JP2002501368A - レプトスピラ病原体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般に、病原性細菌の新規な分離された種およびそれに由来する免疫反応性分子および組成物、例えば、ワクチン調製物における、それらの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）またはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）と表示されるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の新規な分離された血清型亜型およびその診断アッセイに関する。さらに、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、特に血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）またはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に対する動物被検体の受動的および能動的ワクチン接種を提供するワクチン組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 レプトスピラ病原体 本発明は、一般に、病原性細菌の新規な分離された種、およびそれに由来する 免疫反応性分子および組成物、例えば、ワクチン調製物におけるそれらの使用に 関する。本発明の組成物は、宿主生物を細菌感染に対して保護するとき有用であ る。さらに詳しくは、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属に属 する細菌の分離された血清群（ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ）、血清型亜型または種に関 する。なおさらに詳しくは、本発明は、「レプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａ ｉｎｅｉ）」と表示するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の新規な分離さ れた種または「ハーストブリッジ（ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）」と表示する新規 な分離されたレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）血清型亜型、およ び「血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）」と表示する血清型亜 型ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）と同 一の血清群に属する細菌、およびそれの診断アッセイに関する。本発明は、さら に、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、例えば、血清群ハーストブリッジ （Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）に属するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の 検出、同定および定量の方法、さらに詳しくは、レプトスピラ・ファイネイ（Ｌ ．ｆａｉｎｅｉ）の検出の方法、なおさらに詳しくは、血清型亜型ハーストブリ ッジの検出の方法に関する。さらに、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）、例えば、血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）に属す るレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対してヒトまたは動物の宿主を受動 的および能動 的にワクチン接種するワクチン組成物、さらに詳しくは、レプトスピラ・ファイ ネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）血清型亜型ハーストブリッジに対するワクチン組成物 に関する。 この明細書を通じて、特記しない限り、用語「含む」またはその変形「含み」 または「含んでなる」は、記載する完全体または完全体の群を包含するが、他の 完全体または完全体の群を排除しないことを意味する。 本明細書において使用するとき、用語「に由来する」は、特定の完全体または 完全体の群が特定した種から由来するが、必ずしも特定した源から直接的に得ら れなかったことを示すと理解すべきである。 この明細書において著者が言及する刊行物の引用文献の詳述は説明の終わりに 収集されている。この明細書において言及するヌクレオチド配列およびアミノ酸 配列についての配列番号（配列ＮＯ：）は、引用文献の後に規定されている。 レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌は、いくつかの既知の種から なる病原性または腐生性スピロヘータ〔病原性：レプトスピラ・インテルロガン ス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・イナダイ（Ｌ．ｉｎａｄａ ｉ）、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ（Ｌ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ）、レプトスピラ・サンタロサイ（Ｌ．ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）、レプトスピラ ・キルスクネリ（Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）、レプトスピラ・ウェイリイ（Ｌ ．ｗｅｉｌｉｉ）またはレプトスピラ・ノグチイ（Ｌ．ｎｏｇｕｃｈｉｉ）；腐 生性：レプトスピラ・バイフレクサ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ）、レプトスピラ・メ エリ（Ｌ．ｍｅｙｅｒｉ）またはレプトスピラ・ウォルバキイ（Ｌ．ｗｏｌｂａ ｃｈｉｉ）〕であって、それらの各々は多数の血清型亜型からなる。レプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の腐生性血清型亜型は新鮮な表面水の中に偏在し、 時々海水の中に見出される。病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清 型亜型は、種々の家畜動物、コンパニオン動物、野生動物およびヒトにおいて天 然に存在する。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清型亜型の宿主範囲は 一般に非常に広いが、細菌はそれが感染した各宿主生物において異なる症状を生 成することがある。 病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清型亜型が維持されている、 主要な（維持）宿主において、生殖疾患が典型的である。また、感染は無症候性 であることがある。病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清型亜型は 、また、哺乳動物において急性の、熱性、全身的疾患を引き起こすことがある。 また、急性熱性疾患は多数のヒトの感染の特徴を示す。 家畜動物、例えば、ブタおよび多分ウマおよびイヌまたは他の種において、病 原性レプトスピラ・インテルロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜 型ブラティスラバ（ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）は不妊、流産または死産に導く生殖 疾患を引き起こし、そして季節的不妊の可能な原因となる因子として引用された （Ｃｈａｐｐｅｌ等、１９９３ａ、ｂ；Ｅｌｌｉｓ等、１９８５；Ｅｌｌｉｓ等 、１９８６ａ、ｂ；Ｆｒａｎｚ等、１９８８）。レプトスピラ・インテルロガン ス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型ブラティスラバを原因とする感染 は、ヨーロッパおよび北アメリカのブタの群れにおける風土病である。オースト ラリアのブタの群れにおいて、病原性血清型亜型レプトスピラ・インテルロガン ス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型ポモナ（ｐｏｍｏｎａ）およびレ プトスピラ・ボルグペテルセニイ（Ｌ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）血清型 亜型タラッソビ（ｔａｒａｓｓｏｖｉ）は長い間認識 されてきている（Ｃｈａｐｐｅｌ等、１９８７ａ、ｂ；Ｃｈａｐｐｅｌ等、１９ ９０；Ｄａｖｏｓ、１９７７）が、多数のオーストラリアの群れは、また、顕微 鏡凝集試験、以後「ＭＡＴ」と呼ぶ、を使用してレプトスピラ・インテルロガン ス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型ブラティスラバの存在について陽 性であると試験された（Ｃｈａｐｐｅｌ等、１９９２；Ｃｈａｐｐｅｌ等、１９ ９３ａ、ｂ）。レプトスピラ・インテルロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎ ｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型ブラティスラバは、出発物質として感染した宿 主生物からの試料を使用して、標準的分離技術により御し難いことが知られてい る。この因子は、血清型亜型ブラティスラバによる感染に対して動物を特異的に 保護するワクチンのオーストラリアにおける製造を、今日まで妨げてきている。 本発明まで導いた研究において、本発明者らは、血清型亜型ブラティスラバに 対するＭＡＴ力価およびレプトスピラの場合の免疫化学的証拠を使用して、レプ トスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群、特にレプトスピラ・インテルロガン ス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型ブラティスラバをブタの群れから 分離することを探求した。驚くべきことには、ＭＡＴにおいて他の病原性血清型 亜型、例えば、血清型亜型ブラティスラバ、ポモナおよびタラッソビと交差反応 しない、新規なレプトスピラが分離された。この新規なレプトスピラは、顕微鏡 凝集アッセイ（ＭＡＴ）の結果に基づいて、抗原的に明確な血清群および血清型 亜型を形成し、そして核酸ハイブリダイゼーションデータに基づいて、遺伝的に 明確な種を形成する。新規なレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）およびそれ に由来する組換え核酸、ポリペプチドまたは免疫反応性、およびそれらの誘導体 、相同体または類似体は、従来入手可能でなかったレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓ ｐｉｒａ）感染のための、ある範囲の診 断および治療剤を開発する手段を提供する。 したがって、本発明の１つの面は、血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒ ｉｄｇｅ）または血清型亜型ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ （Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）種に属する分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓ ｐｉｒａ）細菌またはその誘導細菌を提供する。 用語「血清群」または「血清型亜型」は、血清学的型別データ、特に凝集アッ セイ、例えば、顕微鏡凝集試験（ＭＡＴ）を使用して得られたデータに基づく、 レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の分類に関する。 用語「血清型亜型」は、抗原的に同一である、１またはそれより多いレプトス ピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）種を意味する。定量的に、血清型亜型はＦａｉｎ ｅ（１９９４）が概説している交差凝集吸収技術により互いに区別される。 本発明の関係において、用語「血清型亜型ハーストブリッジ（ｈｕｒｓｔｂｒ ｉｄｇｅ）」は、交差凝集吸収基準（Ｆａｉｎｅ、１９９４）に従いＡＧＡＬ受 託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託されたレプトスピラ・ファイネイ（Ｌｅｐｔｏ ｓｐｉｒａ ｆａｉｎｅｉ）ＷＫＩＤ株またはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ． ｆａｉｎｅｉ）ＢＵＴ６株と交差反応性である、任意のレプトスピラを包含する ことを意味する。用語「血清型亜型ハーストブリッジ」は、本明細書において定 義する血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）に属する細菌にいか なる方法においても限定されない。 用語「血清群」は、そのメンバーが共有する群の抗原と交差凝集しかつ他の群 のメンバーと交差凝集しない、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の群を意 味し、結局、血清群のメンバーは簡単な交差凝集により互いに多少密接な抗原的 関係を有する。 したがって、用語「血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）」は 、そのメンバーがＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託されたレプトスピ ラ・ファイネイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｆａｉｎｅｉ）ＷＫＩＤ株またはレプ トスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）ＢＵＴ６株の共有した群の抗原と交 差凝集するが、本発明の日付においてこの分野において知られている他の群のメ ンバーと簡単な交差凝集試験においてと交差凝集しない。用語「血清群ハースト ブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）」は、上に定義した血清型亜型ハーストブ リッジに属する細菌にいかなる方法においても限定されない。 レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を異なる種に分類することは、この分 野において知られており、全体のゲノムＤＮＡが他のレプトスピラのゲノムＤＮ Ａに対する相同率が４０％より低い１つのレプトスピラを言及するために使用さ れる。したがって、本発明において使用するとき、種の定義「レプトスピラ・フ ァイネイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｆａｉｎｅｉ）」または「レプトスピラ・フ ァイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）」は、標準的ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーショ ンおよび分析技術を使用して測定して、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で 寄託されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）またはレプトスピラ（Ｌｅｐ ｔｏｓｐｉｒａ）ＢＵＴ６株に由来するゲノムＤＮＡと少なくとも４０％相同性 であるゲノムＤＮＡを含む、任意のレプトスピラ細菌を意味する。 当業者は知っているように、血清型亜型および血清群の抗原は細胞表面のモザ イクでありそして、結局、血清型亜型ハーストブリッジおよび／または血清群ハ ーストブリッジに属する細菌の間に厳格な描写は存在しないであろう。そのうえ 、異なる種に属するレプトスピラは、抗原決定により区別できないので、同一の 血清型亜型ま たは血清群に分類することができる。 本発明は、明らかなように、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハース トブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｆａｉｎ ｅｉ）に属する、任意の細菌に拡張される。 本発明に関して、血清群ハーストブリッジまたは血清型亜型ハーストブリッジ の典型的なレプトスピラ・ファイネイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｆａｉｎｅｉ） 細菌は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認についてのブダベ スト条約の規定に従い、寄託機関の参照ＷＫＩＤ（ＶＩＡＳ）として、オースト ラリア政府分析研究所（Ａｕｓｔｒａ１ｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａ ｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＡＧＡＬ）、１ Ｓｕａｋｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｙｍｂｌｅ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ ２０７３、 Ａｕｓｔｒａｌｉａ（Ｐｏｓｔａｌ Ａｄｄｒｅｓｓ：ＰＯ Ｂｏｘ ３８５ Ｐｙｍｂｌｅ ＮＳＷ ２０７３ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に１９９５年１１月１ ５日に寄託され、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４を与えられた。 レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＷＫＩＤおよびＢＵＴ６株は、本来、 実施例に記載するようにオーストラリアのニュー・サウス・ウェールズ州および ヴィクトリア州の異なる群れにおいて分離された（例えば、表３参照）。これら の分離株の双方は、ＤＮＡハイブリダイゼーション分析に基づいて、現在レプト スピラ・ファイネイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｆａｉｎｅｉ）として知られてい る株に属し、ならびにＭＡＴを使用する血清学的基準に基づいて、血清群ハース トブリッジおよび血清型亜型ハーストブリッジに属する。 本発明のレプトスピラ細菌の「誘導体」は、上に定義したレプト スピラの血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプ トスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の突然変異、組換え、接合または形 質転換により発生した細菌である。好ましくは、血清群ハーストブリッジまたは 血清型亜型ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅ ｉ）の誘導体は、本明細書において定義する血清群ハーストブリッジまたは血清 型亜型ハーストブリッジと血清学的に交差反応性または免疫学的に交差反応性で あるか、あるいは上に定義したレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ） 、特にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４を割り当てられたレプトスピラまた はレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＢＵＴ６株に遺伝的に関係する。この ような誘導体を生産する方法はこの分野において知られている。 したがって、本発明のこの面は、本明細書において例示するＡＧＡＬ受託番号 Ｎ９５／６９６８４で寄託されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）または レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＢＵＴ６株の１またはそれより多い抗原 決定基とＭＡＴにおいて抗原的に交差反応性である分離された病原性レプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌、および／またはＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６ ９６８４で寄託されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）またはレプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＢＵＴ６株またはそれらの誘導細菌に由来するゲノ ムＤＮＡと少なくとも４０％相同性であるゲノムＤＮＡを含む分離された病原性 レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌に関する。 本発明の特に好ましい態様において、レプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉ ｎｅｉ）または血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジに属 する細菌は約１３℃〜約３７℃、好ましくは１３℃〜３７℃の温度、より好まし くは約１３℃において増殖 する。さらに、主題のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、８−アザグア ニンまたは５−フルオロウラシル、より好ましくは少なくとも１００μｇ／ｍｌ の８−アザグアニン、なおより好ましくは少なくとも１５０μｇ／ｍｌの８−ア ザグアニン、なおさらにより好ましくは少なくとも２００μｇ／ｍｌの８−アザ グアニン、なおさらにより好ましくは少なくとも２５０μｇ／ｍｌの、または５ ００μｇ／ｍｌまでの濃度の８−アザグアニンの存在において増殖することが特 に好ましい。 より好ましい態様において、前記細菌はヒトまたはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ 、ウマ、シカ、アルパカ、イヌおよびネコからなるリストから選択される家畜ま たはコンパニオン動物をさらに感染することができる。 なおより好ましい態様において、前記病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉ ｒａ）細菌は、前記ヒトまたは動物を感染することができ、そして本明細書にお いて記載する生殖疾患を誘発することができる。 用語「生殖疾患」は、本発明において使用するとき、ヒトまたは他の動物、特 にブタまたはウシの、前記ヒトまたは動物の生殖能力を減少させる、増殖系の異 常性、例えば、前記ヒトまたは動物の不妊により特徴づけられる異常性、例えば 、前記ヒトまたは動物における季節的不妊または異常な発育または前記ヒトまた は動物における胎児の自発的流産または前記ヒトまたは動物により考えられる不 全を意味する。本発明の関係において、用語「生殖疾患」は、また、発育の減少 または遅延、例えば、妊娠の間にまたは妊娠するようになる前に感染した動物に おける離乳−交尾の期間の増加を包含する。このような生殖疾患は、レプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の病原性細菌、特にレプトスピラの血清型亜型ハ ーストブリッ ジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉ ｎｅｉ）またはその誘導細菌により引き起こされる。 別の態様において、本発明は、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒ ａ ｉｎａｄａｉ）血清型亜型リメ（ｌｙｍｅ）のｒＲＮＡ遺伝的配列に対して 少なくとも８０％同一でありかつレプトスピラ・バイフレクサ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ）血清型亜型パトク（ｐａｔｏｃ）のｒＲＮＡ遺伝的配 列に対する８０％より低い同一性を有する、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ ）遺伝子のヌクレオチドからの遺伝的配列を含有する、分離されたレプトスピラ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはその誘導細菌を提供し、ここで前記病原性 細菌は約１３℃〜約３７℃の温度においておよび／または少なくとも１００μｇ ／ｍｌの８−アザグアニン、好ましくは少なくとも１５０μｇ／ｍｌの８−アザ グアニン、より好ましくは少なくとも２００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、な おより好ましくは少なくとも２５０μｇ／ｍｌの、または５００μｇ／ｍｌまで の濃度の８−アザグアニンの存在において増殖することができる。 