CN110904255A - 一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110904255A
CN110904255A CN201911312606.8A CN201911312606A CN110904255A CN 110904255 A CN110904255 A CN 110904255A CN 201911312606 A CN201911312606 A CN 201911312606A CN 110904255 A CN110904255 A CN 110904255A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
detection kit
listeria monocytogenes
reverse primers
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911312606.8A
Other languages
English (en)
Inventor
许恒皓
郦娟
董井泉
王蕾
吉敬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JIANGSU HAIHENG PHARMACEUTICAL Co Ltd
Jiangsu Ocean University
Original Assignee
JIANGSU HAIHENG PHARMACEUTICAL Co Ltd
Jiangsu Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JIANGSU HAIHENG PHARMACEUTICAL Co Ltd, Jiangsu Ocean University filed Critical JIANGSU HAIHENG PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority to CN201911312606.8A priority Critical patent/CN110904255A/zh
Publication of CN110904255A publication Critical patent/CN110904255A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。该检测试剂盒包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条；所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3‑spacer进行末端封闭。本发明使用RPA‑LFS(The isothermal recombinase polymerase amplification and the lateral flow strip)方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高。

Description

一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)简称单增李斯特菌，是革兰氏阳性菌。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李氏特病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，其致死率高达44％。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌可广泛存在于多种食品中,如水产品、肉制品、奶制品、蔬菜等,在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，且能引起各种食物间的交叉感染，被称为“冰箱杀手”。本研究主要通过不同浓度的灭活菌液污染当地购买新鲜牛奶，制备待检测模板以达到鉴别单增李斯特菌和其它易感染致病菌目的，如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠致病性埃希氏菌(E.coli O157)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、沙门氏菌(S.enteritidis)等。
现有的通常对于食源性单增李斯特菌的检测是通过培养法，需要实验室操作并且周期较长，检测较为繁琐；利用分子手段进行检测，通常需要昂贵的仪器设备及具备专业技能的实验人员，成本较高；近年由于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA技术)、侧流层析试纸条检测技术(LFS)的兴起，本发明通过RPA-LFS技术快速鉴别单增李斯特菌，以期为该菌检测带来新的技术参考。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为LM-F、LM-R，且序列分别为CTCGCTCTAGGTATCTTTGGGATTTACTAC、Biotin-GTCCGAATATCATTTACCTCATCAAAAGGG，其探针为LM-P，且序列为FITC-GTTTCATTCCTGCGTTACTATTCATTGTTG[THF]TGCTATACTTTGTTT-/C3-spacer/。
本发明还涉及一种单增李斯特菌特异性的检测试剂盒，其包含上述所述的正反向引物及探针、侧流层析试纸条:
所述反向引物5'端用生物素进行标记；
所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。
优选地，所述正反向引物长度为30bp。
优选地，所述探针长度45bp。
优选地，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。
优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
本发明的有益效果：
本发明使用RPA结合胶体金试纸条快速检测食源性单增李斯特菌，能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高，耗时短。
附图说明
图1为试纸条组装示意图；
图2为本发明实施例中探针种间特异性筛选结果；
图3为本发明实施例中RPA-LFS最低检出限测定结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为LM-F、LM-R，且序列分别为CTCGCTCTAGGTATCTTTGGGATTTACTAC、Biotin-GTCCGAATATCATTTACCTCATCAAAAGGG，其探针为LM-P，且序列为FITC-GTTTCATTCCTGCGTTACTATTCATTGTTG[THF]TGCTATACTTTGTTT-/C3-spacer/。
本发明还涉及一种单增李斯特菌特异性的检测试剂盒，其包含上述所述的正反向引物及探针、侧流层析试纸条:
所述反向引物5'端用生物素进行标记；
所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。
优选地，所述正反向引物长度为30bp。
