CN1155407C

CN1155407C - 制备肠道传播性非甲非乙型肝炎疫苗的方法

Info

Publication number: CN1155407C
Application number: CNB991083075A
Authority: CN
Inventors: 格雷戈里・R・雷耶斯; 格雷戈里·R·雷耶斯; ・W・布雷德利; 丹尼尔·W·布雷德利
Original assignee: Genelabs Technologies Inc
Current assignee: Genelabs Technologies Inc
Priority date: 1988-06-17
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2004-06-30
Anticipated expiration: 2009-06-16
Also published as: CN1048523C; CN1245721A; CN1044955A

Abstract

公开了由肠道传播性非甲非乙型肝炎病毒因子产生的病毒蛋白。在一种具体方案中，该蛋白与存在于由肝炎病毒因子感染的个体中的抗体具免疫反应性。此蛋白可用于检测肠道传播性因子的感染的诊断方法。还公开了由病毒因子的克隆顺序产生的DNA探针。这些探针可用于鉴别完整的病毒因子及测定其顺序，及在感染样品中检测病毒因子的存在，用病毒衍生的DNA片段的探针专一性扩增法为基础。

Description

制备肠道传播性非甲非乙型肝炎疫苗的方法

本申请是申请日为1989年6月16日，申请号为89104064.1，发明名称为“肠道传播性非甲非乙型肝炎病毒因子”的发明专利申请的分案申请。

本申请是1988年6月17日提交的208,997号美国申请的后续部分，该申请被作为本文的参考文献。

技术领域

本发明涉及重组蛋白、基因和基因探针，更具体地说，涉及由肠道传播性非甲非乙型肝炎病毒因子产生的这种蛋白和探针，并涉及利用这些蛋白和探针的诊断方法和疫苗应用。

背景技术

据报导，在亚洲、非洲和印度次大陆，肠道传播性非甲非乙型(ET-NANB)肝炎病毒因子是许多流行性和零星性肝炎病例的病因。传染作用通常是通过粪便污染的水体进行，但该病毒也可通过密切的物理接触传播。此病毒似乎并不会导致慢性感染。通过用收集的粪便分离物感染志愿者，已经证实了ET-NANB病毒的病原学；免疫电镜(IEM)研究表明，来自感染个体粪便的病毒颗粒直径为27-34nm。病毒颗粒能与来自不同地理区域感染个体的血清抗体反应，这一现象提示，全球范围的ET-NANB肝炎中有大部分是由一种病毒因子或类别导致的。在由血液传播性NANB病毒感染的个体的血清中，没有观察到抗体反应，表明两种NANB型之间具有不同的特异性。

除了血清学差别以外，这两种NANB型感染还显示出各自的临床差别。ET-NANB的特征是急性感染，通常伴随有发热和关节痛，以及肝门发炎，还伴随有肝脏活体解剖样品中的胆汁阻塞(Arankalle)。症状一般在六周内消退。与此相反，血液传播性NANB在大约50％病例中都是慢性感染。很少观察到发热和关节痛，炎症则主要分布于实质细胞中(Khuroo，1980)。根据对于灵长类宿主的感染性也可区别这两种病毒因子。ET-NANB能够传染犬猴(Cynomolgusmonkeys)，但血液传播性因子不能。血液传播性因子比ET-NANB更易传染黑腥腥(Bradley，1987)。

为了鉴别和克隆与ET-NANB肝炎相关的病毒基因组顺序，在全球范围内已作出了大量努力。努力的目标之一是鉴别病毒及其蛋白产物并确定其特征，这需要有病毒特异性的基因组顺序。另一目的是生产重组病毒蛋白，它能够用于以抗体为基础的诊断法和疫苗。尽管作出了这些努力，但迄今为止，还没有成功地鉴别出与ET-NANB肝炎相关的病毒顺序，也没有鉴别或生产出任一种病毒特异性蛋白。

本文引用的相关文献如下：

Arankalle，V.A.， et al.，The Lancet，550(March 12，1988).

Bradley，D.W.， et al.， J Gen.Virol.，69：1.(1988).

Bradley，D.W. et al.，Proc. Nat.Acad.Sci.，USA，84：6277(1987).

Gravelle，C.R. et al.， J.Infect.Diseases，131：167(1975).

Kane，M.A.， et al.， JAMA，252：3140(1984).

Khuroo，M.S.， Am.J.Med.，48：818(1980).

Khuroo，M.S.， et al.， Am.J.Med.，68：818

(1983).

Maniatis，T.， et al. Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982).

Seto，B.， et al.， Lancet，11：941(1984).

Sreenivasan，M.A.m et al.， J.Gen.Virol.，65：1005(1984).

Tabor，E.， et al.， J.Infect.Dis.，140：789(1979).

发明内容

本发明提供了新的组合物、组合物的制备方法和应用，所述组合物包括来自ET-NANB病毒因子的病毒蛋白和其片段。制备ET-NANB病毒蛋白的方法包括分离ET-NANB基因组顺序，然后将其克隆并在宿主细胞中表达。所产生的重组病毒蛋白可用作诊断剂和疫苗。基因组顺序和其片段可用来制备ET-NANB病毒蛋白，并可用作病毒检测的探针。

附图说明

图1显示了用以获得克隆的ET-NANB片段和测定其顺序的载体构建和操作过程：

图2A-2B显示了Southern杂交印迹，其中，使放射性标记的ET-NANB探针与扩增的cDNA片段杂交，所述cDNA片段是用从感染的(I)和非感染的(N)胆汁来源(2A)、以及从感染的(I)和非感染的(N)粪便样品来源(2B)分离的RNA制备的。

具体实施方式

本发明提供了包括由ET-NANB病毒因子产生的一般顺序及其片段的新的组合物，以及用此基因组顺序生产的重组病毒蛋白和使用这些组合物的方法。

通过鉴定发现，ET-NANB病毒因子基因组含有一个与质粒PTZ-KF1(ET1.1)中的1.33kb DNA E coRI插段同源的区域，该质粒携于保藏号为CCTCCM89041的大肠杆菌BB4株中。在初步研究中，测定了该插段的两端区域和一个中间区域。此插段的5′端区域含有以下顺序：

1 42

GAT GGA AGG CAC TAA TCT GGC AAG ACC TGT CCC TGT TGC AGC

43 84

TGT TCT ACC ACC CTG CCC CGA GCT CGA ACA GGG CCT TCT CTA

85 126

CCT GCC CCA GGA GCT CAC ACA CCC TGT GAT AGT GTC GTA ACA

127 168

TTT GAA TTA ACA GAC ATT GTG CAC TGC CGC ATG GCC GCC CCG

169 210

AGC CAG CGC AAG GCC GTG CTG TCC ACA CTC GTG GGC CGC TAC

211

GGC.

一个中间区域具有以下顺序：

691 731

CTA GAG TGT GCT ATT ATG GAG GAG TGT GGG ATG CCG CAG TGG

733 774

CTC ATC CGC CTG TAT CAC CTT ATA AGG TCT GCG TGG ATC TTG

775 816

CAG GCC CCG AAG GAG TCT CTG CGA GGG TTT TGG AAG AAA CAC

817 858

TCC GGT GAG CCC GGC ACT CTT CTA TGG AAT ACT GTC TGG AAT

859 900

ATG GCC GTT ATT ACC CAC TGT TAT GAC TTC CGC GAT TTT CAG

901 942

GTG GCT GCC TTT AAA GGT GAT GAT TCG ATA GTG CTT TGC AGT

943 984

GAG TAT CGT CAG AGT CCA GGA GCT GCT GTC CTG ATC GCC GGC

985 1026

TGT GGC TTG AAG TTG AAG GTA GAT TTC CGC CCG ATC GGT TTG

1027

TAT.

3′端区域具有如下顺序：

1191 1232

TGA GTA GAG GAT GTT GTT TCC CGT GTT TAT GGG GTT TCC CCT

1233 1274

GGA CTC GTT CAT AAC CTG ATT GGC ATG CTA CAG GCT GTT GCT

1275 1316

GAT GGC AAG GCA CAT TTC ACT GAG TCA GTA AAA CCA GTG CTC

1317 1327

GAC CGG AAT TC.

