CN113684294B - 一种鉴别四川地区金荞麦的ssr分子标记引物及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鉴别四川地区金荞麦的SSR分子标记引物及其方法，方法包括如下步骤：以待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板，用SSR分子标记物进行PCR扩增，得到扩增产物；对扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到扩增产物的分型结果；将扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，得到等位基因矩阵；根据等位基因矩阵，通过GenALEx计算金荞麦的遗传多样性数据；基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。解决现有金荞麦产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种鉴别四川地区金荞麦的SSR分子标记引物及方法。
背景技术
金荞麦为蓼科植物金荞麦的干燥根茎，金荞麦又叫野荞麦、天荞麦、开金锁、野荞麦根，金荞麦有清热解毒、散风化痰、活血散淤、健脾利湿的功效，金荞麦有治疗咽喉肿痛、肺热咳嗽、肺痈痰臭、风湿痹痛、肺脓疡、痢疾的作用。
不同产地的金荞麦的药效质量差异较大。药材的“道地性”是由于各个地区生态环境差异导致药材的药效不同，特定的地理气候种植的特定的药材，才能更好地发挥药效，也是道地药材的精髓。
金荞麦产地的鉴别一直是金荞麦物种鉴定的技术难点，也是当前中药资源产业面临的行业难题。当前金荞麦产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种鉴别四川地区金荞麦的SSR分子标记引物及其方法，解决当前金荞麦产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强的技术问题。
本发明通过如下技术方案实现：
本发明的一种鉴别四川地区金荞麦的SSR分子标记引物，包括以下引物对：
进一步，所述引物对的退火温度为59℃-63℃之间，所述引物对的长度在21bp-25bp之间，PCR产物长度在100bp-200bp之间。
本发明还提供利用上述SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，具体包括如下步骤：
以待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板，用所述SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到PCR扩增产物的分型结果；
将所述PCR扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵；
根据所述等位基因矩阵，通过GenALEx计算金荞麦在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据；
基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。
进一步的，利用mCTAB法提取待鉴定金荞麦样本的总DNA。
进一步的，将待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板之前，还包括将待鉴定金荞麦样本的总DNA进行纯化。
进一步的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性0.5min，退火0.5min，72℃延伸1min，重复32个循环；72℃延伸10min。
进一步的，所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O 11.8μL，10×Taq Buffer 2μL，2mMdNTP 2μL，5uM Forward primer 1μL，5uM Reverse primer 1μL，Taq DNA polymerase0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL。
进一步的，对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳测序分型之前，还包括，将所述PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
进一步的，所述记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵具体包括：以二元方式来记录等位基因片段大小，即某一等位基因存在时记为1，某一等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵。
进一步的，所述遗传多样性数据包括遗传相似性系数、等位基因数NA、期望杂合度HE、观测杂合度HO、Shannon's指数。
和最接近的现有技术比，本发明的技术方案具备如下有益效果：
本发明应用基因组技术及SSR分子标记技术，利用金荞麦基因组设计SSR引物，并通过云南、贵州以及四川等地的金荞麦样本筛选出5对SSR分子标记引物，用于特异性鉴别四川地区金荞麦样本，准确度高、稳定性强、易于大范围推广应用。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于本发明的SSR分子标记引物构建的不同主产区金荞麦样本的UPGMA聚类图。
图2为对未知的金荞麦样本基于本发明的SSR分子标记引物在UPGMA聚类图的鉴定结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，具体包括如下步骤：
S1：利用mCTAB法提取待鉴定金荞麦样本叶片的总DNA，具体包括如下步骤：
(1)取金荞麦样本叶片100mg放入2.0mL的离心管中，同时加入少量石英砂和一颗磁珠，金荞麦样本叶片浸入液氮中冻存1min左右，置于研磨机中打磨至细小的粉末状材料备用；
(2)在研磨好的粉末状材料中加入1.5mL buffer A(0.1M Tris-HCl pH8.0；5mMEDTA；0.25M NaCl；1％PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，期间将沉淀下的粉末重新均质混合两次，10000×g离心后，弃掉上清液，得到第一次沉淀。
(3)将第一次沉淀再次加入1.5mL buffer A(0.1M Tris-HCl pH8.0；5mM EDTA；0.25M NaCl；1％PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，期间将沉淀下的粉末重新均质混合两次，10000×g离心后，弃掉上清液，得到第二次沉淀。