好ましい態様において、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌 または誘導血清型亜型は病原性細菌としてさらに特徴づけられる。 より好ましくは、本発明の病原性細菌は、ヒトまたは家畜動物、特にヒトまた はブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ、イヌおよびネコからなる リストから選択される家畜動物またはコンパニオン動物、例えば、なかでも、イ ヌまたはネコをさらに感染することができる。 病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が前記家畜動物を感染する 、本発明のこの態様によれば、前記細菌はそれにおけ る生殖疾患を誘発することが最も好ましい。 本発明の別の態様において、配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに 記載するヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％同一である遺伝的配列ま たはそれらの補体、またはそれらの誘導体、相同体または類似体を含有する、分 離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはその誘導体が提供さ れる。 配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレオチド配列に 対する同一性の百分率が少なくとも約８５％であることが好ましい。本発明のこ の態様によれば、前記病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌または その誘導細菌の遺伝物質は、配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに対 して少なくとも９０％同一である、なおより好ましくは少なくとも９７％同一で ある、なおより好ましくは少なくとも９９％同一でありかつ１００％の同一性を 包含することがより好ましい。 命名の目的で、配列ＮＯ：１に記載するヌクレオチド配列は、血清型亜型ハー ストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（ Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の分離株のｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列に関する。配 列ＮＯ：２〜７に記載するヌクレオチド配列は、種または血清群ハーストブリッ ジの病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の診断的検出に特に有用 であることを本発明者らが示した、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハ ーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）のｒＲＮ Ａ遺伝子のヌクレオチド配列に対して特異的なプライマー配列に関する。さらに 詳しくは、配列ＮＯ：２〜３に記載するヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖 反応を使用する、種または血清群ハーストブリッジの病原性レプトスピラ（Ｌｅ ｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の診断的検出のためのプライマー対として 有用である。 さらに別の態様において、本発明は、配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれ か１つに記載するヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列、または それらの誘導体、相同体または類似体に対して、高いストリンジェンシイ条件下 に、ハイブリダイゼーションすることができる遺伝物質を含有する、分離された 病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはその誘導細菌を提供す る。 好ましくは、前記遺伝物質はＲＮＡまたはＤＮＡを含むリストから選択される 。 さらに別の態様において、本発明は、ヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡ −３’に対して少なくとも８０％同一であるか、あるいはヌクレオチド配列５’ −ＴＴＴＧＡＴＡ−３’に対して少なくとも９０％同一であるか、あるいはヌク レオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡ（Ｎ）₈ＴＴＴＧＡＴＡ−３’または補体、 またはそれらの誘導体、相同体または類似体（ここでＮは任意のヌクレオチド残 基である）に対して少なくとも９０％同一である、ヌクレオチド配列からなるｒ ＲＮＡ遺伝子を含有する、分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細 菌またはその誘導細菌を提供する。 より好ましくは、本発明の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 細菌またはその誘導細菌は、ヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＡ ＡＧＡＴＴＴＧＡＴＡ−３’または補体、または誘導体、相同体または類似体に 対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＲＮＡ遺伝子を含 有する。 この態様によれば、種レプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）または 血清群ハーストブリッジまたは血清型亜型ハーストブリッジに対してユニークで あるレプトスピラが属しかつ診断的用途 に特に適するｒＲＮＡ遺伝子の領域を本発明者らは発見した。本発明は、単離さ れたヌクレオチド配列および前記ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに 明らかに拡張される。 前記病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌は、さらに、約１３℃ 〜約３７℃の温度においておよび／または少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−ア ザグアニン、好ましくは少なくとも１５０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、より 好ましくは少なくとも２００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、なおより好ましく は少なくとも２５０μｇ／ｍｌの、または５００μｇ／ｍｌまでの濃度の８−ア ザグアニンの存在において増殖することができる。 より好ましくは、本発明は、配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに 記載するヌクレオチド配列またはそれに対する相補的ヌクレオチド配列またはそ れらの誘導体、相同体または類似体に対して、高いストリンジェンシイ条件下に 、ハイブリダイゼーションすることができるＲＮＡまたはＤＮＡを含有する、分 離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはその誘導細菌 を提供し、ここで前記細菌はさらに約１３℃〜約３７℃の温度においておよび／ または少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、好ましくは少なくとも １５０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、より好ましくは少なくとも２００μｇ／ ｍｌの８−アザグアニン、なおより好ましくは少なくとも２５０μｇ／ｍｌの、 または５００μｇ／ｍｌまでの濃度の８−アザグアニンの存在において増殖する ことができる。 ストリンジェンシイのレベルを定義する目的で、高いストリンジェンシイはこ こにおいてサザンハイブリダイゼーションおよび／またはその後０．１×ＳＳＣ 緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で６５℃において実施される洗浄として定 義される。サザンハイブリ ダイゼーションにおいて、ストリンジェンシイは一般にＳＳＣ緩衝液の濃度を減 少し、および／またはＳＤＳの濃度を増加し、および／またはハイブリダイゼー ションおよび／または洗浄の温度を増加することによって増加される。サザンハ イブリダイゼーションおよび洗浄の条件を当業者はよく理解している。明瞭化の 目的で、（核酸分子の間のハイブリダイゼーションに影響を与えるパラメーター に対して）、引用はＡｕｓｕｂｅｌ等（１９８７）のｐ．２．１０．８−２．１ ０．１６（これは引用することによって本明細書の一部とされる）において見出 される。 また、高いストリンジェンシイは、また、本明細書において例示するように、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における核酸プライマーのアニーリングに適当 な条件に従い定められる。 本発明の特に好ましい態様において、下記の分離された細菌または血清群が提 供される： １．レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属に属する病原性種である； ２．約１３℃〜約３７℃の範囲の温度において増殖する； ３．少なくとも２２５μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含有する培地中で増殖 する； ４．ヒトまたは家畜またはコンパニオン動物、特に、なかでも、ブタ、ウシ、 ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ、イヌおよびネコからなるリストから選択 される家畜またはコンパニオン動物を感染することができる； ５．前記感染した動物の少なくとも１つにおいて上に定義した生殖疾患を誘発 することができる；そして ６．ヌクレオチド配列を含む遺伝的配列を含有するか、あるいは配列ＮＯ：１ 〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレオ チド配列またはそれに対して相補的なヌクレオチド配列またはそれらの誘導体、 相同体または類似体に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含 む遺伝的配列に対して相補的である遺伝的配列を含有する。 最も特に好ましい態様において、本発明は、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６ ８４でＡＧＡＬに寄託された微生物の特性または属性を有するか、あるいは微生 物Ｎ９５／６９６８４と同一の血清群（Ｆａｉｎｅ、１９９４により定義された ）の範囲内であるか、あるいは微生物Ｎ９５／６９６８４と同一種であるか、あ るいは顕微鏡凝集試験（ＭＡＴ）において微生物Ｎ９５／６９６８４と免疫学的 に反応性である、血清群ハーストブリッジまたは血清型亜型ハーストブリッジま たはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に属する、分離された病原 性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌を提供する。 なおより好ましくは、本明細書において定義する血清型亜型ハーストブリッジ または血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎ ｅｉ）に属する細菌は、ヒトおよび／または家畜またはコンパニオン動物、特に 、なかでも、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ、イヌおよびネ コからなるリストから選択される家畜またはコンパニオン動物の病原体である。 本発明の他の態様は、上に定義したレプトスピラの血清型亜型ハーストブリッ ジの分離された血清型亜型またはその誘導細菌を提供する。好ましくは、レプト スピラの血清型亜型ハーストブリッジの前記血清型亜型は、１９９５年１１月１ ５日にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託された株と遺伝的 に交差反応性または免疫学的に交差反応性である。 より好ましくは、前記血清型亜型は１９９５年１１月１５日にＡ ＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託された株と同一である。 本発明のこの態様によれば、前記分離された血清型亜型は、関係する技術にお ける当業者に知られている任意の手段により、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６ ８４でＡＧＡＬに寄託されたレプトスピラの血清型亜型と免疫学的に交差反応性 であるか、あるいは遺伝的に交差反応性であるか、あるいは遺伝的に交差ハイブ リダイゼーションさせることができることによって、決定することができ、この ような手段は血清学的、免疫学的または分子生物学的手段を包含するが、これら に限定されない。血清学的手段はＭＡＴ力価の推定（Ｃｏｌｅ等、１９７３；Ｃ ｈａｐｐｅｌ、１９９３ａ）を包含する。免疫学的手段は、なかでも、ＥＬＩＳ Ａ、ウェスタンブロット免疫電気泳動、免疫拡散技術、ロケットゲル電気泳動、 ラジオイムノアッセイ技術を包含する。分子生物学的手段は、なかでも、核酸ハ イブリダイゼーション、核酸配列決定技術、ポリメラーゼ連鎖反応技術およびそ れらに対する変法を包含する。本発明のレプトスピラの型別において、これらの 手順に適用できる変法および最適化を当業者は知っているであろう。 この面に従い説明した本発明は、液体または固体の形態、例えば、グリセロー ルのストック、スタブ、スロープ、プレート、または、例えば、膜のフィルター または紙ディスク上で、凍結乾燥または他の方法で乾燥された形態、の培養物と して提供されるとき、前記分離された細菌に拡張される。 本発明の第２面は、工程： １．病原体で感染した宿主物からヒトまたは動物の組織を収集し； ２．病原性細菌の完全性を維持するために適当な均質化媒質中で 前記組織を均質化し；そして ３．細菌を必要な密度に増殖させるために十分な時間の間培地中で、レプトス ピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌を含有する前記組織を培養する； を含む、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の血清型亜型ハーストブ リッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆ ａｉｎｅｉ）またはそれらの免疫学的に交差反応性または遺伝的に交差反応性の 血清型亜型または誘導細菌を分離する方法に関する。 培地はレプトスピラ細菌を培養する目的に適当な任意の培地であることができ 、これらの培地は一般にこの分野において知られており、例えば、Ｃｈａｐｐｅ ｌ（１９９３ｂ）が記載するＥＭＪＨ培地である。 本発明のこの面によれば、培養物の生活能力を維持するために、レプトスピラ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の前記培養はある間隔における継代培養を必要とする ことがあることを当業者は気づくであろう。このような継代培養は、細菌の生活 能力および／または増殖に対して必須である、培地中の栄養素を置換する働きを する。十分なサイクルの継代培養を実施する場合、これは究極的に宿主生物に由 来する汚染組織を本質的に含まない細菌培養物を産生する。 好ましくは、前記病原体を得るヒトまたは動物の組織は、血液であるか、ある いは膀胱、腎臓、子宮またはファロピウス管、精巣または卵巣からなるリストか ら選択される尿生殖路であるか、あるいは、なかでも、肝臓または肺の組織から 、または体液または滲出物、例えば、尿または脳脊髄液からの組織である。より 好ましくは、前記組織は、特にヒトまたはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シ カ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから選択される家畜ま たはコンパニオン動物における、病原性レプトスピラの血清型亜型ハーストブリ ッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａ ｉｎｅｉ）の好ましい宿主に由来する。 当業者は理解するように、ある範囲の使用できる適当な均質化媒質が存在し、 唯一の要件は使用する特定の均質化媒質が細菌を生存可能な状態に維持し、こう して生存可能な培養物を確立するために十分に生存可能な細胞がホモジネートの 中に存在するようにすることである。 本発明は、例えば、リン酸塩緩衝化アルブミンを含有する培地を包含する、主 題のレプトスピラの分離における、任意の適当な均質化媒質の使用に拡張される 。 好ましくは、培地は、８−アザグアニンに加えて、なかでも、５−フルオロウ ラシルと、リファマイシン、マクロリドポリエンおよびキノリンの抗生物質を含 むリストから選択される少なくとも１種の抗生物質を含有する。 リファマイシン抗生物質は、グラム陽性細菌およびある種のグラム陰性細菌に 対して活性であるが、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌を包含するス ピロヘータ細菌が耐性である、高置換大環状化合物である。リファマイシンは、 真性細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを特異的に阻害し、β−サブユニッ トに結合し、そして転写を阻害する。 マクロリドポリエンは、非置換トランス−共役二重結合の剛性、親油性領域お よび柔軟性、親水性ヒドロキシル化領域を含有する、置換または非置換のラクト ンにより特徴づけられる。マクロリドポリエンは細胞質膜中のステロールと相互 作用し、イオンおよび小さい分子の漏出を引き起こす。マクロリド抗生物質は、 膜の中にステロールを含有しない細菌に対して有効ではない。マクロリド抗生物 質は、酵母および他の真菌に対しておよび膜の中にステロールを含有する原生動 物に対して、低い濃度において静菌性であるか、あるいは高い濃度において殺菌 性である。好ましいマクロリドポリエンは、なかでも、アンホテリシン、オーレ オフンギン、カンジシジンＢ、エトルスコマイシン、フィリピン、ハマイシン、 ヒスタチン、プリマイシン、プリマリシンおよびトリコマイシンを含むリストか ら選択される。 キノリン抗生物質は置換４−キノリン環を含有し、グラム陰性細菌に対して主 として活性である。好ましいキノリン抗生物質は、なかでも、ナラジキン酸、シ ノキサシン、オキソリン酸、ピペミジン酸、シプロフロキサシン、エノキサシン 、ノルフロキサシン、オフロキサシンまたはペルフロキサシンを含むリストから 選択される抗生物質を包含するが、これらに限定されない。 本発明によるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の分離のために提供 される抗生物質のリストは限定的ではなく、当業者は理解するように、別のまた は追加の抗生物質を使用することができる。また、当業者は知っているように、 病原性レプトスピラを分離すべき組織は、前記レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉ ｒａ）細菌に加えて、いくつかの汚染微生物を含有することができ、そして使用 するために選択される抗生物質の特定の組合わせは存在する汚染微生物の特質に 依存して変化するであろう。本発明は、明らかなように、前記病原性レプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の分離に使用される培地において、追加の抗生 物質を使用することを包含する。 特に好ましい態様において、本発明は、前記細菌が１９９５年１１月１５日に ＡＧＡＬに寄託され、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４を割り当てられた血 清型亜型である、上に記載した病原性レ プトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌を分離する方法を提供する。 特に好ましい態様において、前記方法は、１９９５年１１月１５日にＡＧＡＬ に寄託され、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４を割り当てられた病原性レプ トスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の分離に有用である。 本発明の第３の面は、本質的に本明細書において記載する方法に従い、病原性 レプトスピラの血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまた はレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）またはその誘導細菌の分離に おいて使用するための薬品および化学的組成物を提供する。 本発明の好ましい態様において、薬品または化学的組成物は本発明のレプトス ピラの選択的増殖のための培地である。 本発明のこの面によれば、薬品または化学的組成物は粉末、タブレット、ペレ ット、カプセルまたは他の形態であることができる。 本発明は、前記薬品または化学的組成物を、病原性微生物、好ましい病原性細 菌、より好ましくは病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌、特にレ プトスピラの血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたは レプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、例えば、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ ９５／６９６８４で寄託された株またはその誘導細菌の分離、検出、精製、培養 または貯蔵するために使用するか、あるいは使用することを意図する、薬品また は化学的組成物に拡張される。 本発明の第４の面は、本発明の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子またはそれらの誘導体、相同体または類似体に対応 するヌクレオチド配列に対応するか、あるいはそれに対して相補的であるヌクレ オチド配列を含む、単離さ れた核酸分子を提供する。 本明細書における「遺伝子」に対する言及はその最も広い関係において解釈さ れ、そして下記のものを包含する： （ｉ）転写および／または翻訳の調節配列および／またはコーディング範囲およ び／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列 ）から成る古典的ゲノム遺伝子；また（ｉｉ）遺伝子のコーディング領域（すな わち、エクソン）および５’−および３’−非翻訳配列に対応するｍＲＮＡまた はｃＤＮＡ。 用語「遺伝子」は、また、機能的産物のすべてまたは一部分をコードする合成 または融合分子を記載するために使用される。好ましいｒＲＮＡ遺伝子は、天然 に存在する血清型亜型、特に血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハースト ブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）から、標準的組 換え技術により、誘導することができる。一般に、ｒＲＮＡ遺伝子を突然変異誘 発させて、単一または多数のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を引 き起こすことができる。本発明のｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド挿入誘導体は、 ５’および３’末端の融合ならびに単一または多数のヌクレオチドの配列内挿入 を包含する。挿入ヌクレオチド配列変異型は１またはそれより多いヌクレオチド がヌクレオチド配列中の前もって決定された部位の中に導入されたものであるが 、また、ランダム挿入は可能であり、生ずる産物を適当にスクリーニングする。 欠失変異型は配列からの１またはそれより多いヌクレオチドの除去により特徴づ けられる。