后续的研究工作已提供了两个方向的完整顺序，这些顺序列在下面。

由于不知道基因位于哪一条链上，下面提供了两条链的顺序。然而，

一个方向的顺序已被命名为“正向”顺序，因为它与已知蛋白具有统

计学相似性。下面给出了此顺序及三种可能的翻译顺序。其中有一个

长的可译框以异亮氨酸始于核苷酸145，并延伸至顺序的末端。另外

两个解读框有许多终止密码。在下面和本说明书的其他地方，都使用核苷酸和氨基酸的标准缩写。

正向顺序

R I P P T D G R H Z S G K T C P C C S C

E F R Q L M E G T N L A R P V P V A A V

N S A N Z W K A L I W Q D L S L L Q L F

35 * * * * *

1 11 21 31 41 51

CGAATTCCGCCAACTGATGGAAGGCACTAATCTGGCAAGACCTGTCCCTGTTGCAGCTGT

S T T L P R A R T G P S L P A P G A H H

L P P C P E L E Q G L L Y L P Q E L T T

Y H P A P S S N R A F S T C P R S S P P

* * * * * *

61 71 81 91 101 111

TCTACCACCCTGCCCCGAGCTCGAACAGGGCCTTCTCTACCTGCCCCAGGAGCTCACCAC

L Z Z C R N I Z I N R H C A L P H G R P

C D S V V T F E L T D I V H C R M A A P

V I V S Z H L N Z Q T L C T A A W P P R

* * * * * *

121 131 141 151 161 171

CTGTGATAGTGTCGTAACATTTGAATTAACAGACATTGTGCACTGCCGCATGGCCGCCCC

E P A Q G R A V H T R G P L R R R T K L

S Q R K A V L S T L V G R Y G V A Q S S

A S A R P C C P H S W A A T A S H K A L

* * * * * *

181 191 201 211 221 231

GAGCCAGCGCAAGGCCGTGCTGTCCACACTCGTGGGCCGCTACGGCGTCGCACAAAGCTC

Y N A S H S D V R D S L A R F I P A I G

T M L P T L M F A T L S P V L S R P L A

Q C F P L Z C S R L S R P F Y P G H W P

* * * * * *

241 251 261 271 281 291

TACAATGCTTCCCACTCTGATGTTCGCGACTCTCTCGCCCGTTTTATCCCGGCCATTGGC

P V Q V T T C E L Y E L V E A M V E K G

P Y R L Q L V N C T S Z W R P W S R R A

R T G Y N L Z I V R A S G G H G R E G P

* * * * * *

301 311 3 21 331 341 351

CCCGTACAGGTTACAACTTGTGAATTGTACGAGCTAGTGGAGGCCATGGTCGAGAAGGGC

Q D G S A V L E L D L C N R D V S R I T

R M A P P S L S L I F A T V T C P G S P

G W L R R P Z A Z S L Q P Z R V Q D H L

* * * * * *

361 371 381 391 401 411

CAGGATGGCTCCGCCGTCCTTGAGCTTGATCTTTGCAACCGTGACGTGTCCAGGATCACC

F F Q K D C N K F T T G E T I A H G K V

S S R K I V T S S P Q V R P L P M V K W

L P E R L Z Q V H H R Z D H C P W Z S G

* * * * * *

421 431 441 451 461 471

TTCTTCCAGAAAGATTGTAACAAGTTCACCACAGGTGAGACCATTGCCCATGGTAAAGTG

G Q G I S A W S K T F C A L F G P W F R

A R A S R P G A R P S A P S L A L G S A

P G H L G L E Q D L L R P L W P L V P R

* * * * * *

481 491 501 511 521 531

GGCCAGGGCATCTCGGCCTGGAGCAAGACCTTCTGCGCCCTCTTTGGCCCTTGGTTCCGC

A I E K A I L A L L P Q G V F Y G D A F

L L R R L F W P C S L R V C F T V M P L

Y Z E G Y S G P A P S G C V L R Z C L Z

* * * * * *

541 551 561 571 581 591

GCTATTGAGAAGGCTATTCTGGCCCTGCTCCCTCAGGGTGTGTTTTACGGTGATGCCTTT

D D T V F S A A V A A A K A S M V F E N

M T P S S R R L W P Q Q R H P W C L R M

Z H R L L G G C G R S K G I H G V Z E Z

* * * * * *

601 611 621 631 641 651

GATGACACCGTCTTCTCGGCGGCTGTGGCCGCAGCAAAGGCATCCATGGTGTTTGAGAAT

D F S E F D S T Q N N F S L G L E C A I

T F L S L T P P R I T F L W V Z S V L L

L F Z V Z L H P E Z L F S G S R V C Y Y

* * * * * *

661 671 681 691 701 711

GACTTTTCTGAGTTTGACTCCACCCAGAATAACTTTTCTCTGGGTCTAGAGTGTGCTATT

M E E C G M P Q W L I R L Y H L I R S A

W R S V G C R S G S S A C I T L Z G L R

G G V W D A A V A H P P V S P Y K V C V

* * * * * *

721 731 741 751 761 771

ATGGAGGAGTGTGGGATGCCGCAGTGGCTCATCCGCCTGTATCACCTTATAAGGTCTGCG

W I L Q A P K E S L R G F W K K H S G E

G S C R P R R S L C E G F G R N T P V S

D L A G P E G V S A R V L E E T L R Z A

* * * * * *

781 791 801 811 821 831

TGGATCTTGCAGGCCCCGAAGGAGTCTCTGCGAGGGTTTTGGAAGAAACACTCCGGTGAG

P G T L L W N T V W N M A V I T H C Y D

P A L F Y G I L S G I W P L L P T V M T

R H S S M E Y C L E Y G R Y Y P L L Z L

* * * * * *

841 851 861 871 881 891

CCCGGCACTCTTCTATGGAATACTGTCTGGAATATGGCCGTTATTACCCACTGTTATGAC

F R D F Q V A A F K G D D S I V L C S E

S A I F R W L P L K V M I R Z C F A V S

P R F S G G C L Z R Z Z F D S A L Q Z V

* * * * * *

901 911 921 931 941 951

TTCCGCGATTTTCAGGTGGCTGCCTTTAAAGGTGATGATTCGATAGTGCTTTGCAGTGAG

Y R Q S P G A A V L I A G C G L K L K V

I V R V Q E L L S Z S P A V A Z S Z R Z

S S E S R S C C P D R R L W L E V E G R

* * * * * *

961 971 981 991 1001 1011

TATCGTCAGAGTCCAGGAGCTGCTGTCCTGATCGCCGGCTGTGGCTTGAAGTTGAAGGTA

D F R P I G L Y A G V V V A P G L G A L

I S A R S V C M Q V L W W P P A L A R S

F P P D R F V C R C C G G P R P W R A P

* * * * * *

1021 1031 1041 1051 1061 1071

GATTTCCGCCCGATCGGTTTGTATGCAGGTGTTGTGGTGGCCCCCGGCCTTGGCGCGCTC

P D V V R F A G R L T E K N W G P G P E

L M L C A S P A G L P R R I G A L A L S

Z C C A L R R P A Y R E E L G P W P Z A

* * * * * *

1081 1091 1101 1111 1121 1131

CCTGATGTTGTGCGCTTCGCCGGCCGGCTTACCGAGAAGAATTGGGGCCCTGGCCCTGAG

R A E Q L R L A V S D F L R K L T N V A

G R S S S A S L L V I S S A S S R M Z L

G G A A P P R C Z Z F P P Q A H E C S S

* * * * * *

1141 1151 1161 1171 1181 1191

CGGGCGGAGCAGCTCCGCCTCGCTGTTAGTGATTTCCTCCGCAAGCTCACGAATGTAGCT

Q M C V D V V S R V Y G V S P G L V H N

R C V W M L F P V F M G F P L D S F I T

D V C G C C F P C L W G F P W T R S Z P

* * * * * *

1201 1211 1221 1231 1241 1251

CAGATGTGTGTGGATGTTGTTTCCCGTGTTTATGGGGTTTCCCCTGGACTCGTTCATAAC

L I G M L Q A V A D G K A H F T E S V K

Z L A C Y R L L L M A R H I S L S Q Z N

D W H A T G C C Z W Q G T F H Z V S K T

* * * * * *

1261 1271 1281 1291 1301 1311CTGATTGGCATGCTACAGGCTGTTGCTGATGGCAAGGCACATTTCACTGAGTCAGTAAAA

P V L D R N S S

Q C S T G I R

S A R P E F E

* * *

1321 1331 1341

CCAGTGCTCGACCGGAATTCGAGC

互补顺序在这儿被称为“反向顺序”，下面以与正向顺序相同的方式给出此顺序。在此反向顺序中，可看到有好几个可译框，它们都短于存在于正向顺序中的长的可译框。

反向顺序

A R I P V E H W F Y Z L S E M C L A I S

L E F R S S T G F T D S V K C A L P S A

S N S G R A L V L L T Q Z N V P C H Q Q

* * * * * *

1 11 21 31 41 51

GCTCGAATTCCGGTCGAGCACTGGTTTTACTGACTCAGTGAAATGTGCCTTGCCATCAGC

N S L Z H A N Q V M N E S R G N P I N T

T A C S M P I R L Z T S P G E T P Z T R

Q P V A C Q S G Y E R V Q G K P H K H G

* * * * * *

61 71 81 91 101 111

AACAGCCTGTAGCATGCCAATCAGGTTATGAACGAGTCCAGGGGAAACCCCATAAACACG

G N N I H T H L S Y I R E L A E E I T N

E T T S T H I Z A T F V S L R R K S L T

K Q H P H T S E L H S Z A C G G N H Z Q

* * * * * *

121 131 141 151 161 171

GGAAACAACATCCACACACATCTGAGCTACATTCGTGAGCTTGCGGAGGAAATCACTAAC

S E A E L L R P L R A R A P I L L G K P

A R R S C S A R S G P G P Q F F S V S R

R G G A A P P A Q G Q G P N S S R Z A G

* * * * * *

181 191 201 211 221 231

AGCGAGGCGGAGCTGCTCCGCCCGCTCAGGGCCAGGGCCCCAATTCTTCTCGGTAAGCCG

A G E A H N I R E R A K A G G H H N T C

P A K R T T S G S A P R P G A T T T P A

R R S A Q H Q G A R Q G R G P P Q H L H

* * * * * *

241 251 261 271 281 291

GCCGGCGAAGCGCACAACATCAGGGAGCGCGCCAAGGCCGGGGGCCACCACAACACCTGC

I Q T D R A E I Y L Q L Q A T A G D Q D

Y K P I G R K S T F N F K P Q P A I R T

T N R S G G N L P S T S S H S R R S G Q

* * * * * *

301 311 321 331 341 351

ATACAAACCGATCGGGCGGAAATCTACCTTCAACTTCAAGCCACAGCCGGCGATCAGGAC

S S S W T L T I L T A K H Y R I I T F K

A A P G L Z R Y S L Q S T I E S S P L K

