JPH0499487A - 恙虫病の遺伝子診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は志虫病の遺伝子診断用試薬に関し、詳しくはリ
ケッチアツツガムシによる志虫病の迅速診断に利用でき
る試薬及び型特異性の少ないリケッチアＤＮＡを合成す
るための試薬に関する。

〔従来の技術１発明か解決しようとする課題〕１９８０
年代からＨ本全国のみならずアジア諸国で多発している
志虫病患者の診断には、蛍光抗体法、酵素免疫測定法、
補体結合反応なとの免疫学的に抗原抗体反応を利用した
、いわゆるタンパク質を用いた方法か主に使われてきた
。また、病原体であるリケッチアの検出には、生きたマ
ウスを用い１〜３ケ月を要して分離、判定する方法か一
般的に行われている。

ところで、病原体であるリケッチアツツガムシ（Ｒｉｃ
ｋｅｔｔｓｉａ　ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）の遺伝
子配列は、大橋らにより、標準３株の１っであるＧｉｌ
ｌｉａｍ株の５６にタンパク質をコート′する部分に対
して決定している。

したかって、この配列の一部を利用しでぶ虫病の遺伝子
診断を行う方法が確立されれば、迅速な診断が可能とな
り、この分野に与える影響は大きい。

〔課題を解決するための手段〕

前述のように、思上病の実態解明に免疫学的な手法が多
く利用されてきたが、この方法では患者の診断のために
、感染後早くても１週間が必要であった。この疾患の媒
介動物であるダニ（ツツガムシ）に感染している病原体
リケッチアを感度よく発見することは、予防対策上量も
重要なことである。

しかし、上記した従来法では技術上、限界かあり、結論
を得るのに多くの日数が必要である。そのため、病原体
リケッチアを効率よく高感度で迅速に検出する技術の開
発か強く望まれていた。

本発明は、かかる要望に応える思上病の遺伝子診断用試
薬の提供を目的としている。

本発明は、リケッチアツツガムシのＧｉ　１１　ｉａｍ
、　Ｋａｒｐ。

Ｋａｔｏの標準３株及びＫａｗａｓａｋｉ、　Ｋｕｒｏ
ｋｉ、　Ｓｈｉｍｏｋｏｓｈｉのそれぞれの株のＤＮＡ
に相同性の高い、５６にタンパク質をコードするリケッ
チアツツガムシのＧｉｌｌｉａｍ株の２　、　３　Ｋｂ
ＨｉｎｄｌｌＩ断片の５′末端第６２２番目から第６９
９番目までの相補性ＤＮＡを合成するのに必要な１対の
プライマー並びに上記相補性ＤＮＡを鋳型として該プラ
イマーとＤＮＡ合成酵素を作用させて作製したリケッチ
アツツガムシＤＮＡと特異的に結合するプローブに関す
る。

以下に本発明の詳細な説明する。

■Ｇｉｌｌｉａｍ株の遺伝子より他のリケッチアツツガ
ムシ（Ｋａｒｐ、　Ｋａｔｏ、　Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｋ
ｕｒｏｋｉ、Ｓｈｉｍｏｋｏｓｈｉ）株のＤＮＡに相同
性の高いプライマーの選別大橋らによって決定されたＧ
ｉｌｌｉａｍ株の５６にタンパク質をコードするＨｉｎ
ｄＩ［断片、２．３ＫｂのＤＮＡ配列より複数の配列を
選別し、コンピューターでＧＣコンテンツを計算して最
もアニーリング温度の高いと思われる配列部分の５゛末
端より６２２番目から６５１番目と６９９番目から６７
０番目までのそれぞれ３０ｍｅｒ（ベース）のＤＮＡを
合成した。

この１対のプライマーの塩基配列は下記の通りである。

プライマー１　：　ＡＴＡＧＡＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧ
ＡＡＧＧＡＧＧＡＴＴＡＧＡＧプライマー２　：　ＡＣ
ＣＡＧＴＡＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＧＡＴＴＣＣ
ＡＡＣ■プライマーを利用したリケッチアツツガムシの
検出と判定 上記■て合成したプライマーを使って、培養したリケッ
チアツツガムシＤＮＡの検出を試みたところ、理論値で
ある７８ｂのＤＮＡが合成されることか確認できた。こ
のプライマーを使用してＤＮＡ増幅装置を利用すること
により、３〜４時間で病原体の検出ができる。一方、同
じリケッチア属である紅斑熱リケッチア、発疹熱リケッ
チア、さらにプロテウス菌、シゲラ菌、大腸菌なとでは
、このプライマーによって合成されるＤＮＡは存在しな
かった。また、他の細菌なとでは全く交差反応が認めら
れなかったことから、思上病とほかの疾患との鑑別診断
に利用できるものと考えられる。

