JP2008539718A - ネコ・ヘモプラズマの分離株 - Google Patents
ネコ・ヘモプラズマの分離株 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008539718A JP2008539718A JP2008509541A JP2008509541A JP2008539718A JP 2008539718 A JP2008539718 A JP 2008539718A JP 2008509541 A JP2008509541 A JP 2008509541A JP 2008509541 A JP2008509541 A JP 2008509541A JP 2008539718 A JP2008539718 A JP 2008539718A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- hemoplasma
- nucleic acid
- pathogen
- rrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明のある態様では単離されたヘモプラズマ病原体を提供し、ここではSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2;またはSEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4;またはSEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:14から成るPCRプライマーと共にヘモプラズマ病原体の核酸を使用して実施するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅産物が得られる。SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2で増幅させた増幅産物は約1342核酸長であり;SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4で増幅させた増幅産物は約85ヌクレオチド長であり;そしてSEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:14で増幅させた増幅産物は約1342核酸長でありうる。ヘモプラズマ病原体はSEQ ID NO:12の16S rRNA配列を含有してもよい。
図1は、感染実験を示す。感染後100日間にわたる、ネコ1(A)およびネコ2(B)における、新たに報告された分離株の病原体量(血液ml当たりのDNAテンプレートのコピー数の対数(左側Y軸、黒三角)、および血中血球容積(PCV)(%、右側Y軸、白四角)の経過。PCVの基準範囲を灰色の網掛けで示す。リアルタイムPCRアッセイの検出下限値(100コピー/血液ml)を点線で示す。
ヘモプラズマ病原体
近年の分子的方法の進歩により、ネコ血液サンプル中のヘモプラズマ病原体の高感度かつ特異的な同定および定量が可能となった。スイスにおける飼いネコ集団のヘモプラズマ感染に関する調査を行う疫学的研究にこれらの方法を適用して、第3の新規のユニークなネコ・ヘモプラズマ分離株(‘Candidatus Mycoplasma turicensis’)を同定した。これはブタペスト条約の下、PTA-6782として寄託されている(2005年6月8日)。
本発明の核酸分子は以下を含む単離された核酸分子を含む:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、それらのフラグメント、またはそれらの組み合わせ。
サンプルには例えば以下がある:精製核酸、未精製核酸、細胞、細胞抽出物、組織、臓器液、体液、組織切片、標本、吸引液、骨髄液、組織生検検体、組織拭き取り検体、細針吸引物、皮膚生検検体、血液、血清、リンパ液、脳脊髄液、精液、便、または尿。
本発明の他の態様は、本発明のヘモプラズマ病原体感染の診断法およびヘモプラズマ病原体感染の治療効果のモニタリング法を提供する。例えば本発明は、ヘモプラズマ病原体に感染した被験体の治療効果をモニタリングする方法を提供する。この方法は以下を含む:被験体から治療前サンプルを得る;サンプル中のヘモプラズマ16S rRNA核酸の存在、非存在、量、またはそれらを組み合わせたものを検出する;被験体から1つ以上の治療後サンプルを得る;治療後サンプル中のヘモプラズマ16S rRNA核酸の存在、非存在、またはそれらの組み合わせを検出する;投与前サンプル中の16S rRNA核酸の存在、非存在、量、またはそれらの組み合わせと、投与後サンプル中のそれとを比較する;そして治療の効果を測定する。
上記のアッセイ試薬(プライマー、プローブ、固相支持体を含む)、並びに他の検出試薬を、好適な取り扱い説明書および他の必要な試薬と共にキットとして提供し、例えば上記のアッセイを実施することができる。キットは個別の容器で、プライマーおよびプローブの組み合わせ(既に固相支持体に結合させてあるか、または支持体にそれらを結合させるための試薬と分離されている)、コントロール製剤(ポジティブおよび/またはネガティブ)、標識された試薬、および標識がシグナルを直接生成しない場合はシグナル生成試薬(例えば酵素基質)を含有してもよい。アッセイを実施するための取り扱い説明書(例えば記述、テープ、VCR、CD-ROM)がキットに含まれてもよい。キットは、使用する特定のアッセイによって、他のパッケージ化された試薬および物質(すなわち洗浄バッファーなど)を含んでもよい。上記のような標準的なアッセイをこれらのキットを用いて実施することができる。
