CN107385074B - 基于kasp技术用于水稻特殊营养物质基因分型的引物及应用 - Google Patents

基于kasp技术用于水稻特殊营养物质基因分型的引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一套基于KASP技术开发的用于水稻特殊营养物质基因分型的引物，所述水稻特殊营养物质基因包括LOC_Os01g53380、LOC_Os02g28340、LOC_Os04g56910、LOC_Os09g37200、LOC_Os10g01080、LOC_Os10g17990和LOC_Os12g13800中的至少一种，它们的KASP引物序列分别如SEQ ID NO:1‑21所示。利用本发明提供的整套KASP功能标记及其引物组合能够快速检测水稻种质中营养物质基因功能等位基因和不同基因有利单倍型的组合方式，检测结果准确可靠，操作简单，成本低。本发明方法能够实现水稻育种材料特殊营养品质功能基因的检测，解决营养物质测定复杂、困难等问题，为水稻富含营养物质新品种选育、改良提供科学指导。

Description

基于KASP技术用于水稻特殊营养物质基因分型的引物及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及作物遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种基于KASP技术开发的用于水稻特殊营养物质基因分型的引物及其应用。
背景技术
芹菜素(Apigenin)属于黄酮类化合物，具有抑制致癌物质的致癌活性。研究显示,芹菜素可抑制多种肿瘤细胞的生长，如乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、胸腺癌、膀胱癌及白血病细胞等，与其他黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比，具有低毒、无诱变性等特点，因此对于芹菜素生物活性的研究受到了广泛的关注(Czeczot et al.1990；Zhu et al.2013)。
麦黄酮(Tricin)，又称小麦黄素，苜蓿素，黄酮类化合物，是重要的天然活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤作用(国家医药管理局中草药情报中心，1986)。
阿魏酸(Ferulic Acid)又名4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一，具有多方面的生物活性，如抗血小板聚集，促进血小板解聚，抗血栓、抗氧化、抗菌消炎，增强免疫功能等(马逢时等，2008)。
维生素B6又称吡哆素(Pyridoxine)，包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，常被用于预防和治疗维生素B6缺乏症，如动脉硬化、胆固醇过高、低血糖症、精神障碍、神经障碍，也可用于妊娠恶心和呕吐、手足综合征、认知障碍、自闭症和经前期综合征等疾病(陈敏等，2016)。一般而言，人与动物的肠道中微生物(细菌)，可合成维生素B6，但其量甚微，需要从食物中补充。
绿原酸类物质又名咖啡鞣酸(Chlorogenic acid)，属酚类化合物，是植物体在有氧呼吸过程中由肉桂酸和奎宁酸经莽草酸途径形成的一种苯丙素类物质。绿原酸类物质为众多药材(如金银花、茵陈、杜仲)以及中成药(如复肝宁、双花注射液、粉刺口服液)的主要有效成分 (李云等，2015)，具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、止血、保肝利胆、促进胃肠蠕动、减肥、抗肿瘤、降压、清除自由基、兴奋中枢神经系统等多种生物活性作用，因此是某些中药制剂质量控制的重要指标(周志娥等，2014)。
樱花素(Sakuranetin)属于黄酮类化合物，具有抗炎活性，干扰平滑肌细胞的钙代谢而使平滑肌松弛，对哮喘有治疗作用，因其较高的抗氧化活性，能有效对抗黑色素沉积，改善肤色暗沉，起到美白嫩肤的作用(马玉翠等，2017)。
随着生活水平提高以及对身体健康的关注，人们对食物的要求已经逐渐从吃得饱向吃得好转变。水稻是我们的主要粮食作物，因此，增加水稻品种中对人体健康有益的特殊营养物质的含量逐步成为育种工作者的一个重点研究方向。研究表明，水稻中含有多种对人体健康具有促进作用的特殊营养物质，例如：樱花素、绿原酸、阿魏酸、芹黄素、麦黄酮以及维生素B6等，并且这些营养物质的含量在水稻种质资源中具有很大的差异(Chen etal.,2014)。然而，上述物质大多以大家族衍生物的形式存在，并且含量相对较低，其测定方法繁琐，成本高、耗时长，不利于育种工作者在育种改良过程中直接进行测定和选择目标单株，因此，开发与这些重要营养物质的含量高度关联的基因标记，利用基因标记辅助选择营养物质含量高的目标单株，可以大大提高选择效率，加快育种进程。
另外，水稻基因组含有丰富的SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)，其中一些SNPs与营养物质含量紧密连锁，而KASP (Kompetitive Allele Specific PCR)基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性PCR，可对各种基因组核酸样品进行SNPs高精度双等位基因分型，并且KASP技术操作简单，分析稳定、准确，成本较低。利用上述营养物质的基因功能位点开发的分子标记，对水稻种质进行有利等位基因的鉴别以及不同基因有利单倍型组合筛选，进行特定有利基因的转移和聚合，提高营养物质含量，可以极大地节省成本，增加选择的准确性和效率，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的是开发一套能够对稻米特殊营养物质基因进行分型的引物组合，并将其应用于水稻自然种质的筛选、鉴定以及应用于基因型辅助选择改良稻米特殊营养物质的含量。