置換ヌクレオチド変異型は、配列中の少なくとも１つのヌクレオチド が除去され、そしてその場所に異なるヌクレオチドが挿入されているものである 。 したがって、本発明の単離された核酸分子は、一本鎖または二本 鎖の形態のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチド分子 を含むことができる。さらに、本発明はこのような分子のコンフォメーション異 性体に拡張される。 好ましくは、単離された核酸分子は、配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれ か１つに記載するヌクレオチド配列または補体、またはそれらの誘導体、相同体 または類似体に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む。 別の態様において、単離された核酸分子は、少なくとも、ヌクレオチド配列５ ’−ＴＧＴＴＧＧＡ−３’に対して少なくとも８０％同一であるか、あるいはヌ クレオチド配列５’−ＴＴＴＧＡＴＡ−３’に対して少なくとも９０％同一であ るか、あるいはヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡ（Ｎ）₈ＴＴＴＧＡＴＡ −３’または補体、またはそれらの誘導体、相同体または類似体（ここでＮは任 意のヌクレオチド残基である）に対して少なくとも９０％同一である、ヌクレオ チド配列を含む。 より好ましくは、単離された核酸分子は、ヌクレオチト配列： ５’−ＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＡ−３’または補体、ま たはそれらの誘導体、相同体または類似体に対して少なくとも８５％同一である ヌクレオチド配列を含む。 またあるいはさらに、単離された核酸分子は、高いストリンジェンシイ条件下 に、前述のヌクレオチド配列の任意の１つ、またはその相補的ヌクレオチド配列 、またはそれらの誘導体、相同体または類似体にハイブリダイゼーションするこ とができる。 この目的で、ヌクレオチド配列の相同体は、前記配列内に１またはそれより多 いヌクレオチドの置換、挿入、欠失、または再配置の存在にかかわらず、本発明 の核酸分子またはその相補的ヌクレオチド配列と実質的に同一であるか、あるい はそれに対して少なくとも ８０％同一である、単離された核酸分子を言及するために使用される。 本明細書において記載するヌクレオチド配列の類似体は、前記単離された核酸 分子の中に通常存在しない非ヌクレオシド構成成分、なかでも、例えば、炭水化 物、放射性ヌクレオチドを包含する放射性化学物質、リポーター分子、例えば、 ＤＩＧ、アルカリ性ホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、の 存在にかかわらず、本発明の核酸分子またはその相補的ヌクレオチド配列と実質 的に同一である、単離された核酸分子を言及するために使用される。 本明細書において記載するヌクレオチド配列の誘導体は、前記配列またはその 一部分に対する有意な類似性を含有する、単離された核酸分子を言及するために 使用される。一般に、本発明のヌクレオチド配列を突然変異誘発させて、単一ま たは多数のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を生成する。本発明の ヌクレオチド配列のヌクレオチド挿入誘導体は、５’および３’末端の融合なら びに単一または多数のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の配列内挿入を包 含する。挿入のヌクレオチド配列の変異型は、１またはそれより多いヌクレオチ ドまたはヌクレオチド類似体が前記配列のヌクレオチド配列中の前もって決定さ れた部位の中に挿入されているものであるが、ランダム挿入は可能であり、生ず る産物を適当にスクリーニングする。欠失変異型はヌクレオチド配列からの１ま たはそれより多いヌクレオチドの除去により特徴づけられる。置換ヌクレオチド 変異型は、配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが除去され、そしてその場所 に異なるヌクレオチドが挿入されているものである。 好ましい相同体、類似体および誘導体は、少なくとも約５〜１５ ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１５〜３０ヌクレオチドの長 さからなり、本明細書において記載する本発明のヌクレオチド配列に対して約８ ０％同一である。また、本明細書において記載する相同体、類似体および誘導体 は、さらに、本明細書において記載する本発明のヌクレオチド配列のいずれか１ つに対して少なくとも約９０％同一である、より好ましくは少なくとも約９５％ 同一である、さらにより好ましくは少なくとも約９７％同一である、なおより好 ましくは少なくとも約９９％同一であるヌクレオチド配列からなる。特に好まし い相同体、類似体および誘導体は、本明細書において記載する本発明のヌクレオ チド配列のいずれか１つから誘導された少なくとも約１５〜１８ヌクレオチドの 長さからなる。 本発明の目的に対して、本発明の核酸分子は、ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９ ６８４で寄託されたレプトスピラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝的配列であることが好ま しい。当業者に知られているように、寄託されたレプトスピラの誘導細菌または 同一種に属する細菌は、いっそう遠く関係するか、あるいは無関係のレプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）から得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝的配列よりも、血 清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の１６ＳｒＲＮＡにいっそう密接に関係する、 １６ＳｒＲＮＡ遺伝的配列を一般に含有するであろう。結局、本発明の遺伝的配 列は、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が血清型亜型ハースト ブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ． ｆａｉｎｅｉ）に密接に関係するか否かを決定するとき、少なくとも有用である 。前記遺伝的配列は、また、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハースト ブリッジまたはレプトスピラ・ファイネ イ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に密接に関係するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ）の血清型亜型からの遺伝的配列の分離において有用である。 血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピ ラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に関係するレプトスピラを同定するために 使用することができる核酸ハイブリダイゼーション技術、特にこのような同定手 順において使用することができる種々のハイブリダイゼーションストリンジェン シイを当業者は知っているであろう。ストリンジェンシイのレベルを定義する目 的で、低いストリンジェンシイは６×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ 中で２８℃において実施されるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄であ ると、ここにおいて定義される。一般に、ＳＳＣ緩衝液の濃度の減少、および／ またはＳＤＳの濃度の増加および／またはハイブリダイゼーションおよび／また は洗浄の温度の増加により、ストリンジェンシイは増加される。ハイブリダイゼ ーションおよび洗浄の条件を当業者はよく理解している。核酸分子の間のハイブ リダイゼーションに影響を与えるパラメーターを明瞭にする目的で、言及はＡｕ ｓｕｂｅｌ等（１９８７）のｐ．２．１０．８−２．１０．１６（これは引用す ることによって本明細書の一部とされる）において見出される。 当業者は理解するように、本発明の核酸分子は天然に存在する配列に対応する か、あるいは１またはそれより多いヌクレオチドの置換、欠失および／または付 加により異なることができる。したがって、本発明は、ｒＲＮＡ遺伝子およびそ れらの任意の分離された、合成または組換え遺伝子、オリゴヌクレオチド、突然 変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体または類似体に拡張され、これ らは、例えば、前記遺伝子の酵素的または化学的合成における遺伝 的プローブ、またはプライマー配列として、あるいは免疫学的に相互作用性組換 え分子の発生において、あるいは病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 細菌の分離または検出において、少なくとも有用である。 特に好ましい態様において、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハース トブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）のｒＲＮＡ遺 伝的配列またはそれらの誘導体、相同体または類似体は、病原性レプトスピラ（ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌で感染され得る、宿主生物の細胞、組織または器官 の型、特に、なかでも、膀胱、子宮またはファロピウス管または体液または滲出 物、例えば、尿または脳脊髄液を包含する尿生殖路の細胞、組織または器官から の同様な遺伝子を同定するために使用される。 この態様によれば、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が感染 することができる宿主生物における関係するｒＲＮＡ遺伝的配列を同定する方法 が考えられ、この方法は前記宿主生物から得られた細胞の抽出物または核酸の試 料を、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプト スピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）から誘導された、ハイブリダイゼーシ ョン有効量のｒＲＮＡ遺伝的配列またはその機能的部分と接触させ、次いで前記 ハイブリダイゼーションを検出することを含む。したがって、本発明のこの態様 は、また、レプトスピラの血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブ リッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、特に１９９５年 １１月１５日にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託されたレ プトスピラの株、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の血清型亜型を同定す る方法に関する。 前記ｒＲＮＡ遺伝的配列を、同定シグナルを与えることができる リポーター分子（例えば、放射性同位元素、例えば、³²Ｐまたは³⁵Ｓまたはビオ チニル化分子）で標識化することができる。 本発明において考えられる別の方法は、本発明のｒＲＮＡ配列またはその相補 的配列から誘導された少なくとも１５ヌクレオチド長さの２つの核酸「プライマ ー分子」を、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の存在について 試験される宿主ヒトまたは他の動物の細胞、組織または器官から誘導された核酸 「鋳型分子」にハイブリダイゼーションさせることを包含し、前記鋳型分子はこ こにおいて関係するレプトスピラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝的配列、またはその機能 的部分、またはその相補的配列として定義される。鋳型分子の特定の核酸分子の コピーをポリメラーゼ連鎖反応において酵素的に増幅する。前記鋳型分子を分離 する方法およびポリメラーゼ連鎖反応の方法はこの分野において知られている。 核酸プライマー分子は一般に一本鎖合成オリゴヌクレオチドであるが、本発明 は他のプライマーをまた包含する。この態様によれば、核酸プライマー分子は、 ポリヌクレオチド分子の中に組込むすることができる、任意のヌクレオチドのア デニン、シチジン、グアニン、チミジン、またはイノシン、またはそれらの機能 的類似体または誘導体の組合わせから成る。 好ましくは、各核酸プライマー分子は、血清型亜型ハーストブリッジまたは血 清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の １６ＳｒＲＮＡのヌクレオチド配列、またはその機能的部分、相同体または類似 体から誘導された、あるいはそれに対して相補的である、少なくとも１５ヌクレ オチド長さのヌクレオチド配列である。特に好ましい態様において、少なくとも １つのプライマー分子は配列ＮＯ：２および３に記載するヌクレオチド配列と実 質的に同一であるか、あるいはそれに対して相補的で ある。 核酸鋳型分子は、組換え形態、ウイルス粒子、バクテリオファージ粒子、酵母 細胞、動物細胞、または植物細胞であることができる。好ましくは、関係する遺 伝的配列は、必要に応じて病原性レプトスピラ細菌、例えば、血清型亜型ハース トブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ ．ｆａｉｎｅｉ）で感染した、哺乳動物の細胞、組織または器官に由来する。よ り好ましくは、哺乳動物の細胞、組織または器官は、さらに、前記細菌で感染さ れることができる、ヒトまたは家畜またはコンパニオン動物、特に、なかでも、 ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ、イヌおよびネコからなるリ ストから選択される家畜またはコンパニオン動物に由来する。 本発明のそれ以上の面は、約１３℃〜約３７℃の温度においておよび／または 少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、好ましくは少なくとも１５０ μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、より好ましくは少なくとも２００μｇ／ｍｌの ８−アザグアニン、なおより好ましくは少なくとも２５０μｇ／ｍｌの、または ５００μｇ／ｍｌまでの濃度の８−アザグアニンの存在において増殖する病原性 レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはその誘導細菌の１またはそれ より多い免疫原に対して製造された、免疫学的に相互作用性の分子を提供する。 特に好ましい態様において、細菌は本発明のレプトスピラまたはその誘導細菌 である。最も特に好ましい態様において、前記細菌は１９９５年１１月１５日に ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託されたレプトスピラの株 またはその誘導細菌である。 用語「免疫学的に相互作用性の分子」は、本発明において使用す るとき、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその機能的誘導体、 例えば、Ｆａｂ、ＳＣＡＢＳ（一本鎖抗体）または酵素、放射性または蛍光性標 識に結合した抗体を包含すると解釈すべきであり、唯一の要件は前記免疫学的に 相互作用性の分子がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、特に血清型亜型ハ ーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ （Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）から誘導されるか、あるいはその中に存在するか、あるい はその表面上に存在する免疫原に結合することができることである。 本発明の別の態様において、本発明は、約１３℃〜約３７℃の温度においてお よび／または少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、好ましくは少な くとも１５０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、より好ましくは少なくとも２００ μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、なおより好ましくは少なくとも２５０μｇ／ｍ ｌの、または５００μｇ／ｍｌまでの濃度の８−アザグアニンの存在において増 殖することができる病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはそ の誘導細菌の１またはそれより多い免疫原に対して製造された、免疫学的に相互 作用性の分子を提供し、ここで前記免疫原の少なくとも１つは表面のリポ多糖分 子である。 本発明の特に好ましい態様において、前記レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒ ａ）細菌は血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレ プトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）またはその誘導細菌である。最も 好ましくは、前記細菌は１９９５年１１月１５日にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６ ９６８４でＡＧＡＬに寄託されたレプトスピラの株またはその誘導細菌である。 関係する態様において、本発明の免疫学的に相互作用性の分子は、病原性レプ トスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌、好ましくは 血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）またはその誘導細菌、最も好ましくは１９９ ５年１１月１５日にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託され たレプトスピラの株の表面のリポ多糖分子のＢ細胞またはＴ細胞のエピトープを 模擬するか、あるいはそれと交差反応する免疫原に対して製造することができる 。 慣用法を使用して免疫学的に相互作用性の分子を製造することができる。例え ば、本発明の細菌の株または血清型亜型またはそれから誘導された免疫原を使用 することによって、標準的方法に従いポリクローナル抗血清またはモノクローナ ル抗体を作ることができる。ここにおいて証明するように、哺乳動物（例えば、 マウス、ハムスター、またはウサギ）を血清型亜型ハーストブリッジまたは血清 群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の免 疫原性形態で免疫化することができ、これは哺乳動物において抗体の応答を引き 出す。本発明のレプトスピラにより産生された表面タンパク質または他の分子に 免疫原性を付与する技術は、担体に対する結合または他のこの分野においてよく 知られている技術を包含する。例えば、細菌をアジュバントの存在において投与 することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出により モニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを抗原 として免疫原とともに使用して、抗体のレベルをアッセイすることができる。免 疫化後、抗血清を収集し、必要に応じて、ポリクローナル抗体に対応するＩｇＧ 分子を血清から分離することができる。 モノクローナル抗体を製造するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化さ れた動物から収集し、標準的体細胞融合手順により骨 髄腫細胞と融合させ、こうしてこれらの細胞を永久分裂能化し、ハイブリドーマ 細胞を生成することができる。このような技術はこの分野においてよく知られて いる。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）により本来開 発されたハイブリドーマ技術ならびに他の技術、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリド ーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ等、１９８３）、ヒトモノクローナル抗体を生成するＥ ＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ等、１９８５）、および組合わせの抗体ラ イブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅ等、１９８９）。ハイブリドーマ細胞を ポリペプチドと特異的に反応性である抗体の産生について免疫化学的にスクリー ニングし、そしてモノクローナル抗体を分離することができる。 抗体を引き出すすべての免疫原性組成物を使用するときのように、免疫原の免 疫学的に有効な量を実験的に決定しなくてはならない。考慮すべき因子は、免疫 原の免疫原性、それをアジュバントまたは担体タンパク質または他の担体と複合 化するか、あるいはそれに共有結合させるべきか否か、および組成物の投与経路 、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、およびその他、および投与すべき免疫化投与 の数を包含する。このような因子はワクチンの分野において知られており、そし て過度の実験を実施しないで、このような決定を行なうことは免疫学者の技量の 範囲内である。 用語「抗体」は、本発明において使用するとき、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐ ｔｏｓｐｉｒａ）細菌、好ましくは血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハ ーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、特に１ ９９５年１１月１５日にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託 されたレプトスピラの株が産生する表面のリポ多糖分子または表面のポリペプチ ドまたは他の分子のＢ細胞またはＴ細胞のエピトープを含むか、あ るいはそれを模擬するか、あるいはそれと交差反応する分子と、また、特異的に 反応性である、そのフラグメントを包含することを意図する。抗体を慣用技術に よりフラグメント化し、そして全抗体について前述した方法と同一の方法におい てフラグメントを実用性についてスクリーニングすることができる。例えば、ペ プシンで抗体を処置することによって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを発生させ ることができる。生ずるＦ（ａｂ’）２を処理して、ジサルファイド架橋を還元 してＦａｂ’フラグメントを生成することができる。 上で論じた最初に述べた抗体に対して向けられた任意の第２抗体（モノクロー ナル抗体、ポリクローナル抗体または抗体のフラグメント）を誘導することは本 発明の範囲内に入る。第１抗体および第２抗体の双方を検出アッセイにおいて使 用するか、あるいは第１抗体を商業的に入手可能な抗免疫グロブリン抗体ととも に使用することができる。本発明において考えられる抗体は、レプトスピラの血 清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、特に１９９５年１１月１５日にＡＧＡＬ受託 番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託されたレプトスピラの株の任意の免疫 原に対して特異的な任意の抗体を包含する。好ましくは、前記免疫原は表面のリ ポ多糖分子であるか、あるいはその連続的または不連続のＢ細胞またはＴ細胞の エピトープを模擬する分子である。 ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラのモノクローナル抗体 を使用して、種々の生物学的物質における本発明の病原性細菌またはその誘導細 菌を検出することができ、例えば、それらをＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ または組織化学的試験において使用することができる。前記抗体は、また、それ らの製造に使用した、分離された、不純なまたは純粋な形態の免疫原の検出にお いて有用である。