重组杆状病毒63-2-IV-2的昆虫细胞的裂解液经CsCl梯度离心分离。感染重组病毒的昆虫细胞的CsCl梯度流份与大猩猩-1313超免疫血清一起孵育时，在浮密度为1.30g/ml的流份中发现两种被抗体覆盖的类病毒颗粒：第一种(图3A)，被抗体覆盖的单个颗粒，其大小(30nm)和形态结构都表示是HEV；第二种(图3B)，包裹了抗体的颗粒聚集体，颗粒除较小(约20nm)之外其它都很象HEV。直接EM显示存在着一个异源性很高的物质群，直径分别约为30和20nm，它们看似病毒颗粒，但因为没有结合抗体，所以不能确认是HEV。大量IEM实验显示，HEV基因组ORF-2区合成的蛋白质中至少部分被组装成颗粒结构。研究发现，感染后期的昆虫细胞，此时小蛋白比例较高，ELISA的结果都较好。所以在以后的测试中，在ELISA中使用感染后期重组昆虫细胞的全裂解液作为抗原。

                            实施例5

                   以昆虫细胞的抗原进行ELISA

         检测感染不同HEV毒株后完整抗HEV ORF-2的表达

5×10⁶个感染了63-2-IV-2病毒的SF9细胞重悬于1ml 10mM Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl，然后冻融3次。取10μl该悬浮液溶解于10ml碳酸盐缓冲液(pH9.6)，用它覆盖一块弹性微滴测试板(Falcon)。血清稀释成1∶20，1∶400和1∶8000，或1∶100，1∶1000和1∶10000。ELISA使用的封闭液和洗涤液与Western印迹中的相同。过氧化物酶偶合的抗人IgG的山羊IgG，或辣根过氧化物酶标记的山羊抗旧世界或新世界猴免疫球蛋白被用作次级抗体。通过测定405nm处的光密度(O.D.)来确定结果。

对3个猴子进行了检查，以确定代表HEV巴基斯坦毒株的昆虫细胞抗原是否能够在感染了HEV墨西哥毒株的犬猴中测出抗HEV抗体(图4)。cyno-80A82和cyno-9A97用含墨西哥’86HEV毒株的粪便感染(Ticehurst，J.等(1992)，J.Infect.Dis.，165：835-845)，另一个猴子cyno-83用以上毒株的第二代感染。作为对照，在该实验中测试了感染巴基斯坦HEV毒株SAR-55的cyno-374的血清样品。感染墨西哥毒株的3只猴子的血清都转为抗HEV阳性。感染第一代病毒的动物最迟在15周血清转阳，感染第二代的不晚于5周。有趣的是，4个动物中抗HEV效价最高的是接种了墨西哥毒株第二代的cyno-83。接种墨西哥毒株第一代的cyno猴的效价最低，接种巴基斯坦毒株第一代的猴效价中等。

                            实施例6

    基于表达完全ORF-2的昆虫细胞的抗原的抗HEV ELISA的特异性

为了评价在此所述的ELISA是否排除任何其它肝炎相关性抗体而只特异性检测抗HEV，取感染了其它肝炎病毒的大猩猩的血清样品进行分析，4只1组(Garci，P.等(1992)，J.Infect.Dis.，165：1006-1011；Farci，P.等(1992)，Science；Ponzetto，A.等(1987)J Infect.Dis.，155：72-77；Rizzetto，m.等(1981)Hepatology1：567-574；涉及大猩猩-1413，1373，1442，1551(HAV)；和大猩猩-982，1442，1420，1410(HBV)的参考资料来自Purcell等，尚未公开)(表1)。对接种前、接种后5周和15周的血清样品进行HEV ELISA分析，血清稀释度为1∶100，1∶1000和1∶10000。感染HAV、HBV、HCV和HDV的动物的血清与检测HEV抗体都不发生ELISA反应，但是4只接种了HEV的大猩猩都产生了抗HEV的IgM和IgG抗体。表1.对感染不同肝炎病毒(甲、乙、丙、丁、戊肝)大猩猩进行的抗HEV抗体血清学测试大猩猩    接种病毒    血清转阳周    前血清                接种后周数

                                                      5                  15                   20/25

                              IgG      IgM      IgG        IgM      IgG        IgM        IgG       IgMChimp-1413    HAV         5        -        -        -          -        -          -Chimp-1373    HAV         7        -        -        -          -        -          -Chimp-1442    HAV         5        -        -        -          -        -          -Chimp-1451    HAV         5        -        -        -          -        -          -Chimp-982     HBV         3        -        -        -          -        -          -Chimp-1442    HBV         7        -        -        -          -        -          -          -         -Chimp-1420    HBV         9        -        -        -          -        -          -Chimp-1410    HBV         5        -        -        -          -        -          -Chimp-51     HCV         10       -        -        -          -        -          -Chimp-502     HCV         12       -        -        -          -        -          -Chimp-105     HCV         28       -        -        -          -        -          -Chimp-793     HCV         13       -        -        -          -        -          -Chimp-904     HDV         8        -        -        -          -        -          -Chimp-814     HDV         7        -        -        -          -        -          -Chimp-800     HDV         10       -        -        -          -        -          -Chimp-29     HDV         10       -        -        -          -        -          -          -         -Chimp-1310    HEV         5        -        -        1∶10.000  1∶100   1∶10.000  -Chimp-1374    HEV         3        -        -        1∶8000    -^*      1∶8000    -Chimp-1375    HEV         3        -        -        1∶8000    1∶400   1∶400     -Chimp-1313    HEV1st°^** 5        -        -        1∶10.000  1∶100   1∶1000    -Chimp-1313    HEV2end°^**0.5      1∶100   -        1∶10.000  -        1∶10.000  -^*Chimp-1374在接种后3和4周转为IgM抗HEV阳性(见图5)^**Chimp-1313两次接种HEV。第一次用来自7名巴基斯坦患者样品混合物接种。第二次时在45个月后接种HEV墨西哥毒株。

                           实施例7

          测定HEV SAR-55毒株除人之外灵长类动物宿主范围

不同灵长类动物静脉接种含HEV的标准粪便悬浮液，收集血清样品监测感染情况。测定血清ALT水平作为肝炎指标，血清转阳即抗HEV升高。结果与犬猴和大猩猩的结果相比较。

接种HEV的只恒河猴(表2)都显示十分明显的丙氨酸转氨酶活性峰和强抗HIV应答。两动物的丙氨酸转氨酶活性峰都出现在第35天，血清转阳发生在第21天。第29天达到最高抗HEV效价。所用的2只非洲绿猴(表2)都发生丙氨酸转氨酶活性和抗HEV效价升高。虽然非洲绿猴230在接种后第7周死亡，但在此之前已经获得了感染的证据。猴74的丙氨酸转氨酶活性峰高出接种前血清约3倍，猴230的则高出约5倍。猴74和230同时于第28天和第21天分别出现丙氨酸转氨酶活性峰和血清转阳。表2.8种灵长类动物中HEV感染的生物化学和血清学特征

           丙氨酸转氨酶(单位/L)             抗HEV IgG动物    接种前平均值(SD)    天       值     首次测得日    最大效价

                                          (效价)大猩猩1374       51(12)         27      114      27(1∶400)    1∶80001375       41(14)         27       89      27(1∶400)    1∶8000犬猴374^*      46(20)         26      608      19(1∶400)    1∶8000381^*      94(19)         35      180      28(1∶20)     1∶8000恒河猴726        43(6)          35      428      21(1∶20)     1∶8000230        29(10)         35      189      21(1∶20)     1∶8000非洲绿猴74         72(21)         28      141      28(1∶400)    1∶8000938       102(45)         21      334      21(1∶8000)   1∶8000pigtail猴98         37(8)          21       47      21(1∶400)    1∶800099         41(6)          28       59      21(1∶400)    1∶8000Tamarin616        28(7)          70       41          -636        19(4)         7，56     30          -Squirrel猴868       90(35)          40      355      41(1∶20)     1∶20869      127(63)          40      679      35(1∶20)     1∶20Owl猴924       41(7)           35       97      21(1∶20)     1∶8000925       59(6)         49，91+  78，199+  21(1∶20)     1∶8000注：-：没有测得抗HEV。*先前用细菌表达的HEV蛋白片段作为抗原进行的研究[18]。+：丙氨酸转氨酶活性的生物模量(biomodal)升高。

SD＝标准偏差。

pigtail短尾猿99表现出丙氨酸转氨酶活性＞3SD高于接种前血清的该值，但pigtail短尾猿98则不。但是，两只猴子在第21天都血清转阳，而且抗HEV效价与大猩猩和旧世界猴的相当。因为pigtail短尾猿的丙氨酸转氨酶峰值较低，所以尚不能完全排除是免疫而不是被HEV感染的可能性，总之，不可能是免疫有几条理由。首先，在两个只有pigtail短尾猿四分之一大但接种量相同的tamarine中没有发现免疫作用。其次，众所周知，分泌到粪便中的HEV通常很少，实验中所用0.5ml 10％粪便悬浮液不可能含有免疫动物所需的足量抗原，尤其是在静脉接种时。

本实验中的tamarin既没有丙氨酸转氨酶活性的显著升高也没有产生抗HEV(表2)。所以，这些动物表现为没有被感染。松鼠猴产生了抗HEV，但水平比大猩猩或旧世界猴的低得多(表2)。此外，血清转阳在其它动物中出现得较晚。松鼠猴868在第41天血清转阳，869在第35天转阳。在3个月以上的观察期内，抗HEV效价都不超过1∶20，而且，在第47至54天达到峰值后，两个动物体内的该效价都显著降低。但是，两动物中丙氨酸转氨酶活性的升高却很明显，而且与血清转阳的时间短暂相关。

owl猴子对HEV感染的应答大致与旧世界猴的相同(表2)。两只owl猴都在第21天血清转阳，抗HEV效价在第28天达到1∶8000。owl猴924的丙氨酸转氨酶活性在第35天达到峰值，但是猴925直到第49天才达到峰值。

                           实施例8

                 检测大猩猩IgM和IgG的抗HEV

大约接种后4周，两个大猩猩的血清ALT水平升高(表2，图5)。当ALT酶升高时或在此之前，两个大猩猩都血清转阳(图5A，5C)。还测定了大猩猩的IgM抗HEV水平。大猩猩-1374的IgM抗HEV效价(图5B)不及IgG(图5A)的效价高并在2周后下降。虽然该动物的IgG和IgM抗体最早都是在第20天测得的，但此时的IgM抗HEV效价最高而IgG的则最低，IgG的效价随后升高并在大致相同的水平上维持了3个月以上。大猩猩1375在第20日只测得IgM抗HEV(图5D)。效价高于大猩猩1374，而且在整个过程期内都测得IgM抗HEV。该大猩猩的IgG抗HEV最早出现在第27日(图5C)，在实验全过程中保持在大致相同的水平。

                         实施例9

              昆虫细胞表达的完整ORF-2蛋白ELISA与

              大肠杆菌表达的结构蛋白片段ELISA的比较

为了说明与大肠杆菌表达结构蛋白的片段相比，真核细胞内表达HEV基因组完整ORF-2蛋白是否具有优越性，我们用前一抗原在ELISA中对先前用细菌表达的抗原片段分析过(Tsarve，S.A.等(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：559-563；和Tsarve，S.A.等(1993)，J.Infect.Dis.(167：1302-1306))的犬猴血清重新进行了测试(表3)。

表3.表达完整ORF-2的昆虫细胞抗原ELISA

与表达结构蛋白片段的大肠杆菌抗原ELISA的比较犬猴    来自细菌细胞的抗原           来自昆虫细胞的抗原

         (部分ORF-2)^*                (完整ORF-2)

        首次测得抗HEV日  首次测得日      效价       最大效价Cyno-376            28           21         1∶400      1∶8000Cyno-369            54           40         1∶100      1∶8000Cyno-374            19           19         1∶400      1∶8000Cyno-375            26           26         1∶400      1∶8000Cyno-379            21           19         1∶100      1∶8000Cyno-381            28           28         1∶400      1∶8000

*还用灵敏度较低的ORF-3抗原对该血清进行了测试。

Tsarev，S.A.等(1993)，J.Infect.Dis.，168：369-378

ELISA检查的6只猴子中有3只，昆虫细胞表达抗原的血清转阳早于大肠杆菌表达抗原。用昆虫细胞抗原，我们能够在全部6只猴子血清的最高稀释度(1∶8000)测得抗HEV抗体。用大肠杆菌细胞产生的抗原(缅甸毒株)则没有获得抗HEV效价信息，因为仅在1∶100稀释度测试了全部血清(Tsarve，S.A.等(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：559-563；和Tsarve，S.A.等(1993)，J.Infect.Dis.(167：1302-1306))。

在另一实验中，戊肝病毒SAR-55以10倍增量连续稀释，取10-1至10-5稀释度接种数对犬猴，测定病毒效价。通过测定血清ALT水平来检测肝炎，用本发明ELISA法(数据见图)或Genelab的ELISA法测定血清中抗HEV抗体(3次ELISA，分别使用抗原4-2、3-2和612中的一种，Yarbrough等，(J.Virol.，(1991)65：5790-5797)(图6a-g的底端，数据以阳性(+)测试或阴性(-)测试显示))。所有样品均编号接受测试。

本发明ELISA方法在全部接种犬猴和各病毒稀释度都测得对IgG抗HEV的血清转阳。

相比之下，Genelab的结果则很不确定，概括如下：

                               表4.

