CN103397041A - 细胞致死肿胀毒素及以其为目标的弯曲杆菌属细菌的检测 - Google Patents

Abstract

本发明人成功克隆了先前未知的C.coli和C.fetus的CDT基因，并测定了它们的序列。另外，本发明人还通过比较C.jejuni和C.fetus的CDT，研制出两种细菌的特异性引物和通用引物。此外，本发明人证明了这些引物可用于多重PCR，其可快速方便地同时确定弯曲杆菌CDT的存在和鉴定其种类，并且它们还可用于基于PCR-RFLP的分型。

Description

细胞致死肿胀毒素及以其为目标的弯曲杆菌属细菌的检测

本发明是2004年12月03日申请的发明名称为“细胞致死肿胀毒素及以其为目标的弯曲杆菌属细菌的检测”的第200480041257.6号和第201210085750.4号发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)的细胞致死肿胀毒素及其编码多核苷酸。本发明还涉及通过追踪弯曲杆菌(包括大肠弯曲杆菌)的细胞致死肿胀毒素，以检测待测样品中(如临床样品和食物)存在弯曲杆菌的方法。

背景技术

弯曲杆菌是对人类和野生动物以及家畜具有致病性的微生物，它会引起动物的流产和肠炎和人类的肠炎。空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和大肠弯曲杆菌是已知的人体内引起弯曲杆菌感染的病原菌。这些细菌经常被称为食物中毒细菌(参见非专利文件1和2)。

到2000年，弯曲杆菌已被分为15个种和9个亚种。空肠弯曲杆菌在人腹泻病例中分离的细菌中占95－99%，而其它细菌品种，如大肠弯曲杆菌仅占很少的百分比(参见非专利文件3)。然而，猪中大肠弯曲杆菌的携带率非常地高。近年来，随着主要由东南亚进口猪肉的增加，弯曲杆菌感染已经呈现增长趋势。特别地，由于牛肉如BSE和O-157问题导致与鸡肉相关食品消费的增长，鸡肉相关食品的感染迅速增加了。

此外，虽然胚胎弯曲杆菌是公知引起绵羊和牛流产的细菌，但是只到最近才报道它同样涉及人的流产和早产。由于吃了胚胎弯曲杆菌污染的生的肝脏或者牛肉而感染胚胎弯曲杆菌会出现如脓血症和脑膜炎的症状。人类胚胎弯曲杆菌感染的主要来源是鸡肉，其肠道内高密度带菌(参见非专利文件4)。

弯曲杆菌一般高密度分布在动物，如牛、羊、猪和鸡的消化道内，因而被称为人兽互通病病原菌。大多数弯曲杆菌病认为是由鸡肉造成。感染会通过直接接触上述动物或其粪便引起，或者通过摄入或加工被粪便污染的食物、饮用水、牛奶引起。此外，在如新生儿监护室的环境中，也有感染病例的报道(参见非专利文件5)。

弯曲杆菌病有一个3至7天的长潜伏期。其特征表现为胃肠炎症状，如腹泻(有时为出血的粘液性腹泻)、腹痛、发烧、反胃、呕吐、头痛、畏寒和虚弱。虽然致死率低，但是新生儿可能发展成全身感染，如脓血症和脑膜炎。在大多数情况下，治愈需要几天至约一周的时间。除了一些免疫缺陷病人，一般预测会有一个有利的治疗过程。然而，近些年已经报道，病人感染弯曲杆菌病后可能引起吉兰－巴雷综合症(Guillain-Barre)或者Fischer综合症，它们属于自身免疫病。由弯曲杆菌病引发的病例通常倾向变得严重，而且发作的一年后痊愈率只有60%。

对状况严重或者伴有脓血症的病例，使用抗生素化学疗法。首选的药物是大环内酯物，如红霉素。由于天然抗性，cephem类抗生素预计没有治疗效果。同时，对新的喹诺酮抗生素有抗性的细菌数量的增长已成为近年来的问题。感染后病原体微生物的快速鉴定对实施正确的弯曲杆菌病治疗方案以及发现感染途径以阻止感染的扩散有重要意义。然而，仅依据临床症状难以诊断弯曲杆菌病，更不用说鉴定弯曲杆菌及其种类。

弯曲杆菌是微需氧生物。该细菌的培养需要如Skirrow氏培养基的特殊培养基和特殊仪器(厌氧广口瓶或其类似物)以维持氧气的浓度在3－10%的绝对微需氧条件。此外，与其它微生物相比，该培养过程是耗时的(2－3天)。因此，难以获得和维持弯曲杆菌的隔离培养。另外，由于弯曲杆菌在空气中易死亡，因此它们必须在样品收集后2－3小时内检测。而且由于弯曲杆菌病的潜伏时间长(3－7天)，出现病症后，在对相关食物的细菌鉴定的时候，通常不能分离到该细菌。还有，弯曲杆菌有非常强的传染性，据报道只要几百个细胞就会造成传染。因而，对传染源的鉴定是极度困难的。

区别诊断空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的一种方法涉及检测马尿酸盐的水解。具体地，该方法是以空肠弯曲杆菌能够水解马尿酸盐，而大肠弯曲杆菌不能水解马尿酸盐的事实为基础。然而，该方法不精确，因为现有技术中已知存在一些马尿酸盐阴性的空肠弯曲杆菌(参见非专利文件6)。因此，只有通过从食物摄取的历史记录和症状估计细菌的存在，以及通过检测由粪便培养物中得到菌落的细菌的形态和生物特征，这需要数天时间，才能证实弯曲杆菌的存在。

因而，已经尝试使用利用DNA探针方法或者用寡核苷酸的PCR方法的遗传诊断方法，作为不需培养的快速诊断方法来鉴定弯曲杆菌和检测其毒素基因。例如，编码rRNA的基因通常用作检测弯曲杆菌的探针(参见专利文件1)。弯曲杆菌rRNA基因的序列已经公开(参见非专利文件7)。另外，检测弯曲杆菌的核酸片段也是已知的(参见专利文件2、3、4、5、和6)。然而，虽然这些序列可用于检测空肠弯曲杆菌和/或大肠弯曲杆菌，但是它们不能够检测其它弯曲杆菌。并且特异性的现有水平不够。

还有报道使用选自大肠弯曲杆菌VC167的fla A基因的寡核苷酸，通过PCR鉴定空肠弯曲杆菌的方法(参见非专利文件8)。另外，有文献报道使用寡核苷酸引物扩增空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的过氧化物歧化酶的靶序列(参见专利文件7)。然而，这些方法不能区别空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。

同时，对弯曲杆菌致病因子的研究活跃。各种因子，如细胞侵入、鞭毛蛋白以及霍乱毒素类肠毒素是已经报道的弯曲杆菌致病因子(参见非专利文件9和10)。最近，从空肠弯曲杆菌中发现作为毒素因子的细胞致死肿胀毒素(CDT)，其与致病力的相关性吸引了人们的注意。例如，已有报道使用产生志贺氏菌(Shigelladysenteriae)CDT的重组大肠杆菌在动物模型体内引发毒素性腹泻(参见非专利文件12)。

CDT是由称为cdtA、cdtB和cdtC的三个亚基组成的全毒素，它们由纵排排列的基因编码。毒素的活性中心是在具有I型脱氧核糖核酸酶样活性的cdtB亚基里，而cdtA和cdtC亚基认为是用来对靶细胞的粘附。当全毒素作用于细胞时，细胞肿胀即膨胀，最后死亡。因而该毒素被命名为“细胞致死肿胀毒素”。

据信其分子机制如下所述。构成毒素活性中心的cdtB亚基转运到细胞核内，通过它的I型脱氧核糖核酸酶活性，在染色体DNA上形成缺口，从而诱导DNA损伤应答。然后此细胞阻止处于G2/M相的细胞循环以激活基因修复系统，然后膨胀和死亡(非专利文件13)。此外已发现CDT广泛作用于包括上皮细胞和免疫细胞的多种细胞。特别地，据信CDT作用于人类淋巴细胞，并诱导其凋亡，借此轻易逃脱了免疫(非专利文件14)。