新規のヘモプラズマ分離株がネコ946(13歳オス去勢ネコ)で発見され、2002年12月にZurich大学のthe Clinic for Small Animal Internal Medicineに提示された。スイスのネコのM. haemofelisおよび‘Candidatus M. haemominutum’の感染率を評価する疫学的研究の際、ネコ946が矛盾するPCR結果のために注目された。このネコから2003年3月に採取した血液サンプルから抽出したDNAを試験したところ、慣例的なPCR(Jensenら)では陽性であったが、既に報告されているM. haemofelisおよび‘Candidatus M. haemominutum’に特異的なリアルタイムPCRアッセイ(Taskerら, 2003. J Clin Microbiol 41:439-41)では陰性であった。増幅されたPCR産物および、それに次いで16S rRNA遺伝子をシーケンシングし、報告されている他のヘモプラズマ種の配列と比較した(下記参照)。発症の4ヶ月前、ネコ946はHaemobartonellosisと一致する臨床兆候(嗜眠、食欲不振、蒼白、呼吸困難、および体重減少を含む)を示していた。その時点で採取した血液および尿サンプルの検査により、以下の症状が明らかになった:血管内溶血(PCV 12%(基準値:33%-45%))、白血球増加(25.6 x 109/l(基準値: 5 -18.9 x 109/l))、ビリルビン血症(34μmol/l(基準値: 0 − 15 μmol/l))、およびヘモグロビン尿症。貧血症は最初の発症の4日後に高度の再生性となった(PCV 17%;凝集網状赤血球数201,670/μl(>60,000/μlを再生性と定義))。ネコ946の血液中の新規の分離株を検出する前は、原発性免疫介在型溶血性貧血が疑われ、コルチコステロイドでの治療が行われていた。しかしながらこの治療ではネコの臨床状態は一時的に改善されるのみであった。ヘモプラズマ感染の診断後、そして感染実験のための血液を採取した後、ネコ946をデオキシサイクリンで2回治療した(10mg/kg/日、14日間)。デオキシサイクリン治療の開始後、ネコの症状は改善した。しかしながら、RBC浸透圧脆弱性は急性疾患後1年以上にわたって高いままであった(0.71% NaCl中で50%溶血)(基準値:0.50-0.57% NaCl中で50%溶血)。
自動血球計測器(Cell-Dyn 3500, Abbott, Baar, スイス)を使用してネコ946、ネコ1、およびネコ2の完全なヘモグラムを行った。EDTA-抗凝固処理した新鮮な血液を用いて血液塗抹標本を調製し、AMES Hema Tekスライドステイナー(Bayer, Zurich,スイス)を使用してGiemsa染色を行った。それらを白血球判別、赤血球の形態学的特徴、およびヘモプラズマ生物体の存在について評価した。メチレンブルーで超生体染色した後、網状赤血球凝集体を計測した。自動化学分析装置(Cobas Integra 700, Roche Diagnostics, Rotkreuz, スイス)を使用し、the International Federation of Clinical Chemistryで推奨されている標準的な方法(Tieze. 1995. Clinical guide to laboratory tests, 第3版The W.B. Saunders Company, Philadelphia, Paにも報告されている)によってネコ946の血清生化学分析を行った。基準値はthe Clinical Laboratory, University of Zurich(スイス)において、58検体の健常成体ネコ由来の血液サンプルを用い、同じ方法で測定した。基準値の範囲を5%から95%クォンタイルの範囲とした。
浸透圧脆弱性を測定するために、50μlの新たに回収したEDTA-抗凝固処理血液を0.3-0.9%の濃度範囲のNaCl溶液5mlに添加した。内容物を穏やかに撹拌し、37℃で1時間インキュベートした。試験管を600 x gで10分間遠心分離した。546nmで分光光度分析を行い、上清のヘモグロビン含量を測定した。0.9% NaCl溶液をブランクとして使用した。溶血のパーセンテージを以下のように算出した:0.3% NaCl溶液中でインキュベーションした後の上清での吸光度測定値を100%溶血、0.9% NaCl中でインキュベーションした後の上清での吸光度測定値を0%溶血と定義した。S字回帰を用いて曲線をデータに適合させた(SigmaPlot Regression Wizard, SSPS, Chicago, 米国)。ネコ2から採取した全ての血液サンプル、およびネコ1および946由来の選択したサンプルで浸透圧脆弱性を測定した。健常ネコ(SPF 6検体、個人の飼いネコ3検体)から採取した血液サンプルでこの方法を実施し、基準値を測定した。基準値の範囲を5%から95%クォンタイルの範囲とした。
PCR分析およびシーケンシングのために、MagNaPure(登録商標) LC DNA Isolation Kit I(Roche Diagnostics)を用いて200μlのEDTA抗凝固処理血液からゲノムDNAを精製した。クロス・コンタミネーションをモニタリングするために、200μlの無菌水から成るネガティブコントロールをサンプルの各バッチと同時に調製した。既に報告されている慣例的なPCR(Jensenら 2001 Am J Vet Res 62:604-608)およびリアルタイムPCRアッセイ(Taskerら 2003. J Clin Microbiol 41:439-41)を実施して、M. haemofelisおよび‘Candidatus M. haemominutum’感染を検出した。ネコ・コロナウィルス(FCoV)、ネコ免疫不全ウィルス(FIV)、ネコ白血病ウィルス(FeLV)、およびネコ・パルボウィルス(FPV)の検出のためのPCRアッセイは、報告されているように実施した(Foleyら 1998. Am J Vet Res 59:1581-8;Hofmann-Lehmann 2001. Journal of General Virology 82:1589-1596;Leutenegger 1999. Journal of Virological Methods 78:105-116;Meliら 2004. J Feline Med Surg 6:69-81)。