病毒稀释度          Genelab的ELISA         本发明ELISA

   10-1                   未测                 阳性

   10-2            两个动物都呈阳性，          阳性

                     持续时间有限

   10-3             两动物都呈阴性             阳性

   10-4        Cyno 389：IgM和IgG阳性          阳性

                    Cyno 388：阴性             阳性

   10-5             Cyno 386：阴性             阳性

                    Cyno 385：阳性             阳性

因为Cyno 385(10-5)在Genelab和本发明的ELISA都呈阳性，估计10-4(接种病毒多10倍)和10-3(接种病毒多100倍)也将呈阳性。本发明将它们定为阳性，而在Genelab的ELISA中，虽然Cyno 383和393的ALT水平都显示有活性肝炎，但在10-4和10-3都没有测得阳性。所以，以上数据证明本发明ELISA方法检测HEV的抗体优于现有方法。

                          实施例10

              不同重组ORF-2抗原的ELISA的比较：

   由HEV巴基斯坦毒株SAR-55完整ORF-2区表达的55KDa蛋白构成，

           或由细菌表达的含较短ORF-2区的融合蛋白构成

如实施例3所述，如图2A和2B所示，用含完整ORF-2的杆状病毒感染的昆虫细胞表达大量不同分子量的蛋白质。如下所述，接种后7天，从回收的5×108个SF9昆虫细胞中部分纯化分子量约55KDa的蛋白质：离心感染细胞，重悬于10ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM NaCl，含40μg/ml苯基甲基磺酰氯(Sigma，St.Louis，Missouri)，超声波裂解细胞，裂解液以90,000xg4℃离心30分钟。上清液上样在DEAE-琼脂糖CL-6B层析柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，层析柱已用10mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM NaCl平衡。用上样缓冲液洗柱，用10mM Tris-HCl(pH8.0)，250mM NaCl洗脱55kDa的蛋白质。合并含55kDa蛋白质的流份，在10ml蛋白质溶液中加3g(NH4)2SO4沉淀蛋白质。蛋白质沉淀溶于10mMTris-HCl(pH8.0)，50mM NaCl。然后将55kDa的蛋白质作为昆虫表达的HEV抗原用于ELISA，与细菌表达的两HEV抗原之一，3-2(墨西哥)(Goldsmith等(1992)，Lancet，339：328-331)或SG3(缅甸)(Yarbough等，(1993)戊肝诊断测试的发展，“病毒性肝炎和肝脏疾病国际学会。科学项目和摘要卷”Tokyo：VHFL，p.87，摘要#687)的ELISA相比较。这些细菌抗原是26kDa谷胱甘肽S转移酶(GST)与以下两抗原之一的融合蛋白：ORG-2的C末端上游6氨基酸处42氨基酸的抗原序列3-2(M)(Yarbough等，(1991)，J.Virol.，65：5790-5797)，或ORF-2的327个C末端氨基酸(Yarbough等，(1993))。ELISA如下进行。

在聚苯乙烯微滴测试板(Dynateck，S.Windham，ME)的测试格中，60ng/格55kDa蛋白质或200ng/格融合抗原的碳酸盐缓冲液溶液(pH9.6)37℃孵育2小时。测试板用含10％胎牛血清和0.5％明胶的PBS封闭。用粪便稀释液(如表5和图7A-7J和8A-8D所示，稀释液含10-1至10-8HEV SAR-55毒株)静脉接种的犬猴血清样品(注：犬猴387和392经口接种)按1∶100稀释在封闭溶液中。1∶1000或1∶2000稀释的过氧化物酶共轭的山羊抗人IgM(Zymed，San Francisco，CA)或1∶1000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗人免疫球蛋白用作检测剂抗体。

除经口接种的犬猴387和392之外的全部ELISA测试中，在同一实验室同时测试55kDa抗原和融合抗原，这样就只存在所用抗原的差异。在用55kDa抗原的抗HEV ELISA中评为阳性的标准是光密度≥0.2，而且比同一动物接种前血清样品高出两倍。此外，因为细菌表达的两种抗原都是与GST的融合蛋白，用这些抗原测试的样品的光密度必须比用非融合GST获得的光密度高出3倍才能认为是阳性(Goldsmith等，(1992))。

结果

用10-1标准HEV粪便悬浮液接种的两只犬猴(377和378)在接种后4至5周，ALT活性都升高，表明患上肝炎(表5，图7A和7B)。表5.犬猴接种10-1至10-8标准SAR-55 HEV接种物储备液后出现的生物化学和血清学现象概括病毒储备液稀释度              ALT           55kDa抗原接种后  融合抗原接种后测得抗HEV的周数

            接种前平均  峰值周   峰值  测得抗HEV的周          IgG              IgM犬猴    接种物   值(SD)&            (U/L)   IgG    IgM     SG3        3-2(M)   SG3    3-2(M)377      10-1    76(39)       5      264   4-15+   3-7    4-10         4-5     3-4     3-5378      10-1     50(9)       4      285    4-15    -      -            -       -       -394      10-2     62(14)      4       89    3-15   3-10    -           4-6      -       -395      10-2    121(21)     15      314    5-15    -      -            -       -       -380      10-3     89(20)      1      135    5-15^*  -     6-15          -       -       -383      10-3     29(8)       4       77    5-15   5-13    -            -       -       -389      10-4     60(7)      15      114    6-15   6-8     -            -       -       -393      10-4     41(4)       5       87    6-15    -      -            -       -       -385      10-5     59(32)      7       56   11-15    -      -           7-15     -       -386      10-5     31(4)       4       34    8-15   8-13    -            -       -       -397      10-6     60(4)       8       94     -      -      -            -       -       -398      10-6     36(3)       2       55     -      -      -            -       -       -399      10-7    102(16)      2       93     -      -      -            -       -       -400      10-7     57(4)       9      188     -      -      -            -       -       -403      10-8     33(3)      2-3      49     -      -      -            -       -       -406      10-8     56(4)       2       73     -      -      -            -       -       -387  10-1(经口)  32(4)        4       38     -      -     ND            -       ND      -392  10-1(经口)   49(6)       3       70     -      -     ND            -       ND      -&：接种前血清的ALT平均值和标准偏差(SD)+：15周后终止使用*：用55kDa抗原的ELISA测试时，犬猴380接种前血清的OD值是其它犬猴接种前血清平均OD值的2倍。§：除犬猴387和392之外，全部ELISA都用相同的实验测试。-：没有测得。ND：没有进行。

被测的3种抗原在接种后3周在犬猴377的样品中都测得了抗HEV IgM(表5，图8A)，但在另一犬猴378的各种样品中都没有测得抗HEV IgM。用55kDa的ELISA在两动物中都测得抗HEV IgG，但用融合抗原的ELISA只在犬猴377中测得。抗HEV IgG的OD值显著高于抗HEV IgM。用55kDa获得的ELISA值也明显高于用两种融合抗原中任一种所得(图7A和7B)。两种抗原的ELISA中的OD值模式具有显著差异。在融合抗原的ELISA中，阳性信号在血清转阳后很快达到最大值，然后在实验的15周中减弱。在55kDa抗原的ELISA中，阳性信号在血清转阳后很快达到最大值，并在整个实验期(15周)内大致保持在同一水平。

标准HEV粪便悬浮液10^-2稀释液接种的两猴(394和395)在预期的肝炎发作时ALT活性升高，幅度明显小于用高10倍剂量接种的动物(表5，图7C和7D)。实际上，犬猴395在接种前和在接种后15周时的ALT活性较高。后者可能与HEV感染无关。只在犬猴394中，只有用55kDa抗原的ELISA测得微弱的抗HEV IgM阳性(图8B)。但是，两个猴子都被感染，因为在两动物中都测得抗HEV IgG血清转阳。在犬猴394中，用55kDa抗原最早在第3周测得抗HEV IgG，用3-2(M)抗原则迟一周测得。SG3(B)抗原在犬猴395中没有测得血清转阳，只有用55kDa抗原测得抗HEV IgG。在该动物中，抗HEV效价随时间逐渐降低。

犬猴380和383接种标准HEV粪便悬浮液的10^-3稀释液(表5，图7E、7F、8C)。犬猴380的ALT活性在接种前后有波动，所以在该动物中ALT活性不能用来确认戊肝。在犬猴383中观察到ALT活性在血清转阳的同时略有升高(图7F)，所以可能是野生型戊肝引起的。用三种抗原都没有在犬猴380的血清中测得抗HEV IgM。用SG3(B)ELISA测得犬猴380 IgG抗HEV血清转阳，而用3-2(M)抗原则没有测得。用55kDa抗原测得该猴原先已有抗HEV IgG，但从第5周起，抗HEV IgG显著升高(图7E)。先前已经报道了在另一犬猴血清中鉴定到原先已有抗体(Ticehurst等(1992)J.Infect.Dis.，165：835-845；Tsarev等，(1993)J.Infect.Dis.，168：369-378)。血清转阳在预期时刻发生，但是犬猴383样品中的抗HEV IgG水平仍然很低，而且只能用55kDa抗原测得。

犬猴389和393接种标准HEV粪便悬浮10^-4液稀释液(表5，图7G、7H、8D)。两猴的ALT活性都没有明显升高，但是第5周在犬猴393血清中出现虽小但清楚的ALT峰提示临界肝炎。用SG3(B)或3-2(M)的ELISA都认为两动物为HEV感染阴性。相反，55kDa抗原在接种后6至8周在犬猴398血清中测得抗HEV IgM(图8D)，而从6至15周在两猴中都测得抗HEV IgG。

在接种标准HEV粪便悬浮液10^-5稀释液的两猴中都没有测得ALT活性的升高(表5，图7I、7J)，但在犬猴386中，用55kDa抗原分别于第8至13周和8至15周测得抗HEV IgM和抗HEV IgG(图7J，8E)。用55kDa抗原和3-2(M)抗原能够测得犬猴385的抗HEV IgG，但是用SG3(B)抗原则不能。与过去相反，用融合抗原测得的IgG抗HEV早于55kDa抗原4周，而且水平也更高。

接种标准HEV粪便悬浮液10^-6-10^-8稀释液的猴子对3种HEV抗原都没有产生抗体。在这些猴子中没有发现ALT活性升高，只有犬猴400第9周一个比较明显的ALT活性峰是例外(表5)。但是，该动物没有血清转阳，表明该峰可能与HEV感染无关。

至于经口接种10％粪便悬浮液10^-1稀释液的两个犬猴(387和392)，它们都没有被感染，因为ALT水平没有升高，而且用3-2(M)和55kDa抗原进行的ELISA都没有检测到HEV血清转阳(表5)。

最后，在接种粪便悬浮液10^-5稀释液的猴子中都发现了HEV感染的血清学证据；接受高于此稀释度接种的猴子中都没有该证据。在10-1接种的两猴中发现以ALT升高，确认有显性肝炎。在用更高稀释度粪便悬浮液接种的有些猴子中，ALT活性升高明显较少，其它猴子则没有升高。仅考虑这一现象，上述低ALT升高不能诊断为肝炎，但是，血清转阳和这些ALT峰的同时出现表明在这些猴子中存在野生型肝炎。在用10-1-10-5稀释度的粪便悬浮液接种的猴子中都测得抗HEV IgG血清转阳。用更高稀释度该储备液接种的猴子则表现出IgG抗HEV减弱和血清转阳延迟的趋势。

总之，在检测感染HEV巴基斯坦毒株的犬猴的抗HEV IgM和IgG方面，55kDa的巴基斯坦ORF-2抗原比3-2(M)和SG3(B)都更有效。例如，除犬猴385血清之外，对各种猴子的血清来说，用55kDa抗原的ELISA检测抗HEV IgM和IgG比用3-2(M)和SG3(B)的都更有效。55kDa ELISA检测的结果具有内在一致性和可重复性，可在用10-5或浓度更低粪便稀释液接种全部10个猴子中测得IgG抗HEV。随接种物被稀释，ELISA信号的强度也减弱。融合抗原不能在成对的两动物之间产生一致的结果。在10^-1、10^-2、10^-3或10^-5接种的每对猴子中只有一只表现出抗HEV IgG血清转阳，用上述抗原只在一个猴子中测得抗HEV IgM血清转阳。10^-4原接种物接种的两猴都没有发生两种融合抗原血清转阳，虽然其中之一(犬猴393)的血清在用55kDa抗原测试时曾维持高抗HEV IgG水平。虽然，如前所述，检测抗HEV IgM的ELISA远不如检测犬猴抗HEV IgG的ELISA灵敏，比起3-2(M)抗原或SG3(M)抗原，55kDa抗原能够在更多动物中测得抗HEV IgM。总之，在本研究中，用3-2(M)和SG3(B)ELISA的综合数据不能得出有关巴基斯坦病毒接种物感染效价的确定结论，但是仅用55kDa巴基斯坦ELISA获得的数据就可以。

在犬猴385中，检测抗HEV IgG两测试结果的差异为4周。以上数据提示，3-2(M)有一个独特的55kDa抗原和SG3(B)抗原所没有的为该猴识别的表位。当用既含完整ORF-2(75kDa)蛋白又含55kDa蛋白的总昆虫细胞裂解液作为抗原再次测试这些样品时，结果与仅用55kDa相同。这一结果显示，55kDa蛋白质可能具有3-2表位氨基酸，但是，实验所用3种抗原3-2表位序列的构象互不相同。最后，必须指出的是，虽然SG3(B)抗原含较长的部分ORF-2并包含完整的表位3-2序列，它测得的阳性血清并不比3-2(M)抗原多。

                         实施例11

         用RT-PCR测定HEV SAR-55病毒储备液的感染效价

知道接种物的感染效价对于解释动物感染实验模型中获得的许多数据十分重要。但是，迄今还不曾有过HEV病毒储备液效价的任何报道。抽提含HEVSAR-55毒株的粪便悬浮液的10倍稀释液，进行如下RT-PCR，测定能测得HEV基因组的最高稀释度。

200μl粪便悬浮液与0.4ml 1.5M NaCl加15％聚乙二醇(PEG)8000混合，4℃放置过夜。在微离心机(Beckman，Palo Alto，CA)中16,000g离心3分钟收集沉淀，溶于475μl含4.2M硫氰酸胍、0.5％N-十二烷基肌氨酸、0.2M Tris-HCl(pH8.0)、0.15M二硫苏糖醇(DTT)和1.0μg tRNA的溶液。然后加50μl Tris-HCl(pH8.0)、100mM EDTA和10％SDS。用苯酚-氯仿(1∶1)65℃抽提RNA两次，然后室温氯仿抽提。上相中加250μl 7.5M乙酸铵，用0.6ml 2-丙醇沉淀核酸，75％乙醇洗涤，100％乙醇洗涤，然后用于逆转录(RT)PCR。

为了检测HEV基因组，使用两组嵌套引物，它们代表SAR-55基因组3’区(ORG-2)序列。用于逆转录和第一次PCR的引物是SEQ ID NO：99：GTATAACGGATCCACATCTC CCCTTACCTC和SEQ ID NO：100：TACAGATCTATACAACTTAA CAGTCGG。第二次PCR所用引物是SEQ ID NO：101：GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC和SEQ ID NO：102：TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG。RNA沉淀溶于20μl 0.05MTris-HCl(pH7.6)，0.06M KCl，0.01M MgCl2，0.001M DTT，40单位RNasin(PromegaBiotec，Madison，WI)，16单位禽成髓细胞瘤病毒逆录酶(Promega Biotec)，和10pmol反相引物，42℃孵育1小时。在20μl逆转录酶混合物中加100μl 0.01MTris-HCl(pH8.4)，0.05M KCl，0.0025M MgCl2，0.0002M各种dNTP，50pmol正向引物，50pmol反相引物和4单位AmpliTaq(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)，覆盖100μl矿物油。35轮PCR循环扩增HEV cDNA：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。然后将5μl该混合物用于相同条件的第二轮扩增，不同的是延伸时间增加至3分钟。