为了实现本发明目的，本发明基于KASP技术开发的用于水稻特殊营养物质基因分型的引物，所述水稻特殊营养物质基因包括 LOC_Os01g53380、LOC_Os02g28340、LOC_Os04g56910、 LOC_Os09g37200、LOC_Os10g01080、LOC_Os10g17990和 LOC_Os12g13800中的至少一种，它们的功能性分子标记分别对应于表1中M1～M7，信息如下：
表1
编号 分子标记类型 物理位置 等位基因 有利单倍型对应的碱基
M1 SNP LOC_Os01g53380基因编码区第19位 [C/T] T
M2 SNP LOC_Os02g28340基因编码区第1321位 [C/A] A
M3 SNP LOC_Os04g56910基因编码区第905位 [A/G] G
M4 SNP LOC_Os09g37200基因编码区第308位 [G/A] G
M5 SNP LOC_Os10g01080基因启动子第-42位 [G/A] G
M6 SNP LOC_Os10g17990基因编码区第907位 [A/G] A
M7 SNP LOC_Os12g13800基因编码区第88位 [T/C] C
基于KASP技术开发的用于检测上述功能性分子标记的引物，所述引物的信息见表2：
表2
Figure BDA0001391343720000041
其中，表2中gaaggtgaccaagttcatgct为FAM标签序列， gaaggtcggagtcaacggatt为HEX标签序列。上述引物序列分别对应于SEQ ID NO:1-21。
本发明还提供含有所述引物或其组合的用于水稻特殊营养物质基因分型的检测试剂盒。
本发明还提供所述引物或其组合，或所述试剂盒在改良水稻品种中的应用。
本发明还提供所述引物或其组合，或所述试剂盒在鉴定富含营养物质水稻品种中的应用。
本发明还提供所述引物或其组合，或所述试剂盒在水稻分子标记辅助育种中的应用。
本发明进一步提供所述引物或其组合，或所述试剂盒在水稻特殊营养物质基因等位功能变异检测中的应用。所述应用包括以下步骤：
1)提取待测水稻样品的DNA；
2)取模板DNA2.5μl，引物混合液0.07μl，2×KASP Master Mix 2.5μl，进行PCR扩增；引物混合液中引物fam-F、引物hex-F终浓度均为12μM，引物R终浓度为30μM；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物单倍型。
步骤2)PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应： 94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒， 55℃退火并延伸60秒，32个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(一)利用本发明提供的整套KASP功能标记及其引物组合能够快速检测水稻种质中特殊营养物质基因的功能等位基因的组合方式，检测结果准确可靠，操作简单，成本低。
(二)本发明方法能够实现水稻育种材料的特殊营养物质功能基因的检测，解决营养物质测定分析复杂、价格昂贵等问题，为富含营养物质新品种选育改良提供科学工具。
附图说明
图1-图7分别为本发明实施例2中7个基因功能位点标记01g53380_KASP、02g28340_KASP、04g56910_KASP、 09g37200_KASP、10g01080_KASP、10g17990_KASP和12g13800_KASP在12份水稻种质材料间的基因型簇图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1水稻特殊营养物质基因功能标记的开发
1、根据文献Chen W,Gao Y,Xie W,et al.Genome-wide association analysesprovide genetic and biochemical insights into natural variation in ricemetabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721的报道。 LOC_Os01g53380编码花青素葡萄糖基转移酶，催化7-葡萄糖苷芹菜素合成。利用网站RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn)水稻533份核心种质重测序信息对LOC_Os01g53380基因序列变异与7-葡萄糖苷芹菜素含量进行连锁分析，发现在LOC_Os01g53380基因编码区第19位 SNP：C/T变异导致基因功能差异并与7-葡萄糖苷芹菜素含量紧密连锁。从MSU网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载 LOC_Os01g53380的基因序列，截取该SNP上下游100bp的序列，利用软件primer premier5设计KASP引物：引物1、引物2和引物3；引物1 依次为FAM标签序列和LOC_Os01g53380无功能基因DNA序列，引物 2依次为HEX标签序列和LOC_Os01g53380有功能基因DNA序列，引物3为共用序列，序列如表3中引物3所示单链DNA，其中引物2为有利单倍型，富含黄酮类物质7-葡萄糖苷芹菜素。