如上所述，CDT具有在其它已知毒素内没有发现的独特分子机制。迄今为止，弯曲杆菌中仅有空肠弯曲杆菌的全长CDT核苷酸序列已经确定(非专利文件11)。

专利文件1:日本专利申请公开号(JP-A)S62-228096(未审查，公开的日本专利申请)

专利文件2:JP-A H2-84200

专利文件3:JP-A H2-154700

专利文件4:JP-A H3-112498

专利文件5:JP-A H6-90795

专利文件6:JP-A H6-90796

专利文件7:JP-A2000-316590

非专利文件1:Blaser等,Ann.Intern.Med.,91:179(1979)

非专利文件2:Tauxe,R.,American Society for Microbiology,Washington DC.pg.9(1992)

非专利文件3:Takahashi,M.等,Infectious Diseases WeeklyReport Japan,3(6):10(2001)

非专利文件4:Simon,M.S.等,2003.Campylobacter infection.Diseases of Poultry,Iowa State Press,615-630

非专利文件5:Japanese Journal of Pediatric Medicine,29:1219-1222(1997)

非专利文件6:Totten等,J.Clin.Microbiol.,25:1747(1987)

非专利文件7:Romaniuk,P.J.等,J.Bacteriol.,169:2173(1987)

非专利文件8:Oyofo等,J.Clin.Microbiol.,30:2613(1992)

非专利文件9:Mizuno,K.等,Microbios.,78:215(1994)

非专利文件10:Suzuki,S.等,FEMS Immunol.Med.Microbiol.,8:207(1994)

非专利文件11:Pickett,C.等.Infect.Immun.,64:2070(1996)

非专利文件12:Infect.Immun.,65:428-433(1997)

非专利文件13:Science,290:354-357(2000)

非专利文件14:J.Biol.Chem.,276:5296-5302(2001)

发明内容

本发明所解决的问题

如上详述，尽管弯曲杆菌的致病因子还没被充分阐明，但是在本领域中需要快速诊断弯曲杆菌感染。传统上，以其血清型为基础的鉴定细菌种类的PCR引物和检测CDT产量的通用引物等已被使用(J.Applied Microbiol.,94:1003-1014(2003))。然而，这些方法需要富集培养步骤，这使得快速探测弯曲杆菌不可能。

因而，本发明的目的是提供大肠弯曲杆菌(即一种CDT核苷酸序列还有待阐述的弯曲杆菌)的CDT及其编码多核苷酸，是为了使通过遗传诊断的弯曲杆菌的快速检测成为可能。本发明的另一目的是提供胚胎弯曲杆菌(其CDT核苷酸序列也还有待阐述)的CDT及其编码多核苷酸。

此外，本发明的另一目的是提供能快速检测弯曲杆菌的方法，其目标是包括大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的弯曲杆菌的CDT，以其得到的大肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的核苷酸序列为基础。

解决问题的技术手段

当使用限制酶HindIII克隆CDT基因时，由于它的编码区含有HindIII位点而不能分离其全长序列。同时，常见限制酶如EcoRI、PstI、KpnI、XbaI、BamHI、SalI和XhoI，不能产生用于克隆CDT基因的足够长(3到5kb)的片段。根据各种研究的结果，本发明人通过选择部分消化的条件，其中HindIII不完全消化CDT基因，最终成功克隆了内部序列没有缺口的全长CDT基因。

本发明人还将大肠弯曲杆菌的CDT与空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的CDT作了比较，研制出三种弯曲杆菌的通用引物和每种细菌的特异性引物。然后本发明人证明了这些引物可用于快速方便地同时检测弯曲杆菌CDT的存在和鉴定种类的多元PCR，而且它们还可用于基于PCR-RFLP的分型。

具体地，本发明包括下面的技术实施方案：

（1）编码细胞致死肿胀毒素的多核苷酸，其是下面中的任一种：

（a）编码包含SEQ ID NO：2－4中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

（b）包含SEQ ID NO：1核苷酸序列中编码区的多核苷酸；

（c）编码包含由SEQ ID NO：2－4任一氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入而形成的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和

（d）在严格条件下与包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸；

（2）含有(1)的多核苷酸的载体；

（3）带有(1)的多核苷酸或(2)的载体的宿主细胞；

（4）由(1)的多核苷酸编码的多肽；

（5）生产(4)的多肽的方法，其包括的步骤有培养(3)的宿主细胞和收集由宿主细胞或者培养上清液中产生的多肽；

（6）结合(4)的多肽的抗体；

（7）检测待测样品中大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌存在的方法，其中此方法包括的步骤有：

（a）用对编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的各个基因组DNA具有特异性的引物对的混合物对待测样品进行聚合酶链式反应；和

（b）根据编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA中扩增片段的存在或分子量来确定细菌的存在；

（8）检测待测样品中大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌存在的方法，其中此方法包括的步骤有：

（a）用能扩增编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物对对待测样品进行聚合酶链式反应；

（b）用步骤(a)中扩增的基因组DNA作为模板和编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的各个基因组DNA的特异性引物对的混合物进行聚合酶链式反应；和

（c）根据编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA中扩增片段的存在或分子量来确定细菌的存在；

（9）(8)所述的方法，其中通用引物对是选自SEQ ID NO：7－10和47－50的引物对，或者是能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（10）(7)或(8)的方法，其中使用(a)－(c)作为特异性引物对的混合物；

（a）选自SEQ ID NO：13、14和28－36以扩增编码大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者是能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（b）选自SEQ ID NO：11、12和17－27以扩增编码空肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者是能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；和

（c）选自SEQ ID NO：15、16和37－46以扩增编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者是能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（11）检测待测样品中大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌存在的方法，其中此方法包括的步骤有：

（a）用能扩增编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物对对待测样品进行聚合酶链式反应；

（b）用限制酶消化步骤(a)中扩增的基因组DNA；和

（c）根据由消化获得的DNA片段的分子量确定细菌的存在；

（12）(11)的方法，其中限制酶可在下列物质构成的组中选择：Sau3AI、Dsa I、Mbo I、Rsa I、EcoRI、Hinf I、Nde I、Pst I、Xba I和Xho II；

（13）(11)的方法，其中通用引物对是选自SEQ ID NO：7－10和47－50的引物对，或者能像上述引物对那样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（14）用在(7)的方法中的一种试剂盒，其中包含说明书手册和对编码大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的各个基因组DNA具有特异性的引物对的混合物；

（15）(14)的试剂盒，其中的特异性引物对的混合物如下所述：

（a）选自SEQ ID NO：13、14和28－36以扩增编码大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对那样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（b）选自SEQ ID NO：11、12和17－27以扩增编码空肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对那样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；和

（c）选自SEQ ID NO：15、16和37－46以扩增编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对那样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（16）用在(8)的方法中的试剂盒，其中包含说明书手册和

（a）对编码大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的各个基因组DNA具有特异性的引物对的混合物；或者

（b）能扩增编码大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物对；

（17）(16)的试剂盒，其中特异性引物对混合物如下所述：

（a）选自SEQ ID NO：13、14和28－36以扩增编码大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（b）选自SEQ ID NO：11、12和17－27以扩增编码空肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；和

（c）选自SEQ ID NO：15、16和37－46以扩增编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（18）(16)的试剂盒，其中通用引物对选自SEQ ID NO：7－10和47－50，或者能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；

（19）用在(11)的方法中的试剂盒，其中包含说明书手册和能扩增编码大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物对；和

（20）(19)的试剂盒，其中通用引物对是选自SEQ ID NO：7－10和47－50的引物对，或者能像上述引物对那样来对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对。

这里，术语“细胞致死肿胀毒素”(CDT或CLDT)是指属于蛋白质型的A－B全毒素群的病毒因子。该细胞致死肿胀毒素有一个由三个亚基A、B和C组成的亚基结构。据信亚基B是毒素活性位点单元，而亚基A和B则涉及细胞粘附。当毒素作用于细胞时，它造成细胞变形，如细胞膨胀，最终导致细胞死亡。试验中用产毒大肠杆菌产生的热不稳定肠毒素(LT)或其类似物对细胞作用时，也可观察到诸如细胞膨胀的细胞变形。然而，除去该毒素后，细胞恢复原形并且存活下来。相反地，即使除去CDT，细胞不能恢复原形而是被杀死。