在2％琼脂糖凝胶上分离10-1至10-5(图9)范围内标准HEV粪便所有稀释液产生的RT-PCR产物，用溴乙锭染色凝胶进行检测。随稀释度升高，特异性PCR产物减少，能够测得HEV基因组的10％粪便悬浮液的最高稀释度是10^-5。所以，考虑到稀释度因素，HEV基因组的效价约106.7/g粪便。

此外，RT-PCR显示只有含HEV基因组的稀释液才对犬猴具有感染性。所以，标准粪便悬浮液的感染效价与RT-PCR测得的基因组效价大致相同。在一种丙肝毒株中也发现类似的RT-PCR与感染性效价间的关联性。(Cristiano等，(1991)，Hepatology，14：51-55；Farci等，(1991)N.Engl.J.Med.，25：98-104；Bukh等，(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：187-191)。

                           实施例12

用ORF-2蛋白作为疫苗的主动免疫和用抗HEV阳性恢复期血浆的被动免疫

在55kDa ORF-2蛋白ELISA中为HEV抗体阴性(＜1∶10)的犬猴(Macacafascicularis)单独关在BL-2生物防害(biohazard)笼中，用稀释至含10,000或1,000CID50的含SAR-55巴基斯坦毒株的粪便悬浮液(在胎牛血清中)静脉接种猴子。

为了研究主动免疫，如实施例10所述在接种后7天收获5×108个SF9细胞，从中纯化杆状病毒重组表达的55kDa ORF-2蛋白。3mg的纯化55kD蛋白质用明矾沉淀，给8只犬猴肌内注射0.5ml含用50μg明矾沉淀的55kDa蛋白的疫苗进行免疫。其中4只免疫一次，另4只在4周后免疫第二次。最后一次免疫后4周，通过静脉注射1,000-10,000 CID50的HEV攻击猴子。4只犬猴在主动免疫研究中作为对照。犬猴412和413接受一剂空白对照剂(0.5ml磷酸盐缓冲液)，犬猴397和849接受2次空白对照剂。用1,000-10,000 CID50的HEV攻击对照猴。

为了研究被动免疫，用0.5ml 10％混合粪便悬浮液感染犬猴384，悬浮液中含2种中国HEV分离株、KS1-1987和KS2-1987，在恢复期反复采集血浆。(Yin等，(1993)J.Med.Virol.，41：230-241；)。犬猴396和犬猴399的约1％血液和犬猴401和402的约10％血液用HEV抗体效价为1∶10,000的犬猴384的恢复期的血浆代替。输注血浆后2天，用1000 CID50的HEV攻击猴子。作为对照，用在感染前获得的犬猴384的抗HEV阴性血浆代替犬猴405的10％血液。然后，用1000CID50的HEV攻击犬猴405。

被动和主动免疫研究中，在接种前和接种后的15周，用穿刺针活检进行肝脏活检和采集血清样品，并收集粪便样品。用购得的测试盒(Metpath Inc.，Rockville，MD)测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平，肝炎的生物化学证据定义为ALT升高2倍或以上。编号检查肝脏活检样本，所用的是实施例10所述的抗HEV的ELISA。如实施例11所述抽提RNA和RT-PCR，所不同的是来自100μl血清或100μl 10％粪便悬浮液的RNA是用TRIzol试剂(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)按照厂商说明抽提的。为了定量，PCR阳性的血清或各动物的粪便合并后以10倍增量用胎牛血清稀释。各用100μl稀释液如前所述抽提RNA和RT-PCR。此处所用PCR能够测出少至10 CID50 HEV/ml血清，或少至100 CID50HEV/g粪便。

接种前5周内和接种后15周内每周采取的血清样品的ALT峰值表示成比例(后/前)。将对照的几何平均值与Simes测试的被动免疫或主动免疫动物比较(Simes，R.J.(1986)Biometrika，73：751-754)。

用Wilcoxon测试，将对照的(Noether，G.(1976)Elements of nonparametricstatistics(John Wiley & Sons Inc.，NewYork)，pp.31-36)病毒血症和病毒进入粪便的时间、HEV基因组效价与被动或主动免疫动物相比较。用该测试比较被动免疫与主动免疫动物的上述参数。

在统计分析中，将1ml血清中HEV基因组少于100的血清样品定义效价为1∶1，1g粪便中所含HEV少于10的粪便样品定义效价为1∶10。

结果

未免疫动物中戊肝感染的过程

未免疫的5个动物中有3个在受HEV攻击后，作为肝炎的生物化学证据的血清ALT至少升高2倍。2个动物中没有测得ALT活度的显著升高。但是，组织病理学数据显示5个动物都患肝炎，见表6。表6.接种疫苗和对照动物受HEV攻击后的组织病理学、生物化学、血清学和病毒学特征

   动物标号 抗HEV阳性  组织病理学值U/L中ALT峰值攻击时的HEV                      HEV基因组

            血浆(％)

   与种类  或55kD蛋白    累积          (周)      抗体效价           血清                         粪便

                      (测得周数)^*

             (μg)                接种前  接种后           测得周(持续)  平均log10效价/ml  测得周(持续)平均log₁₀效价/g对照404              0        10+(8)    67(0)   143(9)  ＜1∶10    1-11(11)            3           1-11(11)       5.7412              0        2+(1)     34(0)   45(3)   ＜1∶10     1-4(4)             3            2-5(4)         7413              0        4+(4)     44(0)   261(6)  ＜1∶10     2-7(6)            4.7           1-7(7)         7849              0        1+(1)     79(-2)  133(2)  ＜1∶10     1-4(4)            3.7           1-4(4)         7397              0        3+(3)     52(-3)  139(7)  ＜1∶10     2-6(5)            4.7           1-7(7)         7被动IP⁺396             1％      1+(1)⁺⁺   33(0)   53(6)     1∶40     3-5(3)             4            1-6(6)        5.7399             1％       0(0)      69(0)   63(11)    1∶40     2-4(3)             3            1-4(4)         4401            10％       0(0)      55(0)   45(5)     1∶200     3(1)             3.6           1-3(3)        5.7402            10％       0(0)      59(0)   35(2)     1∶200    4-6(3)             1            2-6(5)        5.7主动IP⁺003           50μg       0(0)      34(-3)  50(6)   1∶10.000     0               ＜1           2-4(3)         3009           50μg       0(0)      34(-2)  38(6)    1∶1,000     0               ＜1             0           ＜2013§                      50μg       0(0)      44(-3)  36(7)     1∶100      0               ＜1           1-2(2)         3414           50μg       0(0)      65(0)   73(8)    1∶1.000     0               ＜1            2(1)          2398         2×50μg      0(0)      31(0)   41(2)   1∶10.000     0               ＜1             0           ＜2407         2×50μg      0(0)     150(0)   213(4)  1∶10.000     0               ＜1             0          ＜2*：坏死性炎症病变定级为1+，2+，3+，4+，每周测定级数。+：免疫预防。++：犬猴396在2周中测得1级坏死性炎症病变，但是它们只在第一周与病毒性肝炎有关。§；犬猴013在攻击后9周死亡。

坏死性炎症1至4级中的1至2级在两猴中都与ALT活性升高在时间上相关。

对照猴在攻击后3至5周HEV血清转阳，产生的HEV抗体最高效价为1∶1,000至1∶32,000。在感染、肝炎的严重程度与抗HEV应答水平间存在良好的关联性。肝炎累积分值最高的犬猴405病毒血症和病毒排出的时间也最长，而且抗HEV水平最高(表6)。病毒进入粪便的时间与病毒血症相同或比之略长。对全部对照来说，血清中HEV基因组效价(10^-3-l0^-4.7)比粪便中的(10^-5.7-10^-7)高。在这5个猴子中，在4至11周测得病毒血症和病毒进入粪便，并在血清转阳(2至9周)后平均4.2周被检测到。

被动免疫。犬猴396和399约1％的血液用抗HEV阳性的恢复期血浆代替，在接种后2天(即攻击时间)测定，它们的HEV抗体效价为1∶40(表6)。输血1周后，两猴子的HEV抗体效价都下降2倍，输血后2周，HEV抗体下降到可测水平以下(＜1∶10)。攻击后5周再次测得犬猴396的抗HEV，攻击后4周后再次测得犬猴399的抗HEV，结果显示出现了HEV感染。攻击后9至10周，HEV抗体效价到达最大值(1∶8000)。两只犬猴在攻击后都没有表现出明显的ALT活性升高。但是，在犬猴396中发现了肝炎的组织学证据，在两猴的血清和粪便中都测到HEV基因组(表6)。

犬猴401和402约10％的血液用恢复期血浆代替。输血后2天进行攻击，两猴的HEV抗体效价都是1∶200(表7)。表7.免疫犬猴和对照猴中HEV抗体特征对照动物        HEV抗体         被动免疫         HEV抗体           被动免疫                HEV抗体

        效价     最大效价    的动物   攻击时      最大效价      的动物    最大效价    最大效价(首次最大效价(攻

     (测得首周)    (周)               的效价    (攻击后的周数)         (首次免疫后1周)免疫后1周)  击后1周)cyno-405    1∶80    1∶32,000  cyno-396  1∶40        1∶8,000   cyno-003    1∶10,000             1∶10,000

         (3)        (9)                               (10)                   (3)                   (5)cyno-412   1∶100    1∶10,000  cyno-399  1∶40        1∶8,000   cyno-009    1∶10,000             1∶10,000

         (5)        (7)                               (9)                    (3)                   (1)cyno-413   1∶100    1∶10,000  cyno-401  1∶200       1∶4,000   cyno-013      1∶100              1∶10,000

         (5)        (7)                               (6)                     (2)                  (3)cyno-849   1∶100    1∶1,000   cyno-402  1∶200         1∶80    cyno-414     1∶1,000              1∶1,000

         (3)        (5)                               (12)                    (3)                  (0)cyno-397   1∶100    1∶10,000                                    cyno-398     1∶1,000  1∶10,000   1∶10,000

         (3)        (7)                                                       (3)        (5)       (0)

                                                              cyno-407     1∶1,000  1∶10,000    1∶10,000

                                                                              (4)        (5)       (0)

攻击后的15周内在两猴中可持续测得抗HEV，犬猴401的最大效价为1∶1,4000，而犬猴402的最大效价仅为1∶80。生物化学和组织学分析都没有在两猴中测出肝炎，然而在两猴中可观察到HEV病毒血症和粪中排毒，这表明发生了感染(表6)。所以，获得高抗体效价的被动免疫预防能够在HEV攻击后保护犬猴抵抗肝炎。

主动免疫。50μg 55kDa蛋白质免疫的4只灵长类动物产生了对重组蛋白的抗体，效价为1∶100至1∶10,000(表7)。其中一只(犬猴031)在攻击后第9周死于麻醉事故，但包括在研究中(表6)。用抗原免疫两次的4个动物产生效价为1∶10,000的HEV抗体。其中两只在用HEV静脉攻击后死亡。这也可能是因为麻醉事故，但是无法确定病因。这两只猴子不再包括在以后的实验中。攻击后剩余的6只动物都没有出现ALT水平异常升高或组织学证据(表6)。用55kDa蛋白免疫1次或2次的犬猴没有发生病毒血症。但是，接受1次免疫原的4只动物中的3只在其粪便中有病毒。相反，两次接种疫苗的两动物中都没有发现粪中排毒。

大多数动物主动免疫产生的抗HEV抗体效价高于被动免疫。但是，犬猴013在攻击时的HEV抗体效价为1∶100，而用抗HEV血浆被动免疫的两猴的效价则为1∶200。但是，犬猴013表现出抗HEV感染的能力高于被动免疫动物。攻击时HEV抗体效价为1∶1,000的犬猴009能够完全抗肝炎和不受HEV感染(表6)。相反，犬猴003被感染，并将HEV排至粪便中，虽然它在攻击时的HEV抗体效价高达1∶10,000。但是，在该猴中，肝炎和病毒血症都没有测得，在接受一次抗原且HEV抗体效价1∶10,000或更高的犬猴中也没有。

对照和免疫动物中HEV感染进程的比较。

以组织病理血来衡量所有免疫动物除一只被动免疫的之外，在HEV静脉攻击后都抗肝炎。比较对照组、被动免疫和主动免疫动物之间肝炎严重程度和病毒复制水平的平均值显示：总的说来，感染的严重程度与攻击时的HEV抗体效价成反比，并按以下次序减弱：非免疫＞被动免疫(1％)＞被动免疫(10％)＞主动免疫(1剂)＞主动免疫(2剂)(表6，8)。但是，被动和主动免疫两亚组每组的动物数量不足以进行统计学分析。所以，统计学分析是将合并的被动免疫组和合并的主动免疫组进行的分别与合并的对照组进行比较。分析结果见表8。表8：对照和免疫动物的HEV感染平均值

GM^*：几何平均值+：被动和主动免疫预防α：P＜0.01β：P＜0.05γ：不明显

对照组的组织病理学分值和组织变化与被动免疫或主动免疫动物相比有统计学差异。相比被动或主动免疫动物，对照组更高的ALT峰值接种前后之比具有统计学显著性，表明两种免疫动物组都具有抗肝炎生物化学表现的保护作用。两免疫动物组的病毒血症持续时间和粪便中HEV效价显著低于对照组。但是，血清中病毒清除时间和HEV效价在对照组和被动免疫组之间没有统计学差异，但是对照组的这些参数与主动免疫组相比则有显著差别。病毒血症和粪便排毒时间以及HEV效价在主动和被动免疫动物组织也有显著差异。

总之，表6至8结果显示：被动和主动获取HEV抗体都保护犬猴抵抗以后病毒性HEV攻击所致的肝炎。虽然在用1,000-10,000 CID50的SAR-55攻击时5个非免疫犬猴都出现肝炎组织学证据，但是两个被动获得1∶200效价抗体的猴子都没有发生肝炎，而且抗体效价低达1∶40的两猴之一也没有发生肝炎。

但是，必须指出的是：与被动免疫动物相比，主动免疫动物表现出抗肝炎的完全保护作用且抗HEV感染更有效。例如，与被动免疫动物的结果比较，主动免疫动物在受HEV攻击后没有发生病毒血症。在用重组55kDa蛋白免疫1次或2次后，犬猴中的HEV抗体效价可高达1∶10,000。虽然1只猴子(013)在主动免疫后的效价为1∶100，但是这一水平仍然可防肝炎和病毒血症。