ネコ1の血液由来の新規ヘモプラズマ分離株の16S rRNA遺伝子全長の増幅およびシーケンシングを実施した。これには既に報告されているユニバーサルプライマーfHf1およびrHf2を使用し(Messickら, 1998. J Clin Microbiol 36:462-6)、反応混液は2.5μlの10x PCRバッファー(Sigma-Aldrich, Buchs, スイス)、800nMの各プライマー、200μMの各dNTP(Sigma-Aldrich)、2.5mM MgSO4、および0.8 Pfu DNAポリメラーゼ(Promega社, Catalys AG, Wallisellen, スイス)、並びに5μlのテンプレートDNAを含有し、水で最終容量25μlとした。温度プログラムは51-61℃30秒間、72℃3分間、そして最終伸長反応を72℃10分間とした。好適なサイズ(1440bp)の増幅産物を1/2%アガロースゲル上での臭化エチジウム染色によって同定し、MinElute(登録商標) Gel Extraction Kit(Quiagen, Hombrechtikon,スイス)で精製した後、Zero Blunt(登録商標) TOPO(登録商標) PCRクローニングキット (Invitrogen, Basel,スイス)を使用し、説明書に従ってクローニングした。ネコ2および946ではヘモプラズマ病原体量が低かったため、Ampli Taq Gold(登録商標) DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems, Rotkreuz, スイス)および種特異的プライマー(順向き:5’-GAA CTG TCC AAA AGG CAG TTA GC-3’(SEQ ID NO:1);逆向き:5’-AGA AGT TTC ATT CTT GAC ACA ATT GAA-3’(SEQ ID NO:2))を使用して分離株の16S rRNA遺伝子の1342bp産物を増幅した。反応混液は2.5μlの10x PCRバッファー(Applied Biosystems)、800nMの各プライマー、200μMの各dNTP(Sigma-Aldrich)、1.5mM MgCl2、および1.25 U Ampli Taq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)、および5μlのテンプレートDNAを含有し、水で最終容量25μlとした。温度プログラムは95℃5分間を1サイクル、95℃30秒間を35サイクル、51-61℃30秒間のアニーリンググラジエント、72℃2分間、そして最終伸長反応は72℃10分間とした。TOPO TAクローニング(登録商標) キット (Invitrogen) を使用し、説明書に従って増幅産物をクローニングした。増殖させたプラスミドDNAをQIAprep(登録商標)Spin Miniprepキット(Quiagen)を使用して精製し、M13順向きプライマーおよびM13逆向きプライマーを用いてシーケンシングした。16S rRNA遺伝子の中央領域のシーケンシングは内部プライマー(5’-GAA GGC CAG ACA GGT CGT AAA G-3’)(SEQ ID NO:3)を用いて完成させた。BigDye(登録商標) Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)を用いてシーケンシングを行った。サイクル条件は以下の通りである:96℃1分間、96℃10秒間を25サイクル、50℃5秒間、そして60℃4分間。DyeEx(登録商標) Spin columns(Qiagen)で産物を精製し、ABI PRISM(登録商標) 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)で分析した。
自然感染および実験感染させたネコ由来の血液サンプル中の新規分離株の検出および定量を行うために、特異的定量PCRアッセイを構築した。順向きプライマー(5’-GAAGGCCAGACAGGTCGTAAAG-3’)(SEQ ID NO:3)および逆向きプライマー(5’-CTGGCACATAGTTWGCTGTCACTTA-3’)(SEQ ID NO:4;WはAまたはTを示す)、そしてプローブ(6-FAM-AAATTTGATGGTACCCTCTGA-MGB)(SEQ ID NO:6)の設計を16S rRNA遺伝子配列(上記)に基づいて行った。PCR反応液は12.5μlの2x qPCR(商標)Mastermix(Eurogentec, Seraing, ベルギー)、880nMの各プライマー、200nMのプローブ、および5μlのテンプレートDNAを含有し、水で最終容量を25μlとした。ABI PRISM(登録商標) 7700 Sequence Detection system (Applied Biosystems)を使用して定量PCR反応を実施した。未感染SPFネコ由来のDNAサンプルおよび水をネガティブコントロールとして使用した。新規分離株の絶対的定量のために、新規分離株からクローニングした16Sリボソーム遺伝子(rDNA)PCR産物を含有するプラスミドを構築し、上記のように精製し、Not1で消化した。直線化したDNAを分光光度法で定量し、存在するプラスミドのコピー数を算出した。その後、DNAテンプレートをサケ精子DNA(Invitrogen)の30μg/ml溶液で連続的に十倍希釈し、アリコートに分け、使用まで-20℃で保存した。