なお、思上病患者の血液の中には、抗体と共存の形でリ
ケッチアが存在することか知られており、本発明の試薬
を使用することにより、血液中のリケッチアを直接検出
することかできる。

■プローブの作製 制限酵素Ｈｉｎｄ　Ｉ［Ｉで消化した精製Ｇｉｌｌｉａ
ｍ株をアガロースゲル電気泳動で分離し、常法に従いフ
ラグメントを取り出した。これを鋳型として前記■て人
工的に作製したプライマーとＤＮＡ合成酵素を用い、市
販プライマーラベルシステムにより２２Ｐをリケッチア
ツツガムシＤＮＡに標識する。また、同様の方法でこの
プローブに予めビオチンやジゴキシゲニンを標識した合
成基剤を使用することにより、ラジオアイソトープを使
用することなく高感度にリケッチアツツガムシと特異的
に結合するＤＮＡプローブを作製することができる。

■プローブを利用した思上病の診断 標識ＤＮＡプローブを利用してドツトハイブリダイゼー
ションおよびサザンブロットハイプリダイゼーション法
により固定化したナイロン股上のリケッチアツツガムシ
ＤＮＡを高感度に検出することかできた。

〔実施例〕

次に、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ １）恕虫病患者血液からリケッチアツツガムシＤＮＡの
調製 ■リンパ球の分離 患者血液５ｍ７’をＦｉｅｏｌｌて密度勾配遠心し、リ
ンパ球画分を得た。このリンパ球画分をリン酸緩衝液で
２回洗浄した。

■ＤＮＡの抽出 ＤＮＡ抽出用緩衝液（２％ＳＤＳ、１０■／μｌブロテ
ナースに、　　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１００ｍＭ酢酸
ナトリウム）を５００μｌ加え、５６°Ｃで２時間反応
させた。

■フェノール抽出 上記反応液にフェノール／クロロホルム／イソアミル（
２５／２４／１）を等量加え、よく振り混ぜた後、１０
．０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を得た。この操作
を２回繰り返した。次いで、等量のクロロホ／Ｌム７・
′イソアミル（２４／１）を加え、同様に処理した。

■エタノール沈澱 上記の上溝液にｌ／２０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え
、−７０℃に冷やしたエタノールを２倍量添加してよく
混和し、−７０℃で１０分間静置後、１０、００Ｏｒｐ
ｍで３０分間遠心し、沈渣を得た。次いで、これを乾燥
後、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ８，０）　、　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に浮遊させて試
料とした。

調製試料 精製水 ＰＣＲ用緩衝液９ １．２５［［ＩＭ　ｄＮＰＴ プライマー　１（０，００２５０Ｄ／μ　Ｉりプライマ
ー　２（０，００２５０Ｄ／μ　ｌ）耐熱性ポリメラー
ゼ ６１００ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ８ １５［ＩＩＭ　ＭｇＣｊ’　！、　０．０１％ゲラチン
」−記試料を混合し、９４°Ｃで３０秒、５７°Ｃて１
０μ１ ５３、５μ１ １０μ１ １６μｆ ５μ！ ５μ１ ０、５μｆ ３）　、　　５００ｍＭ　ＫＣｌ。

２分、７０°Ｃて２分を１サイクルとして３０サイクル
反応させた。

ＰＣＲ法で増殖させたＤＮＡの一部は２％アガロース電
気泳動法・を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外
線照射により蛍光発色させて泳動位置の確認をし、判定
した。陰性である場合は、上記反応後に耐熱性ポリメラ
ーゼ０．５μｌを加え、さらに３０サイクル反応させた
。このようにしてリケソチアツツガムシＤＮＡの検出を
行うことかできた。