主动免疫研究还显示，虽然单剂疫苗能够防止HEV病毒血症，但粪便中仍有病毒排入。但是，2剂疫苗则完全防止了肝炎和HEV感染的全部表征。以上数据显示，给予1剂疫苗，例如在出境旅游之前，能够在戊肝高危环境中保护个体。

最后必须指出的是，以上结果与过去报道的非人灵长类动物被动免疫和主动免疫预防甲肝结果十分相似：报道免疫预防可防肝炎但不防感染，而疫苗接种则不仅防肝炎而且防HAV感染(Purcell，R.H.等(1992)，Vaccine，10：5148-5149)。有意义的是，在测定保护性抗体效价(＜1∶100)和活病毒静脉攻击后的结果方面，本发明的HEV免疫预防研究都与过去HAV免疫预防研究相似。既然其它研究已经显示了被动和主动获得的抗HAV类似效价对人的效果，并证实了在肝炎研究方面灵长类动物研究的预计性价值(Stapleton，J.等(1985)Gastoenterology 89：637-642；Innes，B.L.：(1992)Vaccine，10：S159)，所以此处犬猴中的结果很可能预示了对人的保护作用。

                          实施例13

         完整ORF-2蛋白和低分子量片段的在酵母中直接表达

用质粒P63-2为模板，用以下合成寡核苷酸：

SEQ ID NO.：103(反向引物#1703)GCACAACCTA GGTTACTATAACTCCCGAGT TTTACC；SEQ ID NO.：104(正向引物#1778)GGGTTCCCTAGGATGCGCCC TCGGCCTATT TTG；SEQ ID NO.：105(正向引物#1779)CGTGGGCCTA GGAGCGGCGG TTCCGGCGGT GGT；SEQ ID NO.：106(正向引物#1780)GCTTGGCCTA GGCAGGCCCA GCGCCCCGCC GCT；SEQ IDNO.：107(正向引物#1781)CCGCCACCTA GGGATGTTGA CTCCCGCGGCGCC；

PCR制备4段cDNA ORF-2片段，分别编码：

完整ORF-2蛋白(aa1-660，MW70979)，片段1778-1703。(片段编号为后文给出的引物编号)

第34aa开始的ORF-2蛋白(aa34-660，MW67206)，片段1779-1703。

第96aa开始的ORF-2蛋白(aa96-660，MW60782)，片段1780-1703。

第124aa开始的ORF-2蛋白(aa124-660，MW58050)，片段1781-1703。

SEQ ID NO.：103-107在5’端4个核苷酸之后都具有人造序列CCTAGG。这段人造序列由Avr II(Bln I)限制性酶识别。用BlnI剪切PCR合成片段，克隆到pPIC9载体(Invitrogen)的Avr II位点(图10)。用限制性酶切分析，用ORF-2序列和载体中的不对称EcoRI位点来验证片段方向正确。按照Invitrogen程序，纯化以下重组质粒：pPIC9-1778(含片段1778-1703)；pPIC9-1779(含片段1779-1703)；pPIC9-1780(含片段1780-1703)；pPIC9-1781(含片段1781-1703)，转化酵母(Picha株)原生质球。以同一程序筛选重组克隆并分析表达。表达出的蛋白可用作疫苗中的免疫原或本发明免疫实验中的抗原。最后，本领域熟练技术人员将发现，以上实施例所用的载体和酵母株可换用它载体(例如，pHIL-F1；Invitrogen)或酵母株(例如，酿酒酵母)。

                            实施例14

        对重组杆状病毒63-2-IV-2感染的SF-9昆虫细胞合成的

          HEV ORF-2基因产物的纯化和氨基酸末端序列分析

如实施例10所述，用重组杆状病毒63-2-IV-2感染SF-9细胞，接种后7天收获。昆虫细胞裂解液在SDS-PAGE上的主条带蛋白分子量约55kDa。用DEAE琼脂糖离子交换层析柱，150-450mM NaCl梯度，进一步纯化该55kDa条带。用SDS-PAGE再用考马斯蓝染色，检测DEAE流分中有55kDa条带。然后用无SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳将层析峰流份区分成55kDa、61kDa和中间分子量3条条带。对聚丙烯酰胺凝胶上各蛋白带的氨基末端蛋白微测序(microprotein)显示：55和61kDa蛋白都有一段独特的SEQ ID NO.：2中Ala-122处的N末端。这两种ORF-2剪切产物的大小差异被认为反映了大产物COOH-末端的两种不同剪切。

聚丙烯酰胺凝胶上的第三种中等蛋白经证实为杆状病毒几丁质酶蛋白。对DEAE峰流份进行反向HPLC，用微孔系统，NaCl和乙腈溶剂，将55和61kDa的ORF-2蛋白分离成无任何几丁质酶的对称单峰。

                           实施例15

                  55和61kDa剪切产物的直接表达

以p63-2为模板，PCR获取自氨基酸112开始(ORF-2的氨基酸112-660)的编码ORF-2蛋白的cDNA ORF-2片段。然后将该片段插入pBlueBac-3转移载体内的BamHI-PstI位点。用该载体形成的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞。用考马斯蓝染色聚丙烯酰胺凝胶分析昆虫细胞裂解液中有否55 kDa和61kDa的ORF-2蛋白。直接表达的蛋白可用作疫苗中的免疫原和本发明免疫试验中的抗原。

                          实施例16

              HEV ORF-2蛋白在昆虫细胞内表达的动力学

测定全长和截短HEV ORF-2(巴基斯坦毒株)在杆状病毒感染的昆虫细胞内的表达动力学和纯化。本实施例所述72和63kDa的ORF-2蛋白分别相同于实施例3和14所述的74和61kDa蛋白；分子量差异符合通过凝胶电泳迁移率测定分子量时公称偏差小范围Cell culture。Spodoptera frugiperda细胞，9号克隆(Sf-9)单层培养以进行噬斑试验和转染，振荡悬浮培养物用于病毒感染产生高效价病毒储备液和重组蛋白。Sf-9细胞维持在28℃，150rpm，Sf-900 II无血清培养基(SFM)(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)，干燥培养箱中，从起始密度0.2×106个细胞/ml开始，传代达70次，至最终密度1.0×107个细胞/ml。

病毒感染。

重组Autographa californica多核多角体杆状病毒(AcMNPV)以低感染复数(MOI：0.01)在Sf-9细胞(0.2×106个细胞/ml)传代。为产生重组蛋白，在MOI＝5时启动病毒感染，持续4天，直至活度＜10％。在6格测试板上用铺满率75％的Sf-9细胞单层以标准方法进行琼脂糖噬斑试验。

重组杆状病毒的构建。

在Sf-9细胞内用标准同源重组法构建含全长(bHEV ORF2 fl)和5’截短(bHEVORF2 5’tr)缺省HEV ORF-2(巴基斯坦毒株)的重组杆状病毒(图11)。用杆粒载体构建含5’-3’截短缺省HEV ORF-2的重组杆状病毒(Luckow，V.A.等，(1993)J.Virol.，67：4566-4579)：

寡核苷酸引物)和HEV-140(5’-TTCGGATCCA TGGCGGTCGC TCCGGCC-3’)(SEQ ID NO.：108)和HEV-141(5’-TCAAGCTTAT CATCATAGCACAGAGTGGGG GGC-3’)(SEQ ID NO.：109)用于将一段1512bp的PCR产生的DNA片段(p61.2内，编码HEV ORF2的氨基酸112至607，带自己的ATG翻译起始密码子和多个终止密码子)用T/A PCR克隆到pCR2.1(InVitrogen，San Diego，CA)。含HEV ORF2 DNA序列的一段1520bp BamHI-EcoRI DNA片段插入杆状病毒供体质粒pFASTBAC-1(Life Technologies，Inc.)内ploh基因座中ploh启动子下游。用阳离子脂质体CELLFECTIN(Life Technologies，Inc.)从重组杆粒DNA感染的Sf-9细胞中分离出含HEV ORF2 DNA的重组杆状病毒。筛选经噬斑纯化病毒分离株的HEV ORF2 DNA插入片段完整性和昆虫细胞内蛋白质的表达，并扩展为一个主要病毒种子库，命名为bHEV ORF5’-3’tr病毒。

感染细胞和上清液的处理。

在指定时间500×g，4℃离心5分钟回收感染细胞和培养基清液，并处理获取重组HEV ORF2蛋白。制备细胞裂解液：2ml/mg细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(0.5％NP-40，50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA)，补充新鲜抑蛋白酶肽至0.2mg/ml的最终浓度，略微搅拌，冰上孵育20分钟。3000×g，4℃低速离心15分钟沉淀细胞核，收集细胞质用作细胞裂解原液。用Sorvall SS34离心机，12,000×g，4℃离心60分钟澄清感染细胞清液和细胞裂解液。

HEV ORF2蛋白产物纯化。

分别从澄清的杆状病毒感染细胞裂解液和培养基清液中纯化重组HEV ORF2蛋白。用上样缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM NaCl)1∶10稀释细胞裂解原液。

澄清的感染细胞清液在Amicon Proflux M-12超滤系统上，用螺旋环绕纤维素超滤柱(SlY10；1平方英寸；截留分子量10,000；Amicon，Beverly，MA)，循环速度4L/分钟，跨膜压力20psi，切向流超滤浓缩10倍。用4体积上样缓冲液透析浓缩清液。

透析液或裂解原液(1.5床层体积)上样在Q琼脂糖快速强离子交换柱(XK50柱，5.0×7.5cm，150ml；Pharmacia Piscataway，NJ)上，流速为5.0ml/min。先用1.0床层体积上样缓冲液以5ml/min流速洗柱，接着用1.0床层体积上样缓冲液以20ml/min流速洗柱。用10至300mM NaCI连续线性梯度的6.5床层体积相同缓冲液，20ml/min流速洗脱蛋白质。

取10μl Q琼脂糖层析柱峰蛋白流份用SDS-PAGE鉴定是否HEV ORF2(+)蛋白流份。合并(+)流份，用琼脂糖G-25(Pharmacia)和上样缓冲液凝胶过滤脱盐。收集峰蛋白流份，上样在Source 15Q高效强离子交换柱上离析各HEV ORF2多肽。用与Q琼脂糖液体层析相同的方法洗柱和洗脱。如前所述合并HEV ORF2蛋白(+)流份进行鉴定，合并，在Sephacryl S-200柱(Pharmacia)上用上样缓冲液进行凝胶过滤最后纯化蛋白质。如下所述用SDS-PAGE和Western印迹试验鉴定HEV ORF2流份。

用BAC/Pierce蛋白微试验60℃测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为蛋白质标准物。所有层析都用配有Millenniun2021过程控制和检测软件的Waters 600E层析工作站系统(Medford，MA)进行。用AccuMet20电导测定仪测定缓冲液的电导。用Corning 220 pH计测定缓冲液的pH。所有缓冲组份都是USP或分子生物学级原料。

SDS-PAGE，和Western印迹试验

用蛋白变性样品缓冲液(126mM Tris-HCl，pH6.8，5％β巯基乙醇，20％乙二醇，2％SDS和0.005％溴酚蓝)将蛋白质稀释2倍，99℃变性5分钟。变性样品在8-16％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶(NOVEX)上(Laemmli，U.K.等(1970)Nature227：680-685)上电泳。根据生产商的说明，用胶体考马斯蓝染色溶液染色蛋白凝胶来显示蛋白质(NOVEX，San Diego，CA)。

用电印迹技术(Tsarev，S.A.等(1993)J.Inf.Dis.，168：369-378)将蛋白质转移到PVDF薄膜上。层析检测HEV ORF2蛋白：结合第一抗血清(大猩猩多克隆α-HEV；1∶500)，再结合第二抗血清(与碱性磷酸酶共轭的山羊α-人IgG2(1∶5000；LifeTechnologies，Inc.))。用NBT/BCIP(Life Technologies，Inc.)作为生色底物。

氨基末端序列分析

用Laemmli缓冲系统(Laemmli，U.K.等(1970)Nature 227：680-685)，在SDS存在下，聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质。按照生产商的说明，将蛋白质从凝胶上电泳转移到Pro Blot膜(Applied Biosystems，Foster City，CA)上。考马斯蓝染色显示蛋白质，切取63kDa和55kDa的HEV ORF2蛋白，用配有联机(on-line)PTH分析仪的Applied Biosystems 473型气体/脉冲-液相蛋白测序仪分析氨基末端序列。

内部氨基酸序列分析

如上电泳蛋白质。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，Ponceau S染色显现。从膜上切取相关条带，处理，按Abersold等的方法进行原位Lys C蛋白酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)消化(Abersold，R.H.等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6970-6974)。用Waters Associates(Medford，MA)高压液相层析系统和Vydac C4(Hesperia，CA)反向柱分离Lys C产生的片段。用AppliedBiosystems 477A型蛋白测序仪和120A型联机PTH分析仪测定分离肽的氨基酸序列。

氨基酸序列分析

6N Hcl 150℃汽相水解1小时后用Waters Pico Tag工作站分析上述Lys C产生片段的氨基酸组成。用异硫氰酸苯酯(PTC)衍生氨基酸，用Waters Pico Tag氨基酸分析系统分离和定量所得的PTC氨基酸。

羧基末端序列分析

用固定化羧基肽酶Y(Pierce，Rockford，IL)从55kDa HEV蛋白羧基末端开始依次释放氨基酸。800μl 0.05mM乙酸钠缓冲液pH5.5中约150μg蛋白质与200μl树脂悬浮液在37℃混合。在0、5、15、30、60、90和120分钟取多份清液(100μl)。最后一份在第16小时采集。真空干燥样品，如上所述，但不水解，进行氨基酸分析。

质谱

用配有一个大气压连接(articulated)离子喷雾源的Perkin-Elmer Sciex API-III三相四极(triple stage quadrupole mass spectrometer)质谱仪(Foster City，CA)测定纯化蛋白的质谱。高纯氮气既作为雾化气(操作压力＝0.5MPa)，又作为帘气(流速＝0.8I/min)。氩气以3×1015原子/cm2的冲击气量用作目标气体。用HarvordApparatus 11型针筒泵(Southnatick，MA)以50μl/ml直接注射1∶200稀释于移动相中的牛血清白蛋白标准溶液获得质谱扫描范围mIz 100-1500正离子。以1.0秒的间隔集取质谱。毛细管电压维持在2kV和60℃。