此处所用的术语“多核苷酸”是指核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸，或者由一些碱基或者碱基对构成的多聚物。多核苷酸包括单链DNA和双链DNA。这里的多核苷酸可既包括未修饰的天然存在的多核苷酸，又包括修饰的多核苷酸。三苯甲基化的碱基和特殊碱基，例如肌苷，是修饰的碱基的例子。

此处所用的术语“多肽”是指由许多氨基酸构成的多聚物。因此，寡肽和蛋白质也属于多肽的概念范围。多肽既包括未修饰的天然存在的多肽，又包括修饰的多肽。多肽修饰的例子包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、与黄素的共价连接、与血红素部分的共价连接、与核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、与脂或脂的衍生物的共价连接、与磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚体、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、消旋化、硒化、硫酸盐化、在蛋白质上添加转运RNA介导的氨基酸(如精氨酰化)和遍在蛋白化等。

此处所用的术语“分离”是指将物质(例如多核苷酸或多肽)从它的原始环境(例如天然存在的物质的自然环境)之中移出，“人为地”改变它的自然状态。“分离的”化合物是指这样的化合物，其包括在大量富含目的化合物的样品中存在的那些化合物，和/或存在在样品中(其中目的化合物部分或基本纯化)的那些化合物。这里，术语“基本纯化的”是指一种化合物(例如多核苷酸或者多肽)从自然环境中分离出来，其中至少60%、优选75%、更优选90%的天然与该化合物相关的其它组分不存在。

此处所用的术语“突变”是指氨基酸序列中氨基酸的变化，或核苷酸序列中碱基的变化(即取代、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸或核苷酸)。因此，如此处所用的术语“突变体”是指有一个或多个氨基酸变化的氨基酸序列，或有一个或多个核苷酸变化的核苷酸序列。突变体中核苷酸序列的变化可改变由标准多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列，或者没有改变。突变体可为自然界存在的，例如等位突变体，或为在自然界还没有确定的突变体。突变体可以是保守性变化，其中取代的氨基酸保持与原始氨基酸类似的结构或者化学特性。很少地，突变体会是非保守性取代。本领域已知的计算机程序，如DNA STAR软件可用来确定哪些或者多少个氨基酸残基取代、插入或缺失而不会抑制生物或免疫活性。

“缺失”是指氨基酸序列或核苷酸序列的变化，其中与天然存在的细胞致死肿胀毒素多肽的氨基酸序列或其编码核苷酸序列相比，缺少一个或多个氨基酸残基或核苷酸残基。

“插入”或“添加”是指氨基酸序列或核苷酸序列的变化，其中与天然存在的细胞致死肿胀毒素多肽的氨基酸序列或其编码核苷酸序列相比，增加一个或多个氨基酸残基或核苷酸残基。

“取代”是指氨基酸序列或核苷酸序列的变化，其中与天然存在的细胞致死肿胀毒素多肽的氨基酸序列或其编码核苷酸序列相比，有一个或多个氨基酸残基或核苷酸残基变化为不同的氨基酸残基或者核苷酸残基。

此处所用的术语“杂交”是指核酸链通过碱基对的形成结合到其互补链的过程。

附图说明

图1是表示用C.Coli Co1-192细胞提取物作模板，引物GNW和LPF-D的PCR结果的照片。箭头1表示由CDT区(约1.5Kb)扩增产生的带；箭头2表示的带(800bp)是由cdtB衍生的第二条带，其被扩增是由于引物GNW是混合引物。

图2是表示限制酶HindIII消化C.coli Co1-192细胞的基因组后杂交结果的照片。

图3是表示用通用引物对1的PCR结果的照片。电泳泳道2－6中CDT衍生带可见于约1.9kbp。

图4是表示用通用引物对2的多种C.jejuni菌株的PCR结果的照片。CDT衍生带可见于约720bp。

图5是表示多种C.jejuni和C.coli菌株用通用引物对2的PCR结果的照片。

图6是表示C.jejuni、C.coli和C.fetus菌株用通用引物对2的PCR结果的照片。

图7是表示C.jejuni、C.coli和C.fetus菌株用特异性引物的多重PCR结果的照片。检测到每种菌株独特的CDT特异性扩增片段(C.jejuni，750bp；C.coli，400bp；C.fetus，530bp)。

图8表示C.jejuni、C.coli和C.fetus菌株用通用引物对1的PCR-RFLP的结果的照片。

图9是表示多种C.jejuni、C.coli和C.fetus菌株用特异性引物的多重PCR结果的一系列照片。检测到每种菌株独特的CDT特异性扩增片段(C.jejuni，750bp；C.coli，400bp；C.fetus，530bp)。

图10是表示限制酶HindIII消化C.fetus Col-187细胞的基因组后杂交结果的照片。

图11是表示cdtA和cdtC用通用引物的PCR结果的照片。泳道2－8中cdtA衍生带可见于约550bp；泳道10－16中cdtC衍生带可见于约320bp。

图12是表示多种弯曲杆菌菌株的cdtA用通用引物PCR结果的系列照片。cdtA衍生带可见于约550bp。

图13是表示多种弯曲杆菌菌株的cdtC用通用引物PCR结果的系列照片。cdtC衍生带可见于约320bp。

图14是表示C.jejuni、C.coli和C.fetus菌株用cdtA和cdtC的特异性引物的多重PCR结果的照片。检测到每种菌株独特的cdtA特异性扩增片段(C.jejuni，630bp；C.coli，330bp；C.fetus，490bp)和cdtC特异性扩增片段(C.jejuni，500bp；C.coli，400bp；C.fetus，300bp)。

图15是表示C.jejuni、C.coli和C.fetus菌株用cdtA特异性引物的多重PCR结果的系列照片。检测到每种菌株独特的cdtA特异性扩增片段。

图16是表示C.jejuni、C.coli和C.fetus菌株用cdtC特异性引物的多重PCR结果的系列照片。检测到每种菌株独特的cdtC特异性扩增片段。

图17显示了C.jejuni CDT的ORF和引物退火区域。

图18显示了C.coli CDT的ORF和引物退火区域。

图19显示了C.fetus CDT的ORF和引物退火区域。

具体实施方式

<多核苷酸>

本发明提供了编码大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的多核苷酸。由本发明人鉴定，包含在本发明范围之内的编码C.coli的细胞致死肿胀毒素的多核苷酸序列在SEQ ID NO：1中示出。由该核苷酸序列编码的三个多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：2－4中示出。SEQ ID NO：2，3和4分别对应于cdtA、cdtB和cdtC的氨基酸序列。

本发明还提供了编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的多核苷酸。由本发明人鉴定，包含在本发明范围之内的编码C.fetus的细胞致死肿胀毒素的多核苷酸序列在SEQ ID NO：51中示出。由该核苷酸序列编码的三个多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：52－54中示出；SEQ ID NO：52、53和54分别对应于cdtA、cdtB和cdtC的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸包括编码具有SEQ ID NO：2－4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的编码区，即SEQ ID NO：1中第1－777位、802－1605位和1615－2187位中任一核苷酸序列的多核苷酸；以及具有与SEQ ID NO：1的核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是由于遗传密码的简并性，仍然编码具有SEQ ID NO：2－4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。

本发明的多核苷酸还包括编码具有SEQ ID NO：52－54的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；包含SEQ ID NO：51的核苷酸序列的编码区，即SEQ ID NO：51中第1－702位、778－1629位和1615－2187位中任一核苷酸序列的多核苷酸；以及具有与SEQ ID NO：51的核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是由于遗传密码的简并性，仍然编码具有SEQ ID NO：52－54的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。

本发明的多核苷酸进一步包括编码功能上与由上述多核苷酸编码的多肽等同的多肽，且其核苷酸序列与上述多核苷酸的全长序列有至少40%或更高，优选60%或更高，更优选80%或更高，甚至更优选90%或更高，还更优选95%或更高，仍更优选97%或更高(例如98－99%)的同一性的多核苷酸。核苷酸序列同一性可被测定，例如使用Karlin和Altschul的BLAST运算法则(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268,1990;Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877,1993)。在此算法的基础上已经开发了名为BLASTN的程序(Altschul等J.Mol.Biol.215：403-410,1990)。用BLASTN分析核苷酸序列时，例如，参数的设置如下：分数＝100，字长＝12。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，每个程序使用默认参数。这些分析方法的特定技术手段是已知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。本发明的多核苷酸包括具有与上述多核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可从天然来源，如细菌细胞的基因组DNA中通过标准的克隆和筛选方法获得。可选的，该多核苷酸从由细菌细胞的mRNA得到的cDNA库中获得。该多核苷酸还可使用商业可得的已知的技术来合成。