2、根据文献Chen W,Gao Y,Xie W,et al.Genome-wide association analysesprovide genetic and biochemical insights into natural variation in ricemetabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721的报道。LOC_Os02g28340编码转移酶，催化丙二酰己糖苷麦黄酮合成。利用网站RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn)水稻533份核心种质重测序信息对LOC_Os02g28340基因序列变异与丙二酰己糖苷麦黄酮含量进行连锁分析，发现在LOC_Os02g28340基因编码区第1321位SNP： C/A变异导致基因功能差异并与丙二酰己糖苷麦黄酮含量紧密连锁。从MSU网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载LOC_Os02g28340的基因序列，截取该SNP上下游100bp的序列，利用软件primer premier5 设计KASP引物：引物4、引物5和引物6；引物4依次为FAM标签序列和LOC_Os02g28340无功能基因DNA序列，引物5依次为HEX标签序列和LOC_Os02g28340有功能基因DNA序列，引物6为共用序列，序列如表3中引物6所示单链DNA，其中引物5为有利单倍型，富含黄酮类物质丙二酰己糖苷麦黄酮。
3、根据文献Chen W,Gao Y,Xie W,et al.Genome-wide association analysesprovide genetic and biochemical insights into natural variation in ricemetabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721的报道。 LOC_Os04g56910编码转移酶，催化阿魏酰胍丁胺合成。利用网站 RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn)水稻533份核心种质重测序信息对LOC_Os04g56910基因序列变异与阿魏酰胍丁胺含量进行连锁分析，发现在LOC_Os04g56910基因编码区第905位SNP：A/G变异导致基因功能差异并与阿魏酰胍丁胺含量紧密连锁。从MSU网站 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载LOC_Os04g56910的基因序列，截取该SNP上下游100bp的序列，利用软件primer premier5设计KASP 引物：引物7、引物8和引物9；引物7依次为FAM标签序列和 LOC_Os04g56910无功能基因DNA序列，引物8依次为HEX标签序列和LOC_Os04g56910有功能基因DNA序列，引物9为共用序列，序列如表3中引物9所示单链DNA，其中引物8为有利单倍型，富含芬妥胺类物质阿魏酰胍丁胺。
4、根据文献Chen W,Gao Y,Xie W,et al.Genome-wide association analysesprovide genetic and biochemical insights into natural variation in ricemetabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721的报道。 LOC_Os09g37200编码转移酶，催化阿魏酸腐胺合成。利用网站 RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn)水稻533份核心种质重测序信息对LOC_Os09g37200基因序列变异与阿魏酸腐胺含量进行连锁分析，发现在LOC_Os09g37200基因编码区第308位SNP：G/A变异导致基因功能差异并与阿魏酸腐胺含量紧密连锁。从MSU网站 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载LOC_Os09g37200的基因序列，截取该SNP上下游100bp的序列，利用软件primer premier5设计KASP 引物：引物10、引物11和引物12；引物10依次为FAM标签序列和 LOC_Os09g37200有功能基因DNA序列，引物11依次为HEX标签序列和LOC_Os09g37200无功能基因DNA序列，引物12为共用序列，序列如表3中引物12所示单链DNA，其中引物10为有利单倍型，富含芬妥胺类物质阿魏酸腐胺。
5、根据文献Chen W,Gao Y,Xie W,et al.Genome-wide association analysesprovide genetic and biochemical insights into natural variation in ricemetabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721和 Dell'Aglio E,Boycheva S,Fitzpatrick T B.The pseudoenzyme PDX1.2 sustains vitamin B6biosynthesis as afunction of heat stress[J].Plant Physiology,2017:Vol.174,pp.2098-2112的报道。LOC_Os10g01080 编码维生素B6合成蛋白，催化维生素B6合成。