Q L L D S D D T H C K A L S N H H L Z R

* * * * * *

361 371 381 391 401 411

AGCAGCTCCTGGACTCTGACGATACTCACTGCAAAGCACTATCGAATCATCACCTTTAAA

G S H L K I A E V I T V G N N G H I P D

A A T Z K S R K S Z Q W V I T A I F Q T

Q P P E N R G S H N S G Z Z R P Y S R Q

* * * * * *

421 431 441 451 461 471

GGCAGCCACCTGAAAATCGCGGAAGTCATAACAGTGGGTAATAACGGCCATATTCCAGAC

S I P Z K S A G L T G V F L P K P S Q R

V F H R R V P G S P E C F F Q N P R R D

Y S I E E C R A H R S V S S K T L A E T

* * * * * *

481 491 501 511 521 531

AGTATTCCATAGAAGAGTGCCGGGCTCACCGGAGTGTTTCTTCCAAAACCCTCGCAGAGA

L L R G L Q D P R R P Y K V I Q A D E P

S F G A C K I H A D L I R Z Y R R M S H

P S G P A R S T Q T L Z G D T G G Z A T

* * * * * *

541 551 561 571 581 591

CTCCTTCGGGGCCTGCAAGATCCACGCAGACCTTATAAGGTGATACAGGCGGATGAGCCA

L R H P T L L H N S T L Z T Q R K V I L

C G I P H S S I I A H S R P R E K L F W

A A S H T P P Z Z H T L D P E K S Y S G

* * * * * *

601 611 621 631 641 651

CTGCGGCATCCCACACTCCTCCATAATAGCACACTCTAGACCCAGAGAAAAGTTATTCTG

G G V K L R K V I L K H H G C L C C G H

V E S N S E K S F S N T M D A F A A A T

W S Q T Q K S H S Q T P W M P L L R P Q

* * * * * *

661 671 681 691 701 711

GGTGGAGTCAAACTCAGAAAAGTCATTCTCAAACACCATGGATGCCTTTGCTGCGGCCAC

S R R E D G V I K G I T V K H T L R E Q

A A E K T V S S K A S P Z N T P Z G S R

P P R R R C H Q R H H R K T H P E G A G

* * * * * *

721 731 741 751 761 771

AGCCGCCGAGAAGACGGTGTCATCAAAGGCATCACCGTAAAACACACCCTGAGGGAGCAG

G Q N S L L N S A E P R A K E G A E G L

A R I A F S I A R N Q G P K R A Q K V L

P E Z P S Q Z R G T K G Q R G R R R S C

* * * * * *

781 791 801 811 821 831

GGCCAGAATAGCCTTCTCAATAGCGCGGAACCAAGGGCCAAAGAGGGCGCAGAAGGTCTT

A P G R D A L A H F T M G N G L T C G E

L Q A E M P W P T L P W A M V S P V V N

S R P R C P G P L Y H G Q W S H L W Z T

* * * * * *

841 851 861 871 881 891

GCTCCAGGCCGAGATGCCCTGGCCCACTTTACCATGGGCAATGGTCTCACCTGTGGTGAA

L V T I F L E E G D P G H V T V A K I K

L L Q S F W K K V I L D T S R L Q R S S

C Y N L S G R R Z S W T R H G C K D Q A

* * * * * *

901 911 921 931 941 951

CTTGTTACAATCTTTCTGGAAGAAGGTGATCCTGGACACGTCACGGTTGCAAAGATCAAG

L K D G G A I L A L L D H G L H Z L V Q

S R T A E P S W P F S T M A S T S S Y N

Q G R R S H P G P S R P W P P L A R T I

* * * * * *

961 971 981 991 1001 1011

CTCAAGGACGGCGGAGCCATCCTGGCCCTTCTCGACCATGGCCTCCACTAGCTCGTACAA

F T S C N L Y G A N G R D K T G E R V A

S Q V V T C T G P M A G I K R A R E S R

H K L Z P V R G Q W P G Z N G R E S R E

* * * * * *

1021 1031 1041 1051 1061 1071

TTCACAAGTTGTAACCTGTACGGGGCCAATGGCCGGGATAAAACGGGCGAGAGAGTCGCG

N I R V G S I V E L C A T P Z R P T S V

T S E W E A L Z S F V R R R S G P R V W

H Q S G K H C R A L C D A V A A H E C G

* * * * * *

1081 1091 1101 1111 1121 1131

AACATCAGAGTGGGAAGCATTGTAGAGCTTTGTGCGACGCCGTAGCGGCCCACGAGTGTG

D S T A L R W L G A A M R Q C T M S V N

T A R P C A G S G R P C G S A Q C L L I

Q H G L A L A R G G H A A V H N V C Z F

* * * * * *

1141 1151 1161 1171 1181 1191

GACAGCACGGCCTTGCGCTGGCTCGGGGCGGCCATGCGGCAGTGCACAATGTCTGTTAAT

S N V T T L S Q V V S S W G R Z R R P C

Q M L R E Y H R W Z A P G A G R E G P V

K C Y D T I T G G E L L G Q V E K A L F

* * * * * *

1201 1211 1221 1231 1241 1251

TCAAATGTTACGACACTATCACAGGTGGTGAGCTCCTGGGGCAGGTAGAGAAGGCCCTGT

S S S G Q G G R T A A T G T G L A R L V

R A R G R V V E Q L Q Q G Q V L P D Z C

E L G A G W Z N S C N R D R S C Q I S A

* * * * * *

1261 1271 1281 1291 1301 1311

TCGAGCTCGGGGCAGGGTGGTAGAACAGCTGCAACAGGGACAGGTCTTGCCAGATTAGTG

P S I S W R N S

L P S V G G I

F H Q L A E F

* * *

1321 1331 1341

CCTTCCATCAGTTGGCGGAATTCG

通过分析由缅甸分离的病毒株的相应顺序，已经证实了此顺序与病原因子中的顺序的一致性。缅甸人的分离物中含有下列顺序，它含有ET1.1顺序中除了最前面37碱基对的核苷酸顺序，并被克隆伪迹所搅乱。此顺序是除去了克隆伪迹的正确顺序。

CCGTTGTTCAGTACCAGTTTACTGCAGGTGTGCCTGGATCCGGCAAGTGC

CGCTCTATCACCCAAGCCGATGTGGACGTTGTCGTGGTCCCGACGCGTGA 100

GTTGCGTAATGCCTGGCGCCGTCTCGCGCTTTGCTGCTTTACCCCGCATA

CTGCCGCCAGAGTCACCCAGGGCCGCCGGGTTGTCATTGATGAGGCTCCA 200

TCCCTCCCCCCTCACCTGCTGCTGCTCCACATGCAGCGGGCCGCCACCGT

CCACCTTCTTGGCGCCCCGAACCAGATCCCAGCCATCGACTTTGAGCACG 300

CTGGGCTCGTCCCCGCCATCAGGCCCGACTTAGCCCCACCTCCTGGTGGC

ATGTTACCCATCGCTGCCTGCGGATGTATGCGAGCTCATCCGTGGTGCAT 400

ACCCCATGATCCAGACCACTAGCCGGGTTCTCCGTTCGTTCTTCTGGGCT

GACCCTGCCGTCGGGCAGAAACTAGTGTTCACCCAGGCGGCCAACCCCGC 500

CAACCCCGGCTCAGTGACGGTCCACGACGCGCAGGGCGCTACCTACACGG

AGACCACTATTATTGCCACAGCACATGCCCGCGGCCTTATTCAGTCGTCT 600

CGGGCTCATGCCATTGTTGCTCTGACDCGCCACACTGAGAAGTCCGTCAT

CATTGACGCACCAGGCCTGCTTCGCGACCTGCGCATCTCCGATGCAATCG 700

TTAATAACTTTTTCCTCGCTGGTGGCGAAATTGGTCACCAGCGCCCATCA

GTTATTCCCCGTGGCAACCCTGACGCCAATGTTGACACCCTGGCTGCCTT 800

CCCGCCGTCTTGCCAGATTAGTGCCTTCCATCAGTTGGCTGAGGAGCTTG

GCCACAGACCTGTCCCTGTTGCAGCTGTTCTACCACCCTGCCCCGAGCTC 900

GAACAGGGCCTTCTCTACCTGCCCCAGGAGCTCACACCACCTGTGATAGT

GTCCTAACATTTGAATTAACAGACATTGTGCACTGCCGCATGGCCGCCCC 1000

GAGCCAGCGCAAGGCCGTGCTGTCCACACTCGTGGGCCGCTACGGCGTCG

CACAAAGCTCTACAATGCTTCCCACTCTCATGTTCGCGACTCTCTCATCC 1100

CCGGATTGGCCCGGATTGCCCCCGTACACGTTACAACTTCTGAATTGTAG

GAGCTAGTGGAGGCCATGGTCGAGAAGGGCCAGGATCTGCCGCCGTCCTT 1200

GAGCTTCATCTTTGCAACCGTGACGTGTCCAGGATCACCTTCTTCCAGAA

AGATTGTAACAAGTTCACCACAGGTGAGACCATTGCCCATGGTAAAGTGG 1300

GCCAGGGCATCTCGGCCTGGAGCAAGACCTTCTGCGCCCTCTTTGGCCCT

TGGTTCCGCGCTATTGAGAAGGCTATTCTGGCCCTGCTCCCTCAGGGTGT 1400

GTTTTACGGTGATGCCTTTGATGACACCGTCTTCTCGGCGGCTGTCGAGG

CCAAAGGCATCCATGGTGTTTGAGAATGCATTTTCTGAGTTTGACTCCAC 1500

CCAGAATAACTTTTCTCTGGGTCTAGAGTGTGCTATTATGGAGGAGTGTC

GGGATGCCGCAGTGGCTCATCCGCCTGTATCACCTTATAAGGTCTGCGTG 1600

GATCTTGCAGGCCCCGAAGGAGTCTCTGCGAGGGTTTTGGAAGAAACACT

CCGGTGAGCCCGGCACTCTTCTATGGAATACTGTCTGGAATATGGCCGTT 1700

ATTACCCACTGTTATGACTTCCGCGATTTTCAGGTGGCTGCCTTTAAAGG

TGATGATTCGATAGTGCTTTGCAGTGAGTATCGTCAGAGTCCAGGAGCTG 1800

CTGTCCTGATCGCCGGCTGTGGCTTGAAGTTGAAGGTAGATTTCCGCCCG

ATCGGTTTGTATGCAGGTGTTGTGGTGGCCCCCGCCCTTGGCCCGCTCCC 1900

TGATGTTGTGCCGTTCGCCGGCCGGCTTACCGAGAAGAATTGGCCCTGGC

CTGAGCGGCGAAGACACGTGCGCTCGCTGTTGTTAGTGATTTCCTCCGCA 2000

AGCTCACGAATGTAGCTCAGAGTGTGTGGATGTTGTTTCCCGTGTTTATG

GGGTTTCCCCTGGACTCGTTCATAACCTGATTGGCATGCTACAGGCTGTT 2100

GCTGATGGCAAGGCACATTTCACTGAGTCAGTAAAACCAGTGCTCCACTT

GACAAATTCAATCTTGTGTCGGGTGGAATGAATAACATGTCTTTTGCTGC 2200

GCCCATGGGTTCGCGACCATGCCCCTCGGCCTATTTTGTTGCTGCTCCTC

ATGTTTTTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCGGTCAGCCGTCTCGCCG 2300

CCGTCGTGGGCGGCGCAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACC

GGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCAATCCCCTATATTCATCCAACCAACCCC 2400

TTCGCCCCCGATGTCACCGCTGCGGCCGGGGCTGGACCTCGTGTTCGCCA

ACCCGCCCGACCACTCGGCTCCGCTTGGCGTGACCAGGCCCAGCGCCCCG 2500

CCCTTGCCTCACGTCGTAGACCGACCACAGCTGGGGCCGCGCCGCTAACC

GCGGTCGCTCCGGCCCCG 2568

本文所述的方法能够从其他的NANB肝炎病毒株中分离和鉴别遗传物质，这一点已通过鉴别由墨西哥得到的分离物中的遗传物质而得到证实。此分离物的顺序中有大约75％与前面列出的ET1.1顺序一致。此顺序是利用下面第II.3节给出的条件通过杂交鉴别的。下面列出了由1304核苷酸组成的部分cDNA顺序。