优选地，所述探针长度45bp。
优选地，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。
优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
实施例
试验材料
单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色萄球菌、肠致病性埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌标准株基因组均由武汉市食品化妆品检疫所提供；
Figure BDA0002324946230000041
Basic kit、
Figure BDA0002324946230000042
nfokit购自英国TwistDX公司；侧流层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司；PCR清洁试剂盒购自莫纳生物科技有限公司；Qubit 4购自Thermo Scientific；MonAmpTM SYBR Green购自莫纳生物科技有限公司；本研究所用引物和探针均由通用生物系统(安徽)有限公司合成；罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪，购自罗氏制药。
试验方法
引物及探针设计
从NCBI上获取单增李斯特菌基因组序列，用Primer-Blast通过不同参数设计得到理论上可行的特异性引物。
RPA反应筛选引物
引物筛选所使用的
Figure BDA0002324946230000051
Basic kit反应体系：LM-F(10μM)2.1μL、LM-R(10μM)2.1μL、2X Reaction Buffer 25μL、10X Basic E-mix 5μL、dNTP(1.8mM)2.25μL、Template 1μL、ddH2O 6.95μL、20Xcore Reaction mix 2.5μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；通过琼脂糖凝胶电泳及紫外凝胶成像仪检验引物敏感性。
RPA-LFS筛选探针
用Geneious软件在正反向引物间设计特异性探针，用Primer 5.0验证引物探针特性，应在理论上尽量避免正方向引物二聚体、发夹结构、错配、探针和反向引物的二聚体等发生。探针筛选使用
Figure BDA0002324946230000052
nfo kit，其反应体系：LM-F(10μM)2.1μL、LM-R(10μM)2.1μL、LM-P(10μM)0.6μL、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH2O 11.2μL、加入冻干粉，混匀、Template 2μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；反应结束即刻加入EDTA或置于冰上终止反应，再通过侧流层析试纸条检测获得最佳探针正反向引物，并用琼脂糖凝胶电泳进行结果验证。
试纸条检测原理
吸取无需纯化的扩增产物5μL加入95μL缓冲液中，插入试纸条，在试纸条吸水纸的虹吸作用下，扩增产物与金标抗体、缓冲液向吸水纸端流动。当有扩增产物存在时，扩增产物一端修饰有FITC，与鼠抗FITC金标抗体结合，接着液相继续向吸水纸端流动到达检测线，固定在检测线上的链霉亲和素另一端修饰有生物素的扩增产物捕获，这样就使被扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，最终被质控线上的抗鼠抗体的Fc片段抗体捕获，使质控线同样显色。当扩增产物不存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而被质控线上的抗鼠抗体捕获，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条的质量进行指控，示意图如图1所示。
种间特异性鉴别
用试纸条进行种间特异性筛选，同时用单增李斯特菌引物探针分别扩增单增李斯特菌，蜡样芽孢杆菌，肠致病性埃希氏菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，结果如图1所示。
最低检出下限测定
由于细菌在食物中的起始含量不能确定，实验室条件下在方法建立过程中检测的模板浓度通常较高，在实际检测中对于极低含量存在的菌也要非常灵敏的检出，所以要对最低检出下限进行测定，对于本研究使用RPA-LFS检测单增李斯特菌的最低检出下限为100CFU/μL结果如图2所示。
与qPCR检测结果进行比较
目前qPCR检测是公认的比较灵敏准确的方法，用qPCR检测结果最为对照，能够说明RPA-LFS用于检测的准确度，在具有相同检测准确的条件下使用RPA-LFS方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下实现实时、实地、即时的快速现场检测,分别使用RPA-LFS和qPCR同时检测人工污染新鲜牛奶的48个样品，共检出4个阳性结果，两种方法所述结果一致，结果如表所示。
Figure BDA0002324946230000071
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为LM-F、LM-R，且序列分别为
CTCGCTCTAGGTATCTTTGGGATTTACTAC、
Biotin-GTCCGAATATCATTTACCTCATCAAAAGGG，其探针为LM-P，且序列为
FITC-GTTTCATTCCTGCGTTACTATTCATTGTTG[THF]TGCTATACTTTGTTT-/C3-spacer/。
2.一种单增李斯特菌特异性的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的正反向引物及探针、侧流层析试纸条:
所述反向引物5'端用生物素进行标记；
所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述正反向引物长度为30bp。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针长度45bp。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。
CN201911312606.8A 2019-12-18 2019-12-18 一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 Pending CN110904255A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911312606.8A CN110904255A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911312606.8A CN110904255A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110904255A true CN110904255A (zh) 2020-03-24