(4)在第二次沉淀中加入800μL预热的2％CTAB(0.1M Tris-HCl pH8.0；1.4MNaCl；25mM EDTA；2％(w/v)CTAB；0.2％(v/v)β-巯基乙醇；1％PVP-40)溶液，将沉淀均质悬浮于溶液后置于65℃水浴锅中保存1.5-2h,期间颠倒均质溶液3-5次,得到第一次混合液。
(5)将第一次混合液进行10000×g室温离心，获取第一次DNA上清液，将第一次DNA上清液小心倒入一个新的2.0mL离心管中，加入等体积CI(氯仿：异戊醇＝24:1(v/v))溶液，在颠倒摇床上混合10min，得到第二次混合液。
(6)将第二次混合液进行10000×g离心，获取第二次DNA上清液，以移液枪小心吸取第二次DNA上清液至一个新的2.0mL离心管中，加入等体积CI溶液，在颠倒摇床上混合10min，得到第三次混合液。
(7)将第三次混合液进行10000×g离心，得到第三次DNA上清液，以移液枪小心吸取第三次DNA上清液至一个新的1.5mL离心管中，加入0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混合后置于-20℃冰箱保存1小时以上，得到第四次混合液。
(8)将盛装第四次混合液的离心管从冰箱中取出，进行10000×g离心，弃去上清液，得到第一次凝固体，将盛装第一次凝固体的离心管倒置于干燥纸上尽量控干液滴，然后加入100μL的RNase溶液(100mg/L)，37℃保存0.5h，得到第五次混合液。
(9)在盛装第五次混合液的离心管中依次加入150μL ddH2O,50μL 5M NaCl和700μL无水乙醇，充分混合后10000×g离心，弃去上清液，得到第二次凝固体，将盛装第二次凝固体的离心管再次倒置于干燥纸上尽量控干液滴，然后加入600μL 70％乙醇，弹底混合后离心，弃掉上清液，得到第三次凝固体。
(10)将盛装第三次凝固体的离心管内再次加入600μL70％乙醇，弹底混合后离心，弃掉上清液，得到第四次凝固体。
(11)将盛装第四次凝固体的离心管真空干燥掉乙醇，加100μLTE溶解，得到DNA溶解液。
其中，金荞麦样本采集信息如下：分别采集云南、贵州、四川地区的金荞麦各14株、12株、8株，具体信息如下表1所示：
表1
S2：将待鉴定金荞麦样本叶片的总DNA进行纯化，具体是用金百特的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(货号：DC011)进行操作，步骤如下：
(1)将DNA溶解液点入1.5％的琼脂糖凝胶孔内，140V电泳25min，得到DNA条带。
(2)在长波紫外灯下，用干净刀片将所需纯化回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶。
(3)将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，并加入3倍体积的溶胶液(溶胶液为试剂盒产品内的试剂)，在56℃水浴放置10分钟(或直至胶完全溶解)；每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解，得到溶解液。
(4)将所得溶解液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1分钟，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液；然后加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉收集管中废液；然后再加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉收集管中废液，获取吸附DNA的吸附柱。
(5)将吸附DNA的吸附柱放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，弃掉收集管中废液，达到尽量除去漂洗液的目的，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应，然后将吸附DNA的吸附柱从收集管中取出，放入一个干净的离心管中，在吸附柱的吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，在离心管中得到纯化的DNA溶解液，将得到的纯化的DNA溶解液进行NanodropDNA浓度检测，稀释至50ng/μl，待后续PCR扩增使用。
S3：引物选择
从基于全基因组高通量数据筛选出来的SSR候选引物中，选择重复单元(碱基序列)碱基数2bp-5bp，重复单元(碱基序列)重复5-10次的24对引物进行预实验。所选择的引物长度在20bp-25bp之间，理论退火温度55℃左右，PCR产物长度处于150bp-350bp之间。
选取了8个金荞麦样本进行预实验，从扩增成功率以及多态性(毛细管荧光电泳方式)两个维度进行引物的选择，最终选定5对多态性好，扩增成功率高的SSR分子标记引物，待后续PCR扩增使用，选定的SSR分子标记引物的引物对(JQM03、JQM04、JQM07、JQM19、JQM21)，如下表2所示：
表2
上述表2中，F表示正向引物，R表示反向引物。
S4：以纯化待鉴定金荞麦样本叶片的总DNA为模板，用上述SSR分子标记引物的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增过程具体如下：
反应体系：双蒸水(ddH2O)11.8μL，10×Taq Buffer 2μL，2mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)2μL，5uM正向引物(Forward primer)1μL，5uM反向引物(Reverse primer)1μL，TaqDNA聚合酶(Taq DNA polymerase)0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL。
反应程序：94℃预变性4min；32个循环的三步PCR(94℃变性0.5min，退火时间0.5min，JQM03、JQM04退火温度为56℃，JQM07、JQM21退火温度为58℃，JQM19退火温度为54℃，72℃延伸1min)；72℃延伸10min。
S5：PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电压是140V，电泳时间是15分钟，通过长波紫外灯照射凝胶观察是否有条带且片段大小是否合适以确认实验成功。
S6：将PCR扩增产物按照等比例混合，送生工生物工程(上海)股份有限公司(地址：上海市松江区香闵路698号)进行毛细管电泳检测进行分型，得到PCR扩增产物的分型结果。