オーストラリア、南アフリカ共和国、およびイギリスの飼いネコ、並びに数検体の野生のネコ科動物から得た更なる分離株のシーケンシングを行った。5つの16S rRNA配列(B3、D7、D9、G5、(感染した飼いネコ由来)および94-100(セレンゲティの感染ライオン由来)は、スイスの元の分離株に比較して、多少の相違を示した。報告されているスイス‘Candidatus M. turicensis’配列(スイスの罹患率研究からのDQ157150/ clone 2.24)にアラインメントさせた1295塩基対内では、16ヌクレオチド(G5)から33ヌクレオチド(B3、D7、D9、100-94)の配列相違性が示された。
CMt_spec2f:
5'-CGA ATT GTC GAA AGA CAA TTA GC-3' SEQ ID NO:13
CMt-spec2r:
5'-AGA AGT TTC ATT CTT GAC ACA ATT TAA-3' SEQ ID NO:14
これらのプライマーは種特異的であり、約1342ヌクレオチドの産物を増幅させる。増幅は上記の増幅と同様に行った。
Claims (31)
- 単離されたヘモプラズマ病原体であって、ヘモプラズマ病原体の核酸をSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2;またはSEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4;またはSEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:14から成るPCRプライマーと共に使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅産物が生じることを特徴とする、単離されたヘモプラズマ病原体。
- SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2で増幅される増幅産物が約1342核酸長であり;SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4で増幅される増幅産物が約85ヌクレオチド長であり;そしてSEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:14で増幅される増幅産物が約1342核酸長である、請求項1記載の単離されたヘモプラズマ病原体。
- ヘモプラズマ病原体がSEQ ID NO:12の16S rRNA配列を含有する、請求項1記載の単離されたヘモプラズマ病原体。
- SEQ ID NO:12を含有する単離された核酸分子、またはSEQ ID NO:12の10個以上の連続する核酸を含有する核酸分子。
- 単離された核酸分子がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19;または、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19の10個以上の連続する核酸;またはそれらの組み合わせを含有する、請求項4記載の単離された核酸分子。
- 単離された核酸分子が標識を含有する、請求項4記載の単離された核酸分子。
- サンプル中の請求項1記載のヘモプラズマ病原体の存在または非存在を検出する方法であって、
SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:12の10個以上の連続する核酸を含有する単離された核酸プローブとサンプルを接触させ;そして
ハイブリダイズしたプローブ/ヘモプラズマ病原体核酸複合体の存在または非存在を検出する
ことを含み、ハイブリダイズしたプローブ/ヘモプラズマ病原体核酸複合体の存在はサンプル中の請求項1記載のヘモプラズマ病原体の存在を示すことを特徴とする上記方法。 - ハイブリダイズしたプローブ/ヘモプラズマ病原体核酸複合体の量を測定する、請求項7記載の方法。
- プローブが標識を含有する、請求項7記載の方法。
- 標識が蛍光部分である、請求項9記載の方法。
- 被験体における請求項1記載のヘモプラズマ病原体の存在または非存在を検出する方法であって、被験体から得たサンプル中のヘモプラズマ病原体の16S rRNAまたは16S rRNAをコードする核酸分子を検出することを含み、16S rRNAまたは16S rRNAをコードする核酸の存在はヘモプラズマ病原体の存在を示すことを特徴とする上記方法。
- 検出が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR);リガーゼ連鎖反応;核酸配列に基づく増幅;自己保持配列複製;鎖置換増幅;分枝DNAシグナル増幅;ネステッドPCR;マルチプレックスPCR;定量PCR;直接検出、インサイチューハイブリダイゼーション;転写介在増幅(TMA);ローリングサークル増幅(RCA);およびQ-ベータ-レプリカーゼ系から成る群から選択される方法によってヘモプラズマ病原体の16S rRNA核酸分子を増幅することを含む、請求項11記載の方法。
- 検出が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19;または、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19の10個以上の連続する核酸;またはそれらの組み合わせを含有する単離された核酸プローブの使用を含む、請求項11記載の方法。