Family

ID=69826461

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911312606.8A Pending CN110904255A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110904255A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832241A (zh) * 2021-08-27 2021-12-24 江苏海洋大学 一种rpa-lfs快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773848A (zh) * 2013-12-10 2014-05-07 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种检测单增李斯特菌用核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用
CN105671197A (zh) * 2016-04-19 2016-06-15 宁波大学 一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法
CN106834438A (zh) * 2017-04-07 2017-06-13 广州和实生物技术有限公司 即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒
CN108034737A (zh) * 2017-12-26 2018-05-15 深圳市计量质量检测研究院 用于检测单核细胞增生李斯特菌的rpa引物和探针及检测方法
CN108148894A (zh) * 2017-12-26 2018-06-12 中科智测(天津)科技有限公司 一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773848A (zh) * 2013-12-10 2014-05-07 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种检测单增李斯特菌用核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用
CN105671197A (zh) * 2016-04-19 2016-06-15 宁波大学 一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法
CN106834438A (zh) * 2017-04-07 2017-06-13 广州和实生物技术有限公司 即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒
CN108034737A (zh) * 2017-12-26 2018-05-15 深圳市计量质量检测研究院 用于检测单核细胞增生李斯特菌的rpa引物和探针及检测方法
CN108148894A (zh) * 2017-12-26 2018-06-12 中科智测(天津)科技有限公司 一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEJANDRO GARRIDO-MAESTU等: "Development and evaluation of loop-mediated isothermal amplification,and Recombinase Polymerase Amplification methodologies,for the detection of Listeria monocytogenes in ready-to-eat food samples", 《FOOD CONTROL》 *
WEIFANG GAO等: "Recombinase Polymerase Amplification-Based Assay for Rapid Detection of Listeria monocytogenes in Food Samples", 《FOOD ANAL. METHODS》 *
XIN-XIN DU等: "Recombinase Polymerase Amplification Combined with Lateral Flow Strip for Listeria monocytogenes Detection in food", 《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》 *
刘旸等: "单增李斯特氏菌快速检测方法的建立", 《食品研究与开发》 *
李秀梅等: "环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测单增李斯特菌的研究", 《中国预防兽医学报》 *
王金凤等: "单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA检测方法的建立及应用", 《现代食品科技》 *
藏雨轩: "食源性致病菌恒温扩增试纸条检测研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832241A (zh) * 2021-08-27 2021-12-24 江苏海洋大学 一种rpa-lfs快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kawasaki et al. Multiplex real-time polymerase chain reaction assay for simultaneous detection and quantification of Salmonella species, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157: H7 in ground pork samples
Cai et al. An integrated microfluidic device utilizing dielectrophoresis and multiplex array PCR for point-of-care detection of pathogens
Wolffs et al. Rapid quantification of Yersinia enterocolitica in pork samples by a novel sample preparation method, flotation, prior to real-time PCR
Walcher et al. Evaluation of paramagnetic beads coated with recombinant listeria phage endolysin–derived cell-wall-binding domain proteins for separation of Listeria monocytogenes from raw milk in combination with culture-based and real-time polymerase chain reaction–based quantification
Lambertz et al. Real-time PCR method for detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in food
Amagliani et al. Direct detection of Listeria monocytogenes from milk by magnetic based DNA isolation and PCR
CN104946749B (zh) 一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用型引物与探针以及试剂盒
CN108251548B (zh) 禽致病性大肠杆菌等的多重pcr检测引物组、方法及试剂盒
CN102534041B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素a、b基因pcr同步检测试剂盒
Hahm et al. Pathogen enrichment device (PED) enables one-step growth, enrichment and separation of pathogen from food matrices for detection using bioanalytical platforms
CN104450940A (zh) 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒
CN110791592A (zh) 一种快速检测非洲猪瘟病毒的引物以及试剂盒
CN104263838A (zh) 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN110982914A (zh) 一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用
Fernandez et al. Captive rhesus monkeys (Macaca mulatta) are commonly infected with Helicobacter cinaedi
Aprodu et al. Advanced sample preparation for the molecular quantification of Staphylococcus aureus in artificially and naturally contaminated milk
CN110904255A (zh) 一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用
CN104911269B (zh) 鉴别气溶胶中布鲁氏菌a19疫苗株的引物、探针及试剂盒
CN110724752B (zh) 多重pcr检测人鱼共患病病原菌的方法
CN106282354B (zh) 一种鲁氏不动杆菌的检测引物及荧光定量pcr检测方法
El-Sharoud et al. A real-time PCR-based microfluidics platform for the detection of Cronobacter sakazakii in reconstituted milks
CN109811073B (zh) 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
CN104164510A (zh) 利用多重pcr技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法
Marinho et al. Rotavirus analyses by SYBR Green real-time PCR and microbiological contamination in bivalves cultivated in coastal water of Amazonian Brazil
CN112553355A (zh) 一种基于raa技术检测单增李斯特菌的引物探针组合、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200324