したがって、抗体を使用して、試料中のレプトスピラの血清型 亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファ イネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、またはその誘導細菌に対する結合について試験す るか、あるいは分離された免疫原に対する結合について試験するか、あるいはそ のＢ細胞またはＴ細胞のエピトープと交差反応する分子に対する結合について試 験することができる。 米国特許第４，０１６，０４３号、米国特許第４，４２４，２７９号および米 国特許第４，０１８，６５３号を参照することによって理解することができるよ うに、広い範囲のイムノアッセイ技術を利用することができる。これらは、もち ろん、非競合型ならびに伝統的競合結合アッセイにおける単一部位または２部位 または「サンドイッチ」アッセイを包含する。また、これらのアッセイは標識化 抗体の標的への直接的結合を包含する。 サンドイッチアッセイは最も有用な、普通に使用されているアッセイの１つで あり、そして本発明における使用に好都合である。サンドイッチアッセイ技術の 多数の変形が存在し、すべては本発明において包含されることを意図する。簡単 に述べると、典型的な前方向アッセイにおいて、非標識化抗体を固体の支持体上 に固定化し、結合した分子と試験すべき試料を接触させる。抗体−抗原の複合体 を形成させるために十分な時間の間かつ条件下に、適当なインキュベーション期 間後、検出可能なシグナルを生成することができるリポーター分子で標識化され た、抗原に対して特異的な第２抗体を添加し、抗体−抗原−標識化抗体の他の複 合体を形成させるために十分な時間の間インキュベートする。未処理の物質を洗 浄除去し、そしてリポーター分子が生成するシグナルの観測により、抗原の存在 を決定する。 この場合において、第１抗体を病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 細菌の免疫原に対して発生させ、ここで前記細菌は本明細書において記載する血 清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）または１９９５年１１月１５日にＡＧＡＬ受託 番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託されたレプトスピラの株である。より 好ましくは、前記第１抗体を前記病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 細菌の免疫原に対して発生させ、ここで前記免疫原は血清型亜型ハーストブリッ ジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉ ｎｅｉ）の表面リポ多糖である。 結果は、可視のシグナルの簡単な観測により、定性的であるか、あるいは既知 の量のハプテンを含有する対照試料との比較により定量することができる。前方 向アッセイに対する変法は、試料および標識化抗体の双方を結合した抗体に同時 に添加する、同時アッセイを包含する。これらの技術は当業者によく知られてお り、容易に明らかなように、任意の小さい変形を包含する。本発明によれば、試 料は血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトス ピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、またはその誘導細菌を含有するか、あ るいは前記細菌に由来する免疫原を含有することができるものである。 典型的な前方向サンドイッチアッセイにおいて、血清型亜型ハーストブリッジ または血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎ ｅｉ）またはその免疫原に対して発生させた第１抗体を固体の表面に共有結合さ せるか、あるいは受動的に結合させる。固体の表面は典型的にはガラスまたはポ リマーであり、最も普通に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミ ド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固 体の支持体は管、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイ の実施に適当な任意の他の表面の形態であることができる。 結合プロセスはこの分野においてよく知られており、一般に架橋、共有結合ま たは物理的吸着から成り、ポリマー−抗体の複合体を被験試料の調製において洗 浄する。次いで試験すべき試料のアリコートを固相複合体に添加し、試料の中に 存在する抗原を抗体に結合させるために十分な時間（例えば、２〜４０分）の間 かつ適当な条件（例えば、２５℃）下にインキュベートする。インキュベーショ ン期間後、反応位置を洗浄し、乾燥し、第１抗体の一部分に対して特異的な第２ 抗体とインキュベートする。第２抗体はリポーター分子に結合し、ここでリポー ター分子はハプテンに対する第２抗体の結合を示すために使用される。 別の方法は、生物学的試料中の標的分子を固定化し、次いで固定化された因子 を特異的抗体に暴露させ、ここで特異的抗体をリポーター分子でレベルするか、 あるいはしないことができる。標的の量およびリポーター分子のシグナルの強度 に依存して、結合した標的を抗体で直接的に標識化することによって検出するこ とができる。第１抗体に対して特異的な、第２の標識化抗体を標的一第１抗体の 複合体に暴露して、標的一第１抗体一第２抗体の第３複合体を形成する。複合体 はリポーター分子が放射するシグナルにより検出される。 「リポーター分子」とは、本発明において使用するとき、その化学的特質によ り、抗原結合抗体の検出を可能とする、分析的に同定可能なシグナルを提供する 。検出は定性的または定量的であることができる。この型のアッセイにおいて、 最も普通に使用されている リポーター分子は、酵素、蛍光体または放射性核種を含有する分子（すなわち、 放射性同位元素）および化学発光性分子である。 酵素イムノアッセイの場合において、一般にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ 素酸塩により、酵素を第２抗体に結合する。しかしながら、容易に認識されるよ うに、当業者に容易に利用可能である、広範な種類の異なる結合技術が存在する 。普通に使用されている酵素は、なかでも、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、 グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファター ゼを包含する。特異的酵素とともに使用すべき基質は、一般に、対応する酵素に より加水分解されるときの、検出可能な色の発生について選択される。適当な酵 素の例はアルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼを包含する。また、 前述の色素形成基質よりむしろ蛍光産物を生ずる蛍光発生を使用することができ る。すべての場合において、酵素標識化抗体を第１抗体−ハプテン複合体に添加 して、結合させ、次いで過剰の試薬を洗浄除去する。次いで適当な基質を含有す る溶液を抗体−抗原−抗体の複合体に添加する。基質を第２抗体に結合した酵素 と反応させて、定性的可視シグナルを発生させ、これを、通常分光光度測定的に 、さらに定量して、試料の中に存在するハプテンの量を指示させる。用語「リポ ーター分子」は、また、ラテックスビーズ上の赤血球のような、細胞の凝集また は凝集の阻害の使用に拡張される。 また、蛍光化合物、例えば、フルオレセインおよびローダミンを、それらの結 合能力を変更させないで、抗体に化学的に結合させることができる。特定の波長 の光で照明して活性化するとき、蛍光色素標識化抗体は光エネルギーを吸収し、 分子中で励起可能な状態を誘発し、次いで光学顕微鏡で視的に検出可能な特徴的 な色を放射する。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）におけるように、蛍光標識化抗 体を第１抗体−ハプテン複合体に結合させる。非結合試薬を洗浄除去した後、残 留する第３複合体を適当な波長の光に暴露し、観測される蛍光は問題のハプテン の存在を示す。免疫蛍光およびＥＩＡ技術はこの分野において非常によく確立さ れており、本発明の方法とって特に好ましい。しかしながら、他のリポーター分 子、例えば、放射性同位元素、化学発光または生物発光分子を使用することもで きる。上記アッセイを変化させる方法は当業者にとって容易に明らかであり、そ してすべてのこのような変形は本発明に包含される。 したがって、本発明のそれ以上の面は、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌またはその誘導細菌を検出し、同定するか、あるいは定量する方法 を提供し、ここでこの方法は抗体：免疫原または抗体：細菌の複合体を形成する ために十分な時間の間かつ条件下に、物質またはそれに由来する細菌を前記細菌 またはそれに由来する免疫原を認識する抗体とインキュベートし、そして前記複 合体を検出手段に付す工程からなる。 本発明のこの面によれば、リポーター分子を結合して有する細菌またはそれに 由来する免疫原または抗体分子を使用することによって、複合体を検出すること ができる。また、リポーター分子で標識化した第２抗体の添加により、複合体を 検出することができる。 好ましくは、この面に従う本発明は、上に記載した培地中で、約１３℃〜約３ ７℃の温度においておよび／または少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−アザグア ニン、好ましくは少なくとも１５０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、より好まし くは少なくとも２００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、なおより好ましくは少な くとも２５０μｇ／ｍｌの、または５００μｇ／ｍｌまでの濃度の８−アザグア ニンの存在において増殖することができる病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌またはその誘導細菌を検出し、同定する か、あるいは定量する方法を提供する。 最も特に好ましい態様において、本発明のこの面および本明細書において記載 する態様は、レプトスピラの血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハースト ブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、例えば、１９ ９５年１１月１５日にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託さ れた株を検出し、同定するか、あるいは定量する方法に関する。 本発明のこの面によれば、物質またはそれに由来する細菌は、レプトスピラ（ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌、特に血清型亜型ハーストブリッジまたは血清 群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）また はその誘導細菌のための宿主である哺乳動物に由来する生物学的試料または器官 の中に存在する。好ましくは、前記哺乳動物はヒトまたは家畜またはコンパニオ ン動物、特に、なかでも、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ、 イヌおよびネコを含むリストから選択される家畜またはコンパニオン動物である 。 試験すべき生物学的試料は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌 で感染することができる任意の細胞、組織または器官、特に、なかでも、尿生殖 路の細胞、組織または器官、例えば、腎臓、膀胱、ファロピウス管、子宮または 子宮内膜、精巣、または体液または滲出物、例えば、尿または脳脊髄液であるこ とができる。本発明は、また、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハース トブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の検出、同定 または定量に適当な生物学的試料として血液または血液に由来する産物を使用す ることを包含する。 本発明のそれ以上の面は、生物学的試料中の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏ ｓｐｉｒａ）細菌またはその誘導細菌の急速な好都合 なアッセイのためのキットに関し、ここで前記細菌は約１３℃〜約３７℃の温度 においておよび／または少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、好ま しくは少なくとも１５０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、より好ましくは少なく とも２００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、なおより好ましくは少なくとも２５ ０μｇ／ｍｌの、または５００μｇ／ｍｌまでの濃度の８−アザグアニンの存在 において増殖することができる。 特に好ましい態様において、生物学的試料中の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌またはその誘導細菌の急速な好都合なアッセイのためのキッ トに関し、ここで前記細菌は本明細書において提供されたいずれかまたはすべて に従うレプトスピラの血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッ ジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、例えば、１９９５年 １１月１５日にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４でＡＧＡＬに寄託された株 として特徴づけられる。 １つの態様において、前記キットは各々がレプトスピラの血清型亜型ハースト ブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ． ｆａｉｎｅｉ）に由来する少なくとも１つの免疫原を含有するように適合された 、いくつかの第１容器と、前記病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細 菌、その誘導細菌またはそれらに由来する免疫原に結合する抗体分子を含有する ように適合された、いくつかの第２容器とを受け取るように区画化されているか 、あるいは前記第２容器は血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブ リッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）またはその誘導細 菌またはそれらに由来する免疫原に結合する抗体分子を含有する。好ましくは、 前記第２容器はＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託された株、またはそ れに由来する免疫原、特に表面リポ多糖免疫原に結合する抗体を含有する。 本発明のこの態様によれば、前記抗体分子は上に記載した検出可能なシグナル を生成することができるリポーター分子で必要に応じて標識化される。第１抗体 分子がリポーター分子で標識化されない場合、キットはまたいくつかの第３容器 を提供し、ここでこの容器は第１抗体を認識しかつリポーター分子に結合されて いる第２抗体を含有する。このキットにおいて使用されるリポーター分子は、な かでも、酵素、放射性同位元素、蛍光分子または生物発光分子である。 キットが酵素であるリポーター分子に結合された第１抗体または第２抗体の分 子を含有するとき、前記キットはまたいくつかの第４容器を含有し、ここで前記 容器は免疫原：抗体の複合体または免疫原：抗体：抗体の複合体の検出を促進す る前記酵素のための特異的分子を含有する。 必要に応じて、前記キットの第１、第２、第３および第４容器を使用容易とす るために色でコード化することができる。 主題のキットの例示した使用において、対照反応を実施し、ここで免疫原：抗 体の複合体が前記第１容器中で形成するために十分な時間の間かつ条件下に、第 １容器の内容物を第２容器の内容物と接触させる。同一時間において、免疫原： 抗体の複合体が前記第２容器中で形成するために十分な時間の間かつ条件下に、 試験すべき試料を第２容器の内容物と接触させる。準備された第２容器の抗体を リポーター分子で標識化しない場合、第３免疫原：抗体：抗体の複合体が形成す るために十分な時間の間かつ条件下に、前記第１容器および第２容器において生 成した複合体を第３容器の抗体と接触させる。次いで免疫原：抗体：抗体の複合 体の免疫原：抗体の複合体 を、上に記載した検出手段に付す。前記キットを使用して得られた結果を分析す るとき、前記第１容器中で実施した対照反応は常に陽性の結果を提供すべきであ り、前記陽性の結果を被験試料を含有する前記第２容器において得られた結果と 比較する。 別の態様において、本発明は生物学的試料中のレプトスピラの血清型亜型ハー ストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（ Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）またはその誘導細菌の急速な好都合なアッセイのためのキッ トに関し、ここで少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌク レオチド、より好ましくは少なくとも２２ヌクレオチドの長さの２つの非相補的 プライマー分子を含有するように適合した、いくつかの第１容器を受け取るよう に前記キットは区画化されている。この態様によれば、第１プライマー分子の少 なくとも１つは配列ＮＯ：１〜７のいずれか１つ、より好ましくは配列ＮＯ：１ 〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレオチド配列または補体、また はそれらの誘導体、相同体または類似体のある領域と実質的に同一であり、そし て前記プライマー分子の第２は配列ＮＯ：１に記載する配列またはその誘導体、 相同体または類似体のある領域と実質的に同一であることが好ましい。当業者は 本発明のこの面の実行のために適当な核酸プライマー分子の組合わせを知ってい るであろう。 特に好ましい態様において、プライマー分子はプライマー対、より好ましくは 配列ＮＯ：２および３またはプライマーＬＵおよびｒＬＰ（表１０）またはプラ イマーＣおよびＩＮＴｒＬＰ（表１０）またはそれらと少なくとも８０％同一で あるプライマーを含むプライマー対として利用される。 この態様によれば、前記キットは、また、いくつかの第２容器と、いくつかの 第３容器とを含有し、ここで前記第２容器はすぐに使 用できるか、あるいは濃縮された形態の緩衝液および塩溶液からなる反応混合物 を含有することができ、そして第３容器は核酸ハイブリダイゼーション反応また はポリメラーゼ連鎖反応において使用するために適当な酵素、例えば、熱安定性 ＤＮＡポリメラーゼ酵素、特にテルモフィルス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｏ ｐｈｉｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＴａｑＩ、または同様な酵素を含有するこ とができる。必要に応じて、前記キットの第１、第２および第３容器は使用容易 であるように色でコード化することができる。 本発明のこの態様の目的で、生物学的試料は本発明の病原性レプトスピラ（Ｌ ｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の血清型亜型を担持することができる哺乳動物の任意 の細胞、組織、器官、体液または滲出物、例えば、なかでも、尿生殖路、膀胱、 腎臓、子宮、子宮内膜、精巣またはファロピウス管または体液または滲出物、例 えば、尿または脳脊髄液であることができる。本発明は、また、本発明の目的に 対して有用である生物学的試料としての血液の使用を包含する。代りにまたは前 記適切な生物学的試料に加えて、前記細胞、組織または器官の試料から得られた 核酸抽出物を用いることも可能である。好ましくは、前記生物学的試料は家畜動 物、例えば、ヒトまたは家畜またはコンパニオン動物、特に、なかでも、ブタ、 ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから 選択される家畜またはコンパニオン動物に由来する。 この態様において記載する主題のキットの例示した使用において、被験試料の 反応を実施し、ここで第１、第２および第３の容器を組合わせ、そして試験すべ き生物学的試料をそれに添加する。また、陰性の対照反応を構成することができ 、ここで生物学的試料を反応混合物に添加する。主題の細菌に由来するＤＮＡ配 列の増幅が起こるために十分な時間の間かつ条件下に、被験試料および陰性対照 反応物をインキュベートする。 本発明のそれ以上の面は、上に定義した本発明の方法、試薬およびキットを使 用する、生物学的試料中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）病原体を同定 するための診断試験に関する。特に好ましい診断アッセイは、ＭＡＴを使用する 血清群ハーストブリッジの細菌の血清学的検出に基づくか、あるいは核酸をベー スとするハイブリダイゼーションおよび／または増幅反応を使用する同一種レプ トスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に属する細菌の遺伝的検出に基づく 。 本発明は、また、レプトスピラ細菌に由来する分離された組換えポリペプチド の免疫原と、それらに対して免疫学的に相互作用性の分子、例えば、抗体および それらからなる血清とを含んでなる組成物に拡張され、ここで前記レプトスピラ 細菌は血清群ハーストブリッジと同一血清群に属するか、あるいは血清型亜型ハ ーストブリッジと同一血清型亜型に属する。 したがって、本発明のなおそれ以上の面は、下記の成分を含んでなる組成物に 関する： １．血清群ハーストブリッジに属する病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒ ａ）細菌またはその誘導細菌の細胞成分と免疫学的に交差反応性である１または それより多い免疫原；および ２．１またはそれより多い薬学上または獣医学上許容される担体、アジュバント および／または希釈剤。 また、組成物は下記の成分を含んでなる： １．血清群ハーストブリッジに属する病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒ ａ）細菌またはその誘導細菌の１またはそれより多い抗原に結合することができ る抗体分子またはそれからなる血清；および ２．１またはそれより多い薬学上または獣医学上許容される担体、アジュバント および／または希釈剤。 抗体分子は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、免疫グロブリン 画分、Ｆａｂまたはそれらの組換え一本鎖抗体分子または免疫学的同等物である ことができる。 好ましくは、これらの態様に従う組成物はワクチン調製物である。より好まし い態様において、前記組成物は、ヒトまたは動物の被検体に投与したとき、血清 型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・フ ァイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に対する体液性免疫を誘発する。最も特に好まし い態様において、前記組成物はＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託され たレプトスピラに対する体液性免疫を誘発する。 好ましい態様において、本発明のこの面に従う免疫原または抗原は、レプトス ピラの血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプト スピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）、特にＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９ ６８４で寄託されたレプトスピラの株として本明細書において提供された説明の いずれかまたはすべてに従い、特徴づけられる細菌と免疫学的に交差反応性であ る。 より好ましい態様において、前記免疫原または抗原の少なくとも１つは表面リ ポ多糖である。 本発明のこの面によれば、有効な組成物の免疫原成分は、また、前処理されて 非感染性、主として無症候性とされた、完全な、弱毒化されたレプトスピラの血 清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）を含むことができる。前記レプトスピラの血清 型亜型を弱毒化させる方法は、ホルマリンの殺し、加熱の殺し、病原性に関係す る遺伝物質を除去するための照射または遺伝的修飾を包含するが、これらに限定 されない。 