CN102433387A

CN102433387A - 尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物

Info

Publication number: CN102433387A
Application number: CN2011104440100A
Authority: CN
Inventors: 张正光; 王健生; 郑小波; 王源超; 张海峰
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2031-12-27
Also published as: CN102433387B

Abstract

本发明公开了一种尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的检测尖孢镰刀菌的分子检测技术。该检测方法可以在病害侵染初期鉴定出病原物，为枯萎病的防治提供参考。更重要的是，基于新的靶序列CYP51C建立的检测体系为其它病原菌检测新靶标的应用提供了技术指导和理论依据，也为病原菌的分子检测研究奠定了方法基础。

Description

尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物

技术领域

本发明涉及一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，以及利用所述引物检测尖孢镰刀菌的分子检测方法。

背景技术

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)）是一种重要的植物病原真菌，可以引起很多重要农作物的维管束萎蔫病害，根据对不同寄主植物的致病性差异可将尖孢镰刀菌分为不同的专化型（Smith S N. An Overview of Ecological and Habitat Aspects in the Genus Fusarium with Special Emphasis on the Soil-Borne Pathogenic Forms.Plant Pathology Bulletin, 2007, 16(3) ： 97-120），有些专化型内还可进一步分为不同的小种，目前已报道的尖孢镰刀菌专化型和小种有120多个（Armstrong G. Formae speciales and races of Fusariumoxysporum causing wilt diseases.Fusarium： diseases, biology, and taxonomy, 1981）。尖孢镰刀菌在土壤中营兼性寄生，腐生能力强，在土壤和植株残株上均可长期生存（Notz R, Maurhofer M, Dubach H, Haas D, Defago G. Fusaric acid-producing strains of Fusarium oxysporum alter 2, 4-diacetylphloroglucinol biosynthetic gene expression in Pseudomonas fluorescens CHA0 in vitro and in the rhizosphere of wheat.Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(5) ： 2229），且在寄主的整个生育期均可侵染（Zhang Z G, Zhang J Y, Wang Y C, Zheng X B. Molecular detection of Fusarium oxysporumf. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil.FEMS microbiology letters, 2005, 249(1) ： 39-47）。病害症状一旦显现，对农业生产造成巨大危害，并且病害流行速度快，造成的经济损失非常严重。目前没有杀菌剂可以安全、有效而又经济地控制这种病害（Lin Y H, Chang J Y, Liu E T, Chao C P, Huang J W, Chang P F L. Development of a molecular marker for specific detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4.European Journal of Plant Pathology, 2009, 123(3) ： 353-365）。因此，亟需一种能够在发病初期或土壤中进行早期快速检测的技术，以便及时采用有针对性的有效防治措施来控制病害的发生和传播。

尖孢镰刀菌的传统检测方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰（Daniells J, Davis D, Peterson R, Pegg K. Goldfinger ： not as resistant to sigatoka/yellow sigatoka as first thought.Infomusa, 1995, 4(1) ： 6），不能在病害潜伏期和初发期作出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制，所以传统的检测方法逐步被分子检测技术所取代。Zhang等（Zhang Z G, Zhang J Y, Wang Y C, Zheng X B. Molecular detection of Fusarium oxysporumf. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil.FEMS microbiology letters, 2005, 249(1) ： 39-47）根据ITS序列设计引物Fn-1/Fn-2对F. oxysporum f. sp. niveum进行特异性检测；Fernandez 等（Fernandez D, Ouinten M, Tantaoui A, Geiger J P, Daboussi M J,Langin T. Fot 1 insertions in the Fusarium oxysporum f. sp. albedinis genome provide diagnostic PCR targets for detection of the date palm pathogen.Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(2) ： 633）根据Fot 1 transposon序列，设计了对F. oxysporum f. sp. albedinis检测的特异性引物BIO3-FOA1/TL3-FOA28；Chen等（陈微, 文景芝,李永刚. 应用巢式 PCR 检测黄瓜尖镰孢菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumbrum).东北农业大学学报, 2007, 38(003) ： 335-338）根据ITS序列采用PCR-RFLP和nested PCR在黄瓜接种发病早期可检测出黄瓜枯萎病菌。