检测HEV ORF2基因产物的临时表达来鉴定加工后重组HEV蛋白。悬浮培养在无血清培养基中的Sf-9昆虫细胞用编码全长戊肝病毒(巴基斯坦株)衣壳基因的杆状病毒感染(图11)。从病毒感染起连续4天每日收集细胞裂解液和培养基清液。HEV细胞裂解液的SDS-PAGE和Western印迹分析结果显示有一种HEVORF2 72kDa蛋白存在于感染后(p.i.)第1天但随后消失(图12)。p.i.第2天，感染细胞内有63 kDa和55kDa的HEV蛋白。p.i.第3天，感染细胞内主要是55kDa的HEV蛋白(图12)。感染后第2至4日丰富的63kDa至65kDa蛋白经鉴定是杆状病毒几丁质酶而不是HEV 63kDa蛋白。早在p.i.第1天就有53kDa的蛋白分泌到感染细胞培养基清液中，在p.i.第3天达到最多。以上结果显示，原72kDa的HEV蛋白被蛋白酶随机剪切产生最终的55kDa(细胞裂解液)和53kDa(培养基)HEV蛋白产物。

HEV蛋白质纯化

在p.i.第4天收获重组bHEV ORF2全长(fl)病毒或截短病毒感染的Sf-9细胞，经NP-40裂解产生的细胞裂解液，用阴离子交换层析和凝胶过滤从中分离重组HEV 63kDa和55kDa蛋白。从收获的病毒感染培养基清液中纯化53kDa的分泌蛋白，培养基清液事先离心澄清并经切向流超滤浓缩10倍。将5’双重travented结构感染细胞的细胞裂解液和培养基清液浓缩液用Q上样缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM NaCl)稀释10倍并透析。平衡的细胞裂解液(55kDa蛋白)和培养基清液(53kDa蛋白)分开上样在Q琼脂糖快速强阴离子交换柱上。HEV 55kDa蛋白被结合，在140mM NaCl的离子强度被洗脱(图13A)。合并层析后细胞裂解液和清液的HEV蛋白流份，经过Sephacryl G-25柱脱盐，用SOURE 15Q强阴离子高效柱进行第二次阴离子交换层析。HEV蛋白被结合，然后在140mM NaCl时洗脱(图13B)。合并HEV蛋白峰流份，用Sephacryl S200柱(图13C)凝胶过滤分离。对55kDa蛋白流份的SDS-PAGE和Western印迹分析显示该55kDa蛋白来自HEV(图14，下分图)。据考马斯蓝染色的蛋白凝胶估计，该55kDa蛋白的纯度为99％或更高(图14，上分图)。

氨基末端序列分析

为了确定bHEV感染昆虫细胞期间测得的重组HEV 63kDa和55kDa蛋白的氨基末端进行了氨基末端的氨基酸序列分析。bHEV ORF2 fl病毒感染Sf9昆虫细胞，p.i.第2天收获细胞，细胞裂解液稀释后上样在Q琼脂糖快速柱上，合并从柱上洗脱的HEV蛋白流份。在140mM NaCl时从Q峰中纯化得到两种蛋白，比例为1∶20(63kDa∶55kDa)。从ProBlot膜上切取HEV 63kDa和55kDa蛋白条带，20轮直接Edman降解得到相同的氨基酸序列(表9)。

        表9.纯化自细胞裂解液的重组HEV 63 SEQ ID NO.：110

    和HEV 55 SEQ ID NO.：111蛋白质氨基末端的氨基酸序列分析

氨基酸分析循环	HEV 55kDa	HEV 63kDa
			1234567891011121314151617181920	AAPLTAVAPAHDTPPVPDVD	AAPLTAVAPAHDTPPVPDVD

该序列对应于HEV基因组开放读码框2的残基112至131。以上结果显示两种免疫活性蛋白质表观分子量差异是羧基末端截断造成的。

内部氨基酸序列分析

为了进一步测定重组HEV63和55kDa蛋白的相同性，进行肽酶消化和分离。用Lys C蛋白酶消化纯化的55kDa HEV蛋白，因为该酶剪切赖氨酸羧基末端的专一性被认为比胰蛋白酶更适合由55kDa HEV蛋白产生肽和测定氨基酸序列。图15显示Lys C消化产生的肽特征。

取洗脱峰分析氨基酸序列。重组HEV ORF2 55kDa蛋白内部肽的氨基酸序列与预计的HEV ORF2(巴基斯坦株)氨基酸序列一致。没有发现含HEV ORF2内607至670氨基酸序列的肽。特别有意义的是流份24，其52轮循环明显对应于HEVORF2内氨基酸残基554至606。没有发现第53和55轮(残基606和608)时PTH亮氨酸的增加，虽然在第54轮循环时观察到PTH丙氨酸的增加。因为在我们的实验室中超过50个氨基酸残基的可读氨基酸序列并不常见，所以不能确定未获得另外的序列数据是因为到达肽末端(蛋白质的羧基末端)导致信号丢失还是因为Edman chemistry的失读。所以需要用其它方法来测定重组HEV ORF2 55kDa蛋白的羧基末端。

氨基酸组成分析：

确定Lys C消化流份24中有否重组HEV ORF2 55kDa蛋白内氨基酸606至608的另一种方法是分析肽的氨基酸组成。对一份流份24氨基酸序列分析的结果见表10。

表10.Lys C消化的55kDa蛋白的流份24的氨基酸组成分析

氨基酸	预计	实测
			Asn+Asp	4	4.4
Gln+Glu	2	3.2
			Ser	6	5.7
Gly	4	6.3
			His	2	2.1
Arg	1	2.0
			Thr	5	5.0
Ala	10	10
			Pro	3	3.3
Tyr	4	3.5
			Val	6	6.1
Met	0	0.7
			Cys*	0	0*
Ile	2	2.7
			Leu	6	6.3
Phe	0	0.6
			Lys	0	0.9

标定到10Ala水解前不进行Cys的衍生

以上分析显示：未能获得54轮(残基607)以后的氨基酸序列数据是因为氨基酸测序已经到达55kDa蛋白的羧基末端。该结果与肽终止于亮氨酸607一致。虽然该分析包含其它微小变化，但是它清楚地表明肽在超过HEV ORF2内前一赖氨酸(残基600)后完全终止。

羧基末端序列分析

测定重组HEV ORF2 55kDa蛋白质羧基末端的另一种方法是用羧基肽酶消化55kDa蛋白后的羧基末端氨基酸分析。用固定化羧基肽酶Y孵育一定的时间，对期间释放的游离氨基酸的氨基酸分析显示亮氨酸迅速增加，然后是缬氨酸、丝氨酸和组氨酸(图16)。未发现其它氨基酸的明显增加。该结果证实重组HEV ORF255kDa蛋白的羧基末端是亮氨酸607。

质谱分析

根据HEV ORF2(巴基斯坦株)的核苷酸序列，预计HEV 55kDa蛋白(HEVORF2的氨基酸112至607)的分子量为53kDa。为了获得该肽的实际质量，进行纯化重组HEV 55kDa蛋白的电喷质谱分析。数轮MS测定的结果为：蛋白纯制剂中只有一种分子量约56,000Da的多肽(图17)。因为质谱的精确度为0.01％，所以证实了55kDa蛋白是N末端和C末端蛋白酶剪切产生的这一结论。

昆虫细胞内HEV ORF2截短蛋白表达动力学

为了确定在HEV ORF2氨基和/或羧基末端缺失的原蛋白是否能在昆虫细胞内稳定而高水平地表达，将HEV ORF2的5’和5’-3’截短缺失突变体克隆到杆状病毒载体内。bHEV ORF2 5’tr和bHEV ORF2 5’-3’tr病毒感染的结果显示：63和55kDa的蛋白质都在昆虫细胞内表达(图18)。但是，到p.i.第3天时，55kDa kDa蛋白在bHEV ORF2 5’tr感染细胞内的丰度高出50倍以上，而在ORF2 5’-3’tr感染细胞内是唯一的。两种病毒感染后第一天，53kDa蛋白还分泌到培养基清液中，并在p.i.第3天达到最大值。ORF2 5’-3’tr病毒感染的昆虫细胞内53kDa分泌蛋白的丰度比ORF2 5’tr病毒感染的细胞内高20倍。根据前文纯化步骤，从两种病毒感染的细胞裂解液中纯化到55kDa蛋白，从培养基清液中纯化到53kDa蛋白。已经确定，53kDa分泌蛋白的氨基末端和羧基末端为HEV ORF2的氨基酸112和578，而且53kDa蛋白在ELISA中表现出抗原性。53kDa蛋白的预计分子量是50kDa，但质谱显示其分子量约为53kDa。

                                                         实施例17HEV ORF2 3’蛋白酶剪切突变病毒表11.用标准点突变技术由bHEV ORF2 fl产生HEV ORF2 3’蛋白酶剪切突变病毒，该病毒感染的Sf-9昆虫细胞内HEV ORF2基因的表达

突变病毒	602A	603P	604H	605S	606V	607L	****	613M	****	634Q	细胞结合产物	分泌产物
													I2			R								55.63kDa
II2					A						55.63kDa
													III2			R		A						63kDa	72kDa少量
IV2										P	55.63kDa	63kDa少量
													Va1								F			72kDa	72kDa少量
Vb1								L			72kDa	72kDa少量
													VI2						P					63kDa	72kDa少量

1：感染后第24小时收获的病毒感染

2：感染后第48小时收获的病毒感染

另用含AUU密码子和相邻核苷酸的寡核苷酸引物在112-607bHEV的氨基酸578处(HEV ORF2巴基斯坦株)进行PCR定点诱变，以异亮氨酸代替第578位精氨酸。112-607bHEV的其它突变体还包括以甘氨酸、丝氨酸或谷氨酸代替第578位精氨酸。如前所述，用含有产生所需氨基酸改变的密码子的寡核苷酸构建这些突变体。据信，112-607bHEV突变体将推动HEV ORF2蛋白生产平衡向单一蛋白移动。

                            实施例18

                    Phesus恒河猴内的疫苗研究

灵长类动物。本研究使用32只在灵敏ELISA(Tsarev SA.等，J.InfectDis.(1993)；89：369-78)中呈HEV抗体(抗HEV)阴性(＜1.10)的恒河猴(Macaccamulatta)。

HEV攻击储备液。以巴基斯坦HEV毒株SAR-55(Iqbal M.等，J.Trop.Med.Hyg.1989；40，438-443)(人粪便)或墨西哥HEV毒株Mex-14(Velazquez O.等，JAMA(1990)；263：3281-5)(猴粪便，CDC提供)作为攻击病毒源。稀释含巴基斯坦或墨西哥HEV毒株的粪便悬浮液(悬浮于犬猴(Macacca fascicularis)血清阴性血清)至含有10,000猴感染剂量(MID50)，用于给动物静脉接种。

用于免疫的接种物。从被含完整ORF2的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化55kDa的ORF2蛋白(Tsarev SA等，戊肝预防的前景：肠道传染肝炎病毒(Y.Buisson，P.Coursaget，M.Kane编辑)。La Simmarre，Joueles-Tours，France，(1996)p.373-383)，明矾沉淀(Tsarev SA等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，(1994)；191：10189-202)。根据ELISA测定残留可溶性抗原的结果，沉淀率高于99％。蛋白-明矾复合物在4℃保存至多1年。

接种方案

给恒河猴静肌内注射0.5ml含50μg、10μg、2μg或0.4μg明矾沉淀55kDa蛋白的疫苗。以一个月为间隔进行两次接种。其它猴子注射没有重组蛋白的明矾悬浮液(空白剂)0.5ml。

对灵长类动物的观测

接种前和接种后15周中的每一周用透皮针进行肝脏活组织检查获取血清样品和粪便样品。用市售测试试剂盒(Metpath Inc.，Rochville，MD)测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平。肝炎的生物化学表征为ALT的接种后/前之比升高2倍或以上。如(Tsarev S.A.等Proc.Natl.Acad.Sic.USA，(1994)191：10189-202)所述进行肝脏活检和组织病理学测评。对动物进盲法临床评价。如(Tsarev S.A.等Proc.Natl.Acad.Sic.USA，(1994)191：10189-202)所述进行抗HEV ELISA和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。为了定量，合并各动物连续的PCR阳性血清或粪便，以10倍增量稀释于牛血清。用100μl各稀释液抽提RNA和进行RT-PCR。本研究所用PCR方法可测得低至10MID₅₀HEV/ml血清和低至100MID₅₀/g粪便。

统计学分析。用Student T测试(Student T-test)成对比较空白组和接触后接种组，以及空白组和异源病毒攻击组肝炎和HEV感染的定量参数。用Dunnett测试进行空白组与不同剂量重组疫苗接种组之间的多重比较(multiple comparison)。用Tukley多项测试比较不同剂量接种动物在攻击时的抗HEV效价。

为了进行统计学分析，规定每ml血清少于10个HEV基因组的血清样品的效价为1∶1，每g粪便少于100个HEV基因组的粪便样品效价为1∶10。

                              结果

仅接种明矾，受HEV SAR-55毒株攻击的4只猕猴都患上肝炎：这些动物的前后峰ALT之比明显高于临界值2.0，在3.1至10.6之间(表12)。

表12：以同源病毒攻击前接种空白或不同量重组HEV ORF2蛋白的恒河猴内的HEV感染接种(Sar-55 ORF2蛋白)                                               攻击(Sar-55毒株)接种物和动物  一次接种后抗  攻击时的抗HEV  ALT峰后/前  组织病理学   血清中的HEV基因组^* 粪便的HEV基因组^*

            HEV效价     效价(2次接种)     之比      (累积值)    Log10效价+  周数    Log10效价+  周数空白Rh6051          ＜1∶10        ＜1∶10        3.1          4.5+          4        6          6        6Rh6067          ＜1∶10        ＜1∶10        3.9          6.0+          4        5          8        7Rh5984          ＜1∶10        ＜1∶10       10.6          5.0+          4        5          6        7Rh5985          ＜1∶10        ＜1∶10        8.5          4.5+          3        5          6        5疫苗2×50μgRh6068        1∶10,000       1∶10,000       1.1          0+            2        3          3        4Rh6063         1∶1,000       1∶10,000       1.2          0+            3        2          4        3Rh6074        1∶10,000       1∶10,000       1.1          0+           ＜1       0          2        1Rh6071         1∶1,000       1∶1,000        1.1          0+            2        5          5        6疫苗2×10μgRh5991         1∶1,000       1∶1,000        1.4          0+            3        6          4        5Rh5989         1∶1,000       1∶10,000       1.1          0+            3        4          3        5Rh5974         1∶1,000       1∶10,000       1.0          0+            2        6          4        7Rh5972         1∶1,000        1∶1,000       0.9          0+           ＜1       0          3        1疫苗2×2μgRh5976         1∶1,000       1∶10,000       1.0          0+            2        3          5        2Rh5978         1∶1,000       1∶10,000       0.9         0.5+           2        5          4        5Rh6049          1∶100        1∶1,000        1.2          0+            2        4          3        4Rh6050          1∶100         1∶100         1.0          0+            2        2          3        3 疫苗2×0.4μgRh5986      1∶100     1∶1.000      1.2     0+      2    1    3    1Rh5987      1∶100     1∶1,000      0.9     0+      1    2    2    1Rh5988     ＜1∶100    1∶10,000     1.1     0+      2    2    2    2Rh5992      1∶100     1∶1.000      1.1    1.0+     2    2    3    3*：用RT-PCR测定+：合并阳性样品的测定值