具有与本发明人鉴定的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1和51)高度同源的核苷酸序列的多核苷酸可被制备，例如可使用杂交技术(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)出版John Wiley&Sons Section6.3-6.4)和基因扩增技术(PCR)(Currentprotocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)出版JohnWiley&Sons Section6.1-6.4)。具体地，以本发明人鉴定的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1和51)或其部分序列为基础，可用已知的杂交技术分离与此序列高度同源的DNA。可选地，与多核苷酸序列高度同源的多核苷酸可用基因扩增技术分离，使用基于本发明人鉴定的多核苷酸序列的部分序列(例如SEQ ID NO：1和51)设计的引物。因此，本发明包括与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。严格杂交条件典型的是指1×SSC，0.1%SDS和37℃的条件。更严格杂交条件是指0.5×SSC，0.1%SDS和42℃的条件。还要严格的杂交条件是指0.2×SSC，0.1%SDS和65℃的条件。如上述的杂交条件越严格，与探针序列有更高的同源性的DNA可望被分离。然而，SSC、SDS和温度条件的上述组合只是示范性的。本领域技术人员通过适当结合决定杂交严格程度的上述因素或其它因素(例如，探针浓度和长度以及杂交反应时间)，能够获得如上面所述的相同严格性。

含有与本发明人鉴定的多核苷酸序列高度同源的核苷酸序列的多核苷酸也可用在SEQ ID NO：1和51的核苷酸序列中引入突变的方法(例如定点突变(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等(1987)出版John Wiley&Sons Section8.1-8.5))来制备。这样的多核苷酸也可能是自然发生的突变产生的。本发明包括编码具有由于此类核苷酸序列突变，SEQ ID NO：2－4或52－54的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加而形成的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。

当用本发明的多核苷酸生产本发明的多肽时，该多核苷酸包括成熟多肽或仅其片段的编码序列，或者与其它编码序列(例如，前导或分泌序列、前蛋白序列、原蛋白序列、前原蛋白序列或编码其它融合肽部分的序列)处于相同阅读框的成熟多肽或其片段的编码序列。例如，可编码有助于融合多肽纯化的标记序列。在本发明的实施方案中，标记序列的优选实施例包括，例如，由pcDNA3.1/Myc-His载体(Invitrogen)提供的，Gentz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:821-824描述的六组氨酸肽或Myc标签。该多核苷酸也可包括5’和3’非编码序列，例如，转录但不翻译的序列，剪接信号和聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和mRNA稳定序列。

<多肽>

本发明提供了本发明人鉴定的大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素多肽。本发明还提供功能上与本发明人鉴定的多肽等同的多肽。这里，“功能上等同”是指被关注的多肽具有的细胞致死肿胀毒素的特征与本发明人鉴定的多肽的相同。

本发明还提供了本发明人鉴定的胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素多肽。本发明进一步提供功能上与本发明人鉴定的多肽等同的多肽。这里，“功能上等同”是指被关注的多肽具有的细胞致死肿胀毒素的特征与本发明人鉴定的多肽的相同。

在蛋白质的氨基酸序列中引入突变是制备与本发明人鉴定的多肽功能上等同的多肽的一种手段。这些方法包括，例如定点突变(Current Protocols in Molecular Biology，edit.Ausubel等(1987)出版John Wiley&Sons Section8.1-8.5))。多肽的氨基酸突变也可能是自然发生的。本发明包括不论是人工地或是自然地产生的突变蛋白质，其含有本发明人鉴定的氨基酸序列(如SEQ ID NO：2－4和52－54)，其中一个或多个氨基酸残基通过取代、缺失、插入和/或添加所改变，仍然与本发明人鉴定的多肽在功能上等同。

从保留蛋白质功能的观点来看，用于取代的氨基酸残基优选具有与被取代的氨基酸残基相似的特性(保守性取代)。例如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp都被划分为非极性氨基酸，认为具有相似的特性。另外，不带电氨基酸的实例有Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln。此外，酸性氨基酸的实例有Asp和Glu，而碱性氨基酸的实例有Lys、Arg和His。

只要突变的多肽保留原始多肽的功能，这些多肽的氨基酸突变的数量和位点没有限制。突变的数量典型地是少于全部氨基酸残基的10%，优选少于5%，更优选少于1%。

制备与本发明人鉴定的多肽功能上等同的多肽的其它手段包括利用杂交技术或者基因扩增技术的方法。更具体地，本领域技术人员在编码本发明人鉴定的多肽的DNA序列(SEQ ID NO:1和51)的基础上，通过用杂交技术(Current Protocols in Molecular Biology,edit.Ausubel等(1987)出版John Wiley&Sons Section6.3-6.4)从来自相同或不同物种的生物的DNA样品中分离高同源性的DNA，能够得到与本发明人确定的多肽功能上等同的多肽。因而，本发明的多肽也包括这样的多肽，其由与编码本发明人鉴定的多肽的DNA杂交的DNA编码，与本发明人鉴定的多肽功能上等同。

将编码与本发明人鉴定的多肽功能上等同的多肽的DNA分离需要的杂交严格程度通常是“1x SSC,0.1%SDS,37℃”的程度，更严格的杂交条件是“0.5x SSC,0.1%SDS,42℃”的程度，甚至更严格的杂交条件是“0.2x SSC,0.1%SDS,65℃”的程度。杂交条件越严格，预期分离的DNA与探针序列的同源性越高。然而，上述SSC、SDS和温度条件的组合只是范例，本领域技术人员通过适当组合决定杂交严格程度的上述因素或其它参数(例如，探针浓度、探针长度和杂交反应时间等)，能够获得如上所述相同的严格性。

用这些杂交技术分离的DNA编码的多肽具有与本发明人鉴定的多肽的高同源性的氨基酸序列。这里，高同源性表示序列的同一性有至少40%或更高，优选60%或更高，更优选80%或更高，甚至更优选90%或更高，还更优选95%或更高，仍更优选97%或更高(例如98－99%)。氨基酸序列同源性的测定，例如可使用Karlin和Altschul的BLAST运算法则(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268(1990);Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877(1993))。在此运算法则的基础上已经开发了被称为BLASTX的程序(Altschul等.J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。用BLASTX分析氨基酸序列时，参数的设置，例如：分数＝50，字长＝3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，每个程序使用默认参数。这些分析方法的特定技术手段是本领域已知的。

基于作为编码本发明人分离的多肽的DNA序列的高度同源DNA而分离的DNA片段，利用基因扩增技术(PCR)(CurrentProtocols in Molecular Biology,edit.Ausubel等(1987)出版JohnWiley&Sons Section6.1-6.4)能够获得与本发明人分离的多肽功能上等同的多肽。这可通过根据编码本发明人鉴定的多肽的DNA序列的一部分(SEQ ID NO:1和51)通过设计引物而实现。

<多肽的片段>

本发明还提供了本发明多肽的片段。这些片段是具有与本发明所述多肽氨基酸序列的一部分而不是全部等同的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽片段通常包括8个氨基酸残基或更多，优选12个氨基酸残基或更多(例如，15个氨基酸残基或更多)。优选片段的例子包括截断的多肽，如缺失了包括氨基末端或羧基末端的一段连续氨基酸残基，或缺失了两段连续氨基酸残基，一段包括氨基末端，另一段包括羧基末端。此外，还可优选包含结构或功能特征的片段，它们包括α-螺旋和α-螺旋形成区、β-折叠和β-折叠形成区、转角和转角形成区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、α-两亲区、β-两亲区、可变区、表面形成区、底物结合区以及高抗原指数区。也优选生物学活性片段。生物学活性片段介导本发明多肽的活性，其包括那些具有相似活性、改进活性、或减少非期望活性的片段。例如，包括那些在动物，特别是人体内具有抗原性或免疫原性的片段。这些多肽片段优选保留本发明的多肽的生物学活性，如抗原性。特定序列或其片段的突变体也组成了本发明的一方面。优选的突变体由于保守性氨基酸(即其中的残基用具有相似特性的残基进行取代的氨基酸)取代，而与被试多肽的突变体不同。典型的取代是那些在Ala、Val、Leu、与Ile之间；Ser与Thr之间；酸性残基Asp与Glu之间；Asn与Gln之间；碱性残基Lys与Arg之间；或芳香族残基Phe与Tyr之间的取代。