本発明の組成物は、例えば、レプトスピラの病原体、例えば、血清型亜型ハー ストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたはレプトスピラ・ファイネイ（ Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）による感染に関連する疾患、特に生殖疾患の予防において、 きわめてすぐれた治療的活性を示すと考えられる。好ましくは、前記組成物は、 哺乳動物、特にヒトまたは家畜またはコンパニオン動物、特に、なかでも、ブタ 、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストか ら選択される家畜またはコンパニオン動物に投与したとき、免疫応答を仲介する とき有効である。 用語「免疫応答を仲介する」は、本発明において使用するとき、免疫原による Ｔ細胞の活性化の誘発、および／または本明細書において記載する血清群ハース トブリッジ棒グラフレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）またはその誘導細菌 の病原性血清型亜型によりコードされる１またはそれより多い分子と交差反応す る中和性抗体の、Ｂ細胞による、発生を包含すると、その最も広い関係において 、定義される。特に、前記中和性抗体は血清型亜型ハーストブリッジまたはその 誘導細菌によりコードされる１またはそれより多い分子と交差反応する。 組成物は、慣用法において、例えば、経口、静脈内（水溶性である場合）、筋 肉内、皮下、鼻内、皮内または坐剤の経路または移植（例えば、遅い解放性分子 を使用する）により投与することができる。投与の経路に依存して、その中に含 有される免疫原をそうでなければ不活性化することがある酵素、酸および他の天 然の条件の作用から免疫原を保護する物質の中に、前記免疫原を被覆することを 必要とすることがある。非経口的投与以外の経路により組成物を投 与するために、不活性化を防止する物質で組成物を被覆するか、あるいは組成物 はその物質とともに投与される。例えば、免疫原はアジュバントの中に含有させ て投与されるか、あるいは酵素インヒビターとともに同時に投与されるか、ある いはリポソームの中に含有させて投与される。「アジュバント」は、本発明にお いて使用するとき、その最も広い意味において使用され、そして免疫刺激化合物 、例えば、サイトカインを包含する。本発明において考えられるアジュバントは 、レゾルシノール、非イオン界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイル エーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルを包含する。酵素インヒ ビターは、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート （ＤＥＰ）およびトラシロールを包含する。リポソームは水中油中水乳濁液なら びに慣用のリポソームを包含する。 また、本発明の組成物を非経口的または腹腔内に投与することができる。免疫 原成分の分散液は、また、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、および それらの混合物および油中で調製することができる。貯蔵および使用の通常の条 件下に、これらの調製物は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。 注射可能な使用に適当な形態は、無菌の水性の溶液（水溶性である場合）また は分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の 粉末を包含する。すべての場合において、形態は無菌でなくてはならず、そして 容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなくてはならない。それは製造およ び貯蔵の条件下に安定でなくてはならず、そして微生物、例えば、細菌および真 菌の汚染作用に対して保存しなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノー ル、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポ リエチレングリコール、およびその他） 、適当なそれらの混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒質であるこ とができる。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用 により、分散液の場合において要求される粒度の維持により、および界面活性剤 の使用により、維持することができる。種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、 パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および その他により、微生物の作用を防止することができる。多くの場合において、等 張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを添加することが好ましいであろう。吸 収を遅延する物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組 成物の中に使用することによって、注射可能な組成物の吸収を遅延することがで きる。 本発明の免疫原を要求される量で適当な溶媒の中に、必要に応じて前述の種々 の他の成分とともに、混入し、次いで加熱滅菌、照射または他の適当な滅菌手段 を実施することによって、無菌の注射可能な溶液を調製する。一般に、基本的分 散媒質および前述の要求される他の成分を含有する、無菌ベヒクルの中に、種々 の滅菌した活性成分を混入することによって、分散液を調製する。無菌の注射可 能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合において、好ましい調製手段は、前 もって滅菌濾過した溶液から活性成分十任意の追加の所望の成分の粉末を生ずる 真空乾燥および凍結乾燥である。 免疫原が前述したように適当に保護されているとき、保護された免疫原を、例 えば、不活性希釈剤または同化可能な担体とともに、経口投与することができる か、あるいはそれを硬質または軟質のゼラチンカプセルの中に取り囲むか、ある いはそれを錠剤に圧縮するか、あるいはそれを食事の食物と直接混合することが できる。経口投与のために、保護された免疫原を賦形剤と混合し、摂取可能な錠 剤、頬の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オ ブラート、およびその他の形態で使用することができる。このような組成物およ び調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。もちろん、組 成物および調製物の百分率は変化可能であり、好都合には、単位の約５〜約８０ 重量％であることができる。このような組成物中の免疫原の量は、前記ワクチン の１回〜５回の投与で有効な免疫化が達成されるような量である。 錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤およびその他は、また、下記の成分を含 有することができる：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アカシアゴム、コー ンスターチまたはゼラチン；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、例 えば、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸およびその他；潤滑剤、例 えば、ステアリン酸マグネシウム；および甘味剤、例えば、スクロース、ラクト ースまたはサッカリンを添加することができるか、あるいは香味剤、例えば、ペ パーミント、ヒメコウジ油、またはサクランボの香味剤。投与単位形態がカプセ ルであるとき、それは、前述の型の物質に加えて、液状担体を含有することがで きる。種々の他の物質がコーティングとして存在することができるか、あるいは 他の方法で投与単位の物理的形態を変更することができる。例えば、錠剤、丸剤 、またはカプセルをシェラック、糖または双方で被覆することができる。シロッ プまたはエリキシル剤は活性化合物、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメ チルおよびプロピルパラベン、色素および香味剤、例えば、サクランボまたはオ レンジの香味剤を含有することができる。もちろん、任意の投与単位形態の製造 において使用される任意の物質は、薬学上純粋であり、使用量において実質的に 無毒であるべきである。さらに、本発明の免疫原は持続放出性の調製物および処 方物の中に混入することができる。 本発明において使用するとき、「薬学上または獣医学上許容され る担体、アジュバントおよび／または希釈剤」は、任意のかつすベての溶媒、分 散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤および その他を包含する。薬学上活性な物質のためのこのような媒質および因子の使用 は、この分野においてよく知られている。任意の慣用の媒質または因子が活性成 分と不適合性である場合を除外して、治療組成物におけるそれらの使用が考えら れる。補助的活性成分を組成物の中に混入することもできる。 投与が容易でありかつ投与が均一性である投与単位形態で、非経口的組成物を 配合することが特に好ましい。本発明において使用する投与単位形態は、治療す べき哺乳動物の被検体のために単一の投与として適した、物理的に離散した単位 を意味する；各単位は要求される薬学上または獣医学上許容される担体に関連し て所望の治療効果を生成するように計算された、前もって決定された量の活性物 質を含有する。 例示のみを目的として、下記の非限定的図面および実施例により、本発明をさ らに説明する。 図面において： 第１図は、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジまたは レプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に属する細菌の電子顕微鏡写真 の写真表示のコピーである。フィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＣＭ１２ＳＴＥＭ 電子顕微鏡を使用し、２％のホスホタングステン酸によるネガティブ染色を用い る、９，４５０×の最終倍率における透過型電子顕微鏡検査により、レプトスピ ラのＢＵＴ６株を検査した。細長い線は１μｍを示す。細菌細胞はほぼ１２μｍ の長さおよび０．２μｍの直径であり、そしてレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉ ｒａ）の特徴を示す、典型的にはらせんの形態を示す。 第２図は、下記のものを包含する他のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 血清型亜型のｒＲＮＡ遺伝子の配列に対するレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆ ａｉｎｅｉ）のｒＲＮＡ遺伝子の配列の２００ｂｐ領域（配列ＮＯ：１に由来す る）の整列を示す概略的表示である：レプトスピラ・イナダイ（Ｌ．ｉｎａｄａ ｉ）血清型亜型リメ（配列ＮＯ：８）、レプトスピラ・メエリ（Ｌ．ｍｅｙｅｒ ｉ）血清型亜型ラナルム（ｒａｎａｒｕｍ）（配列ＮＯ：９）、レプトスピラ・ ウェイリイ（Ｌ．ｗｅｉｌｉｉ）血清型亜型セレドニ（ｃｅｌｌｅｄｏｎｉ）（ 配列ＮＯ：１０）、レプトスピラ・サンタロサイ（Ｌ．ｓａｎｔａｒｏｓａｉ） 血清型亜型シェルマニ（ｓｈｅｒｍａｎｉ）（配列ＮＯ：１１）、レプトスピラ ・ボルグペテルセニイ（Ｌ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）血清型亜型ジャバ ニカ（ｊａｖａｎｉｃａ）（配列ＮＯ：１２）、レプトスピラ・キルスクネリ（ Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）血清型亜型シノプテリ（ｃｙｎｏｐｔｅｒｉ）（配 列ＮＯ：１３）およびレプトスピラ・インテルロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇ ａｎｓ）血清型亜型イクテロヘモルハギエ（ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇ ｉａｅ）（配列ＮＯ：１４）。星印は可変ヌクレオチド残基を示す。塩基のナン バリングは整列の上部に示されている。 実施例１ 一般的戦略および培養のためのブタの群れの選択 ヴィクトリア州およびニュー・サウス・ウェールズ州における３つのブタの群 れを培養のために選択し、すべてはレプトスピラ・インテルロガンス（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型ブラティスラバに対して血 清学的に陽性であった。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌は、既知の オーストラリアのブタのレプトスピラ血清型亜型、ポモナおよびタラッソビによ る感染の血清学的証拠の欠如にかかわらず、組織の免疫蛍光染色により、各群れ において可視化された。培養物は各動物の子宮、ファロピウス管および腎臓から 確立された。目的は、ベイコン年齢（ｂａｃｏｎｅｒ−ａｇｅ）の若雌ブタおよ び雌ブタの双方から、培養により、血清型亜型ブラティスラバを分離する機会を 最大とすることであった。 試料の大きさを各動物について３０またはそれより小さい培養に制限した。培 養のプログラムは、各動物について最初の２４本の培養管の使用を含んだ：３つ の組織、４つの抗生物質の組合わせ、および２つの希釈物。 実施例２ 培養のための組織の収集 ブタの群れを実施例１に従い選択した。ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉ ｄｇｅ）屠殺場（群れＡおよびＢ）およびアルトナ（Ａｌｔｏｎａ）屠殺場（群 れＣ）において、培養のための組織を動物から収集した。膀胱を除去の時点にお いてケーブルの結束で結束し、そしてファロピウス管を有する子宮、および腎臓 を無菌のバッグの中に収集した。また、血液を屠殺の時点において収集し、そし て組織試料と対抗させた。ブタを屠殺の時点において個々の入れ墨により個体識 別した。 実施例３ 細菌の培養 前の実施例に記載するようにして得られた組織の試料をできるだけ早く加工し て、自己分解の程度を減少させた。ファロピウス管のセグメント、子宮内膜の切 削物および腎臓の試料をリン酸塩緩衝化アルブミン中で均質化してレプトスピラ を保護し、次いで１：１００の最終濃度に希釈した後、２×７．５ｍｌの体積の 培地を、それ ぞれ、１滴および５滴で接種した。試料を３０℃において６カ月間までインキュ ベートし、ほぼ２〜３週の間隔で検査した。ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０／８０ の半固体状媒質の４つの異なる処方物を使用し、表１に示すマトリックスに従う 異なる抗生物質の組合わせを用いた。 培養物を２７匹の雌ブタおよび若雌ブタから確立し、それらのうちの２４匹は ３つの標的群れからのものであった（表２）。３つの標的群れのうちの２つ（群 れＢおよびＣ）における２匹の動物に由来する６つの培養物において、レプトス ピラを観察した。表３に示すように、５つの場合において分離が達成された。 群れからのいくつかの培養物において、非運動性レプトスピラに類似する構造 物が観察され、そしてこれらは、培養物中で最初に観察したとき、ブラティスラ バの典型であるように見えた。しかしながら、運動性レプトスピラはこれらの培 養物から発生せず、そして分離は達成されなかった。これらの可能なレプトスピ ラの同定を確証することができなかった。 ３匹の雌ブタからの微生物の４つの分離株が群れＢから得られた。群れＢから の分離株は、暗い背景の顕微鏡検査および透過型電子 顕微鏡検査の双方の下で、典型的なレプトスピラとして見えた。また、レプトス ピラは群れＣからの２つの培養物において観察されたが、ただ１つの分離株が得 られた（表３）。 実施例４ 顕微鏡凝集試験（ＭＡＴ） 生きている抗原または参照抗原として血清型亜型ハーストブリッジ分離株Ｎｏ ．６（表３）を使用して、顕微鏡凝集試験（ＭＡＴ）（Ｃｏｌｅ等、１９７３） を実施した。典型的には、１／３２〜１／１５６またはそれ以上の最終希釈（抗 原を含む）において血清を試験した。各試験した血清型亜型に対するウサギ抗血 清を、陽性対照として各マイクロタイタープレート上に添加した。５０％または それ多い凝集が観察された最終血清希釈（抗原の体積を含む）の逆数として、力 価を表した。 ある範囲のレプトスピラの病原体に対する抗血清による凝集に従い、群れＢの 分離株（表３）を特性決定した。この分離株は、ブラティスラバ、ポモナ、タラ ッソビ、ハードジョボビス、コペンハーゲニまたは多数の他の病原性血清型亜型 に対する抗血清により、高い力価に凝集しなかった。群れＢの微生物は強く自己 凝集することが見出され、したがって、これらの凝集実験の結果は解読が困難で あった。 既知のレプトスピラ病原体に対する抗血清による凝集の欠如の確証のために、 群れＢからの分離株１をオーストリア国ブリスベーンのインターナショナル・レ プトスピソシス・レファレンス・ラボラトリー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に 送った。また、分離株は１３℃において８−アザグアニンの存在下に持続的に増 殖することが証明され、それは腐生菌であり、病原体ではないこと を暗示した。 群れＣからの分離株は、多数の既知の病原性レプトスピラに対する抗血清で凝 集することができなかった（表４）。しかしながら、それは群れＢ分離株に対し て発生させたウサギ抗血清で高い力価に凝集した。これにより示されるように、 それは多分同一微生物である。群れＣの分離株は、群れＢからの分離株と異なり 、最初に得られたとき、自己凝集性を示さなかった。 １培養物は不正確に接種されたので初期に廃棄した。 ２レプトスピラの分離株をこれらのブタから得た。表３参照。 実施例５ ヒトのレプトスピラ症の患者におけるＭＡＴ力価 オーストリア国ヴィクトリア州モナシュ大学（Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ）に提供されたヒト被検体に由来する７２３の血清も、ＭＡＴにより血清 型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジに対する抗体について試 験した。血清のほぼ７９％は男性から得られた。大部分の血清は、レプトスピラ 症と一致する症候を示す患者に由来したと考えられた。 モナシュ大学においてレプトスピラ・ボルグペテルセニイ（Ｌ．ｂｏｒｇｐｅ ｔｅｒｓｅｎｉｉ）血清型亜型バルム、ハードジョボビスおよびタラッソビおよ びレプトスピラ・インテルロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型 オーストラリス（ａｌｉｓ）、コペンハーゲニおよびポモナを抗原として使用し て、ＭＡＴを最初に実施した。これらの血清型亜型についてのＭＡＴは、実施例 ４に記載した血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジについ てのＭＡＴと、下記の事項において異なっていた：第１に、マイクロタイタープ レートの各ウェルからの１ループの懸濁液を顕微鏡のスライド上に移した後、凝 集を顕微鏡下に観察した。第２に、希釈系列における第１の血清希釈は１／５０ であった。 この研究において、実施例４に記載したように、これらの７２３ の血清試料を使用して、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリ ッジについてのＭＡＴを実施した。 さらに、オーストリア国ヴィクトリア州のヴィクトリア州動物科学研究所（Ｖ ｉｃｔｏｒｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ ＶＩＡＳ））において６２人のスタッフから得られた血清の対照グループを、ま た、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジについてのＭＡ Ｔに付した。６２の対照血清は２７人の男性および３５人の女性から得られた。 表５に示すように、血清の２つのグループにおけるＭＡＴの力価は顕著に異な っていた。試験した７２３の診断血清のうちで、血清の７．２％は＞５１２の力 価を有し、そして血清の１３．４％は＞１２８の力価を有した。ＶＩＡＳからの 対照グループにおけるすベての６２の血清は３２またはそれより低いＭＡＴ力価 を有した。＞１２８の力価におけるグループの間における差は高度に有意であっ た（χ²−９．５５、ｄｆ＝１．０；ｐ＜０．０１）。郵便番号の分析により、 血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジに対するＭＡＴ力価 を有する患者はヴィクトリア州の主として酪農場およびブタ生産領域から来たこ とが示された。 診断血清における各血清型亜型に対する高い力価の優勢を表６に示す。血清の 約７％は血清型亜型ハーストブリッジに対して≧４００のＭＡＴ力価を与え、そ して同様な百分率は血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジ に対して≧５１２のＭＡＴ力価を与えた。対照的に、他の血清型亜型に対して≧ ４００のさらにより低い力価が存在した。 実施例６ 雌ブタの生殖能力と血清型亜型ハーストブリッジまたは 血清群ハーストブリッジに対する力価との間の関係 ニュー・サウス・ウェールズ州の群れにおいて、生殖能力と血清型亜型ハース トブリッジまたは血清群ハーストブリッジに対する力価との間の関係の研究を実 施した。合計４６８の混合出産順位の雌ブタから血清試料をランダムに採り、そ して血清試料を血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジにつ いてのＭＡＴ（実施例４）により試験した。得られた力価を採取した動物の完全 な生殖歴史と比較した。４６８匹の採取した動物を合計１４８４回交配させた。 同一雌ブタからの異なる交配の結果を同一の血清学的 結果に関係づけた。 表７は、群れＢ中の雌ブタ（実施例１および２）における血清型亜型ハースト ブリッジに対するＭＡＴ力価と授精への復帰との間の高度に有意な関連を証明す る。全体的に、ハーストブリッジに対する力価を有する雌ブタは、血清学的に陰 性の雌ブタよりも、いっそう有意に授精に復帰するようであり、分娩割合におけ る全体の差は４．３％であった。しかしながら、表７に示すデータをいっそう詳 細に分析すると、力価が３２〜６４であるとき、さらにいっそう授精に復帰する ことをその関係は含むが、１２８またはそれ以上の力価で多少の改良が得られる ことが証明され、多分血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッ ジのより高い力価は保護的であろうことを示す。これらの結果は出産順位の効果 ではない。なぜなら、本発明者らが実施した別の分析は出産順位とハーストブリ ッジ力価との間の有意な関係を見出さなかったからである。 １．χ²＝11.15；df＝2.0；0.01>p>0.00 動物のヴィクトリア州の群れ（実施例１および２における群れＡ）において、 生殖能力と血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジに対する 力価との間の関係を証明するために、追加の研究を実施した。合計１６５匹の混 合出産順位のラージ・ホワイト／ランドレース（Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ／Ｌａ ｎｄｒａｃｅ ）雌ブタを、分娩小屋に入れるとき、ランダムに選択した。実施例４に記載した 血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジについてのＭＡＴを 使用して、分娩の１週前と１週後との間に収集した血液試料からの血清を分析し た。４１の血清について、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブ リッジに対して≧４の力価が検出された（分析した全血清の２５％）。 ヴィクトリア州の群れの中の血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハース トブリッジに対してより高いＭＡＴ力価を有する動物において、子宮内の胎児の 死亡（全期間の１０日またはそれ以上前）は有意にいっそう頻繁であった（ｐ＜ ０．０７５）（表８）。さらに、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハー ストブリッジに対してより高い力価を有するこのグループの動物において、離乳 から最初の交配までの平均間隔は有意により長かった（ｐ＜０．