CN108950055A

CN108950055A - 一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108950055A
Application number: CN201810996678.8A
Authority: CN
Inventors: 宋振巧; 金花; 林彩彩; 冯园园; 周昌浩
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-08-29
Also published as: CN108950055B

Abstract

本发明提供了一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记。利用分子标记SmJBZ1F/1R对待测丹参的基因组DNA进行PCR扩增；PCR扩增产物电泳分析，紫花丹参扩增出大小为868bp的片段，而白花丹参无扩增产物，该发明可以对丹参中的白花和紫花种类进行有效、快速、可靠的鉴定，为丹参种质资源鉴定提供了重要手段。

Description

一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记及其应用。

背景技术

丹参，为唇形科植物（Salvia miltiorrhiza Bge）的干燥根和根茎。全国大部分地区都有分布。具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，瘕瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。现代医学研究丹参对心血管系统的作用表现为：加强心肌收缩力、改善心脏功能，不增加心肌耗氧量；对血管作用，扩张冠脉，增加心肌血流量；扩张外周血管，血流增加；脑血流量下降；抗血栓形成提高纤溶酶活性；抑制血小板聚集（提高血小板内cAMP水平抑制TXA2合成）；改善血液流变学特性（血粘度降低、红细胞电泳时间缩短）；改善微循环。还能促进组织的修复与再生，丹参制剂治疗，坏死心肌清除快；纤维母细胞分化、胶原纤维形成较明显；肉芽形成比较成熟。局部淤血减轻、血液循环改善，愈合时间缩短。对过度增生的纤维母细胞有抑制作用。改善肝微循环。抗菌丹参制剂中含有隐丹参酮、二氢丹参酮，对体外的葡萄球菌、大肠杆菌、变性杆菌有抑制作用。

白花丹参为优异丹参变型，具有非常高的药用价值。现在主要产于山东泰山周围，系山东特有的道地药材，经现代研究证明，白花丹参中含有二类活性成分：脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类化合物。二萜醌类化合物, 如丹参酮I, 丹参酮IIA，隐丹参酮等，具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动脉供血等药理作用, 是治疗心血管系统疾病的重要药物；酚酸类化合物, 如丹酚酸A, 丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原儿茶醛、丹参素等, 具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒症、改善肾功能等作用。两类物质都是颇有价值的药用资源，均蕴藏着巨大的市场潜力。其中有效成份含量丹参素达1.9%、丹参酮IIA达0.54%、丹酚酸B达6.5%，分别是标准规定(一般品种紫花丹参)的1.9、2.7、2.2倍。另外，白花丹参中铁、镁、锰等5种微量元素也高于紫花丹参，而且比紫花丹参多出两种化合物即四氢丹参醌和丹参醛。因此，白花丹参具有重要的医药和经济价值。

白花丹参和紫花丹参的鉴别主要是传统花色鉴定，其他方法鉴定比较困难，本课题组已经研发出利用同工酶进行鉴别的方法，但分子标记的鉴别更加快捷准确，至今没有公开分子标记的鉴定方法。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记，可以很好的鉴别白花丹参和紫花丹参。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记，包括以下步骤：

ST1 选取丹参品系的幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA；

ST2 PCR扩增，引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

ST3 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

ST4 对扩增产物进行检测，扩增出大小为868bp的片段为紫花丹参，无扩增产物的为白花丹参。

优选的，步骤ST4中所述对扩增产物进行检测，为利用凝胶成像系统观察，扩增出大小为868bp的片段为紫花丹参，无扩增产物的为白花丹参。

优选的，步骤ST4中所述对扩增产物进行检测，回收两种丹参不同的条带产物，进行测序，扩增出大小为868bp的片段为紫花丹参，无扩增产物的为白花丹参。

所述分子标记可在鉴别白花丹参和紫花丹参种质资源、中药中应用。

本发明的有益效果是：本发明提了一种新颖的鉴别方法，利用SmJBZ1F/1R对待测丹参的基因组DNA进行PCR扩增；PCR 扩增产物电泳分析，紫花丹参扩增出大小为868bp的片段，而白花丹参无扩增产物，本发明可以对丹参中的白花和紫花种类进行有效、快速、可靠的鉴定，为丹参种质资源鉴定提供了重要手段。

附图说明

图1为利用分子标记进行的10个白花丹参嫩叶混合和10个紫花丹参嫩叶混合的扩增产物检测结果；

其中：M为2000标准分子量，CK为不加模板DNA 的PCR扩增即阴性对照；ZH为紫花丹参；BH为白花丹参。

图2为扩增产物序列，其中引物位置和序列用下划线标出。

图3为利用分子标记进行的8个白花丹参嫩叶（单独株系）和10个紫花丹参嫩叶（单独株系或品系）的扩增产物检测结果；其中：M为2000标准分子量，CK为不加模板DNA 的PCR扩增即阴性对照；ZH为紫花丹参，10个泳道从左向右分别为山农丹参1号、山农丹参2号、ZH74、其它紫花品系7个（编号为ZH-1，至ZH-7）；BH为白花丹参，八个泳道从左向右分别为白花丹参8个不同基因型品系（编号为BH-1，至BH-10）。

