CN101921832A - 用于检测致病疫霉的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测致病疫霉的引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测致病疫霉准确性高、特异性强、灵敏性高，本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，同时能够对田间土壤中的病原物进行检测，本发明对马铃薯和番茄的晚疫病防治具有重要意义。同时本发明对于减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

Description

用于检测致病疫霉的引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种致病疫霉的检测引物、包含该引物的检测试剂盒以及检测方式，属于生物技术领域。

背景技术

由致病疫霉(Pyhtophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病是世界马铃薯和番茄生产上毁灭性病害之一。在温度适宜病害发生的条件下，该病害可导致作物大幅减产甚至绝收。传统的检测植物病害的方法包括直接观察植物组织的发病症状或者分离得到病原物后再进行形态学鉴定。然而直接观察会遗漏发病初期未表现出症状的情况，而且由疫霉菌引起的病害很容易与Pythium spp.，Fusarium spp.和Rhizoctonia spp.引起的病害症状相混淆。因此，对于疫霉菌诊断来说，分离得到病原菌的纯培养是非常有必要的。但是，疫霉菌的分离一直比较困难，特别是对于致病疫霉的分离，更是对分离技术提出了较高要求。同时，疫霉菌的鉴定工作也比较困难，因为可以用于鉴定的形态学特征的数目很少，且容易受到环境因素的影响，使得许多疫霉种的鉴定出现了错误。分子检测的出现为植物病害的快速、准确诊断提供了新的思路和方法。近年来，基于PCR的植物病原菌分子检测技术在植物病害防治中起着越来越重要的作用。转录间隔区(ITS)是通常用来作为植物病原菌分子检测的主要靶标之一。但是越来越多的研究发现，部分疫霉菌的ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将这部分疫霉菌与其近缘种区分开。除ITS序列之外，线粒体基因Cox1-Cox2和可能编码储存蛋白的Lpv基因也分别被用来作为少数疫霉菌的分子检测靶标。但是Lpv基因在除了隐地疫霉之外的其他疫霉中的研究比较少，不像ITS序列那样几乎所有的疫霉种都可以从GenBank中获取其序列。而线粒体基因在不同疫霉种间变异较小，且GC含量比较高，有些甚至达到了89％，并不适合用来作为多数疫霉种的分子检测靶标。因此，发掘新的分子检测靶标，对于完善植物病原菌分子检测体系及提高我国植物病害管理水平具有重要意义。

近年来，随着疫霉菌基因组学的迅速发展，越来越多的新靶标被用于疫霉菌的分子检测。在新发现的靶标中，Ypt1因其自身特点，被认为是一个非常适合作为疫霉菌分子检测靶标的基因。Ypt1是一个Ras相关基因，在酵母中，该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。Ypt1基因包含多个内含子，其基因序列保守区和进化区相互间隔，这一特点使得该基因适合作为分子检测的靶标。Schena等分析了29个疫霉种43个菌株的Ypt1基因的序列，认为Ypt1基因可以作为疫霉菌分子检测的靶标基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测致病疫霉的引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测致病疫霉准确性高、特异性强、灵敏性高。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测致病疫霉的引物，即PiF/PiR，其为致病疫霉的特异性引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQID No.2所述。

一种检测致病疫霉的试剂盒，包含所述的特异性引物。

上述的试剂盒，还包含4种dNTP，10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，1％BSA和Taq酶。

一种利用上述的引物检测致病疫霉的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的特异性引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

为提高检测的灵敏度，本发明还提供了另一种用于检测致病疫霉的引物，其包括两对引物，第一对引物即：PiF/PiR，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物为疫霉菌Ypt1基因通用引物，即：Yph1F/Yph1R，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。

本发明还提供另一种检测致病疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二对引物。

上述的试剂盒，还包含4种dNT，10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，1％BSA，吐温-20和Taq酶。

本发明还提供另一种检测致病疫霉的方法，其具体过程是：提取待测样品的DNA，利用所述的两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物(Yph1F/Yph1R)，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物(PiF/PiR)，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

本发明还提供了利用所述引物建立的常规PC反应体系。PCR反应的总体系为25μl，包括：相应浓度的模板DNA，0.5μM引物，4种dNTP各50μM，2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，2.5μl 1％BSA，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后取8μl扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