利用网站RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn)水稻533份核心种质重测序信息对LOC_ Os10g01080基因序列变异与维生素B6含量进行连锁分析，发现在 LOC_Os10g01080基因启动子第-42位SNP：G/A变异导致基因功能差异并与维生素B6含量紧密连锁。从MSU网站 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载LOC_Os10g01080的基因序列，截取该SNP上下游100bp的序列，利用软件primer premier5设计KASP 引物：引物13、引物14和引物15；引物13依次为FAM标签序列和LOC_ Os10g01080有功能基因DNA序列，引物14依次为HEX标签序列和LOC_Os10g01080无功能基因DNA序列，引物15为共用序列，序列如表3中引物15所示单链DNA，其中引物13为有利单倍型，富含维生素 B6。
6、根据文献Chen W,Gao Y,Xie W,et al.Genome-wide association analysesprovide genetic and biochemical insights into natural variation in ricemetabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721的报道。 LOC_Os10g17990编码磷脂酸胞苷酰转移酶，催化绿原酸合成。利用网站RiceVarMap(http://ricevarmap.ncpgr.cn)水稻533份核心种质重测序信息对LOC_Os10g17990基因序列变异与绿原酸含量进行连锁分析，发现在LOC_Os10g17990基因编码区第907位SNP：A/G变异导致基因功能差异并与绿原酸含量紧密连锁。从MSU网站 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载LOC_Os10g17990的基因序列，截取该SNP上下游100bp的序列，利用软件primer premier5设计KASP 引物：引物16、引物17和引物18；引物16依次为FAM标签序列和LOC_ Os10g17990有功能基因DNA序列，引物17依次为HEX标签序列和LOC_Os10g17990无功能基因DNA序列，引物18为共用序列，序列如表3中引物18所示单链DNA，其中引物16为有利单倍型，富含多酚类物质绿原酸。
7、根据文献Shimizu T,Lin F,Hasegawa M,et al.Purification andidentification of naringenin 7-O-methyltransferase,a key enzyme inbiosynthesis of flavonoid phytoalexin sakuranetin in rice[J].Journal ofBiological Chemistry,2012,287(23):19315-19325和Chen W,Gao Y,Xie W,etal.Genome-wide association analyses provide genetic and biochemical insightsinto natural variation in rice metabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721的报道。LOC_Os12g13800编码柚皮素甲基转移酶，催化柚皮素生成樱花素。利用网站RiceVarMap (http://ricevarmap.ncpgr.cn)水稻533份核心种质重测序信息对LOC_Os12g13800基因序列变异与樱花素含量进行连锁分析，发现在LOC_ Os12g13800基因编码区第88位SNP：T/C变异导致基因功能差异并与樱花素含量紧密连锁。从MSU网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载LOC_Os12g13800的基因序列，截取该SNP上下游100bp的序列，利用软件primer premier5设计KASP引物：引物19、引物20和引物21；引物19依次为FAM标签序列和LOC_Os12g13800有功能基因DNA序列，引物20依次为HEX标签序列和LOC_Os12g13800无功能基因DNA 序列，引物21为共用序列，序列如表3中引物21所示单链DNA，其中引物20为有利单倍型，富含黄酮类物质樱花素。
引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，采用高纯度PAGE方式纯化。引物信息见表3。
表3功能性分子标记的引物序列
Figure BDA0001391343720000101
Figure BDA0001391343720000111
所述标签FAM的核苷酸序列为gaaggtgaccaagttcatgct；所述标签 HEX的核苷酸序列为gaaggtcggagtcaacggatt。
实施例2水稻特殊营养物质基因功能标记的多态性筛选
针对7个水稻特殊营养物质基因的功能位点分子标记，对包括8 份籼稻、4份粳稻在内的12份水稻种质材料进行KASP反应，测试标记分型情况。
PCR扩增反应使用的体系为5μl：模板DNA 2.5μl，引物混合液 0.07μl，2×ASPMaster Mix 2.5μl，引物fam-F、引物hex-F终浓度均为12μM，引物R终浓度为30μM。
PCR扩增反应的条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应： 94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒， 55℃退火并延伸60秒，32个循环。