<多肽的制备>

可用任何合适方式制备本发明的多肽。这些多肽包括分离的天然存在的多肽、通过基因重组或人工合成生产的多肽、或由这些方法结合生产的多肽。制备这些多肽的程序是本领域公知的。重组多肽的制备，例如可通过将插入本发明多核苷酸的载体转移到合适的宿主细胞中，纯化得到在转化体里表达的多肽。另一方面，天然存在多肽的制备，例如可使用固定有排斥本发明多肽的抗体(如下所述)的亲和柱(Current Protocols in Molecular Biology,edit.Ausubel等(1987)出版John Wiley&Sons,Section16.1-16.19)。用于亲和纯化的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明的多肽还可通过体外转译等方法(例如，参见“On the fidelity of mRNA translation in thenuclease-treated rabbit reticulocyte lysate system”Dasso,M.C.和Jackson,R.J.(1989)NAR17:3129-3144)和类似方法制备。本发明多肽片段的制备，例如可通过使用合适的肽酶裂解本发明的多肽。

<探针,引物>

本发明提供了具有至少15个核苷酸链长的核苷酸，其与本发明人鉴定的多核苷酸互补(例如，具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸或其互补链和具有SEQ ID NO:51的核苷酸序列的多核苷酸或其互补链)。这里，术语“互补链”定义为由A:T(RNA中是A:U)和G:C碱基对组成的双链核酸中的另一条链。此外，术语“互补的”不仅包括在至少15个相续核苷酸的连续区域内完全匹配，也包括在该区域内至少有70%，优选至少80%，更优选90%，最优选95%或更高的同源性。同源性可用所述的运算法则来确定。这些多核苷酸也包括用于检测或扩增本发明多肽的探针和引物。用作引物的典型多核苷酸是15－100个核苷酸长的，优选15－35个核苷酸长的。可选地，用作探针的多核苷酸是至少有15个核苷酸，优选至少有30个核苷酸的核苷酸。它们包含本发明至少一部分DNA序列或全部DNA序列。用本发明核苷酸作引物时，核酸扩增反应没有特殊限制，只要能够得到目标扩增产物。例如，该反应可选自DNA扩增反应，如聚合酶链反应(PCR)、ICAN、LAMP、SDA和LCR，以及如NASBA的RNA扩增反应。优选的方法是PCR。

在一个实施方案中，这样的核苷酸是那些对编码本发明多肽的DNA有特异性的核苷酸。术语“特异性的”是指在常规杂交条件下，优选严格条件下，只与编码特定多肽的DNA杂交，而不与编码其它多肽的DNA杂交。优选的实施方案是只与编码大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA(SEQ ID NO：1)杂交，不与编码空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA杂交的多核苷酸。这些多核苷酸包括，例如选自SEQ ID NO：13、14、28－36、70、71、76和77的引物对。可选地，优选的实施方案是只与编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA(SEQ IDNO：51)杂交，不与编码空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA杂交的多核苷酸。这些多核苷酸包括，例如选自SEQ ID NO：15、16、37－46、72、73、78和79的引物对。

此外，由于实施例中鉴定了编码大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA(SEQ ID NO：1)，本发明人找到了编码空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的特异性核苷酸序列。因而，本发明还提供了编码空肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的特异性引物对和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的特异性引物对。编码空肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的特异性引物对包括，但不限于，例如SEQ ID NO：11、12和17－27的引物对。编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的特异性引物对包括，但不限于，例如SEQ ID NO：15、16和37－46的引物对。

此外，由于实施例中编码大肠弯曲杆菌(SEQ ID NO：1)和胚胎弯曲杆菌(SEQ ID NO：51)的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的鉴定，本发明人找到了编码大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物(能够扩增编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的所有基因组DNA的引物)。本发明也提供了这些通用引物。优选的通用引物包括，例如SEQ ID NO：64和65的引物(扩增cdtA DNA)、SEQ ID NO：7－10和47－50的引物(扩增cdtB DNA)和SEQ ID NO：66和67的引物(扩增cdtCDNA)。

本领域技术人员能够合理地制备包含一个或多个与上述引物不同的核苷酸的引物，但能像上述引物对一样对相同基因组DNA区域进行扩增。上述引物退火的基因组DNA区域如附图17－19所示。本发明还提供了这种突变体引物。如上所述，本发明的引物应用的核酸扩增反应没有特殊限制，只要产生目标扩增产物。例如，该反应可选自DNA扩增反应，如PCR(聚合酶链反应)、ICAN、LAMP、SDA和LCR，以及如NASBA的RNA扩增反应。优选的方法是PCR。基于上述引物，本领域技术人员能够设计出适用于执行核酸扩增方法的突变体引物。这些突变体引物可以人工合成制备。通过用突变体引物进行核酸扩增反应并分析扩增产物，能够容易地评定突变体引物能否扩增与原始引物扩增的相同基因组DNA区域。

这些引物优选用于检测待测样品中的弯曲杆菌。

<载体、宿主细胞和多肽的制备>

本发明还提供了生产携带本发明多核苷酸的载体，生产保留本发明多核苷酸或所述载体的宿主细胞以及利用所述宿主细胞生产本发明多肽的方法。

本发明的载体没有限制，只要载体中插入的DNA能够稳定地保留。例如pBluescript载体(Stratagene)是用大肠杆菌作宿主细胞时优选的克隆载体。当用载体生产本发明的多肽时，表达载体特别有用。这些表达载体没有特殊限制，只要它们在体外、大肠杆菌中、培养细胞中或体内表达多肽。然而，优选的实例包括用于在体外表达的pBEST载体(ProMega)、用于在大肠杆菌中表达的pET载体(Invitrogen)、用于在培养细胞表达的pME18S-FL3载体(GenBankAccession No.AB009864)和用于在体内表达的pME18S载体(Mol.Cell Biol.8:466-472(1988))等。本发明的DNA可用常规方法插入载体中，例如通过限制性酶切位点的酶连反应(Current Protocols inMolecular Biology,edit.Ausubel等,(1987)出版John Wiley&Sons,Section11.4-11.11)。

引入本发明载体的宿主细胞没有特殊限制，根据本发明的目的可使用各种宿主细胞。例如，细菌细胞(如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草杆菌)、真菌细胞(如酵母菌和曲霉菌)、昆虫细胞(如果蝇S2和草地夜蛾SF9)、动物细胞(如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑素瘤细胞)以及植物细胞都是用于表达多肽的细胞的例子。载体转染宿主细胞可使用常规方法进行，如磷酸钙沉淀法、电穿孔法(Current protocols in MolecularBiology,edit.,Ausubel等,(1987)出版John Wiley&Sons,Section9.1-9.9)、脂质体转染胺法(GIBCO-BRL)和显微注射法等。

宿主细胞中，为了有利于表达的多肽分泌到内质网腔、细胞间隙或胞外环境中，可以将合适的分泌信号掺入到感兴趣的多肽。这些信号可以是内源信号，或者是来自与所述目的多肽不同的种类的信号。

本发明的多肽分泌到培养介质中，收集培养介质以回收本发明的多肽。当在细胞内产生本发明的多肽时，首先裂解细胞，然后收集多肽。

为了从重组细胞培养物中收获和纯化本发明的多肽，可使用本领域已知的方法，包括硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子交换层析或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。

<抗体>

本发明提供了结合本发明多肽的抗体。这里，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、包括Fab的Fab片段或免疫球蛋白表达文库的其它产物。

本发明的多肽或其片段、或其类似物、或其表达物细胞可用于生产结合本发明多肽的抗体的免疫原。抗体优选对本发明的多肽有免疫特异性的。术语“免疫特异性”是指同其它多肽相比，抗体对本发明的多肽具有很高的亲和力。