S7：将PCR扩增产物的分型结果用GeneMarker 4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵，具体包括：以二元方式来记录等位基因片段大小，即某一等位基因存在时记为1，某一等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵。
S8：根据等位基因矩阵，通过GenALEx计算金荞麦在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据，遗传多样性数据包括但不限于遗传相似性系数、等位基因数NA、期望杂合度HE、观测杂合度HO、Shannon's指数。
各居群的遗传多样性参数如下表3所示：
表3
其中，Pop是英文population,表示居群，Na＝观测等位基因数，Ne＝有效等位基因数，I＝Shannon's指数，Ho＝观测杂合度，He＝期望杂合度，F＝1-(Ho/He)。
通过表3可知：3个居群有效等位基因为2.236-5.727，Shannon's指数为0.739-1.768，其中四川居群的等位基因均值最低，相应的Shannon's指数也较低。云南居群、贵州居群的观测杂合度≈期望杂合度，表明该居群比较符合客观状态；四川居群观测杂合度＞期望杂合度，表明该居群存在一定的杂种选择现象或者远交现象。
各居群间的遗传相似性系数如下表4所示：
表4
| 居群 | 云南 | 贵州 | 四川 |
| 云南 | 1.000 | ||
| 贵州 | 0.769 | 1.000 | |
| 四川 | 0.333 | 0.313 | 1.000 |
通过表4可知：居群间平均遗传相似性系数为0.472，其中云南居群与贵州居群的遗传相似性系数最大为0.769，说明云南、贵州居群的种群关系近，四川与云南、贵州的遗传相似性系数分别为0.333、0.313，说明四川与云南、贵州两居群种群关系相对更远。
S9：基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树，如图1所示。
根据图1可知，只有四川居群的聚为较纯的一支，其他分支都有不同程度的混杂情况，同时也说明5对SSR分子标记引物可以较好的对产地为四川的金荞麦居群进行区分鉴定。根据5对SSR分子标记引物多态位点结果，基于遗传相似性系数，若待鉴别金荞麦与四川居群聚在一起则表示该金荞麦产地为四川。
应用案例：
从市场上获取了3份产地未知的金荞麦材料(Sample1,2,3)，通过本实施例的5对SSR分子标记引物组合鉴定结果为Sample1的产区为四川，鉴定结果如图2所示。
需要说明的是，图1和图2中的表示聚类树图的遗传距离标尺，0.6上方的线段长度表示0.6个遗传距离。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 深圳华大基因科技服务有限公司
中国中药有限公司
国药种业有限公司
<120> 一种鉴别四川地区金荞麦的SSR分子标记引物及其方法
<140> 2020110499539
<141> 2020-09-29
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtccgaacga ttacggctct tac 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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Claims (7)
1.一种鉴别四川地区金荞麦的SSR分子标记引物，其特征在于，所述SSR分子标记引物为以下引物对：
2.利用权利要求1所述的SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
以待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板，用所述SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到PCR扩增产物的分型结果；
将所述PCR扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵，所述记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵具体包括：以二元方式来记录等位基因片段大小，即某一等位基因存在时记为1，某一等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵；
根据所述等位基因矩阵，通过GenALEx计算金荞麦在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据，所述遗传多样性数据包括遗传相似性系数、等位基因数NA、期望杂合度HE、观测杂合度HO和Shannon 's指数；
基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树，若待鉴别金荞麦与四川居群聚在一起则表示该金荞麦产地为四川。
3.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，其特征在于，利用mCTAB法提取待鉴定金荞麦样本的总DNA。
4.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，其特征于，将待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板之前，还包括将待鉴定金荞麦样本的总DNA进行纯化。
5.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性0.5min，退火0.5min，72℃延伸1min，重复32个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O 11.8μL，10×Taq Buffer 2μL，2mM dNTP 2μL，5μMForward primer 1μL，5μM Reverse primer 1μL，Taq DNA polymerase 0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL。
7.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别四川地区金荞麦的方法，其特征在于，对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳测序分型之前，还包括，将所述PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
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