実施例２ ＰＣＲ法を用いたジゴキシゲニン標識プローブの製造 精製し・たリケッチアツツガムシＧｉｌｌｉａｍ株から
ＤＮＡを抽出し、試料とした。

試　　　糀　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ精
製水　　　　　　　　　　　　５９，５μ１ＰＣＲ用緩
衝液°　　　　　　　　　１０μｒブライ？−１（０，
００２５０Ｄ／　　μ　ｌ！　）　　　　　　　　　　
　５　　ｔｔ　　ｌプライマー　２（０，００２５０Ｄ
／　　μ　Ａ）　　　　　　　　　　　５　　μ　ｌ耐
熱性ポリメラーゼ　　　　０５μｌ ”　１００ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ８，３）　、　５
００ｍＭ　Ｋ（Ｊ！。

１５ｍＭ　ＭｇＣＡ’　２．０．０１％ゲラチン上記試
料を混合して９４°Ｃで３０秒、５７℃で２分、７０°
Ｃて２分を１サイクルとして３０ザイクル反応させた。

この反応液をプローブとした。

実施例３ 実施例１の１）において調製したリケッチアツツガムシ
ＤＮＡ試料を９５°Ｃて１０分間処理して変性させ、素
早く水浴中で冷却し、ナイロン膜に塗布後、よく風乾さ
せ、次いて紫外線でナイロン膜上のＤＮＡを固定した。

この膜をソールＦバック中に入れ、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（５ｘＳＳＣ（２０ＸＳＳＣ二３Ｍ塩化ナトリ
ウム、　０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、
　０．５％ブロッキング試薬、０゜１％Ｎ−ラウロイル
ザルコシン酸ナトリウム、　０．０２％ＳＤＳ）を加え
、６８°Ｃで４時間プレハイブリダイゼーションを行い
、時々溶液を混和した。　次に、実施例２で作製したプ
ローブを直前に９５°Ｃで１０分間熱変性させ、ハイブ
リダイゼーション溶液に加え、シールドバック中の溶液
と交換した。シールドバックを６８°Ｃで１８時間反応
させ、時々混和した。室温で２　ｘ　ＳＳＣ，０，１％
ＳＤＳを用いて膜を５分間２回洗浄した。次いで、同様
に６８°Ｃで０．１ｘ　ＳＳＣ，０，Ｉ％ＳＤＳを用い
て膜を５分間、２回洗浄した。

膜を緩衝液１　（１００ｍＭ　トリス−塩酸、１５０ｍ
Ｍ　　塩化ナトリウム、　ｐＨ７，５）で１分間洗浄し
た。次いで、緩衝液２（０，２％ブロッキング試薬／緩
衝液１）で３０分間反応させた。これを再度緩衝液１で
洗浄した。次に、緩衝液１で標識抗体（抗ジゴキシゲニ
ン抗体）を１５０　ｍ［Ｊ／ｒ！Ｌｌに希釈し、膜を３
０分間反応させた。その後、緩衝液ｌで１５分間、２回
洗浄し、未反応標識抗体を取り除いた。しかる後、膜を
緩衝液３　（１００ｍＭ　）リス−塩酸、１００ｍＭ　
　塩化ナトリウム、　５０ｍＭ塩化マグネシウム、　ｐ
Ｈ９，５）て２分間平衡化した。

次に、暗所で発色液（４５μｍニトロブルー　テトラゾ
リウム塩溶液、３５μ１５−ブロモ−４−クロロ３−イ
ンドリルホスフェート溶液／１〇−緩衝液３）と膜をシ
ールドバック中で反応させた。発色の停止には緩衝液４
　（１０ｍＭ　トリス−塩酸、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　
ｐＨ８）を用い、膜を５分間洗浄した。ナイロン膜上の
発色より目的のＤＮＡの有無を判定した。

実施例４ サザンブロットハイプリダイゼーションによる患者の診
断 実施例１の１）において調製したリケッチアツツガムシ
ＤＮＡ試料１０μｐに酵素反応液（５０ｍＭトリス−塩
酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、　５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム）　２ｕｌ！、　　１０ＵＨｉｎｄＩ［１μｆｆ、
精製水７μｍを加え、３７°Ｃて２時間反応後、１％ア
ガロースゲル電気泳動を行う。その後、アガロースゲル
を適当な容器に移し、脱プリン溶液（２５０ｍＭ塩酸）
に浸した。次いで、脱プリン溶液を捨て精製水にて３回
洗浄後、アガロースゲルのＤＮＡをナイロン膜に転写し
た。その後、ナイロン膜を０．５Ｎ水酸化ナトリウム、
１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液に３０秒浸し、続いて０．
５Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，４）。