０ｌ）（表９） 。 実施例７ ポリメラーゼ連鎖反応のためのブタの腎臓からの病原性 レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）のＤＮＡの抽出 Ｃｈｅｌｅｘ１００樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１００〜２００メッシュのナトリ ウム型）を無菌の蒸留水に撹拌しながら添加し、次いでオートクレーブ処理する ことによって、樹脂の５％懸濁液を調製した。 ほぼ０．２ｇの腎臓の試料をストマッカー中において２ｍｌの無菌のリン酸塩 緩衝生理食塩水で５分間処理した。０．５ｍｌの体積の生ずる懸濁液をマイクロ フージ管に取出し、５０μｌを２００μｌのＣｈｅｌｅｘ１００懸濁液を含有す る他の管に移した。第２の管を渦形成し（５秒）室温において３０分間インキュ ベートし、再び渦形成し、１００℃において８分間インキュベートし、再び渦形 成し、マイクロフージ中で１３，０００ｒｐｍにおいて３分間遠心した。 上清を取出し、次のようにしてエタノール沈降によりさらに精製した：マイク ロフージ管に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、２７５μｌの１００％エタノール 、および１００μｌのＣｈｅｌｅｘ１００上清を添加した。この懸濁液を−２０ ℃において一夜貯蔵した。上清を取出し、５００μｌの７０％エタノールを添加 し、生ずるペレットを洗浄し、さらに１３，０００ｒｐｍにおいて１５分間マイ クロフージにかけた。次いで上清を取出し、室温において蒸発により１時間乾燥 した。 ペレットを４０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭのＥ ＤＴＡ、ｐＨ８．０）の中に再懸濁させた。 実施例８ ＰＣＲ生成物の遺伝子配列による病原性レプトスピラ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の同定 遺伝子の保存された領域からのオリゴヌクレオチドプライマー２７Ｆおよび１ ３９２Ｒ（表１０）を使用して、多数のレプトスピラ の血清型亜型のｒＲＮＡ遺伝子配列の大部分に対応する約１．４ｋｂのＰＣＲ生 成物を発生させた。Ｗｉｚａｒｄ^TMＰＣＲクリーン・アップ・キットを使用して 、ＤＮＡ生成物を精製した。次いで溶離された生成物を１％（ｗ／ｖ）低融点ア ガロースゲル上で電気泳動させ、所望のバンドをメスのブレードで切除し、Ｗｉ ｚａｒｄ^TMＰＣＲクリーン・アップ・キットでさらに精製した。１．Ａ＝アデニン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアニン；Ｔ＝チミジン； Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｗ＝Ａま たはＴ。 ２．プライマーＢおよびＣはＭｅｒｉｅｎ等（１９９２）により開示された。 ３．このプライマーは本来Ｈｏｏｋｅｙ（１９９２）により開示された。 ４．これらのプライマーはＬａｎｅ（１９９１）により開示された。 ５．これらのプライマーはＰｅｒｏｌａｔ等（１９９８）により開示された。 バイオシステムス（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ型ＤＮＡ配列決定装置に より、オーバーラップする前方向プライマー（表１０中の２７Ｆ、５３０Ｆ、９ ２６Ｆ）および逆方向プライマー（表１０中の１３９２Ｒ、１１００Ｒ、６６０ Ｒ、５１９Ｒ）を使用して、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を得た。 血清型亜型ブラティスラバ、ハードジョボビス、コペンハーゲニ、タラッソビ およびオーストラリスからの遺伝子について、ヌクレオチドの配列決定を試みた 。また、群れＢから培養したレプトスピラの２つの分離株（１および２）につい て２７Ｆプライマーを使用して、部分的遺伝子配列を得た。 完全な１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列を血清型亜型ブラティスラバ、ハー ドジョボビス、コペンハーゲニおよびタラッソビから得た。これらを血清型亜型 ポモナ、カニコーラ、イクテロヘモルハギエおよびＧＥＮＥＢＡＮＫを通して入 手可能ないくつかの他の血清型亜型からの発表された配列と比較した。レプトス ピラ・バイフレクサ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ）血清型亜型パトクについて誘導され た部分的配列は、ＧＥＮＥＢＡＮＫにおける配列に対応した。 群れＢと多数のレプトスピラの血清型亜型との間のヌクレオチド配列の相同性 を表１１に示す。これの結果およびいっそう詳細な比較は下記の事実を示す： （ａ）新しい分離株はレプトスピラの腐生性グループではなく、病原性グループ 内に入る；（ｂ）それにもかかわらず、新しい分離株はブラティスラバ、ポモナ またはタラッソビではない；そして（ｃ）新しい分離株は、ｒＲＮＡ遺伝子配列 の同一性に関して、レプトスピラ・イナダイ（Ｌ．ｉｎａｄａｉ）血清型亜型リ メに最も類似する。 本発明のレプトスピラを特性決定するためのそれ以上の系列の実験において、 レプトスピラのＤＮＡを実施例５に記載したようにブタの腎臓から抽出し、次い で実施例１０に記載したレプトスピラのＤＮＡの検出方法のためにポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。これらの実験において、ＤＮＡからなる組 織抽出物からなり、１０⁵／ｍｌの血清型亜型ポモナ微生物を播種した陽性対照 を各反応系列に含めた。２．５μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液および１５ｍＭのＭｇ Ｃｌ₂、２．５μｌのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μｌの各前方向およ び逆方向プライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、ｌｕのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ （Ｐｒｏｍｅｇａ、典型的には５単位／μｌ）８．５μｌの無菌の蒸留水および １０μｌのＤＮＡ試料からなる反応混合物中で、抽出したＤＮＡを増幅した。増 幅反応において使用したプライマーを表１０に記載する。パーキン−エルマー（ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００を 使用して下記の条件下に、ＰＣＲ反応を実施した：９４℃において３分間、５６ ℃において１．５分間、７２℃において２分間の１サイクル；９４℃において１ 分間、５６℃ において１．５分間、７２℃において２分間の２９サイクル；および９４℃にお いて１分間、５６℃において１．５分間、７２℃において１０分間の１サイクル 。臭化エチジウムを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動させた 後、増幅生成物を可視化した。１系列のプライマー（表１０）を使用して、得ら れた各ＰＣＲ生成物を前方向および逆方向に配列決定した。前方向および逆方向 の双方の配列決定の結果を使用して、コンセンサス配列を誘導した。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド 位置１３９−３３４に対応する、いくつかのレプトスピラの増幅されたｒＲＮＡ 遺伝子のほぼ２００塩基対の領域のヌクレオチド配列を比較して、血清型亜型の 間の可変領域を同定した。分析した２００塩基のうちで、２５ヌクレオチドはレ プトスピラの間で変化することが見出された。研究した領域における配列は、病 原性血清型亜型について区別するために十分に変化しない。しかしながら、差は ９つの病原性種を弁別するために十分である。配列Ｎ０：１に記載するｒＲＮＡ 遺伝子配列と、８つのレプトスピラ種の下記の８つの代表的な血清型亜型から誘 導されたｒＲＮＡ配列とからなる配列の情報のデータベースを収集した：血清型 亜型ジャバニカ（Ｌ．ｂｏｒｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、血清型亜型リメ（Ｌ．ｉ ｎａｄａｉ）、血清型亜型シノプテリ（Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）、血清型亜 型ラナルム（Ｌ．ｍｅｙｅｒｉ）、血清型亜型パナマ（Ｌ．ｎｏｇｕｃｈｉｉ） 血清型亜型シャーマニ（Ｌ．ｓａｒａｔｏｓａｉ）、血清型亜型セレドニ（Ｌ． ｗｅｉｌｉｉ）および血清型亜型イクテロヘモルハギエ（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇ ａｎｓ）。 これらの代表的な配列の各々は異なっていた。それらの間の相同性は８９．５ ％（２１／２００塩基の差）から９９．５％（１／２ ００塩基の差）の間で変化した。血清型亜型ハーストブリッジおよびレプトスピ ラ・イナダイ（Ｌ．ｉｎａｄａｉ）は、ｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性の基準で、 検査した他の種と区別されるグループを形成した。さらに、これらの２つの種か らのヌクレオチド配列は互いに明瞭に識別することができた。 実施例９ 病原性レプトスピラに対して特異的なポリメラーゼ連鎖反応 培養試料中の病原性レプトスピラを検出するＰＣＲは、本明細書において記載 する双方のオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して、Ｈｏｏｋｅｙ（１９９ ２）が記載する１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の検出方法をベースとした。発表 された特異性レベルを達成するために使用するアニーリング温度を調節すること が必要であることが見出された。 ＰＣＲの試料を試験前に１００℃に１０分間加熱した。５０μｌの典型的なＰ ＣＲ反応体積は、１μ１の試料、５μｌの緩衝液濃厚物（０．１ＭのＴｒｉｓ− ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．５ＭのＫＣｌ、０．１％のゼラチン、１５ｍＭのＭｇ Ｃｌ₂、１％のトリトン−Ｘ１００の最終濃度を与える）、５μｌのｄＮＴＰ（ 各々０．２５ｍＭの最終濃度）、水中に適当に希釈した１μｌの前方向プライマ ーおよび１μｌの逆方向プライマーから成っていた。酵素の希釈緩衝液は、１０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＡＴ、 ０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５００μｇ／ｍ１のウシアルブミン、５０％（ｖ／ｖ） のグリセロールおよび０．１％（ｖ／ｖ）のトリトン−Ｘ１００から成っていた 。 ＰＣＲをパーキン・エルマー・セツス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ ｓ）ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００中で実施した。Ｈｏｏｋ ｅｙ（１９９２）のプライマーを使用す るＰＣＲ条件は、９４℃（１０秒）、５９℃（１０秒）および７２℃（１０秒） の３５サイクルであった。 ＰＣＲは培養においてレプトスピラを検出する再現可能な方法であることが示 された。アニーリング条件の変更後、Ｈｏｏｋｅｙ（１９９２）のプライマーを 使用するＰＣＲは、血清型亜型ハーストブリッジ（表３）および病原性レプトス ピラブラティスラバ、タラッソビおよびポモナのすべての５つの分離した株を検 出した。しかしながら、代表的な腐生性レプトスピラであるレプトスピラ・バイ フレクサ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ）血清型亜型パトクはこのアッセイにおいて陰性 であった。 実施例１０ 血清中のレプトスピラを検出するポリメラーゼ連鎖反応 レプトスピラの試料からの１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の一部 分またはそれから誘導された単離された核酸試料の増幅を可能とするように、オ リゴヌクレオチドのプライマーを設計した。ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ を使用して感度を最大とした。ネステッドＰＣＲは当業者によく知られており、 一般的戦略は、例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ等（１９９１）により記載されてい る。本発明の特定のネステッドＰＣＲ戦略は順次に２つの増幅反応を使用し、こ こで第１増幅反応において、病原性レプトスピラに対して特異的なプライマー、 例えば、Ｈｏｏｋｅｙ（１９９２）が記載するプライマー、さらに詳しくは、プ ライマーＬＵおよびｒＬＵ（表１０）を使用して、粗製の核酸またはそれを含む 組織試料からのｒＲＮＡ配列を増幅し、そして第２増幅反応において、レプトス ピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属に対して特異的な内部のプライマーを使用して 、第１反応から得られたｒＤＮＡをさらに増幅する。１０⁵／ｍｌの血清型亜型 ポモナ微生物を播種した組織抽出物また は粗製の核酸配列試料から成る、陽性の対照を各増幅系列に含めた。 ＰＣＲ反応混合物は、２．５μｌの１５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有する１０×Ｔ ａｑ緩衝液、２．５μｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰからなる ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μｌの５０ｐｍｏｌ／μｌの濃度の各プラ イマー、１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、２単位／μｌに 希釈した）、８．５μｌの無菌の蒸留水および１０μｌの試料から成っていた。 ＰＣＲ反応をパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００中で実施した。増幅条件は次の通りであった： ９４℃において３分間、５６℃において１．５分間、７２℃において２分間の１ サイクル；９４℃において１分間、５６℃において１．５分間、７２℃において ２分間の２９サイクル；および９４℃において１分間、５６℃において１．５分 間、７２℃において１０分間の１サイクル。 第１ＰＣＲ反応の生成物を無菌の蒸留水中で１／１０に希釈し、そして２．５ μｌの希釈した試料を同様な増幅反応において前述したように合計２５μｌの体 積で、プライマーＣおよびＩＮＴｒＬＰ（表１０）を使用して、含めた。第２反 応についての増幅条件は最初のラウンドに類似したが、アニーリング反応の温度 は５６℃の代わりに６１℃であった。 ＰＣＲ生成物を臭化エチジウムを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で 電気泳動させて、予測した大きさの生成物を検出した。増幅後、増幅されたＤＮ Ａを紫外線照明により可視化した。 実施例１１ 血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジ またはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ） に対して特異的なＰＣＲ 表３に記載する血清型亜型ハーストブリッジ／血清群ハーストブリッジ／レプ トスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の分離株の５つの分離された株およ び７つの病原性レプトスピラ種の培養物を、ＥＭＪＨ培地中で増殖させ、２×１ ０⁸微生物／ｍｌの濃縮に調節した。ＤＮＡをＢｏｏｍ等（１９９１）のシリカ 吸収法により抽出し、このプロセスの間に、培養物の１００μｌの体積は２５μ １に減少し、そのうちの２５μｌをＰＣＲ反応において試験した。こうして、ほ ぼ４×１０⁶微生物を各ＰＣＲ反応において試験した。 血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジのｒＤＮＡ配列を 特異的に検出するように選択したオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して、 ＰＣＲを実施した。前方向オリゴヌクレオチドのプライマー（配列ＮＯ：２）は ハーストブリッジ１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のある領域に対応し、この領域 はそれと比較した他のレプトスピラのそれと異なっていた。逆方向オリゴヌクレ オチドのプライマー（配列ＮＯ：３）はＨｏｏｋｅｙ（１９９２）により設計さ れ、そしてこれは病原性レプトスピラに対して特異的なＰＣＲ試験のために使用 されるプライマーの対（実施例９）の１つである。 ５０μｌの典型的なＰＣＲ反応の体積は、５μｌの試料、５μｌの緩衝液濃厚 物（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．５ＭのＫＣｌ、１％のトリ トン−Ｘ１００、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂の最終濃度を与える）、５μｌのｄＮＴ Ｐ（各々０．２ｍＭの最終濃度）、水中の適当な希釈度の１μｌの前方プライマ ーおよび１μｌの逆方向プライマー（各５ｐＭ）、５単位のＴａｑＤＮＡポリメ ラーゼ、および前記体積とする水から成っていた。 ＰＣＲをパーキン・エルマー・セツス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ ｓ）ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００中で実施した。増幅条件 は次の通りであった：ａ）９４℃において３分間、６３℃において１．５分間、 ７２℃において２分間の１サイクル；ｂ）９４℃において１分間、６３℃におい て１．５分間、７２℃において２分間の２９サイクル；ｃ）さらに反応の終わり において７２℃に１０分間保持した。 ＰＣＲ生成物を臭化エチジウムを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で 電気泳動させて、予測した大きさの生成物を検出した。増幅後、増幅されたＤＮ Ａを紫外線照明により可視化した。得られた結果を表１２に示す。 このＰＣＲ反応は、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッ ジまたはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）以外の血清型亜型また は血清群を検出しなかった。 実施例１２ ブタの受動的ワクチン接種 ほぼ４週齢の１５匹の子豚を１９９７年１１月１３日に獲得し、５匹の３つの グループに分離し、各々は同一室の中のブタの高いおりの中に入れた。各々５匹 のブタからなる３つのグループに、下記 の調製物を投与した： （グループＡ）：５ｍｌの免疫血清、これは血清型亜型ハーストブリッジにつ いてＭＡＴ陽性（ＭＡＴ力価２５６）であり、そして血清型亜型ハーストブリッ ジを反復して投与されたブタから誘導された； （グループＢ）：５ｍｌの非免疫ブタ血清、これは血清型亜型ハーストブリッ ジについてＭＡＴ陰性である（血清の対照）；および （グループＣ）：非血清（未処置対照）。 受動的ワクチン接種を１９９７年１１月２４日に実施し、引き続いて１１月２ ５日（第０日）に子豚に≧１０⁸血清型亜型ハーストブリッジ微生物で腹腔内的 にチャレンジした。第１日と第１０日との間の間隔で、血液および尿を収集した 。 実施例１０に記載したように、血清をレプトスピラのＤＮＡの存在について血 清を試験することによって、血清型亜型ハーストブリッジによる場合の証拠を決 定した。さらに、尿を暗い背景の顕微鏡下でレプトスピラの存在について検査し た。３滴の尿を５ｍｌのＥＭＪＨ培地に接種し、それから５ｍｌの媒質の中への ３滴の連続希釈を実施し、最後にほぼ１〜２週の培養後に暗視野顕微鏡下に培養 物を検査することによって、尿試料からレプトスピラを培養する試みを行った。 結果を表１３に示す。培養した試料のＰＣＲおよび光学顕微鏡を使用して決定 して、免疫血清をワクチン接種した５匹のブタ（すなわち、グループＡ）は感染 の証拠を示さなかったが、対照における５匹のブタのうちの３匹は、血清型亜型 ハーストブリッジのチャレンジ後、感染の証拠を示した。 受動的に免疫化した動物をさらに特性決定するために、ＭＡＴ（実施例４）を 使用して血清学的データを得て、レプトスピラの感染 が子豚に起こったかどうかを決定した。チャレンジ後１０および２０日に、すべ ての１０匹の対照子豚（上のグループＢおよびＣ）は３２〜５１２の範囲の血清 型亜型ハーストブリッジに対する少なくとも１つの力価を有し、これらの動物は 感染したことを示す（表１４）。顕著に対照的に、５匹の受動的にワクチン接種 した子豚（グループＡ）のうちの１匹のみは３２またはそれ以上のＭＡＴ力価を 発生させた（表１４）。したがって、受動的接種は感染の血清学的証拠を抑制し た。 実施例１３ 血清型亜型ハーストブリッジに対する熱不活性化ワクチン を使用するフタの防御免疫化 ほぼ４週齢の１２匹の子豚を１９９７年１１月１３日に獲得し、６匹の２つの グループに分離し、各々は同一室の中の別々のおりの中に入れた。少なくとも１ ０⁸のホルマリンで殺した血清型亜型ハーストブリッジ微生物／投与を含有し、 水酸化アルミニウムのアジュバントを添加した実験のワクチンで、グループＡを ３回筋肉内にワクチン接種した。レプトスピラの微生物を含有しない、同様に調 製したプラシーボをグループＢに与えた。 グループＡにおける１匹のブタはチャレンジ前に死亡した。 引き続いてブタに１９９８年１月５日（第０日）に子豚に≧１０⁸ 血清型亜型ハーストブリッジ微生物で腹腔内的にチャレンジした。第０日と第 １０日との間の間隔で、血液を収集した。実施例４に記載したように、血清型亜 型ハーストブリッジまたは血清群ハーストブリッジについてのＭＡＴにより、血 清を試験した。 チャレンジの日から、チャレンジ後１０日の屠殺の日までの、能動的にワクチ ン接種した子豚およびプラシーボ処置した子豚の血清学的結果を表１５に示す。 これらのデータから理解できるように、血清型亜型ハーストブリッジまたは血清 群ハーストブリッジに対する有意な抗体はチャレンジにおいてグループＡの中に 存在するが、対照動物はチャレンジにおいて血清型亜型ハーストブリッジまたは 血清群ハーストブリッジに対する検出可能な抗体をもっていない。さらに、チャ レンジに対する血清学的応答は、第０日までに非常に高いＭＡＴ力価をほとんど を有した対照グループ（すなわち、グループＢ）よりも、ワクチン接種したグル ープ（すなわち、グループＡ）においていっそう適度である。 表１６は、チャレンジに対する応答におけるＭＡＴ力価の増加により、この実 験の結果を示す。表１６に示すように、非免疫化動物における１２８倍の最大増 加に比較して、グループＡの動物はチャレンジ後最大８倍のＭＡＴ力価の増加を 経験した。生きている微生物のチャレンジ投与は、それを投与した動物において 、強い既往応答を誘発することが期待されるであろうが、殺したワクチンを前も って３回投与されたグループＡの動物について得られたデータは、ｉｎ ｖｉｖ ｏにおけるワクチン接種した微生物におけるハーストブリッジの生存および増殖 と一致しない。対照的に、６匹のグループＢの動物のうちの４匹は、ＭＡＴによ り決定して、感染の徴候を明らかに示した。 これらのデータが証明するように、グループＡの子豚のワクチン 接種はｉｎ ｖｉｖｏにおける血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハース トブリッジの生存および増殖を阻害した。 ^*ブタＮｏ．１はチャレンジ前に死亡した。 ^*ブタＮｏ．１はチャレンジ前に死亡した。 実施例１４ 群れＢから分離された血清型亜型ハーストブリッジまたは 血清群ハーストブリッジに対するウサギ抗血清の生産 コルソフ（Ｋｏｒｔｈｏｆ）（無タンパク質）媒質中で、分離株１（表３）を 約１０⁸微生物／ｍｌに培養において増殖させた。培養物を５６℃に３０分間加 熱してレプトスピラを殺し、等しい体積のモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）Ｉ ＳＡ５０アジュバントで乳化した。ウサギを２ｍｌのアジュバント添加したレプ トスピラで毎週６週間免疫化し、各投与量は１０の皮下部位にわたって分布させ た。最後の投与後２週に、血液を耳から収集した。 同等の態様 当業者は理解するように、本明細書において記載する本発明は詳細に説明する もの以外の変形および変更を受けることができる。本発明はすべてのこのような 変形および変更を包含することを理解す ベきである。また、本発明は、この明細書の中に言及した工程、特徴、組成物お よび化合物のすべてを、個々にまたは集合的に、包含し、そして前記工程または 特徴の任意のまたはすべての組合わせまたは２またはそれ以上を包含する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年１月２８日（１９９９．