JP2005278536A - Mpv(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるvp2及び該タンパク質をコードするdna、並びに、該タンパク質を抗原として用いた抗体検出キット及び抗体検出方法。 - Google Patents
Mpv(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるvp2及び該タンパク質をコードするdna、並びに、該タンパク質を抗原として用いた抗体検出キット及び抗体検出方法。 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】
MPVウイルスに特異的に発現するタンパク質を抗原として用いた、特異的かつ高感度なMPVの血清学的検査・診断方法を確立すること。
【解決手段】
MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2を提供する。また、該タンパク質をコードするDNAを提供する。また、MPVのVP2をコードするDNAを含む組換えプラスミド、及び、MPVのVP2をコードするDNAを含む組換えプラスミドによって形質転換された大腸菌を提供する。さらに、MPVの構造タンパク質であるVP2を抗原として用いた抗体検出キット、及び、MPVの構造タンパク質であるVP2を抗原として用いる抗体検出方法を提供する。
【選択図】 図3
MPVウイルスに特異的に発現するタンパク質を抗原として用いた、特異的かつ高感度なMPVの血清学的検査・診断方法を確立すること。
【解決手段】
MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2を提供する。また、該タンパク質をコードするDNAを提供する。また、MPVのVP2をコードするDNAを含む組換えプラスミド、及び、MPVのVP2をコードするDNAを含む組換えプラスミドによって形質転換された大腸菌を提供する。さらに、MPVの構造タンパク質であるVP2を抗原として用いた抗体検出キット、及び、MPVの構造タンパク質であるVP2を抗原として用いる抗体検出方法を提供する。
【選択図】 図3
Description
本発明は、MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2及び該タンパク質をコードするDNA、並びに、該タンパク質を抗原として用いた抗体検出キット及び抗体検出方法に関する。
マウスのパルボウイルス感染症は、米国を中心とする多くの動物実験施設で汚染が拡大しており、日本国内でも汚染拡大が憂慮されている。
従来、マウス由来のパルボウイルスとしては、MVM(minute virus of mice)が知られていたが、1990年代になってMVMと抗原的に交差反応性を示すが、HI反応(血球凝集抑制反応)で血清学的にMVMとは異なる新規のパルボウイルスが発見され、MPV(マウスパルボウイルス)と命名された。
なお、非特許文献1、非特許文献2には、MPVについての記載がある。
Ball-Goodrich LJ, Johnson E., Molecular characterization of a newly recognized mouse parvovirus.J Virol. 1994 Oct;68(10):6476-6486 Jacoby RO, Ball-Goodrich LJ, Besselsen DG, McKisic MD, Riley LK, Smith AL., Rodent parvovirus infections.Lab Anim Sci. 1996 Aug;46(4):370-380.
Ball-Goodrich LJ, Johnson E., Molecular characterization of a newly recognized mouse parvovirus.J Virol. 1994 Oct;68(10):6476-6486 Jacoby RO, Ball-Goodrich LJ, Besselsen DG, McKisic MD, Riley LK, Smith AL., Rodent parvovirus infections.Lab Anim Sci. 1996 Aug;46(4):370-380.
MPVは、培養細胞での増殖が困難であったため、MPVを培養細胞に感染・増殖させ、その培養細胞をすりつぶすことにより、大量のウイルスを分離精製するという従来のウイルス分離精製方法を用いることができなかった。そのため、MPVについては、MPV−1、MPV−1b、MPV−1c等の各株の塩基配列が知られているのみで、MPV又はMPVが産生するタンパク質の分離精製は、行うことができなかった。従って、MPVが産生するタンパク質を抗原として用いた、MPVに特異的な血清学的検査・診断方法が確立されていないという問題があった。
現在のところ、MPVがマウスに感染しているかどうかを検査する方法としては、MVMを抗原として用いたELISA法やIFA法で抗体陽性を示し、MVMに対するHI反応が陰性の場合に、MPV陽性と判断する方法が用いられている。しかしながら、上記のMPV感染の検査法は、交差反応性に基づいているため感度が低く、あくまでも便宜的な方法であった。そこで、MPVに特異的に発現するタンパク質を抗原として用いた、特異的かつ高感度なMPVの血清学的検査・診断方法を確立する必要性があった。