GCGGCCGCTCGGCAAAAGAGGCCTAGGGCGCATGGTGGCGAACCCATGGG

CGCACGAAACCACATGTTATTCATTCAGACCGGTGCATAATTGAGTGTGT 100

AAGGTCAAGTATAGGCTTAACAGACTCTGTAAAATGCGCCTTACCATCAC

CAATAGTCTGGAGCATGCCTATCAGGTTATGAACCAGACCCGGGGAAACC 200

CCGTAAACTCTAGACACCACCTCAACACAAATCTGGGCCACATTCGTTAA

CCTACGGAGGAAATCCTGCACGGCGAGGCGGACGTGCTCTGCCCGCTCCG 300

GATCAGGCCCCCAGTTCTTCTCCGAAAGCCGTCCGGCGAATCGAAGGACA

TCGGGTAGGGCCCCGAGCCCGGGGCGACGACAACCCCGGCATACAGCCCA 400

ATCGGCCGGAAGTCAGCCTTCAACTTCGGGCCACAGCCTGCTATAAGCGA

ACCGGCGCCTGGGCTCTGGCGGTATTCACTACAGAAAGCAACCGACCCAG 500

TCGTCCCCCTTGAAGGCGGCAACCTGGAGGTCCCGGAACTCATAGCAATG

GGCAATGATTGCCATGTTCCACACCGTATTCCAGAGCAACGTGCCCGGCT 600

CACCAGAATGCTTGTTCCAGAACCCTCTCAAAGACTCTTTTGGGGCCTGC

AGGGATCCACGCCGACCGGACGGCATGGTACAACCTGACAAGCCACTGGG 700

GCATACCACACTCTTCCATAATGGCGCACTCAAGACCTAGGGAAAAGTTA

TTCTGAGTCGAGTCAAACTCAGAAAAATCATTTTCAAACACCATGGCATG 800

GCTGGCGCCAGCCACGGCAGCAGAGAATACTGAGTCGTCATAAGCATCCC

CGTAGAACACAGCTTGTGGTAAAAGGGATAGAATAGCCTTCTCAATCGCA 900

CGGAACCAGGGGCCAAACAGGGCACAAAAGGTCTTACTCCAGGCGGAGAT

ACCCTGACCGACTTTGCCATGCGCAATTGTCTCGCCGGTCGTGAACTTGT 1000

TACAATCCTTCTGGAAAAAGGTTATGCGGGAGACATCTCGGCTGCACAAA

TCCAACTCGAGGACGGCTGAACCGTCTTGGCCCTTCTCGACCATCGCCTC 1100

TACAAGCTCAAAGAGTTCACAGGTGGTGGCAGTAACCCGCCGAGAGTGGG

AATAAAGCGCGCAAGGGAGGCGCGGACATCCGTGTGACCCGCATCATAAA 1200

GCCTTGTGCGTCTGCCATACCCGCCTACCACCATGACAAAACAGCTTTCC

TTTGGCTAGGGGCCGCCATGGGCCTGACAACTGTCAGTTAGCTCAAATGT 1300

CACA 1304

分子遗传学领域的专业人员将认识到，上面两个顺序都公开了相应的互补DNA顺序，以及相应于所示的两个主要顺序及互补DNA顺序的RNA顺序。此外，其中还有编码肽的可译框，虽然没有象上面的ET1.1顺序中那样清楚地列出氨基酸顺序，但此核苷酸仍然公开了可表达的肽。

I.定义

下面定义的术语具有如下意义：

1.“肠道传播性非甲非乙型(ET-NANB)肝炎病毒因子”是指一种病毒，病毒型或病毒类，这种因子(i)导致由水携带的传染性肝炎，(ii)可传染犬猴，(iii)与甲肝病毒(HAV)和乙肝病毒(HAB)具有不同的血清学性质，以及(iv)包含一个与质粒pTZ-KF1(ET1.1)中的1.3 3kb cDNA插段同源的基因组区域，该质粒携于保藏号为CCTCC M89041的大肠肝菌BB4株中。

2.所谓“同源的”是指核酸片段能够在杂交条件下相互杂交，杂交链中最多含有25-30％的错配碱基对。一般说来，两个单链核酸分子如果在Maniatis等人所述的条件下(同上，p.320-323)杂交，则称它们是同源的，但所用的洗涤条件如下：2×SCC，0.1％SDS，室温下2次，每次10分钟；然后是2×SCC，0.1％SDS，50℃下一次，30分钟；然后是2×SCC，室温下2次，每次10分钟。更优选的是，同源的核酸链含有15-25％错配碱基对，进一步更加优选的是只含有5-15％错配碱基对。这些同源度可使用更加严格的洗涤条件进行选择，以从基因文库(或其他的遗传物质来源)中鉴别克隆，正如本领域所公知的那样。

3.一个DNA片段如果含有与病毒因子基因组的某区域相同或基本相同的碱基对顺序，则称此DNA片段是由ET-NANB病毒因子“产生”。

4.一个蛋白质如果是由产生自ET-NANB病毒因子的DNA或RNA片段的可译框所编码，则称此蛋白质是由ET-NANB病毒因子“产生”。

II.获得克隆的ET-NANB片段

根据本发明的一个方面，发现通过下述步骤能够产生病毒特异性的DNA克隆，(a)从已知具有E T-NANB感染的犬猴的胆汁中分离RRNA，(b)克隆cDNA片段以形成片段文库，以及(c)通过与感染和非感染胆汁来源的放射性标记cDNA的分辨杂交筛选文库。

A.cDNA片段混合物

通过静脉注射接种使犬猴发生ET-NANB感染，接种物为10％W/V病人粪便(27-34nm ET-NANB颗粒阳性，平均直径32nm)的悬浮液。通过丙氨酸转氨酶水平的上升监测感染动物，此上升表明发生了肝炎感染。根据已经公开的方法(Gravelle)，通过血清阳性抗体与类病毒颗粒(VLP)的免疫特异性结合证实ET-NANB感染。简而言之，由感染3-4周后的动物取粪便(或胆汁)样品，用磷酸缓冲液以1∶10稀释，通过低速离心澄清此10％的悬浮液，连续通过1.2和0.45微米的滤器过滤。可进一步通过30％蔗糖垫的沉淀过程纯化此物质(Bradley)。得到的VLP制剂与ET-NANB感染的病人的稀解血清混合。保温过夜后，使混合物离心过夜以沉淀免疫聚集体，染色后用电镜检查与VLP结合的抗体。

通过至VLP阳性血清的血清转化也能证实ET-NANB感染。在此方法中，感染动物的血清如上述与2 7-34nm VLP混合(此VLP由感染病人的粪便样品中分离)，然后通过免疫电镜检查与VLP结合的抗体。

胆汁可通过下述两种方式由ET-NANB阳性动物中收集，即在胆汁管道中插管以收集胆汁液，或在尸体解剖时由胆汁管道中抽取。如实例1A所述，通过热苯酚提取法由胆汁中提取总RNA。同样根据实例1A所述，用此RNA片段通过随机引发合成相应的双链cDNA片段。通过凝胶电泳或密度梯度离心可分离cDNA片段，以得到所需大小的片段，例如500-4000碱基对片段。

虽然可用其他的病毒物质来源生产cDNA组分，例如由粪便样品得到的VLP(如实例4所述)，但仍然优选使用胆汁来源。根据本发明的一个方面，通过免疫电镜的证据发现，来自ET-NANB感染猴子的胆汁比来自粪便样品的物质具有更多的完整病毒粒子。由ET-NANB感染的人或犬猴得到的胆汁可用作ET-NANB病毒蛋白或基因组物质、或完整病毒而来源，此胆汁构成了本发明的一部分。

B.cDNA文库及其筛选

将上述cDNA片段克隆至合适的克隆载体中以形成cDNA文库。这可通过下述步骤完成：为平头片段装配合适的末端人工接头，例如EcoRI顺序，然后将此片段插入克隆载体的合适的插入位点，例如单一的EcoRI位点。在初步克隆以后，如果需要可使文库再克隆，以提高含有插入片段的载体的百分比。实例1B详细描述了文库的构建过程。在此方法中，使cDNA片段变成平头末端，装配上EcoRI末端，并插入λ噬菌体gt10的EcoRI位点中。此文库噬菌体显示的插入片段少于5％，将其分离后，将插入片段再克隆至λgt10载体中，所产生的噬菌体含有95％以上的插段。

通过与cDNA探针的分辨杂交在cDNA文库中筛选特异于ET-NANB的顺序，cDNA探针由感染的和未感染的来源产生。来自感染和未感染胆汁或粪便病毒分离物的cDNA片段可如上述制备。根据常规方法(Maniatis，109页)，通过随机标记、缺口转译或末端标记对片段作放射性标记。如实例2详细描述的，通过转移至复制的硝化纤维素滤膜，以及与感染来源和非感染来源(对照)的放射性标记探针杂交，对上述cDNA文库进行筛选。为了回收在优选的25-30％错配碱基对范围之外处杂交的顺序，能够选择在Maniatis等人(同上，p.320-323)所述条件下杂交的克隆，但使用下述洗涤条件：2×SCC，0.1％SDS，室温下2次，每次30分钟；然后是2×SCC，0.1％ DS，50℃下1次，30分钟；然后是2×SCC，室温下2次，每次10分钟。通过这些条件，利用ET1.1顺序作为探针能够鉴别墨西哥分离物。显示出与感染来源的探针有选择性杂交的空斑最好以低密度再作平板培养，并如上述再进行筛选，以分离出特异于ET-NANB顺序的单一克隆。如实例2所指出，通过这些过程，鉴别出了16个与感染来源的探针发生特异性杂交的克隆。其中之一命名为λgt10-1.1，它含有1.33kb的插入片段。

C.ET-NANB顺序

通过标准的顺序测定法，确定了B部分中克隆的ET-NANB片段的碱基对顺序。在实例3描述的说明性方法中，从选择的克隆载体中切下插入片段，通过凝胶电泳分离，将其插入已知插入位点两侧的碱基对顺序的克隆载体中。实例3利用的具体载体是pTZ-KF1载体，它示于图1的左边。将来自gt10-1.1噬菌体的ET-NANB片段插入pTZ-KF1质粒单一的EcoRI位点中。如实例3所述，通过与分离的1.33kb片段的杂交鉴别携有所需插段的重组体。所选择的一个质粒被鉴定为pTZ-KF1(ET1.1)，此载体用EcoRI消化后产生预期的1.33kb片段。用pTZ-KF1(ET1.1)质粒感染的大肠肝菌BB4株已保藏在美国典型培养物收集中心(Rockville，MD)，保藏号为CCTCCM89041。

图1底部给出了pTZ-KF1(ET1.1)质粒的示意图。插入片段的5′和3′端区域分别标有A和C，中间区域标有B。这些区域中的顺序已通过标准的双脱氧顺序测定法(见下述)进行了测定。三个短顺序(A.B和C)来自同样的插入链。从实例3中可以见到，B区顺序实际上是由对立链测定的，因此上面给出的B区顺序代表所测链的互补顺序。部分顺序的碱基号码只是大概的。

本发明人实验室的后期工作鉴定了完整顺序(也在上面给出)。此完整顺序的片段很容易用限制性核酸内切酶制备。对正向和反向两种顺序进行计算机分析鉴别出若干切割位点。下表总结了这些特异性切割位点(正向顺序的)。