PCR反应结束后，利用BIO-RAD CFX荧光定量PCR仪对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果导出成列表格式，即得到表4中基因分型结果。
结果显示，7个特殊营养物质基因功能标记在12份材料存在多态性，7个基因功能位点标记在12份材料间基因型簇图分别见图1-图7。针对检测7个营养物质基因进行检测，发现12份材料分别存在3～5个有利单倍型，每份材料平均含有3.8个有利单倍型基因，而LOC_Os02g28340与LOC_Os12g123800仅在3份和2份材料含有有利单倍型基因，说明该套营养物质基因标记能够有效地鉴定营养物质基因有利单倍型，在富含营养物质育种中具有极大的应用价值。针对水稻育种基础材料93-11进行7个特殊营养物质基因有利等位变异分析，发现93-11拥有5个营养物质基因有利等位变异，可以将丰矮占中 LOC_Os02g28340和LOC_Os12g13800有利等位基因定向导入9311中，增加9311黄酮类物质麦黄酮与樱花素含量。
表4测试种质材料分型结果
Figure BDA0001391343720000121
注：表4中01g53380_KASP对应的Allele 1、2分别为C、T，02g28340_KASP对应的Allele 1、 2分别为C、A，04g56910_KASP对应的Allele 1、2分别为A、G，09g37200_KASP对应的Allele 1、2分别为G、A，10g01080_KASP对应的Allele 1、2分别为G、A，10g17990_KASP对应的 Allele 1、2分别为A、G，12g13800_KASP对应的Allele 1、2分别为T、C。
实施例3水稻特殊营养物质基因功能标记在改良水稻种质富含营养物质材料筛选中应用
表5水稻种质材料富含营养物质分型结果
Figure BDA0001391343720000131
针对7个水稻特殊营养物质基因的功能位点分子标记，对包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)的533份水稻种质材料进行有利等位基因检测，测试标记筛选准确性。
PCR扩增反应使用的体系为5μl：模板DNA 2.5μl，引物混合液 0.07μl，2×KASPMaster Mix 2.5μl，引物fam-F、引物hex-F终浓度均为12μM，引物R终浓度为30μM。
PCR扩增反应的条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应： 94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20 秒，55℃退火并延伸60秒，32个循环。
PCR反应结束后，利用BIO-RAD CFX荧光定量PCR仪对KASP 反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果导出成列表格式，即得到表5中基因分型结果。
结果显示，7个水稻特殊营养物质基因的功能位点分子标记均能够清晰地将测试种质分为两个亚群，即Allele 1和Allele 2。参照Chen et al.2014文章中533份核心种质7种营养物质含量，Allele 1和Allele 2亚群间的特定营养物质均存在显著差异，用开发的分子标记鉴定的有利单倍型群含量均极显著地高于另外一个单倍型群。表明7个水稻特殊营养物质基因标记能够准确地鉴定在自然种质群体中富含营养物质材料，并能够进行有效地选择。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
Chen W,Gao Y,Xie W,et al.Genome-wide association analyses providegenetic and biochemical insights into natural variation in rice metabolism[J].Nature Genetics,2014,46(7):714-721
Czeczot H,Tudek B,Kusztelak J,et al.Isolation and studies of themutagenic activity in the Ames test of flavonoids naturally occurring inmedical herbs.Mutat Res,1990,240:209—216Dell'Aglio E, Boycheva S,FitzpatrickT B.The pseudoenzyme PDX1.2sustains vitamin B6biosynthesis as a function ofheat stress[J].Plant Physiology,2017:Vol.174,pp.2098-2112
Shimizu T,Lin F,Hasegawa M,et al.Purification and identification ofnaringenin 7-O-methyltransferase,a key enzyme in biosynthesis of flavonoidphytoalexin sakuranetin in rice[J]. Journal of Biological Chemistry,2012,287(23):19315-19325