以上の通り、本発明は、MPVウイルスに特異的に発現するタンパク質を抗原として用いた、特異的かつ高感度なMPVの血清学的検査・診断方法を確立することを主な目的とする。
上記の技術的課題を解決するために、本発明では、まず、MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2を提供する。また、該タンパク質をコードするDNAを提供する。
現在のところ、各種パルボウイルス(マウスに感染するものも含む)に関する研究成果から、パルボウイルスの主要構造タンパク質であるVP2は、ウイルスごとの特異性が高いことが知られている。そこで、MPVのVP2及びそれをコードするDNAを用いることにより、他のパルボウイルス(MVMを含む)との鑑別や、MPV内の同種異株間の識別を、高い精度で行うことができる。
MPVのVP2の例として、後述する本発明に係る手順により分離精製された、新規のMPV株であるMPV/UT株のアミノ酸配列を配列番号1に、塩基配列を配列番号2に示す。但し、後述する抗MPV抗体に対する抗原として利用できるものであれば、MPVのVP2の塩基配列又はアミノ酸配列は、上記のものに限定されない。
次に、本発明では、MPVのVP2をコードするDNAを含む組換えプラスミド(受託番号FERM P−19750)、及び、MPVのVP2をコードするDNAを含む組換えプラスミドによって形質転換された大腸菌を提供する。
例えば、MPVのVP2をコードするDNAを大腸菌用発現プラスミドベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより、大腸菌を形質転換することができる。大腸菌を形質転換させることにより、MPVのVP2を大量かつ効率的に作製することができる。
また、本発明では、MPV感染マウスの臓器をすりつぶした後遠心して得た乳剤上清を別のマウスに接種し、MPVを継代する手順と、継代に用いたマウスの臓器を採取して、該臓器からDNAを抽出する手順と、抽出したDNAのうち、VP2をコードする領域を増幅する手順と、増幅したDNAを大腸菌に組み込んで形質転換する手順と、を含むVP2作製方法をも提供する。
MPVは、前記の通り、培養細胞で増殖しないため、ウイルスの分離精製が困難であった。そこで、MPVをマウスで継代したうえで、該マウスの臓器からDNAを抽出し、抽出したDNAのうち、VP2をコードする領域のみを増幅することにより、MPVのVP2をコードするDNAを、充分量作製することができる。従って、該DNAを大腸菌に組み込んで形質転換することにより、MPVのVP2を大量かつ効率的に作製できる。
次に、本発明では、MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2を抗原として用いた抗体検出キット、及び、MPVの構造タンパク質であるVP2を抗原として用いる抗体検出方法を提供する。
MPVのVP2を抗原として用いることにより、抗MPV抗体の特異的かつ高感度な検出が可能となる。従って、例えば、MPVに感染したマウスの血清を採取し、該血清とVP2を抗原抗体反応させることにより、血清中の抗MPV抗体を、特異的に検出できる。また、血清中の抗MPV抗体を定量的に測定することもできる。血清中の抗MPV抗体の検出及び定量的な測定は、マウスのMPV感染の診断・判定に利用できる。
また、本発明に係るVP2抗原は、MPVに感染したマウスの血清中の抗MPV抗体と特異的に反応するので、マウスのMVM感染を含む他のウイルス感染と容易に識別することできる。従って、MPV感染個体を簡易かつ確実に検出することが可能になり、また、MPV感染に対する特異的かつ簡易な血清診断が可能になる。
その他、マウス飼育集団におけるMPV汚染を早期に摘発したり、実験用マウス飼育施設全体や飼育室の汚染状況を高感度にモニターしたりすることも可能になる。従って、本発明は、MPVの施設内等での汚染拡大を、早期診断等により効果的に予防できる。
抗MPV抗体検出キットは、VP2を抗原として用いることにより抗MPV抗体を検出できるものであれば、特に限定されない。例えば、ELISA法を利用する抗体検出キットを構成することができる。その場合、まず、マイクロプレート中に、VP2を不溶化抗原として固定する。次に、検出キットに血清を加え、マイクロプレートに固定されたVP2に、血清中に含まれる抗MPV抗体を結合させる。そして、結合した抗MPV抗体と酵素標識試薬を反応させることにより、血清中の抗体の検出又は該抗体の定量的測定を行う。
また、抗MPV抗体検出方法も、前記と同様、特に限定されない。例えば、ELISA法を応用することにより、特異的かつ高感度に抗MPV抗体を検出できる。また、定量的な測定も可能となる。ELISA法に用いる酵素標識試薬も、目的に応じて適宜選択でき、例えば、ペルオキシダーゼ標識プロテインAを用いることにより、吸光度測定を用いた高感度かつ定量的な測定が可能になる。
本発明に係るVP2は、抗MPV抗体と特異的に結合することができる。
実施例1では、MPV/UT株のVP2遺伝子のクローニングを行った。