鉴别顺序配对顺序 “正向”链中对

(^＝切割位点) 应的碱基号码

CC^WGG(BstNI) CCWGG 106，360，410，483，

497，973，1129，1243

CC^SGG(NciI) CCSGG 288，841，1063

GAAGANNNNNNNN^(MboII) GAAGA 822，1116

TCTTC(<-7-MboII) TCTTC 422，611，849

GCGTC(<-10-HgaI) GCGTC 225

GCATCNNNNN^(SfaNI) GCATC 488，640

GCAGCNNNNNNNN^(BbvI) GCAGC 53，631，149

GCTGC(<-12-BbvI) GCTGC 919，979

GGATGNNNNNNNNN^(FokI) GGATG 363，734，1212

CATCC(<-13-FokI) CATCC 641，750

GGTGANNNNNNNN^(HphI) GGTGA 454，589，835，931

TCACC(<-7-HphI) TCACC 114，416，446，762

GP^CGYC(AhaII) GPCGYC 224

GDGCH^C(BspI1286) GDGCHC 77，110，158，838，

1125，1324

GPGCY^C(BanII) GPGCYC 77，110，838，1125

C^YCGPG(AvaI) CYCGPG 74，178

Y^GGCCP(EaeI) YGGCCP 171，290，626，875，

1101

GWGCW^C(GgiAI) GWGCWC 77，110，158，1324

C^CTTGG(StyI) CCTTGG 529，1068

P^GATCY(XhoII) PGATCY 782

CAG^CTG(PvuII) CAGCTG 54

C^CATGG(NcoI) CCATGG 344，468，644

CGAT^CG(PvuI) CGATCG 1031

C^GGCCG(EagI) CGGCCG 1101

G^AATTC(EcoR1) GAATTC 2，1335

GAGCT^C(SacI) GAGCTC 77，110

GCATG^C(SphI) GCATGC 1268

GCC^GGC(NaeI) GCCGGC 994，1099，1103

G^CGCGC(BssHII) GCGCGC 1073

GGGCC^C(ApaI) GGGCCC 1125

TCG^CGA(NruI) TCGCGA 264

T^CTAGA(XbaI) TCTAGA 705

TTT^AAA(DraI) TTTAAA 925

G^TGCAC(ApaLI) GTGCAC 158

ACCTGCNNNN^(BpsMI) ACCTGC 99

GCAGGT(<-8-BspMI) GCAGGT 1045

GACN^NNGTC(Tth111I) GACNNNGTC 604

CCANNNN^NTGG(Pf1MI) CCANNNNNTGG 10

CC^TNAGG(MstII) CCTNAGG 571

GCCNNNN^NGGC(Bg1I) GCCNNNNNGGC 216，359，738

CCANNNNN^NTGG(BstXI) CCANNNNNNTGG 204

III.ET-NANB片段

根据另一方面，本发明还包括可与ET-NANB基因组顺序或由其产生的cDNA片段杂交的ET-NANB特异性片段或探针。这种片段可包括如第II节所述的完整长度的cDNA片段，或可以是由克隆的cDNA片段中产生的较短的顺序。从第IV节的描述将可以见到，通过在产生所需大小片段的条件下对完整长度片段进行酶促消化，能够制备较短的片段。另外，这些片段也可利用由cDNA片段产生的顺序通过寡核苷酸合成法生成。生产选择顺序的寡核苷酸片段的方法或服务都可以得到。

为了证实所给的ET-NANB片段确实是由ET-NANB病毒因子产生的，可使该片段与来自感染源的cDNA作选择性杂交。从说明的目的出发，为了证实pTZ-KF1(ET1.1)质粒中的1.33kb片段是起源于ET-NANB的，将此片段从pTZ-KF1(ET1.1)质粒中切下，纯化，通过随机标记法进行放射性标记。使标记片段与来自感染和非感染源的分离的cDNA杂交，以证实探针只与感染源的cDNA反应。实例4说明了此方法，其中，检查上述放射性标记的1.33kb片段〔来自pTZ-KF1(ET1.1)质粒〕与cDNA(由感染和非感染源制备)的结合。感染源包括(1)来自由一病毒株感染的犬猴的胆汁，该病毒是由已知具有ET-NANB感染的缅甸患者的粪便样品产生的，(2)由墨西哥的ET-NANB病人的粪便样品产生的病毒因子。每种片段混合物中的cDNA，首先根据实例4的人工接头/引物扩增法进行扩增。在琼脂糖凝胶上分离片段，然后进行Sowthern印迹转移，然后进行杂交，使放射性标记的1.33kb片段与分离的cDNA结合。正如所期望的，含有感染源cDNA的泳道显示出模糊的结合探针带(通过人工接头/引物扩增法扩增的cDNA被期望具有较宽的大小范围)。没有观察到探针与来自非感染源的扩增cDNA结合。结果表明，1.33kb探针特异于与ET-NANB感染相关的cDNA片段。用ET 1.1作为探针的同类研究已经证实，该探针能与从塔什干、索马里、婆罗洲和巴基斯坦等地收集的ET-NANB样品杂交。其次，探针特异于来自不同大陆(亚洲、非洲和北美)的ET-NANB相关顺序的事实说明，克隆的非洲ET-NANB顺序是由普遍型ET-NANB病毒或病毒类产生的，它负责世界范围内的ET-NANB肝炎感染。

在一项相关的确定性研究中，检查了与分离的基因组片段相结合的探针，这些分离片段是由人或犬猴基因组DNA制备的。没有观察到探针与任一种基因组片段结合，这表明ET-NANB片段并不是人或犬猴的内源片段。

这些片段中存在ET-NANB特异性顺序的另一证据是，片段中的编码区能够表达ET-NANB蛋白。下面的第IV节讨论了利用这些片段表达蛋白的方法。

ET-NANB特异性片段的一个重要用途是鉴别由ET-NANB产生的cDNA，其中含有另外的顺序信息。接着，新鉴别的cDNA又产生新的探针片段，使得能够进行进一步的重复，直至鉴别出完整的病毒基因组并测定其顺序。用以鉴别另外的ET-NANB文库和由其产生新探针的方法，一般可以遵循第II节所述的克隆和选择方法。

这些片段(以及根据上面所给顺序制备的寡核苷酸)还可用来作为检测病人样品中的ET-NANB病毒基因组物质的聚合酶链反应法的引物。下面的第V节将描述此诊断方法。

IV.ET-NANB蛋白质

如上所述，通过ET-NANB片段中可译框编码区的表达，能够制备ET-NANB蛋白质。在一种优选方法中，用来表达蛋白的ET-NANB片段是由克隆的cDNA产生，该cDNA已经过处理使其产生所需大小的片段，最好是大小主要在大约100至大约300碱基对之间的随机片段。实例5描述了通过DNA消化制备这种片段的方法。由于希望得到在大约30至大约100氨基酸之间的肽抗原，消化片段最好经过大小分离，例如通过凝胶电泳分离，以选择大约100-300碱基对范围内的片段。

A.表达载体

将ET-NANB片段插入合适的表达载体中。一个表达载体的例子是λgt11，它在β-半乳糖苷酶基因翻译终止密码上游53碱基对处，含有单一的EcoRI插入位点。因此，插入顺序将作为β-半乳糖苷酶融合蛋白表达，它含有β-半乳糖苷酶基因的N端部分、异源肽、以及含或不含β-半乳糖苷酶肽的C端区域(如果异源肽编码顺序不含翻译终止密码，则C端部分将被表达)。此载体还产生一个温度敏感型阻遏物(c1857)，它在允许温度下(如32℃)导致病毒的溶源现象，而在较高的温度(如42℃)则导致病毒溶解。此载体的优点包括：(1)高效率产生重组体，(2)能够在允许而不是非允许温度下根据宿主细胞的生长选择溶源化的宿主细胞，以及(3)高水平生产重组的融合蛋白。另外，由于含有异源插段的噬菌体产生的β-半乳糖苷酶是失活的，则含有插段的噬菌体能很容易地通过β-半乳糖苷酶染色的底物反应进行鉴别。

为了将消化过的病毒片段插入表达载体中，如果需要的话，可根据常规技术对其进行修饰，使其含有选择的限制位点的人工接头，例如EcoRI人工接头。实例1说明了将消化片段克隆至λgt11中的方法，该方法包括如下步骤：平整片段末端，与EcoRI人工接头连接，将片段导入EcoRI切开的λgt11中。可对产生的病毒基因组文库进行检查，以证实已经产生了相对大的(具代表性的)文库。对于λgt11载体来说，这可以通过下述方法完成：感染合适的细菌宿主，平板培养细菌，检查失去β-半乳糖苷酶活性的空斑。利用实例1所述方法，有大约50％的空斑显示失去了酶活性。

B.肽抗原的表达

在上述形成的病毒基因组文库中筛选肽抗原(以融合蛋白的形式表达)的生产，该抗原具有与来自ET-NANB血清阳性个体的抗血清反应的免疫活性。在一个优选的筛选方法中，如上所述培养用噬菌体文库载体感染的宿主细胞，用硝酸纤维素滤膜复印培养平板，从而将由细胞产生的重组蛋白抗原转移到滤膜上。然后使滤膜与ET-NANB抗血清反应，通过洗涤除去未结合的抗体，然后与标记的抗人抗体反应，该抗体以夹层方式通过抗ET-NANB抗体结合在滤膜上。

一般情况下，通过感兴趣的重组抗原的生产而鉴别出的噬菌体空斑，以相对低的密度再检测它们生产抗体反应性融合蛋白的情况。通过此方法，鉴别出若干生产免疫活性重组抗原的重组噬菌体克隆。

为了纯化出重组蛋白，可用选择的表达载体进行扩大生产。利用大量已知方法中的一种进行扩大生产，这些方法包括：(a)用选择的λgt11重组体使合适的宿主(如大肠肝菌)溶源化，(b)在产生高水平异源肽的条件下培养转导细胞，(c)从溶解细胞中纯化重组抗原。

在涉及上述λgt11克隆载体的一个优选方法中，用选择的文库噬菌体感染大肠肝菌宿主的高生产株，BNN103株，并用两个平板进行重复培养。一个平板培养在32℃下，在此温度下可发生病毒溶源现象，另一个培养在42℃下，在此温度下感染的噬菌体处于溶解状态，并因此阻止细胞的生长。因此，认为在较低而不是较高温度下生产的细胞已被成功地溶源化。