为了提高检测灵敏度，本发明进一步建立了套式PCR反应体系。以疫霉菌Ypt1基因通用引物Yph1F/Yph1R作为第一轮反应引物与特异引物PiF/PiR分别组合进行套式PCR。第一轮PCR反应的混合液总体积为25μl，包括：0.5μM引物，4种dNTP各50μM，2.5μl10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，2.5μl 1％BSA，0.5μl吐温-20，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，模板DNA若干，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。取1μl第一轮PCR反应产物作为模板进行第二轮反应，反应体系和反应程序同1.7.2中所述。反应结束后取8μl扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

本发明的具有如下优点：

本发明以P.infestans为研究对象，分析了P.infestans和其它疫霉种在Ypt1基因序列上的差别，设计了一对用以检测P.infestans的特异引物，以对Ypf1基因作为疫霉菌分子检测靶标的可行性做进一步研究。并在该特异引物基础上建立了P.infestans的普通PCR检测体系和套式PCR检测体系。利用本发明引物检测致病疫霉时，准确性高、特异性强、灵敏度高。利用本发明特异引物PiF/PiR进行普通PCR扩增时，在25μl的反应体系中可以检测到100pg的基因组DNA。因为Ypt1基因既有种间丰富变异的区域，又有保守区域，本发明通过设计疫霉属通用引物作为第一轮PCR的引物来进行套式PCR扩增提高检测灵敏度。本发明通过套式PCR，特异引物PiF/PiR可以检测到10pg的基因组DNA。在游动孢子检测的反应中，通过套式PCR，特异引物PiF/PiR可以检测到3个游动孢子。在检测卵孢子的反应中，通过套式PCR，特异引物PiF/PiR可以检测到1个卵孢子。因此，本发明设计的特异引物PiF/PiR具有更高的游动孢子和卵孢子检测灵敏度。

病田土壤样品的检测结果证明，本发明的特异引物能从含有目的病原菌的土壤中扩增出目的条带，而作为对照健康的土壤则不能扩增出条带。在土壤中，成功的PCR检测依赖于能够高效地从样品中提取到靶标病原物的DNA且尽可能避免混入土壤中的抑制物^[29]。通过使用

SPIN这一商用土壤微生物DNA提取试剂盒可以在0.5小时内提取到土壤中微生物的DNA，且PCR扩增的结果具有很好的可重复性，说明了本研究建立的这套采用套式PCR检测土壤中病原物的方法具备可行性。

在对发病植株进行检测时，使用本发明的特异引物结合简单的DNA提取方法进行PCR扩增，两小时之内就可以判断植物是否被病原菌侵染。从植物组织中提取的用于PCR扩增的DNA除了病原菌的DNA还有植物自身的DNA，为了使PCR扩增的结果更具可靠性，本发明还检验了植物组织DNA是否对PCR扩增产生影响。结果证实，植物组织DNA对于靶标DNA的扩增没有影响。

在本发明中，土壤中的病原物需要使用套式PCR检测，而感病植物组织中的病原物仅需单轮PCR就可以检测到。

本发明根据P.infestans Ypt1基因的序列提供了检测致病疫霉的引物、试剂盒和方法，具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，同时能够对田间土壤中的病原物进行检测，本发明对马铃薯和番茄的晚疫病防治具有重要意义。同时本发明对于减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

附图说明

图1.特异性引物PiF/PiR的PCR扩增电泳图，其中，M为2000bp DNA marker；1-12为Phytophthora infestans菌株；16-23为其他疫霉菌菌株和其他真菌菌株；24为阴性对照。

图2.引物PiF/PiR进行PCR检测P.infestans基因组DNA的灵敏度电泳图，其中，M为2000bp DNA marker；泳道1-8为25μl的反应体系中分别含有20ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fgDNA的扩增结果；9为阴性对照。

图2b采用Yph1F/Yph2R为第一轮PCR的引物，PiF/PiR为第二轮PCR的引物进行套式PCR检测P.infestans基因组DNA的灵敏度电泳图，其中，M为2000bp DNA marker；泳道1-8为25μl的反应体系中分别含有20ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg DNA的扩增结果；9为阴性对照。