MPVは、前記のとおり、培養細胞での増殖が困難であるため、培養細胞を用いたウイルスの分離・精製ができない。そこで、本願発明者は、培養細胞での分離培養に代わる方法として、次の手順を用いてMPVを継代し、継代可能になったウイルス材料からDNAを抽出して、クローニングを行う手順を採用した。
MPVの継代は、次の手順で行った。まず、MPV抗体(MVM抗原と交差反応性を示す抗体)を保有するマウスを見つけて、そのマウス個体の脾臓を採取した。そして、採取した脾臓をホモジナイズ後遠心し、遠心して得た脾臓乳剤上清を、別のマウス(ICRマウス又はヌードマウス)に腹腔内接種した。そして、腹腔内接種したマウスから再び脾臓乳剤上清を作製して別のマウスに腹腔内接種し、MPVの継代を行った。
次に、VP2をコードするDNAのクローニングを次の手順で行った。まず、継代しているMPV感染マウスの脾臓乳剤上清を、ICRマウス又はヌードマウスに腹腔内接種し、接種の一週間後にそのマウスの脾臓及び肝臓からDNAを抽出した。そして、VP2遺伝子の両末端の塩基配列に対するプライマーを用いて、VP2タンパク質をコードするDNA領域をPCR法で増幅した。
なお、プライマーの設計は、MPV−1株(GeneBankにaccession No.U12469で登録されているMPVの株のひとつで、塩基配列が既知)の塩基配列に基づいて行い、5’プライマーにはEcoRI切断配列を、3’プライマーにはXhoI切断配列を付加した。5’プライマーを配列番号3に、3’プライマーを配列番号4に示す。
次に、増幅したDNAをアガロースゲルで電気泳動し、約1.8kbpのDNA断片を切り出して精製したのち、プラスミドベクターpGEM−T easyに組み込んでクローニングし、その塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、蛍光ダイデオキシ・サイクルシークエンス法で行った。
前記手順によりクローニングした遺伝子の塩基配列と既知の塩基配列とを比較した結果、塩基配列が、MPV−1のVP2遺伝子領域の遺伝子配列と98.1%、MVM(p)のVP2遺伝子領域の遺伝子配列と68.5%一致した。このことから、本ウイルスは、既知のMPVとは異なる、新規のMPV株であることが示唆された。そこで、本ウイルスをMPV/UT株と命名した。なお、MPV/UT株のアミノ酸配列を配列番号1に、塩基配列を配列番号2に示した。
実施例2では、組換えプラスミドの作製と、大腸菌によるVP2タンパク質の大量発現・精製を行った。
まず、実施例1で作製したMPV/UT株のVP2遺伝子を、大腸菌用発現プラスミドベクターpGEX−5X−1に挿入し、大腸菌BL21株を形質転換した。具体的手順は、次の通りである。
実施例1でpGEM−T easyに組み込んでクローニングしたVP2遺伝子と、大腸菌用発現プラスミドベクターpGEX−5X−1を、それぞれ、制限酵素EcoRIとXhoIで切断し、両者をライゲーション(連結反応)した。そして、作製した組換えプラスミドで大腸菌BL21株を形質転換し、VP2抗原発現大腸菌を作製した。
次に、VP2抗原発現大腸菌の溶菌を、以下の手順により行った。形質転換したVP2抗原発現大腸菌を、室温(22〜25℃)、LB培地で振盪培養して、OD600が0.5〜0.8になった時点でIPTG(isopropyl−β−D thiogalactpyranoside)を0.4Mになるように添加した。IPTG添加後、さらに4時間振盪培養を続けてVP2タンパク質の発現誘導を行った。
発現誘導を行った培養菌液を2000g、10分、4℃で遠心して、上清を除去したのち、PBS(−)を、培養液の1/20量入れ、菌体ペレットを浮遊させた。そして、Triton X−100を1%になるように添加したのち、凍結融解と超音波破砕処理を行い、8000g、20分、4℃で遠心後上清を回収した。
次に、アフィニティークロマトグラフィーにより、前記手順で作製された大腸菌融解液からVP2タンパク質を回収・精製した。なお、本実験では、pGEX−5X−1を発現ベクターとして用いて、VP2タンパク質を、GST(glutathione S−transferase)との融合タンパク質(VP2−GST融合タンパク質)として発現させた。従って、glutathioneをリガントとするアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、目的のVP2タンパク質(VP2−GST融合タンパク質)を、簡便かつ高純度に精製することができた。
アフィニティークロマトグラフィーの具体的手順は次の通りである。上記の回収した上清に、上清50mlあたり1mlの50%glutathione Sepharose 4Bを添加し、室温で30分間転倒混和したのち、カラムに全量を移して液体分画を自然流下させた。次いで、glutathione Sepharose 4Bの20倍量のPBS(−)でカラムを3回洗浄し、続いて、glutathione Sepharose 4Bの2倍量の還元glutathioneを加えて室温で20分間静置した。静置後、カラムからの流下液を回収した。以下、同様の手順で、還元glutathioneを加えて室温で20分間静置し、静置後、カラムからの流下液を回収する操作を3回繰り返した。以上の手順により、カラムからの流下液の中に、VP2タンパク質が高濃度に含有するようになり、高純度のVP2タンパク質溶液を回収できた。