然后，使溶源化宿主细胞在液体培养基中生长，此条件有利于含有病毒插段的融合蛋白的高水平生产，通过速冻溶解细胞以释放出所需的融合蛋白。

C.肽的纯化

可通过标准的蛋白纯化方法纯化重组肽，这些方法可包括差别沉淀、分子筛层析、离子交换层析、等电点聚焦、凝胶电泳和亲和层析等。对于融合蛋白来说，例如上述制备的β-半乳糖苷酶融合蛋白，用于纯化的蛋白分离技术可由用于分离天然蛋白的技术改造。因此，对于分离β-半乳糖苷酶融合蛋白来说，通过简单的亲和层析就能容易地分离出蛋白，即使细胞溶解物通过表面结合有β-半乳糖苷酶抗体的固相就行。

D.病毒蛋白

本发明的ET-NANB蛋白也可直接由ET-NANB病毒因子产生。如上述由感染个体的粪便样品分离的VLP，即是一个合适的病毒蛋白物质来源。由粪便样品分离的VLP可通过亲和层析进一步纯化，然后进行蛋白质分离(参见下文)。病毒因子也可通过细胞培养物产生，这为病毒蛋白提供了一个方便和潜在的浓缩来源。1986年4月1日提交的共同具有的846,757号美国专利申请描述了一种不灭的三瘤(trioma)肝细胞，它能支持细胞培养中的NANB感染。三瘤细胞系是通过使人肝细胞与小鼠/人融合对(根据人染色体的稳定性选择出)相融合制备的。含有所需NANB病毒因子的细胞，可利用抗ET-NANB的人抗体通过免疫荧光法鉴别。

在分离蛋白之前，通过常规方法使病毒因子破碎，这些方法可包括声处理、高盐或低盐条件、或去污剂的利用等。

ET-NA NB病毒蛋白可通过亲和层析纯化，使用根据标准方法结合了纯化ET-NAN B抗体的合适固相。抗体本身也可通过亲和层析纯化，在此纯化中，使例如上述制备的重组的免疫活性ET-NANB蛋白结合在固相上，以从免疫血清中分离ET-NANB抗体。通过标准方法从固相上释放结合的抗体。

另一种方法是，ET-NANB抗体可以是根据下述方法制备的单克隆抗体(Mab)：用ET-NANB重组蛋白免疫小鼠或其他动物，由动物中分离淋巴细胞，并用合适的融合伙伴使细胞恒定化，选择与重组的蛋白免疫原反应的成功的融合产物。它们也可以用于上述的亲和纯化中，以得到天然的ET-NANB抗原。

V.实用性

A.诊断方法

本发明的粒子及抗原，以及遗传物质能用于诊断检测法中。检测ET-NANB肝炎的方法包括，分析生物样品如血液样品、粪便或肝活体解剖样品，看是否存在有与ET-NANB肝炎病毒相关的分析物。

分析物可以是与探针杂交的核苷酸顺序，该探针包括上述顺序(cDNA顺序)中的至少16个连续核苷酸，通常是30至200个核苷酸，直至基本上完整顺序的核苷酸。分析物可以是RNA或cDNA。典型的分析物是怀疑为ET-NANB的病毒颗粒，或一种为其正排除此分类的颗粒。病毒颗粒进一步的特征是具有一个RNA病毒基因组，该基因组含有的顺序与上述的“正向”和“反向”顺序中至少12个连续核苷酸的顺序有至少大约80％的同源度，通常是与该顺序中的至少大约60个连续核苷酸有至少大约90％的同源度，并可含有一个与完整长度的顺序基本同源的顺序。为了检测分析物，在分析物与探针杂交的情况下，该探针可含有可检测的标记。

分析物也可包括识别一种抗原的抗体，例如在ET-NANB病毒粒子上的细胞表面抗原。分析物也可以是ET-NANB病毒抗原。当分析物是抗体或抗原时，可分别用标记的抗原或抗体与分析物结合形成免疫复合物，然后可通过标记检测此复合物。

一般说来，检测分析例如表面抗原和/或完整粒子的方法是以免疫检测为基础的。免疫检测法可用来测定宿主中由于ET-NANB肝炎病毒的感染而产生的抗体，或直接测定病毒粒子或抗原。这种技术是众所周知的，无需在这儿详细描述。其实例包括异质和同质免疫检测技术。这两种技术都是以病毒粒子或其抗原与相应的特异抗体之间形成免疫复合物为基础的。病毒抗原的异质检测法一般是使用与固相表面结合的特异性单克隆或多克隆抗体。夹层检测法正变得日益普遍。也可以使用同质检测法，这是在没有固相的溶液中进行的，例如测定由于游离抗体与酶-抗原结合物相结合而产生的酶活差别。在US3,817,837、4,006,360、3,996,345中公开了若干合适的检测法。

测定由ET-NANB病毒诱导的抗体时，可用本发明的病毒和抗原作为特异结合剂去检测IgG或IgM抗体。由于IgM抗体一般是感染过程中首先出现的抗体，此时IgG合成可能还未启动，因此，通过特异性地分辨宿主血液中的IgM和IgG抗体，就能使医生或其他研究人员确定该感染究竟是近期的还是慢性的。

在一种诊断方法中，使测试血清与表面结合有ET-NANB蛋白抗原原的固相试剂反应。在抗ET-NANB抗体与试剂结合后，洗去未结合的血清组分，使该试剂与标记的抗人抗体反应，使显示物结合在试剂上，结合量与固相上结合的ET-NANB抗体量成比例。洗涤试剂以除去未结合的标记抗体，测定与试剂结合的显示物的量。一般说来，该显示物是一种酶，它通过使固相与合适的荧光或显色底物保温而检测。

上述检测法中的固相表面试剂是由已知技术制备的，用来使蛋白物质与固相支持物附着，例如聚合物珠，浸签或滤器。这些附着方法一般包括蛋白质与固相的非特异性吸附，或蛋白质与固相的共价结合，一般是通过游离胺基与固相上的化学活性基团反应，例如活性化的羧基基、羟基或醛基。

在第二种诊断方法中，即所谓的同质检测法，与固相结合的抗体在反应基质中产生某些变化，这些变化可直接在基质中检测。迄今为止，已知所提出的同质检测法的一般类型有：(a)自旋标记的(Spin-labeled)显示物，与抗原结合的抗体通过所显示的迁移率(自旋分裂峰的扩宽)进行检测，(b)荧光显示物，通过荧光效率的变化检测测结合，(c)酶显示物，抗体结合影响酶/底物的相互作用，以及(d)脂质体结合的显示物，结合导致脂质体溶解并释放出囊包的显示物。这些方法与本发明蛋白抗原的适应遵循制备同质检测试剂的常规方法进行。

在上述每一种检测法中，都涉及使测试个体的血清与蛋白抗原反应并检查抗原，看是否存在有结合的抗体。在第一种方法的检测中，可包括使标记的抗人抗体与待检查的抗体结合，检查抗体是IgM(急性期)或IgG(恢复期)，并测定与因相结合的显示物数量。在第二种方法的检测中，可包括观察抗体与同质检测试剂结合后的效应。

用于进行上述检测法的检测系统或药盒也构成本发明的一方面。药盒通常包括表面结合有重组蛋白抗原的固相，所述抗原是(a)具有针对存在于肠道传播性非甲非乙型病毒因子囊感个体中的抗体的免疫活性，以及(b)从病毒性肝炎因子中产生，该因子的基因组含有一个与质粒pTZ-KF1(ET1.1)的1.33kb DNA的EcoRI插段同源的区域，该质粒携于保藏号为CCTCCM89041的大肠肝菌BB4株中。药盒中由显示物标记的抗人抗体被用来检测表面结合的抗ET-NANB抗体。

B.病毒基因组诊断的应用

本发明的遗传物质本身能用于多种检测法中，以作为天然发生感染中的遗传物质的探针。使核酸靶扩增(以用于随后通过杂交检测进行分析)的一种方法是所谓的聚合酶链反应法或PCR技术。使用相互间开的寡核苷酸引物和以上述的遗传顺序为基础，PCR技术能用来在可疑病理样品中检测本发明的病毒粒子。引物互补于双链DNA分子的对立链，它们一般由大约50-450或更多的核苷酸(通常不多于2000个核苷酸)所分开。此方法包括制备特异的寡核苷酸引物，然后重复下述循环：靶DNA变性，引物结合，用DNA聚合酶延伸以得到根据引物间隔所预期长度的DNA片段。由一个引物产生的延伸产物作为另外引物的额外的靶顺序使用。靶顺序的扩增程度由循环次数所控制，并由简单的公式2ⁿ作理论计算，其中n是循环次数。假设每次循环的平均效率为大约65％至85％，则25次循环产生0.3-4.8百万拷贝的靶顺序。PCR方法记载于许多出版物中，包括Saiki等人，Science230：1350-1354，1985；Saiki等人，Nature 324：163-166，1986；Scharf等人，Science 233：1076-1078，1986。还可参见US 4,683,194；4,683,195；4,683,202。

本发明包括一个测定ET-NANB病毒因子的特异诊断方法，此方法以ET-NANB片段的选择性扩增为基础。此方法利用一对单链引物，它们由DNA双链片段对立链的非同源区产生，该双链DNA则是由肠道传播性肝炎病毒因子产生，此因子的基因组含有一个与质粒pTZ-KF1(ET1.1)中1.33kbDNA的EcoRI插段同源的区域，该质粒携于保藏号为M89041的大肠肝菌BB4株中。这些“引物片段”构成了本发明的一方面，它们是从例如上面第III节所述的ET-NANB片段制备。该方法如上所述，遵循US 4,683,202所公开的扩增选择的核酸顺序的方法。

C.肽疫苗

本发明的任一种抗原都可用于制备疫苗。制备疫苗的优选起始物质定由胆汁中分离的粒子抗原。抗原最好如上述首先以完整粒子的形式回收。然而，也可能由从其他来源分离的粒子或非粒子重组抗原制备合适的疫苗。如果使用非粒子抗原(一般是可溶性抗原)，则优选使用由病毒被膜或病毒衣壳产生的蛋白制备疫苗。这些蛋白可通过上述的亲和层析纯化。

如果纯化蛋白本身不具备免疫原性，可将其结合在载体上以使蛋白具有免疫原性。载体包括牛血清清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白等。最好使抗原纯化至基本上不含人蛋白，但这并不是必需的。但更重要的是，抗原中不能含有非人类来源的蛋白、病毒和其他物质，它们可能通过各种污染途径导入，例如培养或获得病毒所用的营养基质、细胞系、组织或病理液体的污染。

接种可通过常规方式进行。例如，抗原(不管是病毒粒子或蛋白)可用于合适的稀释剂中，如水、生理盐水、缓冲液、完全或不完全的佐剂等。使用标准技术施用免疫原以诱导抗体，例如含有失活或减弱的病毒粒子或抗原的生理相容性无菌溶液的皮下注射。一般通过接种注射施用能产生免疫应答量的病毒粒子，体积一般为1毫升或更少。