用组织学测试的结果确认肝炎。累积的组织病理学评分在4.5+至6.0+之间。观测每个动物体内的病毒血症和排毒。病毒血症持续5至6周,排毒持续5至7周。合并阳性血清或粪便样品，测定各动物的HEV基因组效价。合并血清中HEV基因组效价为103至104，合并的粪便样品中为106至108。HEV基因组效价与我们先前报道的以相同HEV SAR-55毒株攻击的犬猴中的效价相当(Tsarev S.A.等Proc.Natl.Acad.Sic.USA，(1994)191：10189-202)。病毒血症和排毒的持续时间也相当。

用HEV Mex-14毒株攻击的4个动物都患上肝炎，组织病理学评分除外的各疾病定量参数均与用SAR-55毒株攻击的动物类似(表13)。  表13：以同源病毒攻击前接种空白或不同量重组HEV ORF2蛋白的恒河猴内的HEV感染

接种(Sar-55 ORF2蛋白)                                    攻击(Sar-55毒株)接种物和动物   一次接种后抗    攻击时的抗HEV  ALT峰后/前  组织病理学    血清中的HEV基因组^*   粪便的HEV基因组^*

              HEV效价       效价(2次接种)    之比      (累积值)     Log10效价+    周数    Log10效价+  周数空白Rh5996           ＜1∶10           ＜1∶10       4.8        1.0+            4           4         6         5Rh6044           ＜1∶10           ＜1∶10       4.7        1.0+            4           4         6         4Rh6045           ＜1∶10           ＜1∶10       7.6        1.5+            3           4         7         6Rh6046           ＜1∶10           ＜1∶10       2.7        1.0+            3           4         7         5疫苗2×50μgRh5982          1∶1,000         1∶10,000      1.0          0+             1           1         1         2Rh5983         1∶10,000         1∶10,000      0.9          0+             2           3         3         4Rh5994          1∶1,000         1∶1,000       1.0          0+             2           4         5         2Rh5995         1∶10,000         1∶10,000      1.8          0+            ＜1          0        ＜2        0*：用RT-PCR测定+：合并阳性样品的测定值

这两组动物的感染定量参数也相似。所以，HEV攻击储备液能够在所有受攻击动物中导致肝炎，因此可用于证实抗戊肝疫苗的效力。

接触后接种组内的戊肝感染

用SAR-55攻击4只动物。攻击后48小时，给它们接种50μg疫苗，一个月后进行一次加强(50μg)。这组的疾病或感染参数与对照组相比没有显著差别，只有病毒血症和排毒的持续时间分别降低1.5和1.7倍。(数据未显示)

接种

接种50μg、10μg或2μg疫苗的全部灵长类动物和接种0.4μg重组蛋白的4只动物中的3个在首次免疫后都转为HEV血清阳性(表12和13)。在首次免疫后观察到疫苗剂量与抗HEV效价间的正比关系；0.4μg的几何平均值(GM)为1∶32，2μg的为1∶316，10μg的为1∶1,000，50μg的为1∶3,200。第二次接种疫苗后的1个月内仍可观察到剂量相关性GM效价差异，但是差异范围变窄(如表14所示，在1∶1,800至1∶5,600之间)。表14：同源攻击或异源攻击后的HEV感染接种(Sar-55 ORF2蛋白)                            攻击结果分类      抗HEV   ALT峰GM^*  组织病理学  血清中的HEV基因组⁺   粪便的HEV基因组⁺(4动物/类) GM^*效价 后/前之比 (平均累积值) Log10效价^*   周数  GM效价^*(Log10) 平均周数Sar-55空白      ＜1∶10     5.7         5+         3.8       5.3        6.5           6.3疫苗2×50μg   1∶5,600   1.1(s)      0+(s)      1.8(s)    2.5(N)     3.5(s)        3.5(s)2×10μg   1∶3,200   1.1(s)      0+(s)      2.0(s)    4.0(N)     3.5(s)        4.5(s)2×2μg    1∶1,800   1.0(s)     0.1+(s)     2.0(s)    3.5(N)     3.5(s)        3.8(s)2×0.4μg  1∶1,800   1.1(s)     0.3+(s)     1.8(s)    1.8(s)     1.8(s)        2.5(s)Mex-14空白      ＜1∶10     4.6        1.1+        3.5        4         6.5           5.0疫苗2×50μg   1∶5,600   0.9(s)      0+(s)      1.3(s)    2.0(N)     2.3(s)        2.0(s)*：几何平均值+：用RT-PCR测定(S)：与空白对照组相比有统计学上的显著差异(p＜0.05)(N)：与空白对照组相比无统计学上的显著差异(p＞0.05)

用多重比较测试进行的抗HEV GM效价统计学分析显示，两次接种后GM效价的剂量相关差异不明显。此次攻击的是恒河猴。

同源攻击

根据生物化学标准，接种4种剂量中任一种的16个动物都获得抗肝炎保护，因为其血清ALT水平都没有升高(表12)。只在其中2个接种最低剂量疫苗的动物中发现组织学变化。所述的组织异常极小，其中之一(恒河猴5978)的异常甚至可能与HEV感染无关，因为在接种前的肝样品中也发现类似的异常。总之，两次接种50μg、10μg、2μg或0.4μg疫苗的4组动物都获得抗肝炎保护，而且，各组的戊肝定量参数都与空白组有明显的统计学差异(表14)。

虽然接种组的动物都获得抗戊肝保护，但是它们并没有抗HEV感染的保护。即使接种动物的病毒效价在统计学上明显低于空白组，大多数情况下，病毒血症和排毒的持续时间并没有明显缩短。与空白组相比，接种动物的病毒血症水平平均降低约80倍，排毒水平平均降低约1,000倍。两次接种50μg重组蛋白的两动物获得抗Mex-14HEV毒株病毒血症的保护和抗肝炎保护，该毒株在基因和地理上与疫苗株差异最大(表13)。在这些动物中都没有发现肝炎的组织学和生物化学证据。将免疫动物与空白组相比时，疾病的表现具有统计学显著差异(表14)。但是，和同源攻击情况相同，大多数动物没有抗HEV感染保护。3只动物中可测得病毒血症和排毒，而第4只试验动物既无病毒血症也不排毒，得到了完全的抗感染保护。与空白接种组相比，病毒血症和排毒水平明显降低(约180倍和1,800倍)。排毒持续时间的差异明显，病毒血症持续时间差异不明显。

总之，以上实验表明，两次接种低达0.4μg的重组蛋白可保护恒河猴不患肝炎。两次接种0.4μg至50μg后，抗HEV GM效价没有明显差异。用同源毒株攻击时，根据测定ALT是否升高，接种动物都获得抗戊肝保护，只有两个接种最低剂量疫苗的动物发生最小组织病变。通过多组比较定量评价了疫苗的保护效力，所述的比较显示：除接触后接种组之外，接种灵长类动物的肝炎定量参数都低于空白组，所述差异具有统计学显著性。而且，两次接种50μg疫苗(唯一测定的剂量)的动物都获得抗异源攻击保护，所述的异源攻击是用迄今鉴定到的基因和地理差异最大的HEV毒株。相反，接触后的接种无效。根据生物化学和组织学标准，攻击后48小时接种的动物都患上肝炎。

虽然血清阳性的灵长类动物能够在高剂量HEV攻击后免患戊肝，它们大多不抗HEV感染。这可能并不出人意料，因为为了确保接触一致性，通常经口传播的该病毒是通过静脉给予的。但是，根据病毒血症和排毒水平测定，接种动物的感染程度都比空白组显著降低。实际上，用异源毒株攻击的一个动物获得完全的抗HEV感染保护，用同源HEV毒株攻击的两动物排毒但没有发现病毒血症。在我们先前的研究中，获得抗HEV感染完全保护的动物百分比更高(Tsarev S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1994)；191：10198-202)，可用如下事实解释：在先前的研究中，我们同时使用1,000和10,000 MID₅₀的攻击病毒剂量，但在这次的研究中，我们只使用了高剂量。因为灵长类动物具有剂量依赖性HEV感染应答(Tsarev SA等，戊肝预防的前景：肠道传染肝炎病毒(Y.Buisson，P.Coursaget，M.Kane编辑)。La Simmarre，Joueles-Tours，France，(1996)p.373-383)，所以选用高剂量来确保非接种动物都发生明显的肝炎。

这次和先前的研究表明：所有空白和接种灵长类动物血清中的病毒效价都高于粪便中的效价(平均约10,000倍)，无一例外。这一结果符合HEV经粪-口途径传递这一事实。在所有接种动物中都发现病毒血症和排毒水平比空白动物降低。然而在多数情况下，所有接种灵长类动物的病毒血症持续时间虽然较短，但与空白动物相比并没有明显降低。在数十个被测动物中，病毒血症总是与HEV排入粪便相并行。所以，可用血清样品作为病毒感染的主要指标反映HEV感染水平。这是一个重要的发现，因为血清样品通常比粪便样品更易得到。

                          实施例19

               纯化HEV ORF2蛋白产物的其它方法

以下纯化程序时不同于本申请前文所述纯化方法的另一种实施方式：

分别从澄清的杆状病毒感染细胞裂解液和培养基清液中纯化重组HEV ORF2蛋白。细胞裂解原液用上样缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM NaCl)1∶10稀释。

澄清的感染细胞清液在Amicon Proflux M-12超滤系统上，用螺旋环绕纤维素超滤柱(S1Y10；1平方英寸；截留分子量10,000；Amicon，Beverly，MA)，循环速度4L/分钟，跨膜压力20psi，切向流超滤浓缩10倍。用4体积上样缓冲液透析浓缩清液。

透析液或裂解原液(1.5床层体积)上样在Q琼脂糖快速强离子交换柱(XK50柱，5.0×7.5cm，150ml；Pharmacia Piscataway，NJ)上，流速为10.0ml/min。先用1.0床层体积上样缓冲液以10.0ml/min流速洗柱，接着用1.0床层体积上样缓冲液以20ml/min流速洗柱。用10至300mM NaCl连续线性梯度的7.5床层体积相同缓冲液，20ml/min流速洗脱蛋白质。

取10μl Q琼脂糖层析(Pharmacia Piscataway，NJ)柱峰蛋白流份用SDS-PAGE鉴定是否HEV ORF2(+)蛋白流份。合并(+)流份，用琼脂糖G-25(Pharmacia)和上样缓冲液凝胶过滤脱盐。收集峰蛋白流份，上样在Source 15Q高效强离子交换柱上离析各HEV ORF2多肽。用与Q琼脂糖液体层析相同的方法洗柱和洗脱。如前所述合并HEV ORF2蛋白(+)流份进行鉴定，合并，在Superdex 75柱(Pharmacia)上用磷酸盐缓冲液(pH6.8)进行凝胶过滤最后纯化蛋白质。用SDS-PAGE和Western印迹试验鉴定HEV ORF2流份。

由此纯化的HEV ORF2蛋白适合配制HEV疫苗，用于I期和II期临床研究。

                     序列表(1) 一般信息：

(i)    申请人：美国政府健康及人类服务部

(ii)   发明名称：戊肝巴基斯坦毒株的重组蛋白及其在诊断方法和疫苗中的用途

(iii)  序列数目：111

(iv)   通信地址：

       (A)  收件人：MORGAN & FINNEGAN

       (B)  街道：345 PARK AVENUE

       (C)  城市：纽约

       (D)  州：纽约州

       (E)  国家：USA

       (F)  邮编：10154

(v)    计算机可读形式：

       (A)  记录介质类型：软盘

       (B)  计算机：IBM PC兼容型

       (C)  操作系统：PC-DOS/MS-DOS

       (D)  软件：WORDPERFECT 5.1

(vi)   本申请资料：

       (A)  申请号：

       (B)  申请日：09-APR-1998

       (C)  分类

(vii)  在先申请资料：

       (A)  申请号：08/840,316

       (B)  申请日：11-APR-1997

       (C)  分类：

(viii) 律师/代理人信息：

       (A)  姓名：Richard W.Bork

       (B)  登记号：36,459

       (C)  参考/案卷号：2026-4255PC

(ix)   通讯信息：

       (A)  电话：(212)758-4800

       (B)  电传：(212)751-6849(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：1693氨基酸残基

       (B)  类型：氨基酸

       (C)  链型：未知

       (D)  拓扑结构：未知

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：1：Met Glu Ala His Gln Phe Ile Lys Ala Pro Gly Ile Thr Thr Ala1               5                   10                  15Ile Glu Gln Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asn Ser Ala Leu Ala Asn

            20                  25                  30Ala Val Val Val Arg Pro Phe Leu Ser His Gln Gln Ile Glu Ile

            35                  40                  45Leu Ile Asn Leu Met Gln Pro Arg Gln Leu Val Phe Arg Pro Glu

            50                  55                  60Val Phe Trp Asn His Pro Ile Gln Arg Val Ile His Asn Glu Leu

            65                  70                  75Glu Leu Tyr Cys Arg Ala Arg Ser Gly Arg Cys Leu Glu Ile Gly

            80                  85                  90Ala His Pro Arg Ser Ile Asn Asp Asn Pro Asn Val Val His Arg

            95                  100                 105Cys Phe Leu Arg Pro Ala Gly Arg Asp Val Gln Arg Trp Tyr Thr

            110                 115                 120Ala Pro Thr Arg G1y Pro Ala Ala Asn Cys Arg Arg Ser Ala Leu

            125                 130                 135Arg Gly Leu Pro Ala Ala Asp Arg Thr Tyr Cys Phe Asp Gly Phe

            140                 145                 150Ser Gly Cys Asn Phe Pro Ala Glu Thr Gly Ile Ala Leu Tyr Ser