Zhu Y,Mao Y,Chen H,et al.Apigenin promotes apoptosis,inhibitsinvasion and induces cell cycle arrest of T24human bladder cancer cells[J].Cancer cell international,2013,13(1):54.
国家医药管理局中草药情报中心.植物药有效成分手册[M].北京:人民卫生出版社, 1986:1073
李云,周明眉,邢丽娜,等.绿原酸的肠道菌群代谢研究进展[J].中草药,2015,46(4):610-614.
马逢时,李家明,李传润,等.阿魏酸衍生物及其生物活性[J].药学进展，2008(8)：345-351
陈敏,张伶俐,全淑燕,等.维生素B6临床应用的安全性评价[J].中国药学杂志,2016,51(1): 65-69.
马玉翠,吴翠,王尉,等.樱花素标准样品的研制[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(9):51-56.
周志娥,杜华英,林丽萍,等.超声波辅助提取黄花菜中多酚类物质工艺的优化[J].食品工业科技,2014,35(18):284-287。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 基于KASP技术用于水稻特殊营养物质基因分型的引物及应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc taaaagcatg cgcgtggaaa aagccc 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat taaaagcatg cgcgtggaaa aagcct 46
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggcgaagga agccttccgg gaag 24
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tggcggcatc gaggtgggca tagctc 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tggcggcatc gaggtgggca tagcta 46
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacgtgtcca tgcgctccgg cagc 24
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tacgacgttg cccgtgtagc catcca 46
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tacgacgttg cccgtgtagc catccg 46
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcgcgcgga tgagcccgcc ggtg 24
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc ttggtcgagg cctgcgtgga tggtag 46
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat ttggtcgagg cctgcgtgga tggtaa 46
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttcgccggt gcgatgtcgg cgagg 25
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc ttttgtgtgg caataacaac tcaacg 46
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat ttttgtgtgg caataacaac tcaaca 46
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagaggcgga gctggatcga tctat 25
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaggtgacc aagttcatgc tcataacttt ctggtgtaaa tataga 46
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtcgga gtcaacggat tcataacttt ctggtgtaaa tatagg 46
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggatggctt cattgtgatc ctgg 24
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tcgtcgacta ctcacccaat gttatt 46
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat tcgtcgacta ctcacccaat gttatc 46
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgattcaga caagcataga caaaa 25

Claims (8)