実施例3では、SDS−PAGEによるVP2−GST融合タンパク質の検出を行った。染色には、CBB(coomasie brilliant blue)を用いた。結果を図1に示す。
図1中、レーン1は分子量マーカー、レーン2はVP2−GST融合タンパク質発現大腸菌溶解液(精製前)、レーン3はVP2−GST融合タンパク質(精製後)である。
図1・レーン3に見られるように、VP2−GST融合タンパク質の分子量から予想される位置にバンドが検出された。
実施例4では、ウエスタンブロット法によるVP2−GST融合タンパク質の検出を行った。結果を図2に示す。
図2中、レーン1は分子量マーカー、レーン2はVP2−GST融合タンパク質発現大腸菌溶解液(精製前)、レーン3はVP2−GST融合タンパク質(精製後)である。
図2・レーン3に見られるように、免疫染色によって、VP2−GST融合タンパク質のバンドが検出された。従って、SDS−PAGE(実施例3)とウエスタンブロットの結果より、VP2タンパク質の発現と精製が明らかになった。
実施例5では、実施例2で作製したVP2−GST融合タンパク質を抗原として用いることにより、ELISA法に基づいて、MPV抗体を特異的に検出できることを示す実験を行った。手順を以下に示す。
まず、VP2−GST融合タンパク質を0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.8)で希釈し、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/mlの抗原溶液を調製した。そして、これらの抗原溶液を、96−wellマイクロプレートに200μl/wellずつ分注し、4℃で一晩静置した。
次に、250μl/wellの0.05%Tween20−PBS(−)で各wellを1分間ずつ3回振盪洗浄後、0.1% skim milk−PBS(−)を250μl/wellずつ加え、4℃で1時間静置した。そして、前記のマスキング処理後、液を捨ててプレートを乾燥させた。
次に、MPV実験感染マウス血清及び非感染マウス血清をそれぞれPBS(−)で1/40〜1/640まで2倍階段希釈し、その階段希釈血清を、上記マイクロプレートに200μl/wellずつ添加し、37℃、1時間の反応を行った。
次に、250μl/wellの0.05%Tween20−PBS(−)で各wellを1分間ずつ3回振盪洗浄し、洗浄後、ペルオキシダーゼ標識プロテインAを含む1%BSA−PBS(−)を200μl/wellずつ添加し、37℃で1時間の反応を行った。
そして、250μl/wellの0.05%Tween20−PBS(−)で各wellを1分間ずつ3回振盪洗浄し、洗浄後、1.5mg/ml、σ−フェニレンジアミン・2塩酸塩−0.01%H2O2−PBS(−)を200μl/wellずつ加え、遮光して37℃、10分間の発色反応を行った。3.5N硫酸を50μl/wellずつ加えて振盪混和し、混和後、492nmの測定波長で吸光度を測定した。
吸光度の測定結果を表1、表2及び図3、図4に示す。
表1、表2及び図3、図4に示すとおり、VP2が抗原となって、MPV感染マウスの血清中に含有する抗MPV抗体を、抗原抗体反応により検出することができることが示された。また、上記のELISAの結果は、抗原濃度及び抗体濃度依存的な反応強度を示している。従って、本発明により、MPV抗体を定量的にも測定可能であることが明らかになった。
本発明に係るVP2及び該タンパク質をコードするDNAは、抗MPV抗体に対する特異的抗原として、産業上の利用可能性がある。
本発明に係る組換えプラスミド、形質転換した大腸菌、及び、VP2作製方法は、抗MPV抗体の抗原であるVP2を大量作製できる点で、産業上有用である。
本発明に係る抗体検出キット及び抗体検出方法は、抗MPV抗体を高感度で検出できる点で、産業上有用である。
Claims (7)
- MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2。
- 請求項1記載のタンパク質をコードするDNA。
- 請求項1記載のタンパク質をコードするDNAを含む組換えプラスミド。
- 請求項1記載のタンパク質をコードするDNAを含む組換えプラスミドによって形質転換された大腸菌。
- MPV感染マウスの臓器をすりつぶした後遠心して得た乳剤上清を別のマウスに接種し、MPVを継代する手順と、
継代に用いたマウスの臓器を採取して、該臓器からDNAを抽出する手順と、
抽出したDNAのうち、VP2をコードする領域を増幅する手順と、
増幅したDNAを大腸菌に組み込んで形質転換する手順と、
を含むVP2作製方法。 - MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2を抗原として用いた抗体検出キット。
- MPV(マウスパルボウイルス)の構造タンパク質であるVP2を抗原として用いる抗体検出方法。
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