            155                 160                 165Leu His Asp Met Ser Pro Ser Asp Val Ala Glu Ala Met Phe Arg

            170                 175                 180His Gly Met Thr Arg Leu Tyr Ala Ala Leu His Leu Pro Pro Glu

            185                 190                 195Val Leu Leu Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Thr Ala Ser Tyr Leu Leu

            200                 205                 210Ile His Asp Gly Arg Arg Val Val Val Thr Tyr Glu Gly Asp Thr

            215                 220                 225Ser Ala Gly Tyr Asn His Asp Val Ser Asn Leu Arg Ser Trp Ile

            230                 235                 240Arg Thr Thr Lys Val Thr Gly Asp His Pro Leu Val Ile Glu Arg

            245                 250                 255Val Arg Ala Ile Gly Cys His Phe Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala

            260                 265                 270Pro Glu Pro Ser Pro Met Pro Tyr Val Pro Tyr Pro Arg Ser Thr

            275                 280                 285Glu Val Tyr Val Arg Ser Ile Phe Gly Pro Gly Gly Thr Pro Ser

            290                 295                 300Leu Phe Pro Thr Ser Cys Ser Thr Lys Ser Thr Phe His Ala Val

            305                 310                 315Pro Ala His Ile Trp Asp Arg Leu Met Leu Phe Gly Ala Thr Leu

            320                 325                 330Asp Asp Gln Ala Phe Cys Cys Ser Arg Leu Met Thr Tyr Leu Arg

            335                 340                 345Gly Ile Ser Tyr Lys Val Thr Val Gly Thr Leu Val Ala Asn Glu

            350                 355                 360Gly Trp Asn Ala Ser Glu Asp Ala Leu Thr Ala Val Ile Thr Ala

            365                 370                 375Ala Tyr Leu Thr Ile Cys His Gln Arg Tyr Leu Arg Thr Gln Ala

            380                 385                 390Ile Ser Lys Gly Met Arg Arg Leu Glu Arg Glu His Ala Gln Lys

            395                 400                 405Phe Ile Thr Arg Leu Tyr Ser Trp Leu Phe Glu Lys Ser Gly Arg

            410                 415                 420Asp Tyr Ile Pro Gly Arg Gln Leu Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Arg

            425                 430                 435Arg Trp Leu Ser Ala Gly Phe His Leu Asp Pro Arg Val Leu Val

            440                 445                 450Phe Asp Glu Ser Ala Pro Cys His Cys Arg Thr Ala Ile Arg Lys

            455                 460                 465Ala Val Ser Lys Phe Cys Cys Phe Met Lys Trp Leu Gly Gln Glu

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            485                 490                 495Gly His Asp Ash Glu Ala Tyr Glu Gly Ser Asp Val Asp Pro Ala

            500                 505                 510Glu Ser Ala Ile Ser Asp Ile Ser Gly Ser Tyr Val Val Pro Gly

            515                 520                 525Thr Ala Leu Gln Pro Leu Tyr Gln Ala Leu Asp Leu Pro Ala Glu

            530                 535                 540Ile Val Ala Arg Ala Gly Arg Leu Thr Ala Thr Val Lys Val Ser

            545                 550                 555Gln Val Asp Gly Arg Ile Asp Cys Glu Thr Leu Leu Gly Asn Lys

            560                 565                 570Thr Phe Arg Thr Ser Phe Val Asp Gly Ala Val Leu Glu Thr Asn

            575                 580                 585Gly Pro Glu Arg His Asn Leu Ser Phe Asp Ala Ser Gln Ser Thr

            590                 595                 600Met Ala Ala Gly Pro Phe Ser Leu Thr Tyr Ala Ala Ser Ala Ala

            605                 610                 615Gly Leu Glu Val Arg Tyr Val Ala Ala Gly Leu Asp His Arg Ala

            620                 625                 630Val Phe Ala Pro Gly Val Ser Pro Arg Ser Ala Pro Gly Glu Val

            635                 640                 645Thr Ala Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Arg Phe Asn Arg Glu Ala Gln

            650                 655                 660Arg Leu Ser Leu Thr Gly Asn Phe Trp Phe His Pro Glu Gly Leu

            665                 670                 675Leu Gly Pro Phe Ala Pro Phe Ser Pro Gly His Val Trp Glu Ser

            680                 685                 690Ala Asn Pro Phe Cys Gly Glu Ser Thr Leu Tyr Thr Arg Thr Trp

            695                 700                 705Ser Glu Val Asp Ala Val Pro Ser Pro Ala Gln Pro Asp Leu Gly

            710                 715                 720Phe Thr Ser Glu Pro Ser Ile Pro Ser Arg Ala Ala Thr Pro Thr

            725                 730                 735Pro Ala Ala Pro Leu Pro Pro Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Thr

            740                 745                 750Leu Ser Ala Pro Ala Arg Gly Glu Pro Ala Pro Gly Ala Thr Ala

            755                 760                 765Arg Ala Pro Ala Ile Thr His Gln Thr Ala Arg His Arg Arg Leu

            770                 775                 780Leu Phe Thr Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Val Phe Ala Gly Ser Leu

            785                 790                 795Phe Glu Ser Thr Cys Thr Trp Leu Val Asn Ala Ser Asn Val Asp

            800                 805                 810His Arg Pro Gly Gly Gly Leu Cys His Ala Phe Tyr Gln Arg Tyr

            815                 820                 825Pro Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ser Phe Val Met Arg Asp Gly Ala

            830                 835                 840Ala Ala Tyr Thr Leu Thr Pro Arg Pro Ile Ile His Ala Val Ala

            845                 850                 855Pro Asp Tyr Arg Leu Glu His Ash Pro Lys Arg Leu Glu Ala Ala

            860                 865                 870Tyr Arg Glu Thr Cys Ser Arg Leu Gly Thr Ala Ala Tyr Pro Leu

            875                 880                 885Leu Gly Thr Gly Ile Tyr Gln Val Pro Ile Gly Pro Ser Phe Asp

            890                 895                 900Ala Trp Glu Arg Asn His Arg Pro Gly Asp Glu Leu Tyr Leu Pro

            905                 910                 915Glu Leu Ala Ala Arg Trp Phe Glu Ala Asn Arg Pro Thr Cys Pro

            920                 925                 930Thr Leu Thr Ile Thr Glu Asp Val Ala Arg Thr Ala Asn Leu Ala

            935                 940                 945Ile Glu Leu Asp Ser Ala Thr Asp Val Gly Arg Ala Cys Ala Gly

            950                 955                 960Cys Arg Val Thr Pro Gly Val Val Gln Tyr Gln Phe Thr Ala Gly

            965                 970                 975Val Pro Gly Ser Gly Lys Ser Arg Ser Ile Thr GIn Ala Asp Val

            980                 985                 990Asp Val Val Val Val Pro Thr Arg Glu Leu Arg Asn Ala Trp Arg

            995                 1000                1005Arg Arg Gly Phe Ala Ala Phe Thr Pro His Thr Ala Ala Arg Val

            1010                1015                1020Thr Gln Gly Arg Arg Val Val Ile Asp Glu Ala Pro Ser Leu Pro

            1025                1030                1035Pro His Leu Leu Leu Leu His Met Gln Arg Ala Ala Thr Val His

            1040                104                 1050Leu Leu Gly Asp Pro Asn Gln Ile Pro Ala Ile Asp Phe Glu His

            1055                1060                1065Ala Gly Leu Val Pro Ala Ile Arg Pro Asp Leu Ala Pro Thr Ser

            1070                1075                1080Trp Trp His Val Thr His Arg Cys Pro Ala Asp Val Cys Glu Leu

            1085                1090                1095Ile Arg Gly Ala Tyr Pro Met Ile Gln Thr Thr Ser Arg Val Leu

            1100                1105                1110Arg Ser Leu Phe Trp Gly Glu Pro Ala Val Gly Gln Lys Leu Val

            1115                1120                1125Phe Thr Gln Ala Ala Lys Ala Ala Ash Pro Gly Ser Val Thr Val

            1130                1135                1140His Glu Ala Gln Gly Ala Thr Tyr Thr Glu Thr Thr Ile Ile Ala

            1145                1150                1155Thr Ala Asp Ala Arg Gly Leu Ile Gln Ser Ser Arg Ala His Ala

            1160                1165                1170Ile Val Ala Leu Thr Arg His Thr Glu Lys Cys Val Ile Ile Asp

            1175                1180                1185Ala Pro Gly Leu Leu Arg Glu Val Gly Ile Ser Asp Ala Ile Val

            1190                1195                1200Asn Asn Phe Phe Leu Ala Gly Gly Glu Ile Gly His Gln Arg Pro

            1205                1210                1215Ser Val Ile Pro Arg Gly Asn Pro Asp Ala Asn Val Asp Thr Leu

            1220                1225                1230Ala Ala Phe Pro Pro Ser Cys Glu Ile Ser Ala Phe His Glu Leu

            1235                1240                1245Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Pro Ala Pro Val Ala Ala Val Leu

            1250                1255                1260Pro Pro Cys Pro Glu Leu Glu Gln Gly Leu Leu Tyr Leu Pro Gln

            1265                1270                1275Glu Leu Thr Thr Cys Asp Ser Val Val Thr Phe Glu Leu Thr Asp

            1280                1285                1290Ile Val His Cys Arg Met Ala Ala Pro Ser Gln Arg Lys Ala Val

            1295                1300                1305Leu Ser Thr Leu Val Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Thr Lys Leu Tyr

            1310                131                 1320Asn Ala Ser His Ser Asp Val Arg Asp Ser Leu Ala Arg Phe Ile

            1325                1330                1335Pro Ala Ile Gly Pro Val Gln Val Thr Thr Cys Glu Leu Tyr Glu

            1340                1345                1350Leu Glu Glu Ala Met Val Glu Lys Gly Gln Asp Gly Ser Ala Val

            1355                1360                1365Leu Glu Leu Asp Leu Cys Ser Arg Asp Val Ser Arg Ile Thr Phe

            1370                1375                1380Phe Gln Lys Asp Cys Ash Lys Phe Thr Thr Gly Glu Thr Ile Ala

            1385                1390                1395His Gly Lys Val Gly Gln Gly Ile Ser Ala Trp Ser Lys Thr Phe

            1400                1405                1410Cys Ala Leu Phe Gly Pro Trp Phe Arg Ala Ile Glu Lys Ala Ile

            1415                1420                1425Leu Ala Leu Leu Pro Gln Gly Val Phe Tyr Gly Asp Ala Phe Asp

            1430                1435                1440Asp Thr Val Phe Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala Lys Ala Ser Met

            1445                1450                1455Val Phe Glu Asn Asp Phe Ser Glu Phe Asp Ser Thr Gln Asn Asn

            1460                1465                1470Phe Ser Leu Gly Leu Glu Cys Ala Ile Met Glu Glu Cys Gly Met

            1475                1480                1485Pro Gln Trp Leu Ile Arg Leu Tyr His Leu Ile Arg Ser Ala Trp

            1490                1495                1500Ile Leu Gln Ala Pro Lys Glu Ser Leu Arg Gly Phe Trp Lys Lys

            1505                1510                1515His Ser Gly Glu Pro Gly Thr Leu Leu Trp Asn Thr Val Trp Asn

            1520                1525                1530Met Ala Val Ile Thr His Cys Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Gln Val

            1535                1540                1545Ala Ala Phe Lys Gly Asp Asp Ser Ile Val Leu Cys Ser Glu Tyr

            1550                1555                1560Arg Gln Ser Pro G1y Ala Ala Val Leu Ile Ala Gly Cys Gly Leu

            1565                1570                1575Lys Leu Lys Val Asp Phe Arg Pro Ile Gly Leu Tyr Ala Gly Val

            1580                1585                1590Val Val Ala Pro Gly Leu Gly Ala Leu Pro Asp Val Val Arg Phe

            1595                1600                1605Ala Gly Arg Leu Thr Glu Lys Asn Trp Gly Pro Gly Pro Glu Arg

            1610                1615                1620Ala Glu Gln Leu Arg Leu Ala Val Ser Asp Phe Leu Arg Lys Leu

            1625                1630                1635Thr Asn Val Ala Gln Met Cys Val Asp Val Val Ser Arg Val Tyr

            1640                1645                1650Gly Val Ser Pro Gly Leu Val His Asn Leu Ile Glu Met Leu Gln

            1655                1660                1665Ala Val Ala Asp Gly Lys Ala His Phe Thr Glu Ser Val Lys Pro

            1670                1675                1680Val Leu Asp Leu Thr Asn Ser Ile Leu Cys Arg Val Glu

            1685                1690(2) SEQ ID NO：2的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：660氨基酸残基

       (B)  类型：氨基酸

       (C)  链型：未知

       (D)  拓扑结构：未知

(xi)   序列描述：SEQ ID N0：2：Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro1               5                   l0                  15Met Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg

            20                  25                  30Gly Arg Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg

            35                  40                  45Val Asp Ser Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn

            50                  55                  60Pro Phe Ala Pro Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg

            65                  70                  75Val Arg Gln Pro Ala Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln

            80                  85                  90Ala Gln Arg Pro Ala Ala Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala

            95                  100                 105G1y Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro

            110                 115                 120Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln

            125                 130                 135Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr Ser Ser Val Ala Thr Gly

            140                 145                 150Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu Ser Pro Leu Leu Pro

            155                 160                 165Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala Thr Glu Ala Ser

            170                 175                 180Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr Ile Arg Tyr Arg

            185                 190                 195Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile Ser Ile Ser

            200                 205                 210Phe Tyr Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met Asn

            215                 220                 225Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile

            230                 235                 240Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn

            245                 250                 255Gln Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu

            260                 265                 270Ala Thr Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val

            275                 280                 285Asn Ser Tyr Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu

            290                 295                 300Asp Phe Ala Leu Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn

            305                 310                 315Thr Asn Thr Arg Val Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg

            320                 325                 330Leu Arg Arg Gly Ala Asp Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala

            335                 340                 345Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly

            350                 355                 360Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu

            365                 370                 375Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser

            380                 385                 390Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn

            395                 400                 405Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln

            410                 415                 420Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu

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(i)    序列特征：

       (A)  长度：123氨基酸残基

       (B)  类型：氨基酸

       (C)  链型：未知

       (D)  拓扑结构：未知

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：3：Met Asn Asn Met Ser Phe Ala Ala Pro Met Gly Ser Arg Pro Cys1               5                   10                  15Ala Leu Gly Leu Phe Cys Cys Cys Ser Ser Cys Phe Cys Leu Cys