- サンプル中の請求項1記載のヘモプラズマ病原体の16S rRNA核酸分子を検出する方法であって、
SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:13から成る第1の増幅プライマー、およびSEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:14から成る第2の増幅プライマーを使用してヘモプラズマ病原体の16S rRNA核酸分子を増幅し;そして
増幅産物を検出する
ことを含み、増幅産物が検出された場合には16S rRNA核酸分子が存在することを特徴とする、上記方法。 - サンプル中の16S rRNA核酸分子の量を測定する、請求項14記載の方法。
- 第1もしくは第2、または両方の増幅プライマーが更に標識を含有する、請求項14記載の方法。
- 標識が蛍光部分である、請求項16記載の方法。
- 増幅がリアルタイム定量PCRを含み、5’ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼおよび検出可能な標識を含む少なくとも1つのプローブの使用を更に含む、請求項14記載の方法。
- 少なくとも1つのプローブがSEQ ID NO:6から成る、請求項18記載の方法。
- 増幅がリアルタイム定量PCRを含み、2本鎖DNAに結合する検出可能な色素の使用を更に含む、請求項14記載の方法。
- 検出可能な色素がサイバーグリーンまたは臭化エチジウムである、請求項20記載の方法。
- 請求項1記載のヘモプラズマ病原体の核酸分子を検出および定量する方法であって、
SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:13から成る第1のプライマー;SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:14から成る第2のプライマー;5’ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ;16S rRNA配列に相補的な核酸を含み、レポーター蛍光色素およびクエンチャー色素を含有する核酸プローブを使用してヘモプラズマ病原体の16S rRNA配列を増幅する
ことを含み、請求項1記載のヘモプラズマ病原体由来の核酸が検出および定量される上記方法。 - 核酸分子を検出するキットであって、SEQ ID NO:12;SEQ ID NO:12の10個以上の連続する核酸;またはそれらの組み合わせを含有する配列を有する1つ以上の単離された核酸分子を含む上記キット。
- ポリメラーゼおよび1つ以上のバッファーを更に含む、請求項23記載のキット。
- 1つ以上の単離された核酸分子が1つ以上の標識を含む、請求項23記載の方法。
- 標識が蛍光部分である、請求項23記載のキット。
- サンプルからヘモプラズマ病原体16S rRNA核酸分子を単離する方法であって、
1つ以上の単離された捕捉核酸を含む固相支持体を、ハイブリダイズ条件下でサンプルと接触させ、ここで、単離された捕捉核酸はSEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:12の10個以上の連続する核酸を含み、ヘモプラズマ病原体16S rRNA核酸分子がサンプル中に存在する場合にはこれは捕捉核酸とハイブリダイズし;そして
固相支持体上のハイブリダイズしたヘモプラズマ病原体16S rRNA核酸分子を検出する
ことを含む上記方法。 - 請求項1記載のヘモプラズマ病原体に感染した被験体の治療効果をモニタリングする方法であって、
a) 被験体から治療前サンプルを採取し;
b) サンプル中のヘモプラズマ16S核酸分子の存在、非存在、量、またはそれらの組み合わせを検出し;
c) 被験体から1つ以上の治療後サンプルを採取し;
d) 治療後サンプル中のヘモプラズマ16S rRNA核酸の存在、非存在、またはそれらの組み合わせを検出し;
e) 投与前サンプル中の16S rRNA核酸の存在、非存在、量、またはそれらの組み合わせを投与後サンプルのものと比較し;そして治療の有効性をモニタリングする
ことを含む上記方法。 - 請求項1記載のヘモプラズマ病原体への感染について被験体をスクリーニングする方法であって、
被験体から得たサンプル中の、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:12の10個以上の連続する核酸を含むポリヌクレオチドを検出することを含み、ポリヌクレオチドが検出される場合には被験体はヘモプラズマ病原体に感染していることを特徴とする上記方法。 - 請求項1記載のヘモプラズマ病原体への感染について被験体をスクリーニングする方法であって、
被験体から採取したサンプル中の、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:12の10個以上の連続する核酸を含むポリヌクレオチドを検出して第1の値を取得し;
疾病に罹患していない被験体から採取した同様の生体サンプル中の、SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:12の10個以上の連続する核酸を含むポリヌクレオチドを検出して第2の値を取得し;そして
第1の値を第2の値と比較する
ことを含み、第1の値が第2の値に比較して大きい場合には被験体がヘモプラズマ病原体に感染していることを示すことを特徴とする上記方法。 - ATCC PTA-6782として寄託されている単離されたヘモプラズマ病原体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US67738305P | 2005-05-03 | 2005-05-03 | |