结合本发明的多肽的抗体，可使用本领域技术人员已公知的方法制备。例如，多克隆抗体可按如下方法获得：将本发明的多肽或其GST融合蛋白施予小动物(比如兔子)以获得血清。多克隆抗体通过用硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析以及亲和柱(本发明的多肽在其中偶联)等方法纯化血清来制备。另一方面，单克隆抗体可按如下方法获得，例如：将本发明的多肽施予小动物(如小鼠)，随后摘除脾脏并碾碎分离脾细胞。用如聚乙二醇的试剂使脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并从融合细胞(杂交瘤细胞)中筛选能够生产结合本发明的多肽的抗体的克隆。然后将得到的杂交瘤细胞移植到小鼠的腹膜腔内，并从小鼠体内收集腹水。单克隆抗体通过用例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析以及亲和柱(本发明的多肽在其中偶联)等方法纯化腹水来制备。

本发明的抗体也可用于检测和纯化待测样品中本发明的多肽。

<待测样品中弯曲杆菌的检测>

本发明提供了检测待测样品中弯曲杆菌的方法。检测待测样品中的弯曲杆菌有多种用途，例如诊断弯曲杆菌病、快速检测被弯曲杆菌污染的食物、验证食品加工方法的正确性以及食物中毒爆发时鉴定病原菌。

在一个实施方案中，本发明的检测方法，用于检测待测样品中大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的存在，其包括的步骤有：

（a）用编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的各个基因组DNA的特异性引物对的混合物对待测样品进行聚合酶链反应；和

（b）根据从编码上述细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA中扩增片段的分子量或存在来确定这些细菌的存在；

在一个可选的实施方案中，本发明的检测方法，用于检测待测样品中大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的存在，其包括的步骤有：

（a）用能扩增编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物对对待测样品进行核酸扩增反应；

（b）用步骤(a)中扩增的基因组DNA作为模板和编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的各个基因组DNA的特异性引物对的混合物对待测样品进行聚合酶链反应；和

（c）根据从编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA中扩增片段的分子量或存在来确定这些细菌的存在。

如在实施例中，在一个反应体系中使用多个PCR引物的PCR称为“多重PCR”。通过对PCR产物的电泳和检测其带的尺寸大小可同时鉴定多个细菌种类。本发明提供了通过核酸扩增方法(包括多重PCR作为典型例子)使用适合扩增多个核酸区域的引物或它们的混合物检测弯曲杆菌的方法。本发明核酸扩增方法的类型没有限制，只要能够得到期望扩增产物。优选的方法是PCR。

这些方法中使用的特异性引物对的混合物包括，例如，下面引物对的混合物：

（a）选自SEQ ID NO：13、14和28－36以扩增编码大肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对一样对相同基因组DNA区域进行扩增的的引物对；

（b）选自SEQ ID NO：11、12和17－27以扩增编码空肠弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对一样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对；和

（c）选自SEQ ID NO：15、16和37－46以扩增编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对，或者能像上述引物对一样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对。

此外，选自例如SEQ ID NO：7－10和47－50，或者能像上述引物对一样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对可用作通用引物对。

在本发明的进一步实施方案中，检测方法是用于检测待测样品中大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌存在的方法，其包括的步骤有：

（a）用能扩增编码这些细菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物对对待测样品进行核酸扩增反应；

（b）用限制酶消化步骤(a)中扩增的基因组DNA，和；

（c）根据由消化获得的DNA片段的分子量来确定这些细菌的存在。该方法中使用的限制酶没有特殊限制，只要它能够鉴定编码C.jejuni、C.coli和C.fetus的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA，包括，例如Sau3AI、Dsa I、Mbo I、Rsa I、EcoRI、Hinf I、Nde I、Pst I、Xba I和Xho II。同时，通用引物对的例子包括选自SEQ ID NO：7－10和47－50以及能像上述引物对一样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对。

如下面实施例描述的用于检测基于多种限制酶消化PCR扩增的DNA产生片段的长度的多态性的方法称为PCR-RFLP(PCR限制性片段长度多态性)。本发明还提供了基于多种限制酶处理通过核酸扩增方法扩增的DNA产生的片段长度的检测多态性方法中适用的引物，该方法包括PCR-RFLP作为代表实例。

在本发明的另一个实施方案中，检测方法是用于检测待测样品中弯曲杆菌存在的方法，其包括的步骤有：

（a）用能够扩增编码弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的通用引物对对待测样品进行核酸扩增反应；和

（b）根据从编码弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA中扩增片段的分子量或存在来确定弯曲杆菌的存在。该方法所用的引物对是能够扩增编码任何种类的弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA的引物对。这些通用引物对包括，例如选自SEQID NO：7－10、47－50和64－67的引物对。如上所述，上述的引物对是能扩增编码三个种类，即大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的所有基因组DNA的通用引物对。上述的引物对可以期望不仅能够扩增编码上述三个种类的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA，而且能够扩增其它弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的基因组DNA。同样地，能像上述引物对一样对相同基因组DNA区域进行扩增的引物对可扩增上述三个种类的基因组区域和其它弯曲杆菌的基因组区域。

本发明还提供了上述本发明检测方法中使用的试剂盒。这些试剂盒除包括上述引物对外，还包括说明书手册。试剂盒也可包括其它成分。

弯曲杆菌的检测既可在蛋白质水平进行，又可在如上述的DNA水平进行。待测样品中细菌的存在可通过，例如，用蛋白质印迹、斑点印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光或使用对细菌的细胞致死肿胀毒素具有特异性的抗体的方法检测该细菌的细胞致死肿胀毒素来评定。

这里所有引用的现有技术文件都并入作为参考。

实施例

[实施例1]弯曲杆菌的菌株

使用在2001－2003年从多个临床样品中收集的C.jejuni,C.coli和C.fetus。每个菌株在含有5%去纤维蛋白的马血(日本生物材料中心)和弯曲杆菌选择补充剂SR69(OXOID)的血琼脂平板(BloodAgar Base No.2:OXOID)上培养。C.jejuni和C.coli在42℃的5%O₂，10%CO₂和85%N₂气中培养，而C.fetus在25℃的低温O₂/CO₂气体孵育箱中培养(MODEL9200:Wakenyaku Co.,Ltd)。

[实施例2]PCR模板的制备

刮取每种细菌的五个克隆子，悬于500μl无菌PBS。得到的细菌以转速为10,000rmp离心洗涤5min(MRX-150:TOMY SEIKOCo.,Ltd.)，然后重新悬于300μl无菌PBS。然后，悬液在沸水槽中煮沸10min，再在冰上冷却。将悬液以15,000rmp的转速离心10min，收集所得的上清液。收集的上清液中DNA的量用分光光度仪(Ultrospec3100pro:Amersham Biosciences)定量。每份定量的细胞抽提物稀释至20ng/μl，然后作PCR。

[实施例3]C.coli cdtB探针的制备和DNA杂交

通过用引物GNW和LPF-D、DIG标记混合物(Roche)以及作为模板的C.coli Co1-192细胞抽提物进行PCR标记制备了C.coli cdtB探针。

具体地，为了检测C.coli CDT基因的存在，通过用文献中记载的简并引物GNW[SEQ ID NO:5:5’-GG(ACGT)AA(CT)TGGAT(ACT)TGGGG(ACGT)TA-3’]和LPF-D[SEQ ID NO:6:5’-(AGT)AA(CT)TG(ACGT)AC(AGT)TA(ACGT)CC(AGT)AA(ACGT)GG-3’](Pickett,C.等Infect.Immun.,64:2070(1996))在94℃3min,30个循环[94℃30s,42℃30s,72℃2min]以及72℃5min的条件下进行PCR分析了三种C.jejuni菌株和两种C.coli菌株。所有三种C.jejuni菌株和两种C.coli菌株显示的扩增的cdt区的带约为1.5Kb(图1中箭头1)。