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(i)    序列特征：

       (A)  长度：7168碱基对

       (B)  类型：核酸

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(i)    序列特征：

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ACACAGATCT GAGCTACATT CGTGAG                           26(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：26碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

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(i)    序列特征：

       (A)  长度：25碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

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ACTCACTGCA GAGCACTATC GAATC                            25(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)    序列特征：

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CGGTAAACTG GTACTGCACA AC                               22(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：22碱基对

       (B)  类型：核酸

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AAGTCCCGCT CTATTACCCA AG                               22(2)SEQ ID NO：11的信息：

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ACCCACGGGT GTTGGTTTTT                                  21(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)    序列特征：

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TTCTTGGGGC AGGTAGAGAA G                                21(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)    序列特征：

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TTATTGAATT CATGTCAACG GACGTC                           26(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)    序列特征：

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AATAATTCAT GCCGTCGCTC C                                21(2)SEQ ID NO：15的信息：

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(i)    序列特征：

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(i)    序列特征：

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GATGTTGCAC GGACAGCAAA TC                               22(2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)    序列特征：

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ATCTCCGATG CAATCGTTAA TAAC                             24(2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

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TAATCCATTC TGTGGCGAGA G                                21(2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)    序列特征：

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AAGTGTGACC TTGGTCCAGT C                                21(2)SEQ ID NO：22的信息：

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TTGCTCGTGC CACAATTCGC TAC                              23(2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：23：

CATTTCACTG AGTCAGTGAA G                                21(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：24：

TAATTATAAC ACCACTGCTA G                                21(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：25：

GATTGCAATA CCCTTATCCT G                                21(2)SEQ ID NO：26的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：23碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：26：

ATTAAACCTG TATAGGGCAG AAC                              23(2)SEQ ID NO：27的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：27：

AAGTTCGATA GCCAGATTTG C                                21(2)SEQ ID NO：28的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：28：

TCATGTTGGT TGTCATAATC C                                21(2)SEQ ID NO：29的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

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       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：29：

GATGACGCAC TTCTCAGTGT G                                21(2)SEQ ID NO：30的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：19碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：30：

AGAACAACGA ACGGAGAAC                                   19(2)SEQ ID NO：31的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：31：

AGATCCCAGC CATCGACTTT G                                21(2)SEQ ID NO：32的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

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(xi)   序列描述：SEQ ID NO：32：

TAGTAGTGTA GGTGGAAATA G                                21(2)SEQ ID NO：33的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

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(xi)   序列描述：SEQ ID NO：33：

GTGTGGTTAT TCAGGATTAT G                                21(2)SEQ ID NO：34的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：34：

ACTCTGTGAC CTTGGTTAAT G                                21(2)SEQ ID NO：35的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构  线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：35：

AACTCAAGTT CGAGGGCAAA G                                21(2)  SEQ ID NO：36的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：36：

CGCTTACCCT GTTTAACCTT G                                21(2)SEQ ID NO：37的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：24碱基对

       (B)  类型：核酸

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       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：37：

ATCCCCTATA TTCATCCAAC CAAC                             24(2)SEQ ID NO：38的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：38：

CTCCTCATGT TTCTGCCTAT G                                21(2)SEQ ID NO：39的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：22碱基对

       (B)  类型：核酸

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(xi)   序列描述：SEQ ID NO：39：

GCCAGAACGA AATGGAGATA GC                               22(2)SEQ ID NO：40的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

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(xi)   序列描述：SEQ ID NO：40：

CTCAGACATA AAACCTAAGT C                                21(2)SEQ ID NO：41的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：41：

TGCCCTATAC AGGTTTAATC G                                21(2)SEQ ID NO：42的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：19碱基对

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(xi)   序列描述：SEQ ID NO：42：

ACCGGCATAT ACCAGGTGC                                   19(2)SEQ ID NO：43的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：43：

ACATGGCTCA CTCGTAAATT C                                21(2)SEQ ID NO：44的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

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(xi)   序列描述：SEQ ID NO：44：

AACATTAGAC GCGTTAACGA G                                21(2)SEQ ID NO：45的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：45：

CTCTTTTGAT GCCAGTCAGA G                                21(2)SEQ ID NO：46的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：22碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：46：

ACCTACCCGG ATGGCTCTAA GG                               22(2)SEQ ID NO：47的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：25碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：47：

TATGGGAATT CGTGCCGTCC TGAAG                            25(2)SEQ ID NO：48的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：48：

AGTGGGAGCA GTATACCAGC G                                21(2)SEQ ID NO：49的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：49：

CTGCTATTGA GCAGGCTGCT C                                21(2)SEQ ID NO：50的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：50：

GGGCCATTAG TCTCTAAAAC C                                21(2)SEQ ID NO：51的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：19碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：51：

GAGGTTTTCT GGAATCATC                                   19(2)SEQ ID NO：52的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：15碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：52：

GCATAGGTGA GACTG                                       15(2)SEQ ID NO：53的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：18碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：53：

AGTTACAGCC AGAAAACC                                    18(2)SEQ ID NO：54的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQID NO：54：

CCATGGATCC TCGGCCTATT TTGCTGTTGC TCC                   33(2)SEQ ID NO：55的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：18碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：55：

AGGCAGACCA CATATGTG                                    18(2)SEQ ID NO：56的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：20碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：56：

GGTGCACTCC TGACCAAGCC                                  20(2)SEQ ID NO：57的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：19碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：57：

ATTGGCTGCC ACTTTGTTC                                   19(2)SEQ ID NO：58的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：58：

ACCCTCATAC GTCACCACAA C                                21(2)SEQ ID NO：59的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：24碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：59：

GCGGTGGACC ACATTAGGAT TATC                             24(2)SEQ ID NO：60的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：19碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：60：

CATGATATGT CACCATCTG                                   19(2)SEQ ID NO：61的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：19碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：61：

GTCATCCATA ACGAGCTGG                                   19(2)SEQ ID NO：62的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：62：

AGCGGAATTC GAGGGGCGGC ATAAAGAACC AGG                   33(2)SEQ ID NO：63的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：36碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：63：

GCGCTGAATT CGGATCACAA GCTCAGAGGC TATGCC                36(2)SEQ ID NO：64的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：30碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：64：

GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC                       30(2)SEQ ID NO：65的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：30碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：65：

TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG                       30(2)SEQ ID NO：66的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：38碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：66：

AAATTGGATC CTGTGTCGGG TGGAATGAAT AACATGTC              38(2)SEQ ID NO：67的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：37碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：67：

ATCGGCAGAT CTGATAGAGC GGGGACTTGC CGGATCC               37(2)SEQ ID NO：68的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：28碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：68：

TACCCTGCCC GCGCCCATAC TTTTGATG                         28(2)SEQ ID NO：69的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：69：

GGCTGAGATC TGGTTCGGGT CGCCAAGAAG GTG                   33(2)SEQ ID NO：70的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：27碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：70：

TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG                          27(2)SEQ ID NO：71的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：29碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：71：

GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC                        29(2)SEQ ID NO：72的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：28碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：72：

CCGTCGGATC CCAGGGGCTG CTGTCCTG                         28(2)SEQ ID NO：73的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：31碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：73：

AAAGGAATTC AAGACCAGAG GTAGCCTCCT C                     31(2)SEQ ID NO：74的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：28碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：74：

GTTGATATGA ATTCAATAAC CTCGACGG                         28(2)SEQ ID NO：75的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：36碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：75：

TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATGAG                36(2)SEQ ID NO：76的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：26碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：76：

TCACTCGTGA ATTCCTATAC TAATAC                           26(2)SEQ ID NO：77的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：34碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：77：

TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATG                  34(2)SEQ ID NO：78的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：25碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：78：

TGATAGAGCG GGACTTGCCG GATCC                            25(2)SEQ ID NO：79的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：24碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：79：

TTGCATTAGG TTAATGAGGA TCTC                             24(2)SEQ ID NO：80的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：25碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：80：

ACCTGCTTCC TTCAGCCTGC AGAAG                            25(2)SEQ ID NO：81的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：29碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：81：

GCGGTGGATC CGCTCCCAGG CGTCAAAAC                        29(2)SEQ ID NO：82的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：29碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：82：

GGGCGGATCG AATTCGAGAC CCTTCTTGG                        29(2)SEQ ID NO：83的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：27碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：83：

AGGATGGATC CATAAGTTAC CGATCAG                          27(2)SEQ ID NO：84的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：29碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：84：

GGCTGGAATT CCTCTGAGGA CGCCCTCAC                        29(2)SEQ ID NO：85的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：27碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：85：

GCCGAAGATC TATCGGACAT AGACCTC                          27(2)SEQ ID NO：86的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：30碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：86：

CAGACGACGG ATCCCCTTGG ATATAGCCTG                       30(2)SEQ ID NO：87的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：40碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：87：

GGCCGAATTC AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG            40(2)SEQ ID NO：88的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：25碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：88：

GCAGGTGTGC CTGGATCCGG CAAGT                            25(2)SEQ ID NO：89的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：30碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：89：

GTTAGAATTC CGGCCCAGCT GTGGTAGGTC                       30(2)SEQ ID NO：90的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：24碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：90：

CCGTCCGATT GGTCTGTATG CAGG                             24(2)SEQ ID NO：91的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：22碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：91：

TACCAGTTTA CTGCAGGTGT GC                               22(2)  SEQ ID NO：92的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：22碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：92：

CAAGCCGATG TGGACGTTGT CG                               22(2)SEQ ID NO：93的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：24碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：93：

GGCGCTGGGC CTGGTCACGC CAAG                             24(2)SEQ ID NO：94的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：22碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：94：

GCAGAAACTA GTGTTGACCC AG                               22(2)SEQ ID NO：95的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：22碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：95：

TAGGTCTACG ACGTGAGGCA AC                               22(2)SEQ ID NO：96的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：96：

TACAATCTTT CAGGAAGAAG G                                21(2)SEQ ID NO：97的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：21碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：97：

CCCACACTCC TCCATAATAG C                                21(2)SEQ ID NO：98的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：24碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：98：

GATAGTGCTT TGCAGTGAGT ACCG                             24(2)SEQ ID NO：99的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：30碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：99：GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC                           30(2)SEQ ID NO：100的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：27碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：100：TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG                              27(2)SEQ ID NO：101的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：29碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：101：GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC                            29(2)SEQ ID NO：102的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：30碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：102：TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG                           30(2)SEQ ID NO：103的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：36碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：103：GCACAACCTA GGTTACTATA ACTCCCGAGT TTTACC                    36(2)SEQID NO：104的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：104：GGGTTCCCTA GGATGCGCCC TCGGCCTATT TTG                       33(2)SEQ ID NO：105的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：105：CGTGGGCCTA GGAGCGGCGG TTCCGGCGGT GGT                       33(2)SEQ ID NO：106的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：106：GCTTGGCCTA GGCAGGCCCA GCGCCCCGCC GCT                       33(2)SEQ ID NO：107的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：107：CCGCCACCTA GGGATGTTGA CTCCCGCGGC GCC                       33(2)SEQ ID NO：108的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：27碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：108：TTCGGATCCA TGGCGGTCGC TCCGGCC                              27(2)SEQ ID NO：109的信息：

(i)    序列特征：

       (A)  长度：33碱基对

       (B)  类型：核酸

       (C)  链型：单链

       (D)  拓扑结构：线性

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：109：TCAAGCTTAT CATCATAGCA CAGAGTGGGG GGC                       33(2)SEQ ID NO：110的信息

(i)    序列特征：

       (A)  长度：20氨基酸残基

       (B)  类型：氨基酸

       (C)  链型：未知

       (D)  拓扑结构：未知

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：110：Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro

              5                 10                  15Val Pro Asp Val Asp

            20(2)SEQ ID NO：111的信息

(i)    序列特征：

       (A)  长度：20氨基酸残基

       (B)  类型：氨基酸

       (C)  链型：未知

       (D)  拓扑结构：未知

(xi)   序列描述：SEQ ID NO：111：Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro

              5                  10                 15Val Pro Asp Val Asp

            20

Claims (24)

1.一种DNA分子，其序列主要由编码戊肝病毒开放读码框2蛋白第112至607位氨基酸的核苷酸构成。

2.一种DNA分子，其序列主要由编码戊肝病毒开放读码框2蛋白第112至578位氨基酸的核苷酸构成。

3.根据权利要求1所述的DNA分子，所述分子主要由编码SEQ ID NO.：2中第112至607位氨基酸的核苷酸构成。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，所述分子的序列诱变成在第578位编码异亮氨酸。

5.一种重组蛋白，主要由戊肝病毒开放读码框2蛋白第112至607位氨基酸构成。

6.一种重组蛋白，主要由戊肝病毒开放读码框2蛋白第112至578位氨基酸构成。

7.一种重组表达载体，包含权利要求1至4中任一项所述的DNA分子。

8.产生重组戊肝病毒蛋白的方法，包括：

在适合所述蛋白表达的条件下培养含有权利要求7所述表达载体的生物宿

主。

9.一种用权利要求7所述重组表达载体转化或转染的生物宿主。

10.检测生物样品中有否抗戊肝病毒抗体的方法，所述方法包括：样品接触如权利要求5或6所述的蛋白。

11.根据权利要求10所述的方法，所述的生物样品选自全血、血浆、血清、脑脊液、组织、尿液和胸液。

12.根据权利要求10所述的方法，其中检测的是IgG或IgM抗体。

13.根据权利要求10所述的方法，其中的重组HEV蛋白与固相支持物结合。

14.根据权利要求10所述的方法，其中用带标记抗体检测免疫复合物。

15.用于权利要求10所述方法的试剂盒，它包括：权利要求5或6所述的重组HEV蛋白。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括带标记的第二抗体。

17.一种药物组合物，包含权利要求5所述的蛋白质和合适的赋形剂、稀释剂或载体。

18.一种药物组合物，包含权利要求6所述的蛋白质和合适的赋形剂、稀释剂或载体。

19.预防戊肝的方法，包括给予哺乳动物有效量的权利要求17所述药物组合物，所述有效量能够刺激产生保护性抗体。

20.用于免疫哺乳动物以抗戊肝感染的疫苗，包含权利要求5所述重组蛋白和药学上认可的载体。

21.检测戊肝病毒的方法，包括将生物样品与抗权利要求5或6所述蛋白的抗体接触，与所述戊肝病毒形成免疫复合物。

22.抗HEV抗体，具有与权利要求5或6所述蛋白的特异性结合亲和性。

23.根据权利要求22所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体。

24.用于哺乳动物预防戊肝的试剂盒，它包括权利要求5所述的蛋白质。

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