１．２８） 【補正内容】 請求の範囲 １．上に定義し血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）もしくは 血清型亜型ハーストブリッジ（ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）に属する分離された病 原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌または血清群ハーストブリッジ もしくは血清型亜型ハーストブリッジに属する細菌に血清学的に交差反応性であ るそれらの誘導細菌。 ２．前記細菌がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＷＫＩＤ株（ＡＧＡＬ 受託番号Ｎ９５／６９６８４）またはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）Ｂ ＵＴ６株の増殖特性を示す、請求項１に記載の分離された病原性レプトスピラ（ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ３．前記細菌が少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含有する培 地中で増殖することができる、請求項２に記載の分離された病原性レプトスピラ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ４．前記細菌が約１３℃〜約３７℃の範囲の温度において増殖することができ る、請求項２または３に記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌。 ５．前記細菌がヒトまたはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ 、イヌおよびネコを含むリストから選択される家畜動物またはコンパニオン動物 を感染することができる病原体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分 離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ６．前記細菌がブタを感染することができる、請求項５に記載の分離された病 原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ７．前記細菌がヒトを感染することができる、請求項５に記載の 分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ８．前記細菌がウシを感染することができる、請求項５に記載の分離された病 原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ９．前記細菌がそれが感染するヒトまたは他の動物におけるレプトスピラ症の 症状を生成することができる、請求項５〜８のいずれか一項に記載の分離された 病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １０．前記細菌が生殖疾患を誘発することができる、請求項１〜８のいずれか 一項に記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １１．前記細菌により誘導される生殖疾患が分娩の減少を含む、請求項１０に 記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １２．前記細菌により誘導される生殖疾患が子宮内の胎児死亡または自発的流 産を含む、請求項１０に記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌。 １３．前記細菌により誘導される生殖疾患が感染した動物の子孫における離乳 −交尾の期間を増加させる、請求項１０に記載の分離された病原性レプトスピラ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １４．前記細菌により誘導される生殖疾患が季節的不妊を含む、請求項１０に 記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １５．前記細菌が配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌ クレオチド配列に対して少なくとも約８０％同一である核酸、あるいは前記配列 ＮＯに記載するヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％同一である、少な くとも１５の隣接ヌクレオチドを含む、それらの相同体、類似体または誘導体ま たはそれらに 対する相補的ヌクレオチド配列をさらに含有する、請求項１〜１４のいずれか一 項に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １６．前記細菌がヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡ−３’に対して少な くとも約８０％同一であるか、あるいはヌクレオチド配列５’−ＴＴＴＧＡＴＡ −３’に対して少なくとも約９０％同一であるｒＲＮＡ遺伝子配列、あるいはそ れらの相同体、類似体または誘導体またはそれらに対する相補的ヌクレオチド配 列をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分離されたレプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １７．ｒＲＮＡ遺伝子配列がヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣ ＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＡに対して少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配 列、あるいはそれらの相同体、類似体または誘導体またはそれらに対する相補的 ヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐ ｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １８．同一性の百分率が少なくとも約９７％である、請求項１５〜１７のいず れか一項に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １９．ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託された微生物の特性を有す るか、あるいはそれと血清学的に交差反応する、請求項１〜１８のいずれか一項 に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ２０．ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託された分離されたレプトス ピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ２１．工程： （ｉ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載のレプトスピラ（Ｌ ｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌で感染したヒトまたは他の動物から組織を収集し、 （ｉｉ）前記組織から前記細菌を解放すると同時に前記細菌の完全性を維持す るために十分な時間の間かつ条件下に、前記組織を適当な均質化媒質中で均質化 し、そして （ｉｉｉ）前記細菌を増殖させるために十分な時間の間かつ条件下に、前記均 質化された組織を適当な培地中で培養する、 を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌を分離する方法。 ２２．培地がＥＭＪＨ培地である、請求項２１に記載の方法。 ２３．培地が８−アザグアニンまたは５−フルオロウラシルで補充されている 、請求項２１または２２に記載の方法。 ２４．培地が少なくとも１種の抗生物質で補充されている、請求項２１〜２３ のいずれか一項に記載の方法。 ２５．抗生物質がリファマイシン、マクロリドポリエンおよびキノリンまたは それの誘導化合物を含むリストから選択される、請求項２４に記載の方法。 ２６．培養条件が約１３℃〜約３７℃の範囲の温度における増殖からなる、請 求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。 ２７．他の動物被検体が家畜動物またはコンパニオン動物である、請求項２１ 〜２６のいずれか一項に記載の方法。 ２８．家畜動物またはコンパニオン動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ 、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから選択される、請求項２７に 記載の方法。 ２９．家畜動物がブタである、請求項２８に記載の方法。 ３０．組織が血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、肝臓または肺であるか、ある いは膀胱、腎臓、子宮またはファロピウス管または精 巣を含むリストから選択される尿生殖路に由来する組織である、請求項２１〜２ ９のいずれか一項に記載の方法。 ３１．組織が腎臓または尿である、請求項３０に記載の方法。 ３２．請求項１〜２０のいずれか一項に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅ ｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌または前記細菌に由来する抗原に結合することができる 抗体分子。 ３３．ポリクローナル抗体分子としてさらに定義される、請求項３２に記載の 抗体分子。 ３４．生物学的試料またはそれに由来する核酸分子を、１またはそれより多い 配列ＮＯ：２〜７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を含む単離されたプ ローブもしくはプライマーまたはそれらの相同体、類似体または誘導体またはそ れに対する相補的配列と、ハイブリダイゼーションを起すために十分な時間の間 かつ条件下に接触させ、次いで検出手段を使用して前記ハイブリダイゼーション を検出することを含む、ヒトまたは他の動物の被検体に由来する生物学的試料中 の請求項１〜２０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌の存在を診断する方法。 ３５．検出手段が単離された核酸分子のプローブに結合するリポーター分子で ある、請求項３４に記載の方法。 ３６．リポーター分子が放射性同位元素またはビオチンである、請求項３５に 記載の方法。 ３７．検出手段がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３４に記載の方法。 ３８．ポリメラーゼ連鎖反応が配列ＮＯ：２もしくは配列ＮＯ：３に記載のヌ クレオチド配列またはそれらの誘導体を含む少なくとも一つのプライマーを用い る、請求項３７に記載の方法。 ３９．ポリメラーゼ連鎖反応が配列ＮＯ：２及び３に記載のヌク レオチド配列または前記ヌクレオチド配列のいずれか一つの誘導体を含む少なく とも一つのプライマーを用いる、請求項３７に記載の方法。 ４０．（ｉ）第１回の増幅から得られた第１の増幅された遺伝子配列と、配列 ＮＯ：１に記載のヌクレオチド配列由来の少なくとも約１５ヌクレオチドの長さ の１またはそれよりも多い第２核酸プライマーまたは前記第１の増幅された遺伝 子配列に用いられた核酸プライマー配列の位置に対し内部である前記第１の増幅 された遺伝子配列における位置にハイブリダイゼーションすることができるその 相補的配列とを接触させ、 （ｉｉ）前記第１の増幅された遺伝子配列のコピーをＰＣＲを用いて増幅させ て、レプトスピラ血清群ハーストブリッジまたは血清型亜型ハーストブリッジｒ ＲＮＡ遺伝子配列を生産する、 ネスティッドＰＣＲを含む請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。 ４１．増幅された核酸分子産物を配列決定するそれ以上の工程を含む、請求項 ３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。 ４２．抗体：抗原の複合体を発生させるために十分な時間の間かつ条件下に、 前記生物学的試料を前記細菌に結合する抗体分子またはその抗原と接触させ、次 いで検出手段を使用して前記複合体を検出することを含む、ヒトまたは他の動物 の被検体に由来する生物学的試料中の請求項１〜２０のいずれか一項に記載の病 原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の存在を診断する方法。 ４３．抗体：抗原の複合体を発生させるために十分な時間の間かつ条件下に、 生物学的試料、例えば、血液、血清、または前記ヒトまたは動物被検体に由来す るそれらの誘導体を、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌または それに由来する抗原と接触 させ、次いで検出手段を使用して前記複合体を検出することを含む、ヒトまたは 他の動物の被検体に由来する生物学的試料中の請求項１〜２０のいずれか一項に 記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の存在を診断する方法 。 ４４．イムノアッセイまたは血清学的アッセイを含む、請求項４２または４３ に記載の方法。 ４５．イムノアッセイまたは血清学的アッセイがＭＡＴまたはＥＬＩＳＡを含 む、請求項４４に記載の方法。 ４６．請求項１〜２０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌に対して特異的な、選択的培養条件下に、前記細菌を増殖さ せるために十分な時間の間かつ条件下に、ヒトまたは他の動物の被検体に由来す る細胞または組織を培養する工程を少なくとも含む、請求項１〜２４のいずれか 一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の存在を診断す る方法。 ４７．選択的培養条件が約１３℃〜約３７℃の範囲の温度における８−アザグ アニンまたは５−フルオロウラシルを補充した培地上の増殖を含む、請求項４６ に記載の方法。 ４８．培地が少なくとも１種の抗生物質で補充されている、請求項４７に記載 の方法。 ４９．抗生物質がリファマイシン、マクロリドポリエンおよびキノリンまたは それの誘導化合物を含むリストから選択される、請求項４８に記載の方法。 ５０．他の動物の被検体が家畜動物またはコンパニオン動物である、請求項３ ４〜４９のいずれか一項に記載の方法。 ５１．家畜動物またはコンパニオン動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ 、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから 選択される、請求項５０に記載の方法。 ５２．家畜動物がブタである、請求項５１に記載の方法。 ５３．家畜動物がウシである、請求項５１に記載の方法。 ５４．生物学的組織が血清、血液、尿、脳脊髄液、肝臓、肺、膀胱、腎臓、子 宮、ファロピウス管または精巣に由来するホモジネートまたは組織または細胞抽 出物または全細胞を含む、請求項３４〜５３のいずれか一項に記載の方法。 ５５．生物学的試料が血清、血液、尿または腎臓に由来するホモジネートまた は組織または細胞抽出物または全細胞を含む、請求項５４に記載の方法。 ５６．請求項１〜２０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌に由来する１またはそれより多い免疫原を含有する第１区画 と、前記細菌と結合する抗体分子またはその抗原を含有する第２区画とを少なく とも含む、ヒトまたは他の動物の被検体またはそれらに由来する生物学的試料に おける請求項１〜２０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏ ｓｐｉｒａ）細菌を検出するための診断キット。 ５７．配列ＮＯ：２〜７のいずれか１つに記載するヌクレオチド配列を含む、 ２つの少なくとも約１５ヌクレオチド長さの非相補的核酸プライマー分子を含有 する第１区画と、核酸のハイブリダイゼーション反応またはポリメラーゼ連鎖反 応の実行に適当な反応緩衝液を含有する第２区画とを少なくとも含む、ヒトまた は他の動物の被検体またはそれらに由来する生物学的試料における請求項１〜２ ０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌を 検出するための診断キット。 ５８．請求項１〜２０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌の弱毒型、あるいはその細胞成分 と免疫学的に交差反応性の１またはそれより多い分離されたまたは組換え免疫原 と、１またはそれより多い薬学上または獣医学上許容される担体、アジュバント および／または希釈剤とを含んでなる、ヒトまたは動物被検体において請求項１ 〜２０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細 菌に対する防御免疫性を付与することができる組成物。 ５９．弱毒型の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が殺されて いるか、あるいはそうでなければ弱毒化されている、請求項５８に記載の組成物 。 ６０．病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が少なくとも約１０ ８微生物／単位投与量の濃度で存在する、請求項５８または請求項５９に記載の 組成物。 ６１．アジュバントが水酸化アルミニウムを含む、請求項５８のいずれか一項 に記載の組成物。 ６２．請求項１〜２０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌で感染したヒトまたは他の動物に由来する血清または前記血 清の誘導産物と、１またはそれより多い薬学上または獣医学上許容される担体、 アジュバントおよび／または希釈剤とを含んでなり、前記血清は前記病原性レプ トスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌に結合できる抗体または１またはそれよ り多いその免疫原を含んでなる、ヒトまたは動物の被検体における請求項１〜２ ０のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌に 対する防御免疫性を付与することができる組成物。 ６３．血清が少なくとも約２５６のＭＡＴ力価を産生することができる、請求 項６２に記載の組成物。 ６４．ヒトまたは動物の被検体において免疫応答を誘発するため に十分な時間の間かつ条件下に、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の組成 物を前記被検体に投与することを含む、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉ ｒａ）細菌によるヒトまたは動物の被検体の感染を予防的または治療的に処置す る方法。 ６５．免疫応答が体液性免疫応答である、請求項６４に記載の方法。 ６６．ヒトまたは動物の被検体が血清群ハーストブリッジもしくは血清型亜型 ハーストブリッジの病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはそ れらの血清学的に交差反応性である誘導細菌による引き続くチャレンジに抵抗す るために十分な時間の間かつ条件下に、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載 の組成物を前記被検体に投与することを含む、ヒトまたは動物の被検体において レプトスピラ症を予防的または治療的に処置する方法。 ６７．ヒトまたは動物の被検体が血清群ハーストブリッジもしくは血清型亜型 ハーストブリッジの病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはそ れらの血清学的に交差反応性である誘導細菌によるチャレンジに抵抗するために 十分な時間の間かつ条件下に、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の組成物 を前記被検体に投与することを含む、ヒトまたは動物の被検体において生殖疾患 を予防的または治療的に処置する方法。 ６８．感染した被検体における生殖疾患が季節的不妊、分娩の減少、子宮内の 胎児死亡または自発的流産に関連するか、あるいは感染した被検体の子孫におけ る離乳一交尾の期間の増加に関連する、請求項６７に記載の方法。 ６９．組成物が注射により投与される、請求項６４〜６８のいずれか一項に記 載の方法。 ７０．処置される被検体がヒトである、請求項６４〜６９のいず れか一項に記載の方法。 ７１．処置される被検体が家畜動物またはコンパニオン動物である、請求項６ ４〜６９のいずれか一項に記載の方法。 ７２．家畜動物またはコンパニオン動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ 、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから選択される、請求項７１に 記載の方法。 ７３．家畜動物がブタである、請求項７２に記載の方法。 ７４．家畜動物またはコンパニオン動物がウシ動物である、請求項７２に記載 の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １７１ Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｎ 1/20 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 チャペル，ロデリック ジェイ. オーストラリア国，ビクトリア 3099，ハ ーストブリッジ，ヒルクレスト ロード 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．上に定義し血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）または血 清型亜型ハーストブリッジ（ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）またはレプトスピラ・フ ァイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）種に属する分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅ ｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌またはそれらの誘導細菌。 ２．前記細菌がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＷＫＩＤ株（ＡＧＡＬ 受託番号Ｎ９５／６９６８４）またはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）Ｂ ＵＴ６株の増殖特性を示す、請求項１に記載の分離された病原性レプトスピラ（ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ３．前記細菌が少なくとも１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含有する培 地中で増殖することができる、請求項２に記載の分離された病原性レプトスピラ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ４．前記細菌が約１３℃〜約３７℃の範囲の温度において増殖することができ る、請求項２または３に記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌。 ５．前記細菌がヒトまたはブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、アルパカ 、イヌおよびネコを含むリストから選択される家畜動物またはコンパニオン動物 を感染することができる病原体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分 離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ６．前記細菌がブタを感染することができる、請求項５に記載の分離された病 原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ７．前記細菌がヒトを感染することができる、請求項５に記載の分離された病 原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ８．