扩增带与pT7载体(Novagen)连接，并用连接物转化大肠杆菌(E.coli JM109)细胞。用测序仪(ABI PRISM377DNA测序仪;AppliedBiosystems)对得到的克隆子测序，显示与cdtB类似的序列。测序反应中使用BigDye终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems)。此外，发现了800bp带(图1中的箭头2)是由cdtB衍生的第二条带，其被扩增是由于引物GNW是混合引物。

20μg的C.coli Co1-192基因组DNA用60U的限制酶HindIII在37℃消化12小时。然后，按常规方法(Molecular cloning:alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,(2001))用制备的探针进行DNA印迹和DNA－DNA杂交。

在42℃的严格条件下进行杂交。印迹后，印迹点室温下用2xSSC/0.1%SDS溶液清洗两次，每次5min，然后60℃用0.2x SSC/0.1%SDS溶液清洗两次，每次15min。

结果，发现探针阳性带约为3kbp和4kbp(图2)。3kbp带与pUC18载体连接。连接物将E.coli JM109转化，得到一个含有cdtB区的克隆子(3k44)。

[实施例4]C.coli cdtB基因的测序

用常规方法对含有实施例3中得到的C.coli cdtB区的克隆子3k44测序。测定的C.coli CDT区全长序列如SEQ ID NO:1所示。

[实施例5]通用引物对1的设计和PCR

将本发明的C.coli CDT序列与来自已知数据库的C.jejuni CDT基因进行比较设计了如下述的通用引物U和通用引物R。将引物混合，然后加到1μl20ng/μl的细胞抽提物中，使每个引物的浓度为0.5mM。用PCR缓冲液(TaKaRa Ex Taq kit:Takara Bio)将终体积调整到20μl。反应混合物在94℃3min,30个循环[94℃30s,55℃30s,72℃1min]以及72℃3min的条件下作PCR。结果如图3所示。发现了约1900bp的扩增片段，因而检测到源自C.jejuni(泳道2－4)和C.coli(泳道5－6)的CDT衍生带。

通用引物U[SEQ ID NO:7:GATAA(CT)GATCCTTTAAAACT]

通用引物R[SEQ ID NO:8:(AT)(AT)CCAAAGCG(AT)TTTT(CG)TATGG]

[实施例6]通用引物对2的设计和PCR

同样地，设计如下所示的通用引物Up和通用引物Do，并在94℃3min,30个循环[94℃30s,50℃30s,72℃45s]以及72℃3min的条件下进行PCR。结果如图4－6所示。发现了约720bp的扩增片段。

通用引物Up[SEQ ID NO:9:ACTTGGAATTTGCAAGGC]

通用引物Do[SEQ ID NO:10:TCTAAAATTTAC(ACT)GGAAAATG]

[实施例7]特异性引物的设计和用多重PCR的cdtB基因的检测

将本发明的C.coli CDT序列与来自已知数据库的C.jejuni CDT基因进行比较设计了如下述的C.jejuni特异性引物CjSPBU3和CjSPBR3。同样地，设计了C.coli特异性引物CcSPBU5和CcSPBR5以及C.fetus特异性引物CfSPBU1和CfSPBR1。

将引物混合，然后加到1μl20ng/μl的细胞抽提物中，使每个引物的浓度为0.5mM。用PCR缓冲液(TaKaRa Ex Taq kit:Takara Bio)将终体积调整到20μl。反应混合物在94℃3min,30个循环[94℃56s,55℃30s,72℃45s]以及72℃3min的条件下作多重PCR(GeneAmp PCR system9700;Applied Biosystems).。结果如图7所示。发现了C.jejuni特异性CDT扩增片段(约750bp)、C.coli特异性CDT扩增片段(约400bp)和C.fetus特异性CDT扩增片段(约530bp)，这样可区分C.jejuni(泳道2－4)、C.coli(泳道5－6)和C.fetus(泳道7－8)。

特异性引物CjSPBU3[SEQ ID NO:11:TACTCCGCCTTTTACCGCA]

特异性引物CjSPBR3[SEQ ID NO:12:GAGTATAGGTTTGTTGTC]

特异性引物CcSPBU5[SEQ ID NO:13:TTTAATGTATTATTTGCCGC]

特异性引物CcSPBR5[SEQ ID NO:14:TCATTGCCTATGCGTATG]

特异性引物CfSPBU1[SEQ ID NO:15:CGCAAGTTGGAAGACTAT]

特异性引物CfSPBR1[SEQ ID NO:16:TTTATTATCGCCGGAGCA]

[实施例8]用通用引物对1通过PCR-RFLP鉴定细菌种类

用实施例6中获得的通用引物对1进行PCR后，向8.5μl反应溶液中加入5U的限制酶Sau3AI(NEB)。得到的混合物在37℃反应3h，然后电泳。结果如图8所示。

[实施例9]通过用特异性引物多重PCR的cdtB基因检测

用实施例7中获得的特异性引物和实施例7中实验条件对其它多种临床弯曲杆菌菌株进行多重PCR。结果如图9所示。与实施例7中的情况一样，发现了C.jejuni特异性CDT扩增片段(约750bp)、C.coli特异性CDT扩增片段(约400bp)和C.fetus特异性CDT扩增片段(约530bp)，可使每种细菌区别开来。

[实施例10]C.fetus cdtB探针的制备和DNA杂交

通过用引物对2(通用引物Up和Do)、DIG标记混合物(Roche)以及作为模板的C.fetus Co1-187细胞抽提物进行PCR标记制备了C.fetus cdtB探针。

20μg的C.fetus Co1-187基因组DNA用60U的限制酶HindIII在37℃消化12小时。然后，按常规方法(Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,(2001))用制备的探针进行DNA印迹和DNA－DNA杂交。此杂交在42℃的严格条件下进行。印迹后，室温下印迹点用2xSSC/0.1%SDS溶液清洗两次，每次5min，然后60℃用0.2x SSC/0.1%SDS溶液清洗两次，每次15min。

结果，发现探针阳性带约2kbp和5kbp(图10)。2kbp带与pUC18载体连接。连接物将E.coli JM109转化，得到一个含有cdtB区的克隆子(Cf78)。

[实施例11]C.fetus CDT基因的测序

用常规方法对实施例10中得到的含有C.fetus cdtB区的克隆子Cf78测序以确定C.fetus的cdtA区和cdtB区的序列。因为克隆子Cf78不含有cdtC区，通过在下述的条件下基于测定的cdtB基因序列，用随机引物进行基因步移测定了cdtC区的序列。因而，测定的C.fetus CDT区全长序列如SEQ ID NO:51所示。

[使用随机引物的基因步移]

基于实施例11测定的基因序列设计了如下所述的由随机引物、目标扩增引物和测序引物组成的引物组。用C.fetus Co1-187基因作为目标扩增的模板。为了进行目标扩增，10pmol的随机引物加到20ng的模板基因中，用KOD Dash PCR Kit(TOYOBO)将终体积调整到100μl。反应混合物在94℃2min以及35个循环[94℃20s,65℃5s,74℃30s]72℃3min的条件下作PCR。

用测序引物按常规方法对获得的PCR产物测序。

引物组1

随机引物[SEQ ID NO:55:GCTTGTAGCAGTATTGATGCNNNNNNNNN]

目标扩增引物[SEQ ID NO:56:GCTTGTAGCAGTATTGATGC]

测序引物[SEQ ID NO:57:CTAGTTTCGGACCATTTTCC]

引物组2

随机引物[SEQ ID NO:58:ATACGCAATGCAAACACCGGNNNNNNNNN]

目标扩增引物[SEQ ID NO:59:ATACGCAATGAAACACC GG]

测序引物[SEQ ID NO:60:TAAAAGCGATTTTCAGGGCAG]

引物组3

随机引物[SEQ ID NO:61:TGTCGACATAGAGCCTAAACNNNNNNNNN]

目标扩增引物[SEQ ID NO:62:TGTCGACATAGAGCCTAAAC]

测序引物[SEQ ID NO:63:ATTTTCACCGCCGCTTAGTG]