一个具体的疫苗组合物实例包括一种药物上可接受的佐剂，一种由肠道传播性非甲非乙型肝炎病毒因子产生的重组蛋白或蛋白混合物，该因子的基因组合有一个与质粒pTZ-KF1(ET1.1)中1.33kbDNA的EcoRI插段同源的区域，该质粒携于保藏号为M89041的大肠肝菌BB4株中。以确定的间隔施用疫苗，直至在血清中检测到显著的ET-NANB抗体滴度。此疫苗将预防ET-NANB的感染。

D.预防和治疗抗体和抗血清

除了用作疫苗以外，组合物还能用来制备针对ET-NANB病毒粒子的抗体。抗体可直接作为抗病毒剂使用。为了制备抗体，使用病毒粒子免疫宿主动物，或如果合适的话，如上述使病毒粒子天然产生的非粒子抗原与载体结合而作为疫苗。在合适的时间间隔后收集人血清或血浆，以提供含有能与病毒粒子反应的抗体的组合物。通过使用(例如)饱和硫酸铵或DEAE Sephadex，或本领域内熟知的其他技术，可以得到γ球蛋白组分或IgG抗体。抗体基本上不会产生许多不利的副作用，而这种副作用可能与其他抗病毒剂如药物相结合。

通过使潜在的不利的免疫系统应答降至最小，可使抗体组合物变得与宿主系统具有更大的相容性。这是通过下述方法完成的：去除外源种的抗体的所有部分Fc分，或使用与宿主同种的抗体，例如使用来自人/人杂杂瘤的抗体。

抗体还可用来作为增强免疫应答的手段，因为抗体-病毒复合物是由巨噬细胞识别的。抗体的施用量可与用于其他治疗的抗体施用量相似。例如，在其他病毒性疾病如狂犬病、麻疹和乙肝的感染早期，收集的γ球蛋白的施用量为0.02-0.1ml/磅体重，以干扰病毒的进入细胞。因此，能与ET-NANB病毒粒子反应的抗体，能够单独或与另一种抗病毒剂结合被动施用于感染有ET-NANB病毒的宿主，以增强免疫应答和/或抗病毒药物的效力。

另外，通过施用作为免疫原的抗个体基因型抗体能够诱导抗ET-NANB病毒的抗体。方便的作法是，利用如上述制备的纯化的ET-NANB病毒抗体制剂在宿主动物中诱导抗个体基因型抗体。组合物在合适的稀释剂中施用给宿主动物。在施用之后，通常是重复的施用，宿主产生抗个体基因型抗体。为了消除针对Fc区的免疫原应答，可以使用由与宿主动物同种的动物中产生的抗体，或者去掉所施用抗体的Fc区。在宿主动物中诱导抗个体基因型抗体之后，取出血清或血浆以提供抗体组合物。可如上面对纯化抗ET-NANB病毒抗体所述纯化组合物，或通过使用结合于亲和基质的抗ET-NANB病毒抗体的亲和层析纯化。所产生的抗个体基因型抗体的构象与真正的ET-NANB抗原相似，并可用来制备ET-NANB疫苗，而不使用ET-NANB粒子抗原。

如果用来作为在病人体内诱导抗ET-NANB病毒抗体的手段，注射抗体的方式与用于接种目的时相同，即在生理相容的稀释剂中，在有或没有佐剂的条件下，以有效浓度进行肌肉、腹膜内、皮下注射等。一次或多次加强注射可能是需要的。用抗个体基因型诱导ET-NANB病毒抗体的方法，能够减缓可能由被动施用抗ET-NANB病毒抗体导致的问题，例如不利的免疫应答，以及与施用纯化的血液组分相关的问题，例如被目前还未发现的病毒感染。

本发明由ET-NANB产生的蛋白还可被用于生产被设计为进行暴露之前或之后的预防处理的抗血清。在此方法中，将ET-NANB蛋白或蛋白混合物与合适的佐剂配制在一起，通过已知方法注射给志愿者以生产人抗血清。如上面第II节A所述，在免疫后数周的期间内，监测对于注射蛋白的抗体应答，即定期抽取血清样品检测抗ET-NANB的血清抗体。

来自免疫个体的抗血清可作为暴露前预防剂，施用给具有感染危险的个体。抗血清还可用于治疗暴露后的个体，即类似于使用高滴度抗血清对乙肝病毒作暴露后的预防。

E.单克隆抗体

对于针对ET-NANB病毒粒子和蛋白的抗体以及抗个体基因型抗体，在活体和诊断两种用途中，都可优选使用单克隆抗体。可如下述生产单克隆的抗病毒粒子抗体或抗个体基因型抗体。根据本领域内专业人员公知的方法，由免疫动物取出脾脏或淋巴细胞，并使其恒定化或用来制备杂交瘤。为了生产人-人杂交瘤，选择人淋巴细胞作为供体。已知感染有ET-NANB病毒的供体(通过血液中抗病毒抗体的存在或病毒培养已证实了此感染)可作为合适的淋巴细胞供体。可从外周血液样品中分离淋巴细胞，或如果使供体经受脾切除术则可使用脾细胞。可使用EB病毒(EBV)使人淋巴细胞恒定化，或可使用人的融合伙伴产生人-人杂交瘤。生产人单克隆抗体时，也可使用肽进行离体的初级免疫。

对恒定化细胞分泌的抗体进行筛选，以确定分泌具有所需特异性抗体的克隆。对于单克隆的抗病毒粒子抗体来说，抗体必须与ET-NANB病毒粒子结合。对于单克隆的抗个体基因型抗体来说，抗体必须与抗病毒粒子抗体结合。选择出生产具有所需特异性抗体的细胞。

下述实例说明了本发明的各个方面，但它们绝不是为了限制本发明的范围。

材料

下述实例中所用的材料如下：

酶：DNA酶I和碱性磷酯酶得自Boehringer MannheimBiochemicals (BMB，Indianapolis，IN)；EcoRI、EcoRI甲基化酶、DNA连接酶和DNA聚合酶I得自New EnglandBiolabs (NEB.Beverly MA)；RNA酶A得自Sigma(St.Louis，MO)。

其他试剂：EcoRI人工接头得自NEB；硝基蓝四唑鎓(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)得自Sigma。

cDNA合成药盒和随机引发标记药盒得自Boehringer-Mannheim Biochemical (BMB，Indianapolis，IN)。

实例1 制备cDNA文库

A.ET-NANB病毒来源

两只犬猴(cynos)用10％的粪便样品悬浮液作静脉注射，该样品得自由一株ET-NANB病毒感染的第二代猴(cyno#37)，该病毒由粪便呈ET-NANB阳性的缅甸患者中分离出来，感染证据是，粪便中的27-34nm类病毒粒子(VLP)与已知的ET-NANB患者的免疫血清相结合。接种后24-36天之间，动物体内出现了较高水平的丙氨酸氨基转移酶(ALT)，有一只在感染的前急性期在其胆汁中分泌出27-34nm的VLP。

对每只感染动物的胆汁管道作插管，每天收集大约1-3cc的胆汁。利用标准的RNA分离法，由一个胆汁样品(cyno#121)中通过热酚萃取法提取RNA。利用得自Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)的cDNA合成药盒，由分离的RNA形成双链cDNA，通过随机引物法产生第一链。

B.克隆双链片段

在标准条件下(Maniatis，p.118)，用T4DNA聚合酶使双链cDNA片段的末端平整，然后用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀。平头物质在标准条件下(Maniatis，p.396-397)与EcoRI人工接头连接，并用EcoRI消化以除去多余的接头末端。通过连续的异丙醇沉淀除去未连接上的人工接头。

λgt10噬菌体载体(Huy nh)得自Promega Biotec(Madison，WI)。此克隆载体在噬菌体cI阻遏物基因中有单一的EcoRI克隆位点。将来自上述的cDNA片段导入此EcoRI位点中，即混合0.5-1.0μg EcoRI切开的gt10，0.5-3μl上述双链片段，0.5μl10x连接缓冲液，0.5μl连接酶(200单位)和加至5μl的蒸馏水。根据标准方法(Maniatis，p.256-268)，使混合物于14℃保温过夜，然后进行离体包装。

用包装的噬菌体感染大肠肝菌hfl株，例如HG415株。另外，也可使用大肠肝菌C600hfl株，它可得自Promega Biotec，Madison，WI。通过20个随机空斑的分析，具有EcoRI末端的插段的重组空斑百分比少于5％。

所得到的cDNA文库作平板培养，通过加入洗脱缓冲液从选择平板上洗脱噬菌体。由噬菌体提取DNA后，用EcoRI消化DNA，释放出异源的插段群落，在琼脂糖上分离DNA片段以除去噬菌体片段。分离出500-4,000bp插段，如上述再克隆至λgt10中，用包装的噬菌体感染大肠肝菌HG415株。成功重组体的百分比大于95％。将噬菌体文库培养在大肠肝菌HG415株平板上，在总共8个平板中，有大约5,000空斑/平板。

实例2 ET-NANB克隆片段的选择

A.cDNA探针

如实例1所述，由非感染和ET-NANB感染的犬猴中制备双链cDNA片段。利用得自Boehringer-Mannheim(Indianapol-is，IN)的随机引发标记药盒，通过随机引发法对cDNA片段进行放射性标记。

B.克隆选择

根据标准方法(Mariatis，p.320-323)，将实例1培养的cDNA文库转移至两个硝化纤维素滤膜上，通过烘烤使噬菌体DNA固定在滤膜上。重复滤膜与上述的感染源或对照cDNA探针杂交。检查滤膜的放射自显影图，以鉴别只与感染来源的放射性标记cDNA探针杂交的文库克隆，也就是说，它们不与非感染源的cDNA探针杂交。通过此减法选择法，从总共大约40,000个检查的克隆中鉴别出16个这种克隆。

挑出这16个克隆，并以低浓度培养在琼脂平板上。每个平板上的克隆通过复印转移至两个硝化纤维素滤膜上，并如上述检查与感染和非感染源的放射性标记cDNA探针的杂交。选择出呈现与感染源探针具选择性结合的克隆(也就是说，与感染源探针结合，但基本上不与非感染源的探针结合)。分离出一个与感染源探针选择性结合的克隆作进一步研究。选择的载体被鉴别为λgt10-1.1，如图1所示。