1.基于KASP技术开发的用于水稻特殊营养物质基因分型的引物组合，其特征在于，所述水稻特殊营养物质基因为LOC_Os01g53380、LOC_Os02g28340、LOC_Os04g56910、LOC_Os09g37200、LOC_Os10g01080、LOC_Os10g17990和LOC_Os12g13800，它们的功能性分子标记分别对应于表1中M1～M7，信息如下：
表1
编号 分子标记类型 物理位置 等位基因 有利单倍型对应的碱基 M1 SNP LOC_Os01g53380基因编码区第19位 [C/T] T M2 SNP LOC_Os02g28340基因编码区第1321位 [C/A] A M3 SNP LOC_Os04g56910基因编码区第905位 [A/G] G M4 SNP LOC_Os09g37200基因编码区第308位 [G/A] G M5 SNP LOC_Os10g01080基因启动子第-42位 [G/A] G M6 SNP LOC_Os10g17990基因编码区第907位 [A/G] A M7 SNP LOC_Os12g13800基因编码区第88位 [T/C] C
基于KASP技术开发的用于检测上述功能性分子标记的引物组合，所述引物组合的信息见表2：
表2
Figure FDA0002203929350000011
Figure FDA0002203929350000021
其中，表2中gaaggtgaccaagttcatgct为FAM标签序列，gaaggtcggagtcaacggatt为HEX标签序列。
2.含有权利要求1所述引物组合的用于水稻营养物质基因分型的检测试剂盒。
3.权利要求1所述引物组合，或权利要求2所述试剂盒在改良水稻品种中的应用。
4.权利要求1所述引物组合，或权利要求2所述试剂盒在鉴定富含营养物质水稻品种中的应用。
5.权利要求1所述引物组合，或权利要求2所述试剂盒在水稻分子标记辅助育种中的应用。
6.权利要求1所述引物组合，或权利要求2所述试剂盒在水稻特殊营养物质基因等位功能变异检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测水稻样品的DNA；
2)取模板DNA 2.5μl，引物混合液0.07μl，2×KASP Master Mix 2.5μl，进行PCR扩增；引物混合液中引物fam-F、引物hex-F终浓度均为12μM，引物R终浓度为30μM；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物单倍型。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，32个循环。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108998550B (zh) * 2018-07-17 2021-09-03 袁隆平农业高科技股份有限公司 用于水稻基因分型的snp分子标记及其应用
CN110029187A (zh) * 2019-04-29 2019-07-19 华南农业大学 一种基于竞争性等位pcr构建水稻分子标记图谱的方法及利用其进行育种的应用
CN112251534B (zh) * 2020-11-11 2023-09-22 江西省农业科学院水稻研究所 基于kasp技术用于水稻整个生育期耐冷基因分型的引物组合及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112546A (zh) * 2015-09-23 2015-12-02 中国农业科学院作物科学研究所 基于kasp技术检测小麦功能基因的成套引物及其应用
CN106480228A (zh) * 2016-12-31 2017-03-08 华智水稻生物技术有限公司 水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记及其应用
CN106939349A (zh) * 2017-04-28 2017-07-11 华中农业大学 基于kasp技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用
CN107012252A (zh) * 2017-05-19 2017-08-04 华中农业大学 一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112546A (zh) * 2015-09-23 2015-12-02 中国农业科学院作物科学研究所 基于kasp技术检测小麦功能基因的成套引物及其应用
CN106480228A (zh) * 2016-12-31 2017-03-08 华智水稻生物技术有限公司 水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记及其应用
CN106939349A (zh) * 2017-04-28 2017-07-11 华中农业大学 基于kasp技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用
CN107012252A (zh) * 2017-05-19 2017-08-04 华中农业大学 一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Genome-wide association analyses provide genetic and biochemical insights into natural variation in rice metabolism;Wei Chen 等;《Nature Genetics》;20140730;第46卷(第7期);全文 *

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