[实施例12]cdt A通用引物的设计和PCR

将本发明的C.coli和C.fetus的cdtA序列与来自已知数据库的C.jejuni的cdtA基因进行比较设计了如下述的通用引物U和通用引物R。将引物混合，然后加到1μl20ng/μl的细胞抽提物中，使每个引物的浓度为0.25mM。用PCR缓冲液(TaKaRa Ex Taq kit:Takara Bio)将终体积调整到20μl。反应混合物在94℃3min,30个循环[94℃30s,55℃30s,72℃30s]以及72℃3min的条件下作PCR.。结果如图11(左边)所示。发现了约550bp的扩增片段。因而，检测到所有C.jejuni(泳道2－4)、C.coli(泳道5－6)和C.fetus(泳道7－8)的cdtA衍生带。

CdtA通用引物U

[SEQ ID NO:64:(GA)A(ACT)GAT(AC)(AC)(TAG)GAT(AC)GATCC(AT)(TC)CAAA]

CdtA通用引物R

[SEQ ID NO:65:(GA)(AT)AA(TC)AGG(TC)G(CT)TTG(CT)A(AT)(GA)CA]

[实施例13]用cdtA通用引物通过PCR检测cdtA基因

用实施例12中获得的通用引物和实施例12中的实验条件对其它多种临床弯曲杆菌菌株进行PCR。结果如图12所示。与实施例12中的情况一样，发现了cdtA特异性扩增片段(约550bp)。

[实施例14]cdtC通用引物的设计和PCR

将本发明的C.coli和C.fetus的cdtC序列与来自已知数据库(BLAST)的C.jejuni cdtC基因进行比较设计了如下述的通用引物U和通用引物R。

将1μl20ng/μl的细胞抽提物和引物混合，使每个引物的浓度为0.25mM。用PCR缓冲液(TaKaRa Ex Taq kit:Takara Bio)将终体积调整到20μl。反应混合物在94℃3min,30个循环[94℃30s,55℃30s,72℃30s]以及72℃3min的条件下作PCR.。结果如图3所示。发现了约320bp的扩增片段。因而，检测到所有C.jejuni(泳道10－12)、C.coli(泳道13和14)和C.fetus(泳道15和16)的cdtC扩增带(图11，右边)。

CdtC通用引物U

[SEQ ID NO:66:(AGC)A(TG)(TC)(TC)(AT)(AG)(AT)(AT)(GT)A(CT)CAAAA(CT)TGG]

CdtC通用引物R

[SEQ ID NO:67:(AGC)CTA(AGT)(AT)CC(AT)A(AC)(GT)C(GT)(AT)T(CT)TT(GC)]

[实施例15]用cdtC通用引物通过PCR检测cdtC基因

用实施例中获得的通用引物和实施例14中的实验条件对其它多种临床弯曲杆菌菌株进行PCR。结果如图13所示。与实施例14中的情况一样，发现了cdtC特异性扩增片段(约320bp)。

[实施例16]cdtA特异性引物的设计和用多重PCR检测cdtA基因

将本发明的C.fetus的CDT序列与来自已知数据库(BLAST)的C.jejuni和C.coli的CDT基因进行比较设计了如下述的C.jejuni特异性引物CjASPU2和CjASPR2。同样地，设计了C.coli特异性引物CcASPU1和CcASPR1以及C.fetus特异性引物CfASPU1和CfASPR1。

将引物混合，并加到1μl20ng/μl的细胞抽提物中，使每个引物的浓度为0.125mM。用PCR缓冲液(TaKaRa Ex Taq kit:Takara Bio)将终体积调整到20μl。反应混合物在94℃3min,30个循环[94℃30s,55℃30s,72℃30s]以及72℃3min的条件下作多重PCR(GeneAmp PCR system9700;Applied Biosystems)。结果如图14(左边)所示。发现了C.jejuni特异性CDT扩增片段(约630bp)、C.coli特异性CDT扩增片段(约330bp)和C.fetus特异性CDT扩增片段(约490bp)，这样可区分C.jejuni(泳道2－4)、C.coli(泳道5和6)和C.fetus(泳道7和8)。

特异性引物CjASPU2[SEQ ID NO:68:AGGACTTGAACCTACTTTTC]

特异性引物CjASPR2[SEQ ID NO:69:AGGTGGAGTAGTTAAAAACC]

特异性引物CcASPU1[SEQ ID NO:70:ATTGCCAAGGCTAAAATCTC]

特异性引物CcASPR1[SEQ ID NO:71:GATAAAGTCTAAAACTGC]

特异性引物CfASPU1[SEQ ID NO:72:AACGACAAATGTAAGCACTC]

特异性引物CfASPR1[SEQ ID NO:73:TATTTATGCAAGTCGTGCGA]

[实施例17]用cdtA特异性引物通过多重PCR检测cdtA基因

用实施例中获得的特异性引物和实施例14中的实验条件对其它多种临床弯曲杆菌菌株进行多重PCR。结果如图15所示。与实施例14中的情况一样，发现了C.jejuni特异性cdtA扩增片段(约630bp)、C.coli特异性cdtA扩增片段(约330bp)和C.fetus特异性cdtA扩增片段(约490bp)，可使每种细菌区别开来。

[实施例18]cdtC特异性引物的设计和用多重PCR检测cdtC基因

将本发明的C.fetus的CDT序列与来自已知数据库的C.jejuni和C.coli的CDT基因进行比较设计了如下述的C.jejuni特异性引物CjCSPU1和CjCSPR2。同样地，设计了C.coli特异性引物CcCSPU1和CcCSPR1以及C.fetus特异性引物CfCSPU2和CfCSPR1。

将引物混合，并加到1μl20ng/μl的细胞抽提物中，使每个引物的浓度为0.125mM。用PCR缓冲液(TaKaRa Ex Taq kit:Takara Bio)将终体积调整到20μl。反应混合物在94℃3min,30个循环[94℃30s,55℃30s,72℃30s]以及72℃3min的条件下作多重PCR(GeneAmp PCR system9700;Applied Biosystems)。结果如图14(右边)所示。发现了C.jejuni特异性CDT扩增片段(约500bp)、C.coli特异性CDT扩增片段(约300bp)和C.fetus特异性CDT扩增片段(约400bp)，这样可区分C.jejuni(泳道10－12)、C.coli(泳道13和14)和C.fetus(泳道15和16)。

特异性引物CjCSPU1[SEQ ID NO:74:TTTAGCCTTTGCAACTCCTA]

特异性引物CjCSPR2[SEQ ID NO:75:AAGGGGTAGCAGCTGTTAA]

特异性引物CcCSPU1[SEQ ID NO:76:TAGGGGATATGCACGCAAAAG]

特异性引物CcCSPR1[SEQ ID NO:77:GCTTAATACAGTTACGATAG]

特异性引物CfCSPU2[SEQ ID NO:78:AAGCATAAGTTTTGCAAACG]

特异性引物CfCSPR1[SEQ ID NO:79:GTTTGGATTTTCAAATGTTCC]

[实施例19]用特异性引物通过多重PCR检测cdtC基因

用实施例中获得的特异性引物和实施例14中的实验条件对其它多种临床弯曲杆菌菌株进行多重PCR。结果如图16所示。与实施例14中的情况一样，发现了C.jejuni特异性cdtC扩增片段(约500bp)、C.coli特异性cdtC扩增片段(约300bp)和C.fetus特异性cdtC扩增片段(约400bp)，可使每种细菌区别开来。

工业实用性

本发明的引物不仅可应用到流行病学研究、弯曲杆菌的研究和弯曲杆菌病的诊断，而且可用于快速检测被弯曲杆菌污染的食物、验证食品加工方法的正确性以及食物中毒爆发时鉴定病原菌，因此可用于防止感染的扩散。

Claims (6)

1.编码胚胎弯曲杆菌的细胞致死肿胀毒素的亚基的多核苷酸，其由以下组成：

(a)编码由SEQ ID NO：52－54中任一氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；或

(b)由SEQ ID NO：51的核苷酸序列中第1－702位、778－1629位和1632－2177位中任一核苷酸序列组成的多核苷酸。

2.含有权利要求1的多核苷酸的载体。

3.含有权利要求1的多核苷酸或权利要求2的载体的宿主细胞。

4.由权利要求1的多核苷酸编码的多肽。

5.生产权利要求4的多肽的方法，其包括的步骤有培养权利要求3的宿主细胞和收集宿主细胞或者培养基上清液中产生的多肽。

6.结合权利要求4的多肽的抗体。

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