实例3 ET-NANB顺序

实例2的λgt10-1.1克隆用EcoRI消化以释放异源插段，通过凝胶电泳由载体片段中分离此插段。该片段的电泳迁移率与1.33kb片段的一致。将此含有EcoRI末端的片段插入pTZ-KF1载体的EcoRI位点，该载体的构建和性质记载于1987年11月25日提交的共同具有的125,650号美国专利申请中，标题为“鉴别稀少克隆的克隆载体系统和方法”。简而言之，如图1所示，此质粒含有邻接T7聚合酶启动子位点的单一EcoRI位点，以及质粒和噬菌体复制原点。紧紧邻接于EcoRI位点两侧的顺序是已知的。用此质粒转化大肠肝菌BB4株(得自Stratagene，La Jolla，CA)。

如上所述制备放射性标记的ET-NANB探针，即从实例2的λgt10-1.1噬菌体切下1.33kb插段，由凝胶电泳分离该片段，并进行随机标记。根据实例2所述的方法，通过复印及与放射性标记的ET-NANB探针杂交，选择出用上述pTZ-KF1转染后含有所需ET-NANB插段的细菌。

用一个含有成功重组体的细菌集落测定一部分1.33kb插段的顺序。这种定名为pTZ-KF1(ET1.1)的分离物已保藏在美国典型培养物收集中心，保藏号为CCTCCM89041。利用标准的双脱氧顺序测定法，以及邻接EcoRI位点的顺序的引物，由插段的5′端区域和3′端区域得到了大约200-250bp的顺序。上述第II节中给出了此顺序。随后用同样的技术测定了两个方向的完整顺序，上文中也给出了此顺序。

实例4 ET-NANB顺序的检测

如上述由非感染和ET-NANB感染的犬猴的胆汁制备cDNA片段混合物。由人粪便样品得到的cDNA片段如下述制备。30ml得自一墨西哥个体的10％粪便悬浮液(该个体被诊断为由于ET-NANB的爆发而感染有ET-NANB)，以及同样体积的得自非感染健康个体的粪便，铺在30％蔗糖密度梯度垫上，在SW27转子中于15℃以25,000xg离心6小时。来自感染源粪便的沉淀物中含有具ET-NANB感染特征的27-34nm VLP粒子。对于感染和非感染样品，都从蔗糖梯度沉淀中分离出RNA，并如实例1所述，用分离的RNA产生c DNA片段。

根据1988年6月17日提交的共同具有的O7/208,512号专利申请(标题为“DNA扩增和减法技术”)所述的方法，使感染和非感染的胆汁来源、以及感染和非感染的人粪便来源的cDNA片段混合物都通过新的人工接头/引物复制法进行扩增。简而言之，每种样品的片段用DNA聚合酶I平整末端，然后用苯酚/氯仿萃取和用乙醇沉淀。平头片段与具有下述顺序的人工接头连接：

5′-GGAATTCGCGGCCGCTCG-3′

3′-TTCCTTAAGCGCCGGCGAGC-5′

双链片段用NruI消化以除去人工接头的二聚体，与顺序为5′-GGAATTCGCGGCCGCTCG-3′的引物混合，然后加热变性，冷却至室温以形成单链DNA/引物复合物。加入水生栖热菌(Thermusaquaticus，Taq)聚合酶及所有四种脱氧核苷酸，使复合物复制以形成双链片段。使复制过程重复25次，包括连续的链变性、链/引物复合物的形成及复制。

利用2％的琼脂糖基质，通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的cDNA顺序。将DNA片段由琼脂糖凝胶转移至硝化纤维素滤膜上，然后使滤膜与如下述制备的随机标记的32p探针杂交：(i)用EcoRI处理上述的pTZ-KF1(ET1.1)质粒，(ii)分离释放出的1.33kb ET-NANB片段，以及(iii)随机标记分离的片段。探针杂交根据常规的Southern印迹杂交法(Maniatis，p.382-389)进行。图2显示了用感染的(I)和非感染的(N)胆汁来源(2A)，以及用感染的(I)和非感染的(N)人粪便来源(2B)的cDNA得到的杂交图型。由图中可见，ET-NANB探针与由两种感染源得到的片段杂交，但与由两种非感染来源得到的顺序都不具同源性，因此证实了所产生的顺序的专一性。

还进行了放射性标记的1.33kb片段与来自人和犬猴DNA的基因组DNA片段的Southern印迹杂交。没有观察到探针与任一种基因组片段混合物杂交，证实ET-NANB顺序对于人和猴基因组都是外源的。

实例5 ET-NANB蛋白的表达

A.ET-NANB编码顺序的制备

实例2中的pTZ-KF1(ET1.1)质粒用EcoRI消化，以释放出1.33kb的ET-NANB插段，此片段由凝胶电泳从线性化的质粒中纯化。纯化片段以大约1mg/ml浓度悬浮在标准消化缓冲液中(0.5M Tris-HCl，pH7.5；1mg/ml BSA；10mM MnCl₂)，用DNA酶I于室温下消化大约5分钟。这些反应条件是由在此之前的标定研究确定的，在此研究中，确定了主要产生100-300bp片段所需要的保温时间。用苯酚/氯仿萃取消化液，然后进行乙醇沉淀。

使消化混合物中的片段平整末端，并如实例1所述与EcoRI人工接头连接。产生的片段通过1.2％琼脂糖凝胶电泳(5-10V/cm)分析，利用PhiX174/HaeIII和λ/HindIII作为大小标记。将100-300bp组分洗脱在NA45条上(Schleicher and Schu-ell)，然后置于装有洗脱液(1M NaCl，50mM精氨酸，pH9.0)的1.5ml微管中，于67℃保温30-60分钟。洗脱的DNA用苯酚/氯仿萃取，然后用两倍体积的乙醇沉淀。沉淀再悬浮于20μl TE中(0.01M Tris-HCl，pH7.5,0.001M EDTA)。

B.克隆在表达载体中

λgt11噬菌体载体(Huynh)得自Promega Biotec(Madison，WI)。此克隆载体在β-半乳糖苷酶翻译终止密码上游53碱基对处有一个单一EcoRI克隆位点。来自上述的基因组片段导入此EcoRI位点中，即混合0.5-1.0μg EcoRI切开的gt11，0.3-3μl上述大小的片段，0.5μl 10x连接缓冲液(上述)，0.5μl连接酶(200单位)，并加蒸馏水至5μl。混合物于14℃保温过夜，然后根据标准方法(Maniatis，p.256-268)进行体外包装。

用包装好的噬菌体感染大肠肝菌KM392株(得自Dr.KevinMoore，DNAX，Palo Alto，CA)。另外，也可使用可得自美国典型培养物收集中心的大肠杆菌Y 1090株(ATCC 37197)。培养感染的细菌，利用标准的X-gal底物空斑检测法(Maniatis)，在产生的集落中在X-gal存在下检查β-半乳糖苷酶活性的丧失(清晰空斑)。大约50％的噬菌体空斑显示出β-半乳糖苷酶活性的丧失(重组体)。

C.ET-NANB重组蛋白的筛选

ET-NANB恢复期抗血清取自这样的病人，他们在墨西哥、婆罗洲、巴基斯坦、索马里和缅甸记载的ET-NANB爆发期间有过感染史。血清具有针对粪便样品中VLP的免疫活性，这些样品来自若干患有ET-NANB肝炎的其他病人。

用大约10⁴pfu上述噬菌体储备物感染大肠肝菌KM392细胞，并在150mm平板上于37℃翻转保温5-8小时，从而制得菌苔。将硝化纤维素滤膜铺在菌苔上，使表达的ET-NANB重组蛋白由空斑转移至滤膜上。对平板和滤膜作上标记，使相应的平板和滤膜位置相配对。

滤膜在TBST缓冲液中(10mM Tris pH8.0，105mMNaCl，0.05％ Tween 2 0)洗涤2次，用AIB(TBST缓冲液加1％明胶)进行封闭，再用TBST洗涤，加入抗血清(用AIB稀释至1∶50，12-15ml/平板)后保温过夜。滤膜在TBST中洗涤2次，然后使之与酶标记的抗人抗体接触，使标记抗体附着于含有能用抗血清识别的抗原的滤膜位点上。在最后一次洗涤后，滤膜在5ml碱性磷酯酶缓冲液中(100mM Tris pH9.5，100mM NaCl，5mMMgCl₂)，在含有33%μl NBT(50mg/ml储备液，保持在5℃)与16μl BCIP(50mg/ml储备液，保持在5℃)的底物基质中显色。由于抗血清的识别，在产生抗原的位点出现紫色。

D.筛选培养

在上一步骤中确定产生抗原的区域，以大约100-200pfu在82mm平板上培养。重复上面由5-8小时保温开始至NBT-BCIP显色的步骤，以通过空斑纯化分泌能与ET-NANB抗体反应的抗原的噬菌体。挑出鉴别出的空斑，洗脱至噬菌体缓冲液中(Maniatis，p.443)。

E.抗原决定簇的鉴别

利用与上述相同的技术，分离由实例2的原初pTZ-KF1(ET1.1)质粒产生的一系列亚克隆。在这5个亚克隆中，每一个都具有针对C中的抗ET抗血清的免疫活性。亚克隆含有来自前面所列“反向”顺序中的短顺序。下面给出了亚克隆顺序的起始和结束位点(相对于完整的“反向”顺序)。

表1

亚克隆在“反向”顺序中的位置

5 ′端 3′端

Y1 522 643

Y2 594 667

Y3 508 665

Y4 558 752

Y5 545 665

由于表中给出的所有基因顺序都必须含有抗原决定簇的编码顺序，则很显然，抗原决定簇的编码顺序落在核苷酸594(5′端)和643(3′端)之间的区域内。因此，与此相对较短的顺序等同和互补的基因顺序是本发明特别优选的方面，用此编码区产生的肽也是如此。

鉴别出完全不同的抗原决定簇的第二系列克隆只由墨西哥人的血清中分离。

表2

亚克隆在“正向”顺序中的位置

5′端 3′端

ET 2-2 2 193

ET 8-3 2 135

ET 9-1 2 109

ET 13-1 2 101

此抗原决定簇的编码系统落在核苷酸2(5 ′端)和101(3′端)之间。因此也优选与此短顺序相关的基因顺序，用此编码区产生的肽也是如此。

虽然，已参考具体的实施方案、方法、构建和用途描述了本发明，但在不偏离本发明的情况下，本领域专业人员显然能够作出各种改变和修饰。

Claims

1.一种制备疫苗的方法，所述疫苗可针对肠道传播性非甲非乙型肝炎病毒因子对个体进行免疫，所述方法包括将一种药学上可接受的佐剂，与一种由肠道传播性非甲非乙型肝炎病毒因子产生的重组蛋白混合，所述因子的基因组含有一个与质粒pTZ-KF1(ET1.1)中1.33kb DNA的EcoRI插段同源的区域，该质粒携于保藏号为CCTCC M89041的大肠杆菌BB4株中。

2.权利要求1的方法，其中的蛋白由所述质粒的EcoRI插段产生。