１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液に２分間中和させ、よく風
乾させ、次いで紫外線でナイロン膜上のＤＮＡを固定し
た。この膜をシールドバック中に入れ、ハイブリダイゼ
ーション溶液（５ｘＳＳＣ，０，５％ブロッキング試薬
、０，１％Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、　
０．０２％５ＤＳ）を加え、６８℃で４時間プレハイブ
リダイゼーションを行い、時々溶液を混和した。

次に、実施例２で作製したプローブを直前に９５°Ｃで
１０分間熱変性させ、ハイブリダイゼーション溶液に加
え、シールドバック中の溶液と交換した。シールドバッ
クを６８°Ｃで１８時間反応させ、時々混和した。室温
て２　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて膜を５分間
、２回洗浄した。次いで、同様に６８”ＣテＯ，Ｉ　ｘ
ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用イテ膜を５分間、２回洗浄
した。

膜を緩衝液１　（１００ｍＭ　トリス−塩酸、１５０ｍ
Ｍ　　塩化ナトリウム、　ｐＨ７，５）で１分間洗浄し
た。次いで、緩衝液２（０，２％ブロッキング試薬／緩
衝液１）で３０分間反応させた。これを再度緩衝液ｌで
洗浄した。次に、緩衝液１て標識抗体（抗ジゴキシゲニ
ン抗体）を１５０ｍＵ／−に希釈し、膜を３０分間反応
させた。その後、緩衝液１で１５分間、２回洗浄し、未
反応標識抗体を取り除いた。しかる後、膜を緩衝液３　
（１００ｍＭ　）リス−塩酸、　１００ｍＭ　　塩化ナ
トリウム、　５０ｍＭ塩化マグネシウム、　Ｉ）８９．
５）で２分間平衡化した。

次に、暗所で発色液（４５μｌニトロブルー　テトラゾ
リウム塩溶液、３５μ１５−ブロモ−４−クロロ３−イ
ンドリルホスフェート溶液／１〇−緩衝液３）と膜をシ
ールドバック中で反応させた。発色の停止には緩衝液４
（１０ｍＭ）リス−塩酸、　Ｉｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐ
ｔ（８）を用い、膜を５分間洗浄した。ナイロン膜上の
発色より目的のＤＮＡの有無を判定した。

〔発明の効果〕

本発明によれば、未だ感染実態が解明されていない思上
病患者の診断に遺伝子診断技術を適用てきるため、正確
かつ迅速な診断が可能である。さらに、本発明の試薬を
用いることによりこの疾患の媒介動物であるダニ（ツツ
ガムシ）に感染している病原体リケッチアを感度よく検
出することができ、予防対策の上からも本発明は有用で
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）リケッチアツツガムシのＧｉｌｌｉａｍ、Ｋａｒ
   ｐ、Ｋａｔｏの標準３株及びＫａｗａｓａｋｉ、Ｋｕｒ
   ｏｋｉ、Ｓｈｉｍｏｋｏｓｈｉのそれぞれの株のＤＮＡ
   に相同性の高い、５６Ｋタンパク質をコードするリケッ
   チアツツガムシのＧｉｌｌｉａｍ株の２．３ＫｂＨｉｎ
   ｄIII断片の５’末端第６２２番目から第６９９番目ま
   での相補性ＤＮＡを合成するのに必要な１対のプライマ
   ー。
2. （２）１対のプライマーが下記の塩基配列を有するもの
   である請求項１記載のプライマー。 プライマー１：ＡＴＡＧＡＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＡ
   ＧＧＡＧＧＡＴＴＡＧＡＧプライマー２：ＡＣＣＡＧＴ
   ＡＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣ（
   ３）請求項１記載の相補性ＤＮＡを鋳型とし請求項１記
   載のプライマーとＤＮＡ合成酵素を作用させて作製した
   リケッチアツツガムシＤＮＡと特異的に結合するプロー
   ブ。