病原菌的鉴定研究多以ITS序列、RAPD分析等为基础开展。然而部分真菌由于种间rDNA-ITS序列相似性较高，仅以ITS区做为靶序列，不能有效地进行检测。Martinez-Culebras报道由于C. fragariae和C. loeosporioides在ITS序列上同源性很高，无法利用ITS序列来设计C. fragariae的特异性引物；张竞宇等在对Tilletia indica的检测中发现，T. indica和T. walkeri的ITS序列只相差1个碱基，无法通过ITS序列设计特异性引物将两者分开；Liang等通过对小麦矮腥黑穗病菌(T. controversa)及其近似种小麦网腥黑穗病菌(T. caries)、小麦光腥黑穗病菌(T. foetida)的rDNA-ITS序列比较发现，仅凭rDNA-ITS区难以区分这 3种病原菌；Tang等（Tang J H, Wang W, Wang Y C. Molecular Detection of Colletotrichum orbiculare [J].Scientia Agricultura Sinica, 2006, 10）通过对C. orbiculare和C. lindemuthianum 的rDNA -ITS区序列的比对发现，两者在序列上仅相差 7个碱基，不能利用特异引物将两者分开。所以，在对某些病原菌的分子检测和鉴定中，如果仅根据ITS序列做为靶目标设计引物，有可能无法将其与同属中的其它种分开。另外，RAPD存在稳定性和重复性差、共迁移等问题，在病原菌检测中受到一定限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物，利用该引物及检测方法检测尖孢镰刀菌，速度快、准确、灵敏度高、稳定可靠。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，其上游引物序列如SEQ ID No.1所述，下游引物序列如SEQ ID No.2所述。

一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物。

一种利用上述引物检测尖孢镰刀菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为699bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。

所述检测尖孢镰刀菌的方法，所述PCR反应的扩增体系为：10.0 μL SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)，0.4 μL ROX Reference Dye II (50×)，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板2 μL，用灭菌水补足体积至20μL。

所述检测尖孢镰刀菌的方法，所述PCR反应的反应程序为：95°C预变性30 s； 95°C变性5 s，65°C退火34 s，40个循环；95°C 15 s，60°C 1 min，95°C 15 s，60°C 15 s。

进一步地，为提高检测尖孢镰刀菌的灵敏度，本发明还提供另一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，包括两对引物，即：第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。

本发明还提供另一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二对引物。

本发明还提供另一种检测尖孢镰刀菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为699bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。

本发明具有以下有益效果：

核糖体转录间隔区(ITS)作为病原菌分子检测最常用的靶序列，但是部分真菌种间rDNA-ITS序列相似性较高，仅根据ITS序列做为靶目标设计引物，有可能无法将其与同属中的其它种分开，不能有效地进行检测。CYP51C基因编码甾醇14α-去甲基化酶，是生物甾醇合成过程中关键酶。其中CYP51C序列具有在真菌种间高度变异和种内稳定的特性，相比常规检测靶标ITS、β-tubulin序列更合适作为生物系统发育指标，是病原菌分子检测的新的理想靶序列。本发明分析比较了尖孢镰刀菌（F. oxysporum）与其它病原真菌的CYP51C序列，设计出对尖孢镰刀菌基因组DNA有高度特异性的一对引物，结合PCR技术，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的检测尖孢镰刀菌的分子检测技术。该检测方法可以在病害侵染初期鉴定出病原物，为枯萎病的防治提供参考。更重要的是，基于新的靶序列CYP51C建立的检测体系为其它病原菌检测新靶标的应用提供了技术指导和理论依据，也为病原菌的分子检测研究奠定了方法基础。

附图说明

图1比较分析CYP51C序列设计特异性引物C1/C2；

图2引物C1/C2特异性验证： M ：2 kb DNA marker；泳道1-45 ：各菌株基因组DNA的PCR扩增产物；泳道 46 ：阴性对照；

图3引物对基因组DNA灵敏度验证，其中： M ： 2 kb DNA marker；泳道 1-10 ：模板浓度分别为100 ng, 10 ng, 1 ng,100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg 和 100 ag基因组DNA的PCR扩增产物；泳道11：阳性对照；泳道12：阴性对照；