图3为引物PiF/PiR检测P.infestans游动孢子的灵敏度电泳图，其中，M为2000bp DNAmarker；1-10为25μl的反应体系中分别加入10μl、9μl、8μl、7μl、6μl、5μl、4μl、3μl、2μl、1μl游动孢子粗提液的扩增结果；11为阳性对照；12为阴性对照。

图4为引物PiF/PiR检测P.infestans卵孢子的灵敏度电泳图，其中，M为2000bp DNAmarker；1为阳性对照；2-11为25μl的反应体系中分别加入10μl、9μl、8μl、7μl、6μl、5μl、4μl、3μl、2μl、1μl卵孢子粗提液的扩增结果；12为阴性对照。

图5为发病马铃薯组织中病原物的PCR检测电泳图，其中，M为2000bp DNA marker；1为阳性对照；2-5为感病马铃薯中病原物的扩增结果；6为提取健康马铃薯组织DNA的扩增结果；7为阴性对照。

图6为马铃薯晚疫病田土壤中套式PCR检测电泳图，其中，M，2000bp DNA marker；1为阳性对照；2-6为发病田土壤中病原物的扩增结果；7为提取无病田土壤DNA的扩增结果；8为阴性对照。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：设计、合成引物并建立致病疫霉检测试盒的PCR反应体系

一、引物设计与合成

从GenBank中下载P.infestans的Ypt1基因的部分序列(登录号：DQ162961)，与GenBank登录的30余种疫霉菌序列进行比较。通过比较，依据致病疫霉的特有片段设计引物PiF/PiR：

PiF：5′-GACTTTGTGAGTGTCTAACATA-3′(SEQ ID NO.1)；

PiR：5′-CAAGACGAGCGCACCTATCG-3′(SEQ ID NO.2)。

同时，还设计了疫霉属的Ypt1通用引物Yph1F/Yph1R作为套式PCR的一轮反应引物：

Yph1F(20bp)：5′-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3′(SEQ ID NO.3)；

Yph1R(20bp)：5′-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3′(SEQ ID NO.4)。

所有引物委托Invitrogen公司合成。

二、建立常规PCR反应体系

常规PCR反应的总体系为25μl，包括：相应浓度的模板DNA，0.5μM PiF/PiR引物，4种dNTP各50μM，2.5μl10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，2.5μl 1％BSA，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后取8μl扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

三、建立套式PCR反应体系

为了提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以疫霉菌Ypt1基因通用引物Yph1F/Yph1R作为第一轮反应引物与特异引物PiF/PiR分别组合进行套式PCR。第一轮PCR反应的混合液总体积为25μl，包括：0.5μM引物，4种dNTP各50μM，2.5μl10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，2.5μl 1％BSA，0.5μl吐温-20，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，模板DNA若干，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。取1μl第一轮PCR反应产物作为模板进行第二轮反应，反应体系和反应程序同上述的常规PCR反应所述。反应结束后取8μl扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

实施例2：制备DNA模板

提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下：

一、菌丝粉DNA的抽提

参考Sambrook等方法稍加改进。取少量菌丝粉，加900μl 2％CTAB提取液和90μl10％SDS，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(＞1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/ml RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。

二、发病马铃薯组织DNA的抽提

参考Wang等NaOH法并稍加改进。取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μl 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的EP管中，12000rpm离心5min，取5μl上清液加入495μl 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μl直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次。

三、土壤中DNA的提取

2008年04月在南京下马坊马铃薯地的发病田块中从0～10cm的深度分别采集3个土样，将每个土样晾干碾碎，然后分别称取0.5g土样，采用

SPIN试剂盒(Q-Biogene Ltd，USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。用作对照的土样采自没有种植过马铃薯的健康黄瓜地。

四、游动孢子悬浮液的制备和DNA的提取

参考郑小波方法诱导大豆疫霉释放游动孢子，滤去菌丝块，得到游动孢子悬浮液。在显微镜下对悬浮液中游动孢子的数目进行计数，将游动孢子的浓度调整为1000/μl。将游动孢子悬浮液加入到1.5ml的eppendorf(EP)管中，12000g离心10min，弃上清液，取沉淀物，然后按菌丝粉DNA的抽提方法提取DNA。将提取的DNA用灭菌超纯水溶解，-20℃保存备用。