具体实施方式

实施例1 白花丹参和紫花丹参分子标记鉴别方法的建立

No.1 材料与方法

No.1.1 材料

紫花丹参包括山农丹参1号、山农丹参2号、ZH74、其它紫花品系7个（编号为ZH-1，至ZH-7）；白花丹参不同基因型品系8株（编号为BH-1，至BH-8）。

No.1.2 方法

选取白花丹参品系单株的幼嫩叶片，混合，采用CTAB法提取DNA。

选取紫花丹参品系单株的幼嫩叶片，混合，采用CTAB法提取DNA。

PCR扩增：

引物序列为：

SmJBZ1F（SEQ ID NO.1）: TACTTTCATTTCATAAACTTCATC

SmJBZ1R（SEQ ID NO.2）: TGTCCTAACGATAGGTGGT

配制PCR体系，利用鉴定引物JBZ1R/1F进行扩增，反应体系20μl，每对引物一个对照，每个样品重复两次；

扩增反应在BIO-RAD型基因扩增仪上进行。PCR 20μL的反应体系中，上下游引物各1μLTaq PCR Master Mix 10μL；用ddH2O 补足20μL；；DNA（30ng/μL）1μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸50s，35个循环，72 ℃延伸5 min。EST-SSR反应程序为94 ℃预变性4 min，循环（94 ℃变性40 s、55℃退火40 s、72 ℃延伸1min ）35个循环，最后72 ℃延伸7 min。

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳（1×TAE，120V，时间20min），利用凝胶成像系统观察。

产物回收后，送上海生物生物工程公司进行测序。

No.2 结果与分析

结果发现本引物能够在紫花丹参中扩增出单一的、清晰的、明亮的条带（图1），片段大小在850bp左右。该基因型扩增结果与对应材料的花色类型一致，与传统方法鉴定的紫花和白花一致。证明开发的标记能够有效的进行白花丹参和紫花丹参的鉴定。

经测序结果显示该片段868bp，测序结果见图2。

实施例2 白花丹参和紫花丹参分子标记鉴别方法的验证

材料和方法同实施例1，按照白花丹参和紫花丹参单一株系或品系提取DNA，分别进行电泳，得到实验结果见图3。

实验结果表明，所有的紫花丹参中扩增出单一的868bp条带，而白花丹参没有这个条带。紫花丹参其中左数第1、2、5条带清晰度稍差，但仍能分辨。

本实验结果验证了利用本发明提供的分子标记可以鉴别白花丹参和紫花丹参。

以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tactttcatt tcataaactt catc 24

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtcctaacg ataggtggt 19

<210> 3

<211> 868

<212> DNA

<213> 丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)

<400> 3

tactttcatt tcataaactt catctacaat tttctaacaa aaaagaaaaa acaaatggtt 60

gctacaccgg ctccaactcc aagcccgcgg gttgaggaac tggcccgaag cgggctcgac 120

accatcccca aagactacgt acggcccgaa gaagagctca aaagcatccg cgacattttc 180

gcggaagaga aaagcatcct cgacgggccg cagctgccga cgatcgatct ggaggagatc 240

gactcgagcg acgaggagac gcggcggaag tgctacgacg aggtgaagaa ggcggcgatg 300

gattgggggg tgatgcatct gatcaaccac gggatacctg aggagctcac gagccgtgtg 360

aaggcggccg ggaaggagtt cttcgagctg ccggtggagg agaaggagaa gtacgccaac 420

gagcaggcgg ccggcaacgt gcagggctat ggaagcaagc tcgctaacaa cgccagtggg 480

cagctcgagt gggaggacta ttttttccat tgtgtgctgc cggaggagaa gagggacttg 540

tctatttggc ccaagcaccc agctgattat atgtaagtca cactactgca attttgtact 600

attatgttat ttggattcat tttttcttct tagattcttg atgtgtatat atatataaga 660

ttgtattgca aagtctgcaa tcctcccgta aagtatatat tacgaatttt tattgaatga 720

tgaattcatt gtgaaaagta atgaataaca aaaaaattga aattttccgt cctcatagga 780

ttcgaaccta ggatcaaaaa tgatgaatac accgtaactg aaatctagga ccttagacct 840

tgagaattaa ccacctatcg ttaggaca 868

Claims

1.一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记，其特征在于，包括以下步骤：

ST1 选取丹参品系的幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA；

ST2 PCR扩增，引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

ST3 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

2.根据权利要求1所述的一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记，其特征在于，步骤ST4中所述对扩增产物进行检测，为利用凝胶成像系统观察，扩增出大小为868bp的片段为紫花丹参，无扩增产物的为白花丹参。

3.根据权利要求1所述的一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记，其特征在于，步骤ST4中所述对扩增产物进行检测，回收两种丹参不同的条带产物，进行测序，扩增出大小为868bp的片段为紫花丹参，无扩增产物的为白花丹参。

4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的一种鉴别白花丹参和紫花丹参的分子标记，其特征在于，所述分子标记在鉴别白花丹参和紫花丹参种质资源、中药材中的应用。