US60/677,383 | 2005-05-03 | ||
PCT/IB2006/002387 WO2007000673A2 (en) | 2005-05-03 | 2006-05-03 | Feline hemoplasma isolate |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008539718A true JP2008539718A (ja) | 2008-11-20 |
JP4964230B2 JP4964230B2 (ja) | 2012-06-27 |
Family
ID=37595504
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008509541A Active JP4964230B2 (ja) | 2005-05-03 | 2006-05-03 | ネコ・ヘモプラズマの分離株 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7741462B2 (ja) |
EP (1) | EP1877584B1 (ja) |
JP (1) | JP4964230B2 (ja) |
AT (1) | ATE551434T1 (ja) |
AU (1) | AU2006263454B2 (ja) |
CA (1) | CA2609665C (ja) |
WO (1) | WO2007000673A2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8309306B2 (en) * | 2008-11-12 | 2012-11-13 | Nodality, Inc. | Detection composition |
HUE053610T2 (hu) * | 2017-07-31 | 2021-07-28 | Renate Rosengarten | Hemoplazma kimutatási eljárás |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
AU9491598A (en) * | 1997-09-19 | 1999-04-05 | Synbiotics Corporation | Methods for the diagnosis of feline infectious anemia |
US6518020B1 (en) | 1998-09-18 | 2003-02-11 | Heska Corporation | Haemobartonella PCR methods and materials |
-
2006
- 2006-05-03 JP JP2008509541A patent/JP4964230B2/ja active Active
- 2006-05-03 CA CA2609665A patent/CA2609665C/en active Active
- 2006-05-03 AU AU2006263454A patent/AU2006263454B2/en active Active
- 2006-05-03 US US11/417,979 patent/US7741462B2/en active Active
- 2006-05-03 WO PCT/IB2006/002387 patent/WO2007000673A2/en not_active Application Discontinuation
- 2006-05-03 AT AT06795385T patent/ATE551434T1/de active
- 2006-05-03 EP EP06795385A patent/EP1877584B1/en active Active
-
2008
- 2008-04-30 US US12/112,151 patent/US7771948B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4964230B2 (ja) | 2012-06-27 |
AU2006263454B2 (en) | 2011-06-23 |
US7741462B2 (en) | 2010-06-22 |
WO2007000673A2 (en) | 2007-01-04 |
CA2609665A1 (en) | 2007-01-04 |
WO2007000673A3 (en) | 2007-07-12 |
US20060252080A1 (en) | 2006-11-09 |
US7771948B2 (en) | 2010-08-10 |
AU2006263454A1 (en) | 2007-01-04 |
EP1877584B1 (en) | 2012-03-28 |
ATE551434T1 (de) | 2012-04-15 |
CA2609665C (en) | 2019-04-30 |
US20080206778A1 (en) | 2008-08-28 |
EP1877584A2 (en) | 2008-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cooper et al. | APOL1 renal risk variants have contrasting resistance and susceptibility associations with African trypanosomiasis | |
JP2798499B2 (ja) | 感染症診断用プローブ | |
JP2010537650A (ja) | 細菌及び真菌の検出方法 | |