图4引物对分生孢子灵敏度验证，其中： M ： 2 kb DNA marker泳道1-7：模板分别为106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 个小分生孢子基因组DNA；泳道8 ：阳性对照；泳道9：阴性；

图5 发病组织中尖孢镰刀菌的检测，其中： M ： 2 kb DNA marker；泳道 1 ：阳性对照；泳道2-5 ：以发病植株粗提DNA为模板的PCR扩增产物；泳道6 ：健康植株对照。

图6荧光定量分析标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：设计、合成引物并建立尖孢镰刀菌检测试盒的PCR反应体系

一、引物设计与合成

特异性引C1/C2的设计：对GeneBank中的F. oxysporum和其它病原真菌的CYP51C序列进行比较分析(图1)，设计了一对特异性引物C1/C2，序列如下：

C1 ：5’-AAGAAGTCGAAGAATACATCGCT-3’ （SEQ ID NO.1）

C2 ：5’- CGAGGAGTGTATGAGACGGC -3’ （SEQ ID NO.2）。设计的引物重新在GeneBank中BLAST分析验证其特异性。

同时还设计一对套式PCR外引物C3/C4：根据尖孢镰刀菌的CYP51C序列，使此引物在特异性引物外侧，设计一对外引物C3/C4，序列如下：

C3：5’-GATTCATGGATCAGAAGAGGGCAAG-3’（ SEQ ID NO.13）

C4：5’-GTAGATATGGGCTGCTCACAGACTT -3’ （SEQ ID NO.4）。

二、建立常规PCR反应体系

PCR反应的混合液总体积为25 μL，包括： 10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl₂2 mmol/L， 2.5 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物(20 μmol/L) 0.25 μL， Taq DNA酶(5U/μL ) 0.25 μL ，相应浓度的模板DNA，用灭菌水补足体积。所有试剂均购于TaKaRa公司。在TaKaRaPCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序为：94°C预变性5 min；94°C变性30 s，65°C退火30 s，72°C延伸1 min，共35个循环；72°C延伸10 min。取5 μL扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳(电压5 V/cm)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为699bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。

所有试剂均购于TaKaRa公司。

三、建立套式PCR反应体系

为提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以C3/C4为第一轮反应引物，反应体系和反应程序同上述PCR常规体系。取1 μL 第一轮PCR反应产物为模板进行第二轮 PCR 扩增，反应体系和反应程序同上述PCR常规体。所有试剂均购于TaKaRa公司。取5 μL扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳(电压5 V/cm)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为699bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。

四、荧光定量PCR反应

为了对田间土壤样品病原菌进行定量检测，本发明进一步建立了实时定量PCR检测体系。反应混合液总体积为20 μL：10.0 μL SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)，0.4 μL ROX Reference Dye II (50×)，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板2 μL，用灭菌水补足体积。优化后的反应程序为：95°C预变性30 s； 95°C变性5 s，65°C退火34 s，40个循环；95°C 15 s，60°C 1 min，95°C 15 s，60°C 15 s。荧光定量PCR仪器为7500 Real-Time PCR System。

实施例2：制备DNA模板

提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下：

1．菌丝体的收集及DNA提取

将供试疫霉菌菌株转至V8固体培养基平板，其它菌株转至PDA平板上，25°C黑暗培养3 d后从菌落边缘切取10块2 mm×2 mm菌落块，疫霉菌菌株转至番茄汁液体培养基，其它转至PDB中，25°C振荡培养7天，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成菌丝粉，-20°C保存备用。

取少量菌丝粉置于1.5 mL的Eppendorf管中，加900 μL 2% CTAB提取液，90 μL 10% SDS，漩涡混匀，于60°C水浴1 h，期间每10 min上下颠倒几次。12,000 g离心10 min，取上清，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25 ：24 ：1)，颠倒混匀，12,000 g离心10 min，将上清液移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12,000 g离心5 min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc (pH 5.2)，-20°C沉淀 (>1 h)。12,000 g离心10 min，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE (pH 8.0)溶解沉淀 (含20 μg/mL RNase)，37°C处理1 h，利用紫外分光光度计测量OD₂₆₀值，-20°C保存备用。

2．分生孢子的收集及其DNA提取

用10 mL灭菌水反复冲洗接种F. oxysporum黑暗培养10 d的平板表面的分生孢子(该条件下F. oxysporum仅产生小型分生孢子)，孢子通过4层纱布过滤，除去菌丝，用血球计数板测分生孢子浓度。取100 μL孢子悬浮液置于Eppendorf管中，冷冻抽干后按从提取菌丝体中提取基因组DNA的方法提取，将其浓度定为10⁶个孢子/μL DNA，并按10倍稀释到1个孢子/μL，分别以1 μL各浓度的DNA为模板进行PCR扩增。

3．土壤中病原菌DNA的提取

将8×10⁷个孢子与1 g灭菌土混匀，然后将土壤样品冷冻抽干24 h，用液氮研磨成粉末状，分装到1.5 mL的Eppendorf管中。用FastDNA

SPIN KIT for Soil (MPBio，土壤基因组DNA提取试剂盒)提取土壤基因组DNA，将终产物以80 μL灭菌水溶解，即DNA浓度为10⁶个孢子/μL，按10倍稀释到1个孢子/μL，分别以1 μL各浓度的DNA为模板进行PCR扩增。

4．发病组织中病原菌DNA的提取

取一段新发病的植株组织, 每毫克组织加入10 μL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5 mL的Eppendorf管中，12,000 g离心5 min ，取5 μL上清液加入495 μL 0.1 mmol /L Tris (pH 8.0) ，混匀后取1 μL直接用于PCR反应。为确定植株中无PCR抑制物存在，用本方法提取健康植株组织DNA作为空白对照。

下面用上述实施例1检测引物及方法和实施例2制备的模板进行尖孢镰刀菌的检测。

实施例3：检测引物的特异性和灵敏度

一、特异性检测

采用本发明所设计的特异性引物C1/C2对所有供试菌株基因组DNA进行PCR扩增，仅能从F. oxysporum菌株中特异性地扩增出一条699 bp左右的条带，而其它供试菌株及空白对照均无扩增条带(图2)。结果表明，所设计的引物具有种的特异性，能够区别F. oxysporum与其它病原真菌。

表1：本实施例中用于筛选引物特异性的菌株

菌株	寄主	菌株数目	用C1/C2引物扩增的结果
				F. oxysporum f. sp. niveum	Citrullus lanatus	1	+
F. oxysporum f. sp. Cucumerinum	Cucumis sativus	1	+
				F. oxysporum f. sp. cubense	Musa paradisiaca	1	+
F. oxysporum f. sp. Lycoersici	Solanum lycopersicum	1	+
				F. oxysporum f. sp. melon	Cucumis melo	1	+
F. oxysporum f. sp. Momdicae	Momordica charantia	1	+
				F. oxysporum f. sp. Vasinfectum	Capsicum annuum Linn	1	+
F. solani	Unknown	1	–
				F. equiseti	Unknown	1	–
F. proliferatum	Glycine max	1	–
				F. moniforme	Oryza stiva	1	–
F. culmorum	Unknown	1	–
				F. nivale	Triticuma estivum	1	–
F. avenaceum	Unknown	1	–
				F. graminerum	Triticuma estivum	1	–
Verticillium dahliae	Unknown	1	–
				Mycosphaerella melonis	Unknown	1	–
Alternaria alternata	Nicotiana tabacum	1	–
				Botrytis cinerea	Vitis vinifera	4	–
Colletotrichum truncatum	Glycine max	5	–
				Peronophythora litchi	Litchi chinensis	1	–
Pythium	Unknown	1	–
				Cryphonectria parasitica	Unknown	1	–
Magnaporthe oryzae	Oryza sativa	1	–
				Phytophthora lateralis	Chamaecyparis lawsoniana	1	–
P. boehmeriae	Gossypium hirsutum	1	–
				P. cryptogea	Lycopersicon esculentum	1	–
P. parasitica	Nicotiana tabacum	1	–
				P. palmivora	Trachycarpus fortunei	1	–
P. melonis	Benincasa hispida	1	–
				P. medicaginis	Medicago sativa	1	–
P. cambivora	Castanea mollissima	1	–
				P. drechsleri	Beta vulgaris var. altissima	1	–
P. fragariae	Fragaria × ananassa	1	–
				P. megasperma	Unknown	1	–
P. hibernalis	Citrus reticulata Banco	1	–
				P. sojae	Glycine max	1	–
P. capsici	Capsicum annuum Linn	1	–
				P. infestans	Unknown	1	–

上表中：+表示具有引物C1/C2的特异性扩增条带，长度为699 bp；-表示无扩增产物。

二、灵敏度检测

在25 μL的反应体系中测定了上述所建立的检测体系的灵敏度。引物C1/C2可稳定地从至少100 ng的基因组模板中扩增得到699 bp的特异性条带(图3A)。而以引物C3/C4对F. oxysporum菌株不同浓度的基因组DNA进行PCR扩增的产物为模板，再使用特异性引物C1/C2进行第二轮套式PCR扩增，可稳定地检测到1 pg的基因组DNA，使检测灵敏度提高了10⁵倍(图 3B )。

实施例4：检测各类样品的病原菌DNA

1．土壤中病原菌的检测

对F. oxysporum的分生孢子进行灵敏度检测，在25 μL的普通PCR反应体系中检测不到水中分生孢子存在(图4A)，在1 g土中可检测到10⁴个分生孢子(图4B)；而在25 μL的巢式PCR反应体系中可检测到水中100个分生孢子(图4C)，在1 g土中可检测到1个分生孢子(图4D)，效率分别提高了10²倍和10⁴倍。

2．发病组织检测

从人工接种的植物上剪取发病组织，提取DNA进行PCR扩增，发病样品均扩增出了699 bp的特异性条带 (图 5) ，而健康植株扩增不出该条带。说明该套技术能够用于植物病组织中尖孢镰刀菌的快速分子检测。

3．基因组DNA实时定量PCR

本发明建立了F. oxysporum的实时定量PCR检测体系，可以对土壤和致病植物中病原菌精确定量，这对制定防治策略及防治时机极为重要。用引物C1/C2对F. oxysporum基因组DNA的10倍梯度稀释液进行 SYBR Green I PCR扩增。结果表明，该体系的检测下限为1 pg/μL基因组DNA。F. oxysporum基因组DNA的SYBR Green I PCR标准曲线显示：DNA量(pg)的对数(x)和对应的Ct值 (y)之间呈线性关系：Y=–3.58x+31.65 R²=0.97(图6)。

<110> 南京农业大学

<120>尖孢镰刀菌的分子检测方法及其引物

<160> 4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 1

AAGAAGTCGA AGAATACATC GCT 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 2

CGAGGAGTGT ATGAGACGGC 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 3

GATTCATGGA TCAGAAGAGG GCAAG 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 4

GTAGATATGG GCTGCTCACA GACTT 25

Claims

1.一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，其特征在于：其上游引物序列如SEQ ID No.1所述，下游引物序列如SEQ ID No.2所述。

2.一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的引物。

3. 一种尖孢镰刀菌的分子检测方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为699 bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。

4.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于：所述PCR反应的扩增体系为：10.0 μL SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)，0.4 μL ROX Reference Dye II (50×)，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板2 μL，用灭菌水补足体积到20μL。

5.根据权利要求4所述的分子检测方法，其特征在于：所述PCR反应的反应程序为：95°C预变性30 s； 95°C变性5 s，65°C退火34 s，40个循环；95°C 15 s，60°C 1 min，95°C 15 s，60°C 15 s。

6. 一种用于检测尖孢镰刀菌的引物，其特征在于：包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。

7.一种检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求4所述的引物。

8.一种利用权利要求6所述的引物检测尖孢镰刀菌的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求6所述的引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为699 bp的DNA条带，则证明所检样品中含有尖孢镰刀菌。