前記細菌がウシを感染することができる、請求項５に記載の分離された病 原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ９．前記細菌がそれが感染するヒトまたは他の動物におけるレプトスピラ症の 症状を生成することができる、請求項５〜８のいずれか一項に記載の分離された 病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １０．前記細菌が生殖疾患を誘発することができる、請求項１〜８のいずれか 一項に記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １１．前記細菌により誘導される生殖疾患が分娩の減少を含む、請求項１０に 記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １２．前記細菌により誘導される生殖疾患が子宮内の胎児死亡または自発的流 産を含む、請求項１０に記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌。 １３．前記細菌により誘導される生殖疾患が感染した動物の子孫における離乳 −交尾の期間を増加させる、請求項１０に記載の分離された病原性レプトスピラ （Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １４．前記細菌により誘導される生殖疾患が季節的不妊を含む、請求項１０に 記載の分離された病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １５．前記細菌が配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌ クレオチド配列に対して少なくとも約８０％同一である核酸、あるいは前記配列 ＮＯに記載するヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％同一である、少な くとも１５の隣接ヌクレオチドを含む、それらの相同体、類似体または誘導体ま たはそれらに対する相補的ヌクレオチド配列をさらに含有する、請求項１〜１４ のいずれか一項に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌 。 １６．前記細菌がヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡ−３’に対して少な くとも約８０％同一であるか、あるいはヌクレオチド配列５’−ＴＴＴＧＡＴＡ −３’に対して少なくとも約９０％同一であるｒＲＮＡ遺伝子配列、あるいはそ れらの相同体、類似体または誘導体またはそれらに対する相補的ヌクレオチド配 列をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分離されたレプトスピ ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １７．ｒＲＮＡ遺伝子配列がヌクレオチド配列５’−ＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣ ＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＡに対して少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配 列、あるいはそれらの相同体、類似体または誘導体またはそれらに対する相補的 ヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐ ｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １８．同一性の百分率が少なくとも約９７％である、請求項１５〜１７のいず れか一項に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 １９．細菌が配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレ オチド配列に対して少なくとも約８０％同一である核酸、あるいは前記配列ＮＯ に記載するヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％同一である、少なくと も１５の隣接ヌクレオチドを含む、それらの相同体、類似体または誘導体または それらに対する相補的ヌクレオチト配列を含有する、レプトスピラ・イナダイ（ Ｌ．ｉｎａｄａｉ）血清型亜型リメ、レプトスピラ・インテルロガンス（Ｌ．ｉ ｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清型亜型ブラティスラバ、ポモナまたはカニコーラ、 レプトスピラ・ボルグペテルセニイ（Ｌ ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）血清型亜型トラッソビまたはレプトスピラ・ バイフレクサ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ）血清型亜型パトク以外の分離されたレプト スピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ２０．細菌が配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレ オチド配列またはそれに対する相補的ヌクレオチド配列に対して高いストリンジ ェンシー条件下にハイブリダイゼーションすることができるＲＮＡまたはＤＮＡ を含有するか、あるいは前記配列ＮＯに記載するヌクレオチド配列に対して高い ストリンジェンシイ条件下にハイブリダイゼーションすることができる、少なく とも１５の隣接ヌクレオチド長さを含む、それらの誘導体、相同体または類似体 または誘導体を含有する、レプトスピラ・イナダイ（Ｌ．ｉｎａｄａｉ）血清型 亜型リメ、レプトスピラ・インテルロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血 清型亜型ブラティスラバ、ポモナまたはカニコーラ、レプトスピラ・ボルグペテ ルセニイ（Ｌ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）血清型亜型トラッソビまたはレ プトスピラ・バイフレクサ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ）血清型亜型パトク以外の分離 されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ２１．約１３℃〜約３７℃の範囲の温度において少なくとも２２５μｇ／ｍｌ の８−アザグアニンを含有する培地中で増殖することができ、そして配列ＮＯ： １〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレオチド配列またはそれに対 する相補的ヌクレオチド配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡを含有する、分離された 病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ２２．細菌が血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）または血清 型亜型ハーストブリッジ（ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）またはレプトスピラ・ファ イネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）に属するか、あるいは血清型亜型ハーストブリッジ （ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ ）または血清群ハーストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）またはレプトスピ ラ・ファイネイ（Ｌ．ｆａｉｎｅｉ）の特性を少なくとも有する、請求項１９〜 ２１のいずれか一項に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 細菌。 ２３．ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託された微生物の特性を有す るか、あるいはそれと血清学的または遺伝的に交差反応する、分離されたレプト スピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ２４．ＡＧＡＬ受託番号Ｎ９５／６９６８４で寄託された分離されたレプトス ピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌。 ２５．工程： （ｉ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌で感染したヒトまたは他の動物から組織を収集し、 （ｉｉ）前記組織から前記細菌を解放すると同時に前記細菌の完全性を維持す るために十分な時間の間かつ条件下に、前記組織を適当な均質化媒質中で均質化 し、そして （ｉｉｉ）前記細菌を増殖させるために十分な時間の間かつ条件下に、前記均 質化された組織を適当な培地中で培養する、 を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌を分離する方法。 ２６．培地がＥＭＪＨ培地である、請求項２５に記載の方法。 ２７．培地が８−アザグアニンまたは５−フルオロウラシルで補充されている 、請求項２５または２６に記載の方法。 ２８．培地が少なくとも１種の抗生物質で補充されている、請求項２５〜２７ のいずれか一項に記載の方法。 ２９．抗生物質がリファマイシン、マクロリドポリエンおよびキノリンまたは それの誘導化合物を含むリストから選択される、請求 項２８に記載の方法。 ３０．培養条件が約１３℃〜約３７℃の範囲の温度における増殖からなる、請 求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。 ３１．他の動物が家畜動物またはコンパニオン動物である、請求項２５〜３０ のいずれか一項に記載の方法。 ３２．家畜動物またはコンパニオン動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ 、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから選択される、請求項３０に 記載の方法。 ３３．動物がブタである、請求項３２に記載の方法。 ３４．組織が血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、肝臓または肺であるか、ある いは膀胱、腎臓、子宮またはファロピウス管または精巣を含むリストから選択さ れる尿生殖路に由来する組織である、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の 方法。 ３５．組織が腎臓または尿である、請求項３４に記載の方法。 ３６．配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレオチド 配列に対して少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列、あるいは前記配 列ＮＯに記載するヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％同一である、少 なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む、それらの相同体、類似体または誘導体 またはそれらに対する相補的ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。 ３７．配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに対する同一性の百分率 が少なくとも約９７％である、請求項３６に記載の単離された核酸分子またはそ れらの相同体、類似体または誘導体。 ３８．配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレオチド 配列、少なくとも１５のヌクレオチドの長さを含むヌクレオチド配列、またはそ れらの相同体、類似体または誘導体またはそれらに対する相補的ヌクレオチド配 列を含む、単離された核酸 分子。 ３９．配列ＮＯ：１〜２または４〜７のいずれか１つに記載するヌクレオチド 配列またはそれらの相同体、類似体または誘導体またはそれらに対する相補的ヌ クレオチド配列に対して高いストリンジェンシイ条件下にハイブリダイゼーショ ンすることができる、単離された核酸分子。 ４０．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の分離されたレプトスピラ（Ｌｅ ｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌または前記細菌に由来する抗原に結合することができる 抗体分子。 ４１．ポリクローナル抗体分子としてさらに定義される、請求項４０に記載の 抗体分子。 ４２．生物学的試料またはそれに由来する核酸分子を、１またはそれより多い 請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子またはそれらの相 同体、類似体または誘導体またはそれに対する相補的配列と、ハイブリダイゼー ションを起すために十分な時間の間かつ条件下に接触させ、次いで検出手段を使 用して前記ハイブリダイゼーションを検出することを含む、ヒトまたは他の動物 の被検体に由来する生物学的試料中の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒ ａ）細菌の存在を診断する方法。 ４３．病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が請求項１〜２４の いずれか一項に記載の細菌である、請求項４２に記載の方法。 ４４．検出手段が単離された核酸分子のプローブに結合するリポーター分子で ある、請求項４２または４３に記載の方法。 ４５．リポーター分子が放射性同位元素またはビオチンである、請求項４４に 記載の方法。 ４６．検出手段がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項４２また は４３に記載の方法。 ４７．ポリメラーゼ連鎖反応が病原性レプトスピラに対して特異的である、請 求項４６に記載の方法。 ４８．ポリメラーゼ連鎖反応がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の微 生物に対して特異的である、請求項４６に記載の方法。 ４９．ポリメラーゼ連鎖反応が血清型亜型ハーストブリッジまたは血清群ハー ストブリッジ（Ｈｕｒｓｔｂｒｉｄｇｅ）またはレプトスピラ・ファイネイ（Ｌ ．ｆａｉｎｅｉ）に対して特異的である、請求項４５に記載の方法。 ５０．生物学的試料またはそれに由来する核酸分子を、請求項３６〜３９のい ずれか一項に記載の単離された核酸分子に由来する少なくとも約１５ヌクレオチ ド長さの１またはそれより多い第１核酸プライマーと接触させ、次いで前記生物 学的試料または前記核酸試料からの遺伝子配列をポリメラーゼ連鎖反応において 増幅させることを含む、ヒトまたは他の動物の被検体に由来する生物学的試料中 の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の存在を診断する方法。 ５１．１またはそれより多い第１核酸プライマーの位置に対して内部である増 幅された遺伝子の位置においてハイブリダイゼーションすることができ、かつ配 列ＮＯ：１に記載するヌクレオチド配列またはそれに対する相補的配列に由来す る、少なくとも１５ヌクレオチド長さの１またはそれより多い第２核酸プライマ ーと、増幅された遺伝子配列を接触させ、そしてそれからの遺伝子配列を第２ポ リメラーゼ連鎖反応において増幅する工程をさらに含む、請求項５０に記載の方 法。 ５２．病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が請求 項１〜２４のいずれか一項に記載の細菌である、請求項５０または５１に記載の 方法。 ５３．増幅された核酸分子を配列決定するそれ以上の工程を含む、請求項４６ 〜５２のいずれか一項に記載の方法。 ５４．抗体：抗原の複合体を発生させるために十分な時間の間かつ条件下に、 前記生物学的試料を請求項４０または４１に記載の抗体分子と接触させ、次いで 検出手段を使用して前記複合体を検出することを含む、ヒトまたは他の動物の被 検体に由来する生物学的試料中の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ） 細菌の存在を診断する方法。 ５５．抗体：抗原の複合体を発生させるために十分な時間の間かつ条件下に、 生物学的試料、例えば、血液、血清、またはそれらの誘導体を、請求項１〜２４ のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌また はそれに由来する抗原と接触させ、次いで検出手段を使用して前記複合体を検出 することを含む、ヒトまたは他の動物の被検体に由来する生物学的試料中の病原 性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の存在を診断する方法。 ５６．イムノアッセイまたは血清学的アッセイを含む、請求項５４または５５ に記載の方法。 ５７．イムノアッセイまたは血清学的アッセイがＭＡＴまたはＥＬＩＳＡを含 む、請求項５６に記載の方法。 ５８．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌に対して特異的な、選択的培養条件下に、前記細菌を増殖さ せるために十分な時間の間かつ条件下に、ヒトまたは他の動物の被検体に由来す る細胞または組織を培養する工程を少なくとも含む、請求項１〜２４のいずれか 一項に記載の 病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の存在を診断する方法。 ５９．選択的培養条件が約１３℃〜約３７℃の範囲の温度における８−アザグ アニンまたは５−フルオロウラシルを補充した培地上の増殖を含む、請求項５８ に記載の方法。 ６０．培地が少なくとも１種の抗生物質で補充されている、請求項５９に記載 の方法。 ６１．抗生物質がリファマイシン、マクロリドポリエンおよびキノリンまたは それの誘導化合物を含むリストから選択される、請求項６０に記載の方法。 ６２．他の動物の被検体が家畜動物またはコンパニオン動物である、請求項４ ２〜６１のいずれか一項に記載の方法。 ６３．家畜動物またはコンパニオン動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ 、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから選択される、請求項６２に 記載の方法。 ６４．家畜動物がブタである、請求項６３に記載の方法。 ６５．家畜動物がウシである、請求項６３に記載の方法。 ６６．生物学的組織が血清、血液、尿、脳脊髄液、肝臓、肺、膀胱、腎臓、子 宮、ファロピウス管または精巣に由来するホモジネートまたは組織または細胞抽 出物または全細胞を含む、請求項４２〜６５のいずれか一項に記載の方法。 ６７．生物学的試料が血清、血液、尿または腎臓に由来するホモジネートまた は組織または細胞抽出物または全細胞を含む、請求項６６に記載の方法。 ６８．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌に由来する１またはそれより多い免疫原を含有する第１区画 と、請求項４０または４１に記載の抗体 分子を含有する第２区画とを少なくとも含む、ヒトまたは他の動物の被検体また はそれらに由来する生物学的試料における病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐ ｉｒａ）細菌を検出するための診断キット。 ６９．請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子のヌクレ オチド配列を含む、２つの少なくとも約１５ヌクレオチド長さの非相補的核酸プ ライマー分子を含有する第１区画と、核酸のハイブリダイゼーション反応または ポリメラーゼ連鎖反応の実行に適当な反応緩衝液を含有する第２区画とを少なく とも含む、ヒトまたは他の動物の被検体またはそれらに由来する生物学的試料に おける病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌を検出するための診断 キット。 ７０．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌、あるいはその細胞成分と免疫学的に交差反応性の１または それより多い分離されたまたは組換え免疫原と、１またはそれより多い薬学上ま たは獣医学上許容される担体、アジュバントおよび／または希釈剤とを含んでな る、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌に対する防御免疫性を付 与することができる組成物。 ７１．病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が殺されているか、 あるいはそうでなければ弱毒化されている、請求項７０に記載の組成物。 ７２・病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が少なくとも約１０ ８微生物／単位投与量の濃度で存在する、請求項７０または７１に記載の組成物 。 ７３．アジュバントが水酸化アルミニウムを含む、請求項７０〜７２のいずれ か一項に記載の組成物。 ７４．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔ ｏｓｐｉｒａ）細菌で感染したヒトまたは他の動物に由来する血清または前記血 清の誘導産物と、１またはそれより多い薬学上または獣医学上許容される担体、 アジュバントおよび／または希釈剤とを含んでなり、前記血清は請求項１〜２４ のいずれか一項に記載の病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌に結 合できる抗体または１またはそれより多いその免疫原を含んでなる、ヒトまたは 動物の被検体における病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌に対す る防御免疫性を付与することができる組成物。 ７５．血清が少なくとも約２５６のＭＡＴ力価を産生することができる、請求 項７４に記載の組成物。 ７６．誘導産物が請求項４０または４１に記載の抗体を含んでなる、請求項７ ４または７５に記載の組成物。 ７７．ヒトまたは動物の被検体において免疫応答を誘発するために十分な時間 の間かつ条件下に、請求項７０〜７６のいずれか一項に記載の組成物を前記被検 体に投与することを含む、病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌に よるヒトまたは動物の被検体の感染を予防的または治療的に処置する方法。 ７８．免疫応答が体液性免疫応答である、請求項７７に記載の方法。 ７９．ヒトまたは動物の被検体が病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ）細菌による引き続くチャレンジに抵抗するために十分な時間の間かつ条件下に 、請求項７０〜７６のいずれか一項に記載の組成物を前記被検体に投与すること を含む、ヒトまたは動物の被検体においてレプトスピラ症を予防的または治療的 に処置する方法。 ８０．ヒトまたは動物の被検体が病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ）細菌によるチャレンジに抵抗するために十分な時間の間かつ条件下に、請求項 ７０〜７６のいずれか一項に記載の組成物を前記被検体に投与することを含む、 ヒトまたは動物の被検体において生殖疾患を予防的または治療的に処置する方法 。 ８１．感染した被検体における生殖疾患が季節的不妊、分娩の減少、子宮内の 胎児死亡または自発的流産に関連するか、あるいは感染した被検体の子孫におけ る離乳−交尾の期間の増加に関連する、請求項８０に記載の方法。 ８２．組成物が注射により投与される、請求項７７〜８１のいずれか一項に記 載の方法。 ８３．処置される被検体がヒトである、請求項７７〜８２のいずれか一項に記 載の方法。 ８４．処置される被検体が家畜動物またはコンパニオン動物である、請求項７ ７〜８２のいずれか一項に記載の方法。 ８５．家畜動物またはコンパニオン動物が、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ 、シカ、アルパカ、イヌおよびネコを含むリストから選択される、請求項８４に 記載の方法。 ８６．家畜動物がブタである、請求項８５に記載の方法。 ８７．家畜動物またはコンパニオン動物がウシ動物である、請求項８５に記載 の方法。