五、卵孢子悬浮液的制备和DNA的提取

将含有卵孢子的培养基转移到灭菌容器中，加水100ml左右(视容器大小而定)，5000转/分匀浆2分钟，以破碎培养基并使卵孢子与菌丝和琼脂脱离。匀浆液依次经200、300、600目筛网过滤，用水反复冲洗各目筛网，最后用少量灭菌水洗下600目筛网上收集到的卵孢子，制备成卵孢子悬浮液。在显微镜下对悬浮液中卵孢子的数目进行计数，将卵孢子和厚垣孢子的浓度调整为100个/μl，用

试剂盒(Q-Biogene Ltd，USA)提取DNA，提取步骤参见试剂盒说明书。

下面用上述实施例1检测引物、试剂盒及方法和实施例2制备的模板进行大豆疫霉的检测。

实施例3：检测引物的特异性和灵敏度

一、特异性检测

采用本发明致病疫霉的特异引物对表1中致病疫霉菌株和其它疫霉及真菌菌株进行了PCR扩增，结果在所有的供试菌株中，只有致病疫霉可以扩增出分子量为369bp的特异性片段(请参见图1)，表明该引物具有很好的特异性。

表1.用于检测引物(PiF/PiR)特异性分析的真菌和卵菌

上表中：+表示具有引物Yph1F/1R或PiF/PiR的特异性扩增条带；-表示无扩增产物。

二、灵敏度检测

在25μl的反应体系中含有100pg的基因组DNA时引物PiF和PiR仍然可以稳定地扩增得到369bp的特异性条带(请参见图2a)。以疫霉属菌Ypt1基因通用引物Yph1F/Yph1R对不同浓度的基因组DNA进行PCR扩增的产物为模板，再使用特异性引物PiF/PiR进行第二轮PCR扩增。结果套式PCR反应可以使检测灵敏度提高100倍，在25μl的反应体系中能够检测到含有10pg的基因组DNA(请参见图2b)

实施例4：检测各类样品的病原体DNA

一、在含有游动孢子的PCR反应体系中，通过套式PCR，PiF/PiR对灭菌水中游动孢子的检测灵敏度可达3个游动孢子(请参见图3)

二、在含有卵孢子的PCR反应体系中，通过套式PCR，PiF/PiR对卵孢子的检测灵敏度可达1个卵孢子(请参见图4)

三、发病植物组织中病原物的快速检测

5个感病的马铃薯样品均扩增出了369bp的条带(请参见图5)，而作为对照的健康马铃薯样品未扩增出条带。同时采用传统分离方法均能从这5个感病样品中分离到P.nfestans，而健康的马铃薯组织不能分离到P.infestans，表明NaOH法提取的DNA及特异引物PiF/PiR可用于发病马铃薯植株的快速PCR检测。

四、病田土壤中病原物的检测

采用套式PCR检测取自发病田块的土壤，4份土样均扩增到了369bp大小的特异性片段，而采自健康田块的土壤未扩增出条带(请参见图6)，表明采自下马坊的土样中含有P.infestans。同时也证明该特异引物可以用于病田土壤中病原物的检测。

核苷酸序列表

<110>南京农业大学

<120>用于检测致病疫霉的引物、试剂盒及检测方法

<160>4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>1

GACTTTGTGA GTGTCTAACA TA    22

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>2

CAAGACGAGC GCACCTATCG        20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>3

CGACCATTGG CGTGGACTTT        20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>4

ACGTTCTCGC AGGCGTATCT        20

Claims (10)

1.一种用于检测致病疫霉的引物，其特征在于：其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。

2.一种检测致病疫霉的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包含4种dNTP，10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，1％BSA和Taq酶。

4.一种利用权利要求2或3所述的试剂盒检测致病疫霉的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。

6.一种用于检测致病疫霉的引物，其特征在于：包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。

7.一种检测致病疫霉的试剂盒，其特征在于：包含权利要求6所述的引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：还包含4种dNT，10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，1％BSA，吐温-20和Taq酶。

9.一种利用权利要求6所述的引物检测致病疫霉的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求5所述的引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。

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