JP2004523201A (ja) | シングルコピーゲノムのハイブリダイゼーションプローブおよびその作製方法 | |
Splettstoesser et al. | Rapid differentiation of Francisella species and subspecies by fluorescent in situ hybridization targeting the 23S rRNA | |
EP2014775B1 (en) | Method for the detection of bacterial species of the genera Anaplasma/Ehrlichia and Bartonella | |
Ohlin et al. | Real‐time PCR of the 16S‐rRNA gene in the diagnosis of neonatal bacteraemia | |
WO2000029618A1 (en) | Non-invasive detection of helicobacter pylori infection | |
Hu et al. | Simultaneous analysis of foodborne pathogenic bacteria by an oligonucleotide microarray assay | |
JP4964230B2 (ja) | ネコ・ヘモプラズマの分離株 | |
CA2599146A1 (en) | Detection of very virulent infectious bursal disease virus | |
JP2000511777A (ja) | クラミジア・ニューモニエ検出用核酸プライマーおよびプローブ | |
JP2010515451A (ja) | 大腸菌検出用dnaチップ | |
JP3194943B2 (ja) | クリプトコックス・ネオホルマンスの検出に用いる核酸プローブおよび方法 | |
JP4889258B2 (ja) | ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法 | |
AU2006315715A1 (en) | Identification of USA300 community-associated methicillin-resistant staphylococcus aureus | |
US6518020B1 (en) | Haemobartonella PCR methods and materials | |
CN101092645B (zh) | 诊断性传染病致病原的新颖方法 | |
WO1999060009A1 (en) | Improved methods for detecting a target nucleic acid fragment | |
JP3833152B2 (ja) | ヒトヘルペスウイルス6型(hhv−6)dnaの検出及びサブタイプ識別方法 | |
KR100781559B1 (ko) | 캔디다 알비칸스의 검출용 핵산 탐침 | |
JP3828022B2 (ja) | 四日熱マラリア原虫とその診断 | |
JP3810162B2 (ja) | 腸管出血性大腸菌O157の23SrRNA又はその遺伝子に含まれるプローブ用核酸断片、それらを用いる腸管出血性大腸菌O157の検出法及び検出用キット | |
JP2010515452A (ja) | スタフィロコッカス・アウレウス検出用dnaチップ | |
JP2004514437A (ja) | ネグレリア属の原虫を検出する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081208 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110726 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111020 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111027 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111124 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111201 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20111213 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111222 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120105 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120111 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120217 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120313 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120327 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4964230 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150406 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |